авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Изучение ca2+/рековерин-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ЧУРЮМОВА Валерия Александровна

ИЗУЧЕНИЕ Ca2+/РЕКОВЕРИН-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ

ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ РОДОПСИНА, КАТАЛИЗИРУЕМОГО

РОДОПСИНКИНАЗОЙ 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва – 2008

Работа выполнена в отделе сигнальных систем клетки НИИ физико-химической биоло гии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор П.П. Филиппов кандидат химических наук, старший научный сотрудник И.И. Сенин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Н. Чернов доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Е.Н. Иомдина

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится «_» 2008 г. в _ часов на заседании Диссерта ционного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете им. М.В. Ло моносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» _ 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ионы кальция служат универсальным регулятором самых разнооб разных процессов, протекающих в живой клетке. Воздействие ионов кальция на эти процес сы в большинстве случаев опосредовано Са2+-связывающими белками. За связывание ионов кальция у большинства Са2+-связывающих белков отвечает специальная структура, полу чившая название “EF-hand”. Многие из белков, содержащих EF-hand-структуру, служат сен сорами ионов кальция для различных мишеней в клетках различных типов, например, в ней ронах. Так, в настоящее время известно более сорока представителей EF-hand-содержащих Са2+-связывающих белков, специфичных для нервной ткани, которые составляют семейство нейрональных Са2+-сенсоров (neuronal calcium sensors, NCS). Белки семейства нейрональных Са2+-сенсоров выполняют регуляторную роль в отношении различных внутриклеточных белков-мишеней таких, как: протеинкиназы, гуанилатциклазы, аденилатциклазы и ионные каналы. Изменение внутриклеточной концентрации Са2+ определяет компартментализацию (раствор/мембрана) многих белков этого семейства, что в свою очередь модулирует их взаи модействие с сигнальными партнерами.

Типичным представителем семейства нейрональных Са2+-сенсоров является рекове рин, высокоспецифичный для фоторецепторных клеток сетчатки, представляющих собой высокоспециализированные нейроны. Функция рековерина в фоторецепторной клетке за ключается в Са2+-зависимой регуляции десенситизации фотоактивированного рецептора (ро допсина) путём его фосфорилирования, катализируемого ферментом родопсинкиназой. При высокой концентрации ионов кальция рековерин находится в комплексе с фоторецепторной мембраной и взаимодействует с родопсинкиназой, что приводит к ингибированию фермента.

Тогда как при низких концентрациях катиона комплекс родопсинкиназа-рековерин диссо циирует и ингибирование снимается. Процесс Са2+-зависимого ингибирования фосфорили рования родопсина происходит на фоторецепторной мембране при непосредственном взаи модействии рековерина и родопсинкиназы.

Актуальность данной работы обусловлена тем, что в настоящее время отсутствует полная информация о механизме Са2+-зависимого взаимодействия рековерина и его внутри клеточной мишени родопсинкиназы, а также роли фосфолипидного матрикса фоторецептор ной мембраны в функционировании этих белков.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – изучение механизмов Са2+-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина родопсинкиназой. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи.

• Выявление сайтов родопсинкиназы и рековерина, ответственных за взаимодействие этих двух белков.

• Изучение влияния состава фоторецепторной мембраны на регуляцию фосфорилиро вания родопсина.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе выявлен участок молекулы родопсинкиназы, принимающий участие во взаимодействии с ее внутриклеточным регулятором рековерином. Установлено, что заполнение Са2+-связывающего центра EF2 ре коверина ионами кальция непосредственно контролирует экспонирование гидрофобного “кармана” и миристоильного остатка, и, как следствие, взаимодействие рековерина с его мишенью – родопсинкиназой. Продемонстрировано влияние изменения содержания холесте рина в составе фоторецепторных мембран на Са2+-зависимое связывание рековерина с мем бранами. Показано, что повышение концентрации холестерина в составе мембран увеличи вает способность рековерина ингибировать родопсинкиназу в результате сдвига полумакси мального эффекта ингибирования в сторону низких концентраций свободного Са2+ и рекове рина.

Практическая ценность работы заключается в том, что рековерин является одним из ключевых белков-регуляторов процесса фототрансдукции в фоторецепторной клетке, нару шение которого приводит к целому ряду зрительных патологий. Понимание молекулярных механизмов передачи зрительного сигнала необходимо для разработки эффективных мето дов лечения заболеваний зрения.



Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ, на семинарах отдела сигнальных систем клетки НИИФХБ МГУ, на 7-й Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2003), международной конференции “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (Пущино, 2005) и на XVIII меж дународной зимней молодежной научной школе “Перспективные направления физико химической биологии и биотехнологии” (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 37 ри сунками и 4 таблицами. Библиографический указатель включает 209 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Родопсинкиназа, или GRK1, фермент, фосфорилирующий родопсин, представляет со бой первую обнаруженную протеинкиназу семейства GRK [Lorenz et al., 1991]. Как и другие представители этого семейства протеинкиназ, родопсинкиназа фосфорилирует только сти мулированную (светоактивированную) форму родопсина (Rho*). На основании первичной структуры фермента и гомологии с другими представителями семейства Ser/Thr протеинкиназ в молекуле родопсинкиназы (RK) выделяют три основных домена: централь ный каталитический домен (RK184-454), ограниченный N- и C- концевыми регуляторными до менами (соответственно RK1-183 и RK455-561). С-концевой домен родопсинкиназы содержит СААХ-мотив (CysValLeuSer561), который служит сигналом для присоединения фарнезильной группы к остатку цистеина, и сайты аутофосфорилирования (Ser448, Thr489).

