авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Активность промотора гена фитохелатинсинтазы риса и псевдофитохелатинового гена в модельных трансгенных растениях табака

На правах рукописи

Постригань Богдан Нилович

Активность промотора гена фитохелатинсинтазы риса и

псевдофитохелатинового гена в модельных трансгенных

растениях табака

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Уфа-2009

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Доктор биологических наук, профессор

Научный руководитель Чемерис Алексей Викторович Доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Шакирова Фарида Миннихановна Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Кандидат биологических наук Самигуллин Тагир Халафович Отдел эволюционной биохимии НИИ физико химической биологии им.А.Н.Белозерского МГУ

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН (СИФИБР СО РАН).

Защита состоится «»_200_г. в «_» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133. при ИБГ УНЦ РАН по адресу: Уфа, пр. Октября,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН(Уфа, пр. Октября, 71) и на сайте ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru/dissov.html e-mail: molgen@anrb.ru Автореферат разослан «_»200г.

Ученый секретарь диссертационного совета Бикбулатова С.М.

Актуальность работы. Одной из наиболее актуальных проблем нескольких последних десятилетий является неизбежно нарастающее техногенное загрязнение окружающей среды, в частности, тяжелыми металлами. В этой связи, во всём мире уделяется значительное внимание проблеме устойчивости растений к тяжелым металлам, поскольку они являются опасными экотоксикантами. В настоящий момент используют механические, химические и биологические способы очистки загрязненных территорий. Однако общепринятые технологии рекультивации земель требуют больших капиталовложений, и могут сопровождаться возникновением нежелательных побочных эффектов (Raskin, Ensley, 2000;

Mulligan et al., 2001;

Alkorta et al., 2004;

Ghosh, Singh, 2005;

Van Slycken et al., 2009). В связи с этим, для очистки и стабилизации загрязненных участков довольно привлекательным выглядит применение растений для так называемой "фиторемедиации" (Pilon-Smits, 2005). При этом стоимость всего комплекса мероприятий по очистке снижается, а какой-либо дополнительный ущерб окружающей среде отсутствует. В природе существуют естественные растения-аккумуляторы, которые способны накапливать тяжелые металлы в высоких концентрациях. Однако, чаще всего, они растут медленно и имеют низкую биомассу. В последнее время разрабатываются различные подходы, обеспечивающие повышение эффективности фиторемедиационных мероприятий путем увеличения скорости роста и накопления биомассы растений-гипераккумуляторов, в основном, при помощи генно-инженерных приемов, таких как, например, введение генов, кодирующих признаки, характерные для растений-гипераккумуляторов (Nagata at al., 2009). Одним из таких признаков является способность к синтезу металл-связывающих пептидов – так называемых фитохелатинов с общей структурой ( GluCys)nGly, где n = 2—11, (Clemens et al., 1999;

Vatamaniuk et al., 2000). При создании растений, пригодных для использования в фиторемедиации, видится перспективным использование регуляторных элементов генов фитохелатинсинтаз, их кодирующей части, а также синтетических “псевдофитохелатиновых” генов, непосредственно кодирующих фитохелатины с несколько измененной структурой, характеризующейся отсутствием -связи глутамина в силу матричной природы их синтеза.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования явилось создание модельных трансгенных растений табака, несущих полноразмерный и делеционный вариант промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса, псевдофитохелатиновый ген и изучение экспрессии этих конструкций в трансгенных растениях.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

Разработать эффективные методы оценки экспрессии эукариотических 1.

генов с помощью технологии циклирующей пробы и ПЦР-РВ в присутствии РНКазы Н.

Создать на основе клонированной последовательности промотора 2.

фитохелатинсинтазы риса генно-инженерные конструкции в векторе pCAMBIA 1291Z с маркерным геном GUS под контролем клонированного промотора.

Путем агробактериальной трансформации создать трансгенные растения 3.

табака, несущие промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса, определить ее границы делеционным анализом и провести количественную оценку транскрипционной активности промотора фитохелатинсинтазы риса.

Сконструировать олигонуклеотиды для создания минтетического 4.

псевдофитохелатинового гена с последующим клонированием его в бинарном векторе pCAMBIA 1305.1.

Создать трансгенные растения табака, содержащие 5.

псевдофитохелатиновый ген, и оценить сравнительную устойчивость таких растений к тяжелым металлам.

Научная новизна. Разработаны, и на примере гена фитохелатинсинтазы риса опробованы, два новых подхода к определению и оценке экспрессии безынтронных эукариотических генов, применимых также для анализа экспрессии генов, для которых отсутствует точная информация об интронах.



Впервые созданы трансгенные растения табака, несущие генетическую конструкцию на основе промотора фитохелатинсинтазы риса и его делеционного варианта в рамках системы гетерологической экспрессии, в которых промоторная область одного вида растения функционирует в другом. Проведен количественный анализ экспрессии промотора фитохелатинсинтазы и его делеционного варианта в трансгенных растениях табака. Сконструированы олигонуклеотиды, на основе которых создан псевдофитохелатиновый ген, кодирующий фитохелатины матричного синтеза или псевдофитохелатины с последовательностью аминокислот Созданы трансгенные растения, продуцирующие Met(-GluCys)4Gly.

псевдофитохелатины, повышающие устойчивость растений к тяжелым металлам. Проведена оценка устойчивости к кадмию трансгенных растений табака, экспрессирующих псевдофитохелатины.