Регуляция родопсинкиназы происходит при участии Са2+-связывающего белка реко верина, специфично экспрессирующегося в клетках сетчатки. Молекула рековерина содер жит 4 потенциальных Са2+-связывающих центра типа EF-hand, из которых только два, а именно второй и третий (EF2 и EF3 соответственно) способны связывать ионы кальция. Ос новными следствиями связывания ионов кальция с рековерином, белком, в котором функ ционирует “Са2+-миристоильный переключатель” (calcium-myristoyl switch), является: а) экс понирование гидрофобного “кармана” рековерина и б) экспонирование миристоильного ос татка, ковалентно присоединенного к N-концевому остатку рековерина. Это придает рекове рину способность Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фоторецепторными мембра нами и ингибировать его внутриклеточную мишень – родопсинкиназу.

Предыдущие исследования [Klenchin et al., 1995] показали, что ингибирование родоп синкиназы под действием рековерина происходит при непосредственном взаимодействии этих двух белков. Однако механизм этого взаимодействия изучен не был, в частности, оста вались неизвестными структурные участки, ответственные за связывание рековерина с его внутриклеточной мишенью. Кроме того, не было исследовано влияние фосфолипидного ок ружения (состава фоторецепторных мембран) на функционирование рековерина и родопсин киназы. Используя мутантные формы рековерина и рекомбинантные фрагменты родопсин киназы, мы попытались ответить на эти вопросы в настоящей работе.

1. Влияние содержания холестерина фоторецепторных мембран на взаимодействие рековерина с мембранами и регуляцию фосфорилирования родопсина.

Большинство процессов, имеющих отношение к фототрансдукции и ее регуляции, происходят непосредственно на мембране. Поэтому в основе обнаруженной способности ре коверина ингибировать родопсинкиназную активность может лежать как прямое взаимодей ствие рековерина с родопсинкиназой, так и механизмы, вовлекающие фоторецепторную мембрану.

Известно, что в мембране фоторецепторных дисков, содержащихся в наружных сег ментах палочки (НСП), обнаружена пространственная гетерогенность содержания холесте рина. Так, на новообразованные диски у основания НСП (базальные диски) приходится по давляющая часть массы холестерина, что составляет приблизительно 30% от общего количе ства липидов, в то время как на диски у окончания НСП (апикальные диски) – всего лишь 5% [Boesze-Battaglia et al., 1990]. К моменту начала настоящей работы имелись данные, указы вающие на пространственную неоднородность процессов передачи сигнала в НСП. Обнару жено, что ответ на единичный фотон, регистрируемый на конце НСП, имеет меньшую ам плитуду, чем ответ, регистрируемый у его основания [Schnapf, 1983]. Можно предположить, что эти различия кинетики фотоответа обусловлены составом фоторецепторной мембраны и, в частности, различным содержанием холестерина.

Для изучения влияния холестерина на регуляцию фосфорилирования светоактивиро ванного родопсина мы получили фоторецепторные мембраны с различным содержанием хо лестерина: от 4,1 до 29,6%;

при том, что нативные мембраны НСП содержат в среднем 14% холестерина. С использованием полученных мембран мы провели измерение влияния содер жания холестерина на взаимодействие миристоилированного рековерина с мембранами НСП и фосфолипидными везикулами при насыщающих концентрациях Са2+. (Исследование неми ристоилированных форм не проводились, т.к. они с фоторецепторными мембранами не взаимо действуют.) В результате установлено, что с увеличением содержания холестерина от 4,1% до 29,6% количество рековерина, связанного с мембранами НСП, повышается (рис. 1А).





А Б 4,1% холестерина количество связанного рековерина, % 14% холеcтерина количество связанного рековерина, % 29,6% холестерина 10 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 [родопсин], мкМ холестерин, % Рис. 1. Связывание рековерина с фоторецепторными мембранами и фосфолипидными вези кулами, содержащими различное количество холестерина.

Далее мы исследовали взаимодействие рековерина с фосфолипидными везикулами, содержащими фосфатидилэтаноламин (РЕ) и фосфатидилхолин (РС) в соотношении 50:50 с градиентом содержания холестерина (5-50%) при насыщающих концентрациях Са2+. Обна ружено, что связывание рековерина с фосфолипидными везикулами увеличивается при воз растании концентрации холестерина по сравнению с везикулами, не содержащими холесте рин (рис. 1Б).

Таким образом, результаты нашего исследования взаимодействия рековерина с фото рецепторными мембранами и фосфолипидными везикулами, содержащими различные кон центрации холестерина, позволяют сделать вывод о том, что связывание рековерина с мем бранами зависит от содержания в них холестерина.

Для подтверждения полученных результатов по влиянию холестерина на взаимодей ствие рековерина с мембранами мы использовали альтернативный метод – спектроскопию поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance, SPR). С помощью метода SPR мы исследовали влияние холестерина на взаимодействие рековерина с иммобилизован ным фосфолипидным бислоем. В этих экспериментах мы использовали систему “рековерин искусственная фосфолипидная мембрана”. В этой системе искусственный липидный бислой образует однородную поверхность на SPR-чипе и присутствует в неподвижной фазе в тече ние хода эксперимента, в то время как рековерин находится в составе растворимой фазы, подвижной относительно иммобилизованного липидного бислоя.

Для иммобилизации на гидрофобный сенсорный чип мы приготовили смесь фосфо липидов двух типов: а) РЕ и РС (50:50) и б) РЕ, РС и холестерина (25:25:50). Полученные чипы использовали для измерения взаимодействия рековерина с иммобилизованными липи дами в присутствии насыщающей концентрации Са2+. При иммобилизации смеси липидов, содержащей холестерин, максимальная амплитуда сигнала связывания возрастала приблизи тельно в 2 раза по сравнению с сигналом в отсутствие холестерина (рис. 2).

Рис. 2. SPR-сенсограммы, отражающие взаимодействие рековерина с иммобилизованным липидным бислоем. Концентрация СаCl2 составляла 200 мкМ, рековерина – 5 мкM. Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе от сутствует (не закрашено) и присутствует (закрашено черным) рековерин.

Варьирование концентрации рековерина в условиях насыщающих концентраций ио нов кальция привело к такому же результату: в присутствии холестерина максимальная ам плитуда сигнала связывания была в 2 раза выше, чем без него (рис. 3).

PE:PC PE:PC:холестерин величина сигнала, RU 0 20 40 60 80 [рековерин], мкМ Рис. 3. Зависимость связывания рековерина с иммобилизованным липидным бислоем от концентрации белка. Липидный бислой содержал РЕ:РС в соотношении 50:50 или РЕ:РС:холестерин в соотношении 25:25:50.

Далее мы изучили зависимость ингибирования активности родопсинкиназы от кон центрации рековерина и Са2+ при различных концентрациях холестерина в мембранах НСП.

Полумаксимальная константа ингибирования (K50) родопсинкиназы составила 6,6 мкМ реко верина в присутствии мембран НСП с исходным содержанием холестерина, равным 14%. В то время как в присутствии мембран НСП, содержащих 29,6% холестерина, значение K50 со ставляло 4,5 мкМ рековерина (таблица 1). Изменение содержания холестерина в мембранах НСП также оказывает влияние на зависимость ингибирования родопсинкиназы от концен трации ионов кальция: при увеличении концентрации холестерина от 4,1% до 29,6% величи на K50 для ионов кальция сдвигается в область более низких значений концентрации свобод ного кальция ([Ca2+]f), а именно уменьшается от 4,31 мкМ до 0,82 мкМ [Ca2+]f (таблица 1).

Таблица 1. Зависимость активности родопсинкиназы от концентрации рековерина и свобод ного кальция при различном содержании холестерина в мембранах.

Содержание холестерина в мембране НСП 4,1% 14% 29,6% К50 [рековерин] 10,4 мкМ 6,6 мкМ 4,5 мкМ К50 [Ca2+]f 4,31 мкМ 2,43 мкМ 0,82 мкМ В настоящее время в литературе широко обсуждается влияние специфических мем бранных доменов, нерастворимых в детергенте, (так называемых, рафт-структур) на процес сы, имеющие отношение к клеточной сигнализации [Nair et al., 2002]. Рафт-структуры, обна руженные в НСП, характеризуются высоким содержанием холестерина [Martin et al., 2005].

Наши результаты, демонстрирующие увеличение сродства рековерина к мембранам с повы шенным содержанием холестерина, указывают на возможность нахождения рековерина и родопсинкиназы в составе рафт-структур. Поскольку мы показали что, Са2+-зависимое инги бирование родопсинкиназы усиливается при условии высокого содержания холестерина в мембранах НСП, можно предположить, что этот процесс происходит более эффективно в рафт-структурах, чем в мембранах вне этих структур. Для подтверждения нашего предполо жения мы сравнили ингибирование активности родопсинкиназы в присутствии фоторецеп торных мембран и рафт-структур, изолированных из мембран НСП.

Из графика зависимости активности родопсинкиназы от концентрации рековерина, представленного на рисунке 4А, следует, что ингибирование родопсинкиназы в присутствии рафт-структур происходит при немного меньших концентрациях рековерина по сравнению с мембранами НСП (К50 = 4,9 мкМ в рафт-структурах и 5,3 мкМ в фоторецепторных мембра нах). Однако при исследовании зависимости активности родопсинкиназы от концентрации Ca2+ мы обнаружили существенный сдвиг К50 в сторону низких концентраций Ca2+ в присут ствии рафт-структур (рис. 4Б). Это говорит о том, что Ca2+-зависимое ингибирование реко верином фосфорилирования родопсина более эффективно в рафт-структурах по сравнению с нативными фоторецепторными мембранами (К50 = 0,76 мкМ в рафт-структурах и 1,91 мкМ в фоторецепторных мембранах).

А Б относительная активность родопсинкиназы, % относительная активность родопсинкиназы, % фоторецепторные мембраны фоторецепторные мембраны рафт-структуры рафт-структуры 0,1 1 10 1 [Ca2+], мкМ [рековерин], мкМ Рис. 4. Зависимость активности родопсинкиназы от концентрации рековерина (А) и Са2+ (Б) в присутствии фоторецепторных мембран и рафт-структур.

Полученные нами данные говорят о том, что а) высокая концентрация холестерина способствует связыванию рековерина с мембранами и б) холестерин увеличивает эффектив ность ингибирования активности родопсинкиназы рековерином.

В одной из последних работ по изучению светозависимой транслокации сигнальных белков в фоторецепторной клетке обнаружены факты, указывающие на наличие градиента концентрации рековерина в НСП [Strissel et al., 2005]. В этой работе показано, что более вы сокая концентрация рековерина присутствует в базальной части НСП, т.е. градиент концен трации рековерина в НСП аналогичен таковому в случае холестерина. В соответствии с на шими данными можно полагать, что именно градиент концентрации холестерина в мембра нах НСП обусловливает наблюдаемый градиент концентрации рековерина. Как уже было сказано выше, в НСП существует градиент концентрации холестерина: для базальных дисков до 30%, для апикальных – до 5%. По нашим данным, эффективность ингибирования родоп синкиназной активности рековерином также является гетерогенным процессом, т.к. в ба зальной части НСП эффективность ингибирующего действия рековерина выше, чем в апи кальной области в результате сдвига значения полумаксимального эффекта ингибирования фермента в сторону низких концентраций свободного Са2+ и рековерина. Результаты наших экспериментов, полученные в условиях in vitro, объясняют описанные ранее наблюдения in vivo [Schnapf, 1983] о том, что выключение передачи светового сигнала в базальной части НСП происходит медленнее, чем в их апикальной области.

Исследование роли Са2+-связывающих центров рековерина в ингибировании ро 2.

допсинкиназы.

К началу настоящей работы в нашей лаборатории были получены две мутантные формы рековерина, у которых не функционировал один из двух работающих в рековерине дикого типа (wt-рековерине) Са2+-связывающих центров (рис. 5). Это – мутант RcE85Q, у ко торого не функционирует центр EF2 вследствие замены остатка глутаминовой кислоты в 85 м положении на остаток глутамина, и мутант RcE121Q, у которого не функционирует центр EF3 из-за аналогичной замены в 121-м положении. В дальнейшем при изучении мутантных форм рековерина с модифицированными Са2+-связывающими центрами было показано, что 2+ заполнение Са -связывающих центров катионами происходит последовательно. Сначала за полняется центр EF3 и лишь затем – центр EF2, при этом координация катионов центром EF является необходимым условием для последующего связывания ионов кальция в центре EF2.

Механизм последовательного заполнения Са2+-связывающих центров ионами кальция функ ционирует только в миристоилированном рековерине и не действует в его немиристоилиро ванной форме [Permyakov et al., 2000, Senin et al., 2002].

Рековерин действует как Са2+-сенсор родопсинкиназы, ингибируя ее при относитель но высоких концентрациях катиона. Связывание ионов кальция с молекулой рековерина приводит к экспонированию его гидрофобного “кармана”, в результате чего рековерин ста новится способным взаимодействовать с родопсинкиназой и ингибировать этот фермент [Ta chibanaki et al., 2000]. Как уже было сказано выше, молекула рековерина содержит два функ ционирующих Са2+-связывающих центра, в то же время роль каждого из этих центров в ингибировании родопсинкиназы оставалась неустановленной. Казалось бы, ответ на этот во прос мог быть получен с использованием мутантов рековерина, один из которых способен связывать ионы кальция во втором Са2+-связывающем центре, а другой – в третьем Са2+ связывающем центре. Однако из-за того, что в миристоилированном рековерине функциони рует вышеописанный механизм последовательного заполнения Са2+-связывающих центров ионами кальция, миристоилированный мутант RcE121Q с нефункционирующим третьим Са2+ связывающим центром ионы кальция вообще не связывает [Senin et al., 2002]. Поскольку в немиристоилированном рековерине связывание ионов кальция с его Са2+-связывающими центрами происходит независимо [Ames et al., 1995], мы попытались ответить на вопрос о роли каждого из двух Са2+-связывающих центров рековерина в экспонировании его гидро фобного “кармана” и, соответственно, в ингибировании родопсинкиназы, используя немири стоилированные формы мутантов рековерина RcE85Q (содержит “испорченный” центр EF2) и RcE121Q (содержит “испорченный” центр EF3).

wt-рековерин EF1 EF2 EF3 EF 36 48 73 85 109 121 159 мутант RcE85Q E85Q мутант RcE121Q E121Q Рис. 5. Схема локализации Са2+-связывающих центров в wt-рековерине и его мутантах по второму (мутант RcE85Q) и третьему (мутант RcE121Q) центрам типа EF-hand. Центры, способ ) связывать Са2+, обозначены прямоугольниками.

ные ( ) и не способные ( Ранее было показано, что немиристоилированная форма мутанта RcE85Q, который со держит “испорченный” Са2+-связывающий центр EF2, способна связывать ионы кальция за счет Са2+-связывающего центра EF3 [Weiergraber et al., 2003]. Используя радиоактивный изо Са2+, мы показали, что немиристоилированная форма мутанта рековерина RcE121Q, не топ смотря на то, что в ней присутствует “испорченный” Са2+-связывающий центр EF3, способ на, в отличие от миристоилированной форма этого мутанта, связывать ионы кальция за счет Са2+-связывающего центра EF2 (рис. 6). При этом величина константы диссоциации (KD) для ионов кальция составила 6,4 мкМ, что совпадает со значением KD для Са2+-связывающего центра EF2 в рековерине дикого типа по данным в работе [Ames et al., 1995].

Показателем экспонирования гидрофобного “кармана” рековерина может служить его способность взаимодействовать с гидрофобным носителем фенилсефарозой [Polans et al., 1991]. В связи с этим мы исследовали связывание немиристоилированных форм мутантов рековерина RcE85Q и RcE121Q и рековерина дикого типа с фенилсефарозой. Исследуемые фор мы рековерина инкубировали в присутствии суспензии фенилсефарозы в диапазоне [Са2+]f от 10 нМ до 100 мкМ;

степень связывания указанных форм рековерина с носителем опреде ляли по количеству белка, оставшегося в растворе после осаждения фенилсефарозы.

1, связанный Са2+, моль/моль белка 0, 0, 0, 0, 0, 0,1 1 10 100 2+ [Ca ]f, мкМ Рис. 6. Связывание 45Са2+ с немиристоилированной формой мутанта RcE121Q.

Как было показано ранее [Senin et al., 2002], миристоилированный wt-рековерин Са2+ зависимым образом взаимодействует с фенилсефарозой, тогда как миристоилированные му танты RcE85Q и RcE121Q такой способностью не обладают. Это говорит о том, что оба мутанта в присутствии ионов кальция не экспонируют гидрофобные аминокислотные остатки, необ ходимые для взаимодействия с гидрофобной матрицей. Используя немиристоилированные формы рековерина, мы показали, что немиристоилированный wt-рековерин способен, по добно миристоилированной форме белка, Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фе нилсефарозой (рис. 7). Оказалось, что немиристоилированный мутант RcE121Q, несмотря на отсутствие в нем функционального центра EF3, взаимодействует с фенилсефарозой анало гично wt-рековерину. При этом взаимодействие происходит в том же диапазоне [Са2+]f, что и при заполнении катионом нативного Са2+-связывающего центра EF2 в wt-рековерине. В от личие от мутанта RcE121Q, немиристоилированный RcE85Q, хотя и связывает ионы кальция за счет центра EF3, с фенилсефарозой не взаимодействует.

количество связанного рековерина, % - wt-рековерин - RcE85Q - RcE121Q 0,001 0,01 0,1 1 10 2+ [Ca ] f, м кМ Рис. 7. Са2+-зависимое связывание немиристоилированных форм рековерина с фенилсефарозой.

За 100% принято общее количество рековерина в пробе. Величина K50 для рековерина дикого типа составила 1,19 мкM, для RcE121Q – 1,48 мкM.

Следовательно, можно сделать вывод, что заполнение ионами кальция центра EF2, но не EF3, определяет способность рековерина взаимодействовать с фенилсефарозой и что ко ординация ионов кальция именно в Са2+-связывающем центре EF2 необходима для экспони рования гидрофобного “кармана” рековерина. Этот вывод в свою очередь предполагает, что координация ионов кальция в Са2+-связывающем центре EF2 необходима для придания ре коверину способности ингибировать родопсинкиназу. Правильность этого предположения подтвердили наши последующие эксперименты по исследованию способности немиристои лированных форм wt-рековерина и мутантов RcE85Q и RcE121Q ингибировать родопсинкиназу Ca2+-зависимым образом.

В этих экспериментах активность родопсинкиназы измеряли по включению радиоак тивного фосфата [32Р]-АТФ в родопсин в реконструированной системе, содержащей отмы тые мочевиной фоторецепторные мембраны, очищенную родопсинкиназу и исследуемые формы рековерина. Концентрацию свободного кальция варьировали в диапазоне от 1 нМ до 100 мкМ. Как следует из рис. 8, немиристоилированный мутант RcE121Q, который содержит “испорченный” Са2+-связывающий центр EF3 и, соответственно, координирует ионы кальция только за счет Са2+-связывающего центра EF2 способен ингибировать родопсинкиназу Са2+ зависимым образом. При этом величина K50 по Сa2+ для данного мутанта близка к таковой для wt-рековерина, хотя и несколько сдвинута в область более высоких концентраций ионов кальция. В то же время, немиристоилированный мутант RcE85Q, в котором “испорчен” Са2+ связывающий центр EF2 и который координирует ионы кальция только за счет Са2+ связывающего центра EF3, не способен ингибировать родопсинкиназу.

относительная активность родопсинкиназы, % - wt-рековерин - RcE85Q - RcE121Q 0,001 0,01 0,1 1 10 [Ca2+] f, мкM Рис. 8. Са2+-зависимое ингибирование активности родопсинкиназы немиристоилированными формами wt-рековерина и мутантами RcE85Q и RcE121Q. За 100% принята активность родопсин киназы в отсутствие рековерина. Величина K50 для рековерина дикого типа составила 0, мкM, для RcE121Q – 3 мкM.

Таким образом, описанные эксперименты прямо показывают, что именно связывание ионов кальция в Ca2+-связывающем центре EF2 обеспечивают взаимодействие рековерина с родопсинкиназой и ее ингибирование.

3. Выявление сайтов родопсинкиназы, ответственных за ее взаимодействие с реко верином.

Биохимические эксперименты на препаратах НСП in vitro продемонстрировали, что рековерин ингибирует фосфорилирование родопсина, взаимодействуя с родопсинкиназой [Klenchin et al., 1995, Senin et al., 2005]. Можно предположить два механизма ингибирования.

Согласно первому механизму, рековерин непосредственно действует на каталитическую ак тивность родопсинкиназы, взаимодействуя с ее каталитическим доменом. Согласно второму, рековерин стерически препятствует формированию фермент-субстратного комплекса родоп синкиназы с фотоактивированным родопсином, не затрагивая активный центр фермента. В предыдущих работах показано, что родопсинкиназа в присутствии рековерина теряет спо собность фосфорилировать светоактивированный родопсин. При этом рековерин не оказыва ет влияния на процесс фосфорилирования родопсинкиназой 11-членного пептидного суб страта, гомологичного фрагменту родопсина, который содержит сайты фосфорилирования.

Эти данные предполагают, что рековерин блокирует участок родопсинкиназы, необходимый для узнавания светоактивированного родопсина, не оказывая влияние на каталитическую ак тивность фермента как такового. Рековерин ингибирует родопсинкиназу посредством взаи модействия с участком, удаленным от каталитического центра, следовательно, потенциаль ными сайтами связывания рековерина могут быть участки, находящиеся в регуляторных N- и C-концевых доменах родопсинкиназы.

Целью настоящего раздела работы было выяснение локализации участков родопсин киназы, отвечающих за ее взаимодействие с рековерином. Для ответа на этот вопрос нами была получена рекомбинантная родопсинкиназа, а также рекомбинантные фрагменты фер мента, соответствующие его N-концевому (RK1-183) и C-концевому (RK455-561) доменам, и изучено их взаимодействие с рековерином.

3.1. Клонирование, идентификация и экспрессия полноразмерного гена родопсинкиназы и фрагментов гена родопсинкиназы.

Исходная конструкция, предположительно содержащая полноразмерный ген родоп синкиназы, была любезно предоставлена доктором М. Ахтаром (Department of Biochemistry, University of Southampton, United Kingdom). На первом этапе работы нами было проведено секвенирование гена и показано, что предоставленная кДНК соответствует гену родопсин киназы.

Для проведения экспрессии гена родопсинкиназы нами была выбрана система экс прессии под контролем РНК-полимеразы фага Т7, предложенная Студиером [Studier et al., 1986]. С этой целью ген родопсинкиназы клонировали в вектор рТ7-7, содержащий последо вательность промотора фага Т7, и трансформировали полученной конструкцией клетки штамма E.coli BL21 (DE3), в хромосоме которых имеется последовательность гена Т7 РНК полимеразы под контролем lac-промотора. Наличие lac-промотра позволяет индуцировать экспрессию гена Т7 РНК-полимеразы и, как следствие, гена, клонированного в рТ7-7, добав лением в культуральную среду синтетического аналога лактозы изопропил--D тиогалактозида (ИПТГ).

Электрофореграмма экстракта клеток E.coli BL21(DE3) после проведения аналитиче ской экспрессии полноразмерного гена родопсинкиназы, представленная на рис. 9, демонст рирует наличие белка с кажущейся молекулярной массой ~ 67 кДа, соответствующего ро допсинкиназе. Уровень экспрессии полноразмерной родопсинкиназы в клетках E.coli, как следует из электрофореграммы, оказался невысоким. Последующие попытки выделения ре комбинантного белка были безрезультатными из-за низкого уровня экспрессии. Вследствие этого для проведения экспериментов нами было принято решение получить рекомбинантные фрагменты родопсинкиназы, соответствующие ее доменам.

Рис. 9. Экспрессия полноразмерного гена родопсинкиназы. Экстракт клеток E.coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pТ7-7-RK, до индукции ИПТГ (-ИПТГ) и по сле индукции 0,1 мМ ИПТГ (+ИПТГ). «М» – стандарты молекулярной массы.

Для получения рекомбинантных фрагментов родопсинкиназы нами был выбран плаз мидный вектор pGEX5x-1 (Amersham Biosciences), содержащий ген глутатион S-трансферазы (КФ 2.5.1.18) из Schistosoma japonicum. Данная экспрессионная система позволяет проводить экспрессию генов в виде химерных белков, слитых в рамке считывания с глутатион S– трансферазой (GST), что облегчает выделение белков из клеточного экстракта с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном глутатионе [Smith, Johnson, 1988]. Нами были получены генетические конструкции, которые содержат фрагменты гена родопсинки назы, кодирующие N-концевой домен (pGEX5x-1-N) и С-концевой домен (pGEX5x-1-С), слитые в рамке считывания с геном GST. Экспрессию генов химерных белков проводили в прокариотической системе с использованием штамма E. coli BL21. После индукции экспрес сии генов с помощью ИПТГ образование белков анализировали с помощью SDS электрофореза экстрактов клеток (рис. 10). Данные, приведенные на рис. 10, указывают на образование рекомбинантных белков с молекулярной массой около 45 кДа и 38 кДа, что со ответствует молекулярным массам белков, соответствующих N- и С- концевым доменам ро допсинкиназы, экспрессирующимся в одной рамке считывания с GST (GST-N и GST-C).

Уровень экспрессии генов GST-N и GST-C оказался достаточно высоким, но основная часть данных белков накапливалась в форме нерастворимых телец включения. Причиной об разования нерастворимых белков может быть как очень высокий уровень экспрессии генов, так и восстановление дисульфидных связей в белках [Lobel et al., 2001]. Для увеличения об разования растворимой формы белков нами был проведен ряд экспериментов по оптимиза ции условий экспрессии, направленных на уменьшение скорости трансляции по следующим параметрам: температуре роста клеток в диапазоне 20-37С, оптической плотности клеточ ной культуры в диапазоне А600 от 0,5 до 1 до индукции и времени индукции в диапазоне от 30 минут до 3 часов. Однако любые попытки увеличить выход растворимой формы белка на стадии биосинтеза в бактериальных клетках не привели к успеху – количества растворимого химерного белка не превышали 100 мкг на 1 литр среды, в результате чего выделение хи мерных белков из клеточного экстракта оказалось невозможным. По этой причине нами бы ло принято решение о выделении рекомбинантных белков GST-N и GST-C из образующихся телец включения. Мы опробовали действие ряда детергентов: Тритона Х-100, Твина-80 и лаурилсаркозина натрия на примере выделения GST-N. При этом было установлено, что наибольшее количество экстрагируемого химерного белка GST-N получается при солюбили зации телец включения в растворе, содержащем 1,5% лаурилсаркозин натрия и 2% Тритона Х-100. Поэтому в дальнейшем мы использовали именно эти детергенты для выделения фрагментов родопсинкиназы, слитых в рамке считывания с GST.

Рис. 10. Экспрессия рекомбинантных генов GST-N и GST-C. Экстракт клеток E.coli BL21, трансформированных плазмидой pGEX5x-1-N (GST-N) и pGEX5x-1-С (GST-C), до индук ции ИПТГ (-ИПТГ) и после индукции 0,1 мМ ИПТГ (+ИПТГ). «М» – стандарты молеку лярной массы.

С учетом полученных данных нами был разработан и оптимизирован метод получе ния и выделения химерных белков GST-N и GST-C, продуцируемых E. coli в виде нераство римых телец включения. Метод состоит из следующих процедур: первая экстракция – уда ление растворимых белков в нативных условиях, вторая экстракция – выделение нераство римых белков в присутствии 1,5% лаурилсаркозина натрия и 2% Тритона Х-100 и после дующая очистка химерных белков на иммобилизованном глутатионе. Фракции белков после каждой стадии выделения анализировали методом SDS-электрофореза (рис. 11).

3.2. Выявление доменов и сайтов родопсинкиназы, ответственных за ее взаимодействие с рековерином.

Следующим этапом нашей работы было установление доменов родопсинкиназы, от ветственных за ее взаимодействие с рековерином. С этой целью мы использовали следую щую систему. К суспензии глутатионсефарозы, на которой предварительно иммобилизовали очищенный химерный белок, содержащий GST, добавляли рековерин при конечной концен трации Са2+ в системе, равной 2 мМ. После инкубации реакционной смеси в течение 1 часа при 4С глутатионсефарозу трижды промывали буфером, содержащим 2 мМ CaCl2. Затем белки элюировали с помощью 1% SDS и полученные фракции анализировали методом SDS электрофореза.

Рис. 11. Выделение и очистка рекомбинантных белков GST-N (А) и GST-C (Б). «М» – стандарты молекулярной массы, «ЭК» – экстракт клеток E.coli BL21, «Р» - фракция рас творимых внутриклеточных белков, «Н» – фракция нерастворимых внутриклеточных бел ков, солюбилизированных в растворе, содержащем 1,5% лаурилсаркозин натрия и 2% Три тон Х-100, «Элюат» – фракция белков после хроматографической очистки на глутатионсе фарозе, элюирование 10 мМ глутатионом.

Перед началом исследования взаимодействия белков GST-N и GST-C с рековерином с использованием описанной системы, мы провели контрольные эксперименты по изучению взаимодействия GST с рековерином, из которых однозначно следует, что рекомбинантный белок GST сам по себе с рековерином не взаимодействует. Таким образом, данная система может быть использована для изучения взаимодействия белков GST-N и GST-C с рековери ном.

Результаты эксперимента по связыванию химерных белков GST-N и GST-C с рекове рином представлены на рис. 12. Как видно из представленных данных, N-концевой домен родопсинкиназы в составе химерного белка взаимодействует с рековерином. Напротив, взаимодействия между С-концевым доменом родопсинкиназы и рековерином не наблюдает ся.

Для более точной локализации участка N-концевого домена родопсинкиназы, вовле ченного во взаимодействие с рековерином, мы провели исследования с использованием син тетических пептидных фрагментов родопсинкиназы RK11-26 и RK2-16. Смысл эксперимента заключался в выяснении способности данных пептидных фрагментов конкурировать с им мобилизованным N-концевым доменом родопсинкиназы за связывание с рековерином. Вы бор пептидов обусловлен нашими предварительными результатами, из которых следует, что фрагмент родопсинкиназы 23Asp-471Pro, полученный путем ограниченного протеолиза фарне зилированного белка в присутствии Asp-N-эндопротеиназы, теряет способность взаимодей ствовать с рековерином. Из этого следует, что во взаимодействие с рековерином вовлечен участок 1-23 регуляторного N-концевого домена родопсинкиназы.

Рис. 12. Взаимодействие химерных белков GST-N и GST-C с рековерином. «М» – стандар ты молекулярной массы;

«Rc» – очищенный препарат рековерина;

«-Rc» – фракция белков элюированных с глутатионсефарозы 1% SDS в отсутствие рековерина в инкубационной смеси;

«+Rc» – фракция белков элюированных с глутатионсефарозы 1% SDS в присутст вии рековерина в инкубационной смеси.

Эксперимент проводили в соответствии со следующей схемой. К суспензии глутати онсефарозы, на которую предварительно иммобилизовали очищенный химерный белок GST N, добавляли рековерин при конечной концентрации Са2+ в системе 2 мМ. После инкубации реакционной смеси в течение 1 часа при 4С глутатионсефарозу трижды промывали буфе ром, содержащим 2 мМ CaCl2. Элюирование рековерина проводили одним из трех буферов, содержащих: (а) 1 мМ пептид RK11-26, (б) 1 мМ пептид RK2-16 или (в) 2 мМ Са2+ (в качестве контроля, чтобы исключить неспецифическое элюирование рековерина). Для определения количества рековерина, оставшегося связанным с иммобилизованным N-концевым доменом родопсинкиназы после элюирования в каждом из трех экспериментов, препарат глутатион сефарозы обрабатывали буфером, содержащим 2 мМ ЭГТА.

На рис. 13 представлены результаты по Са2+-зависимому связыванию рековерина с N концевым доменом родопсинкиназы в присутствии и в отсутствие пептидных фрагментов родопсинкиназы RK2-16 и RK11-26.

Как следует из рис. 13, рековерин взаимодействует с N-концевым доменом родопсин киназы в присутствии Са2+ (дорожка 3), тогда как при последующем элюировании буфером, содержащим ЭГТА, рековерин диссоциирует из комплекса с фрагментом родопсинкиназы (дорожка 4). Добавление синтетического пепетида, соответствующего амнокислотным ос таткам 11-26 родопсинкиназы (RK11-26), полностью предотвращает взаимодействие рекове рина с иммобилизованным N-концевым доменом родопсинкиназы (дорожка 7), т.к. после дующая обработка ЭГТА не приводит к дополнительному элюированию рековерина (дорож ка 8). Однако добавление пептида RK2-16 практически не влияет на взаимодействие между рековерином и N-концевым доменом родопсинкиназы (дорожка 5), о чем свидетельствует значительное количество рековерина во фракции белков после элюции ЭГТА (дорожка 6).

Рис. 13. Конкуренция между химерным белком GST-N и пептидами RK11-26 и RK2-16 за взаимодействие с рековерином.

Таким образом, на основании наблюдаемой в ходе эксперимента конкуренции между фрагментом N-концевого домена RK11-26 и целым N-концевым доменом родопсинкиназы за взаимодействие с рековерином можно заключить, что участок RK11-26 регуляторного N концевого домена родопсинкиназы вносит основной вклад во взаимодействие родопсинкина зы и рековерина.

ВЫВОДЫ 1. Сродство рековерина к фоторецепторным мембранам возрастает при увеличении в них концентрации холестерина.

2. Повышение содержания холестерина в фоторецепторных мембранах приводит к уменьшению уровня фосфорилирования содержащегося в них родопсина вследствие усиления Са2+-зависимого ингибирования родопсинкиназы рековерином.

3. Связывание ионов кальция с Ca2+-связывающим центром рековерина EF2, но не EF3, обусловливает экспонирование неполярных боковых цепей гидрофобного “кармана” белка и тем самым – Ca2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы.

4. За взаимодействие родопсинкиназы с рековерином отвечает регуляторный N концевой домен фермента, причем основной вклад вносит ее фрагмент RK11-26.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Ваганова С.А., Сенин И.И., Чурюмова В.А., Зинченко Д.В., Заргаров А.А., Липкин В.М., Косh K.-W. Механизм Са2+-зависимого ингибирования рековерином фосфо рилирования светоактивированного родопсина, катализируемого родопсинкина зой. Тезисы докладов VI чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинни кова. Москва - Пущино, 25 ноября – 2 декабря, 2002, с.78.

2. Чурюмова В.А., Ваганова С.А., Зинченко Д.В., Заргаров А.А., Сенин И.И. Белко вый дизайн Са2+-связывающего белка рековерина: создание искусственного каль ций-связывающего участка в молекуле рековерина. Тезисы докладов 7-й Пущин ской конференции молодых ученых. Пущино, 14-18 апреля, 2003, с. 3. Senin I.I., Hoppner-Heitmann D., Polkovnikova O.O., Churumova V.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P., Koch K.-W. Recoverin and rhodopsin kinase activity in detergent resistant membrane rafts from rod outer segments. J. Biol. Chem. 2004;

v. 279 (47);

p.

48647-53.

4. Senin I.I., Hoeppner-Heitmann D., Polkovnikova O.O., Churumova V.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P., and Koch K.-W. Recoverin and rhodopsin kinase activity in deter gent-resistant membrane rafts from rod outer segments. 8th European symposium on calcium binding proteins in normal and transformed cells. Cambridge, UK, 30 July - August, 2004, p. 83.

5. Komolov K.E., Zinchenko D.V., Churumova V.A., Vaganova S.A., Weiergraber O.H., Senin I.I., Philippov P.P., Koch K.-W. One of the Ca2+ binding sites of recoverin exclu sively controls interaction with rhodopsin kinase. Biol. Chem. 2005;

v. 386 (3);

p. 285 289.

6. Чурюмова В.А., Комолов К.Е., Сенин И.И., Филиппов П.П., Koch K.-W. Роль Са2+ связывающих центров рековерина в Са2+-зависимой регуляции родопсинкиназы.

Тезисы докладов международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сиг нализация», Пущино, 6 – 9 июня, 2005, с. 220-222.

7. Чурюмова В.А., Сенин И.И., Hоeppner-Heitmann D., Тихомирова Н.К., Филиппов П.П., Koch K-W. Изучение влияния содержания холестерина в составе фоторецеп торных мембран на процесс фосфорилирования родопсина, катализируемый ро допсинкиназой. Тезисы докладов XVIII международной зимней молодежной науч ной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотех нологии». Москва, 7 – 10 февраля, 2006, с.70.

8. Weiergraber O.H., Senin I.I., Zernii E.Y., Churumova V.A., Kovaleva N.A., Nazipova A.A., Permyakov S.E., Permyakov E.A., Philippov P.P., Granzin J., Koch K.-W. Tuning of a neuronal calcium sensor. J. Biol. Chem. 2006;

v. 281 (49);

p. 37594-37602.

9. Senin I.I., Churumova V.A., Philippov P.P., Koch K.-W. Membrane binding of the neu ronal calcium sensor recoverin - modulatory role of the charged carboxy-terminus. BMC Biochem. 2007;

v. 22;

p. 24.

10. Komolov K.E., Senin I.I., Kovaleva N.A., Christoph M., Churumova V.A., Grigoriev I.I., Philippov P.P., Koch K.-W. Mechanism of rhodopsin kinase regulation by recov erin. 13th International conference on retinal proteins. Barcelona, June 15 – 19, 2008, p.

101.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.