Практическая значимость. Создание трансгенных растений, способных накапливать без ущерба для своего развития значительные количества тяжелых металлов, связанных псевдофитохелатинами, и таким образом способствовать их выведению из почвы, позволит осуществлять очистку загрязнённых территорий, где уровень неорганических экотоксикантов особенно высок. Исследование промотора фитохелатинсинтазы риса служит отправным этапом для создания трансгенных растений в тех случаях, когда необходима не конститутивная, а индуцибельная экспрессия, например при возможной токсичности псевдофитохелатинов с большим числом повторяющихся мотивов ( GluCys)n.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2006), на Школе-семинаре молодых ученых «Биомика-наука XXI века» (Уфа, 2007), молодежной научной школе конференции «Современные методы и подходы в биологии и экологии»

(Уфа, 2008).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 23 рисунка и 2 диаграммы, и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка литературы, включающего 161 источник.

Конкурсная поддержка работы. Исследования выполнены в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ НШ 1003.2006.4, НШ-649.2008.4 и Государственного контракта 02.740.11. Федеральной целевой программы Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы.





ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом исследований был выбран рис ввиду Oryza sativa относительной легкости манипуляуций c его небольшим геномом, кроме того, он почти полностью секвенирован. Эксперименты проводились с промотором гена фитохелатинсинтазы риса и искусственно сконструированным псевдофитохелатиновым геном. В работе использованы следующие методы. Выделение ДНК из растительного материала осуществляли фенольно-детергентым методом (Graham, 1978);

выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного и мягкого лизиса с некоторыми модификациями, РНК выделяли тризоловым методом.

Количество и качество выделенных препаратов проверяли аналитическим электрофорезом в агарозных и полиакриламидных гелях. Рестрикционное расщепление ДНК проводили в буферах, рекомендованных фирмами поставщиками. ПЦР «по конечной точке» проводили в ДНК–амплификаторе производства компании с использованием «ДНК–технология» Taq– полимеразы. Для клонирования продуктов амплификации промотора фитохелатинсинтазы риса использовали фагмидные вектора pGEM-T и pAL Экспрессионные конструкции на основе промотора гена TA.

фитохелатинсинтазы риса создавались в бинарном векторе pCAMBIA 1291Z;

псевдофитохелатинового гена - в векторе pCAMBIA 1305.1. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе «ABI PRISM 310 Genetic Analyzer» (Applied Biosystems, США). В ходе трансформации генно инженерных конструкций использовались компетентные клетки E.сoli и A.tumefaciens. Экспрессию гена фитохелатинсинтазы риса оценивали при помощи технологии циклирующей пробы и ОТ-ПЦР с FRET эффектом на платформе «УФА» в присутствии РНКазы Н. Регистрацию флоуресценции проводили в ДНК амплификаторе с оптическим модулем iCycler iQ (Bio-Rad, США). Трансгенные формы табака получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков (Horsch et al., 1985). Визуально активность -глюкуронидазы (GUS) определяли гистохимически. Флуориметрическое определение активности (GUS) в клеточных экстрактах проводили по методу, описанному Jefferson (1987). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ пакета Lasergene фирмы «DNASTAR, Inc.» (США).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1. Оценка активности промотора гена фитохелатинсинтазы риса.

Поскольку целью работы было изучение способности к индукции тяжелыми металлами промотора фитохелатинсинтазы риса, его индуцибельности и пригодности для фиторемедиации, была поставлена задача исследовать его активность в естественных условиях стресса, обусловленного воздействием тяжелых металлов на нетрансгенные растения риса Oryza sativa сорта Лиман. Для экспериментов использовались недельные проростки, которые обрабатывались кадмием (0,02 г/л, 0,002 г/л) в течение одного часа. C целью создания комплексной и оптимальной системы оценки экспрессии гена фитохелатинсинтазы риса (которая может быть применена и для прочих эукариотических генов) нами разработано два независимых подхода, основанных на эффекте гашения флуоресценции и эффекте переноса флуоресцентной резонансной энергии (FRET) (рис. 1).

А Б Рис. 1. Схема определения экспрессии гена фитохелатинсинтазы риса при помощи технологии циклирующей пробы (А) и механизм протекания ПЦР-РВ с переносом флуоресцентной резонансной энергии между донорным (FAM) и акцепторным (ROX) красителями на платформе «УФА» (Б).

Первый подход предполагал применение технологии циклирующей пробы (ТЦП) с расщеплением химерных ДНК-РНК-ДНК зондов, отжегшихся на кДНК–матрице при помощи фермента рибонуклеазы Н в – изотермических условиях в режиме реального времени (рис.1 А).

Для определения экспрессии гена фитохелатинсинтазы был также применен второй метод - ПЦР-РВ на платформе “УФА” (Чемерис с соавт., 2005) со сближенным расположением праймеров, образующих короткие ампликоны (рис. 1 Б). Принципиальным моментом здесь также является использование термостабильной РНКазы Н, которая в первом цикле разрушает исходную цепь РНК и делает построенную на ней кДНК пригодной для отжига второго праймера, минуя стадию высокотемпературной денатурации. В дальнейшем денатурация коротких ампликонов производится при минимально достаточной для этого температуре, полностью исключая тем самым вклад геномной ДНК (рис. 2).

А Б Рис. 2. Результаты амплификации ПЦР-РВ по определению экспрессии гена фитохелатинсинтазы риса.

А - Накопление флуоресцентного сигнала в ходе ТЦП-определения.

1, 2 – образцы, обработанные кадмием в концентрации 0,02г/л;

3, 4 – образцы, обработанные кадмием в концентрации 0,002 г/л;

5, 6 – необработанные растения.

Б - ПЦР-РВ с FRET-эффектом. 1 - контрольные растения, без обработки кадмием, 2, 3 – образцы, обработанные кадмием в концентрации 0,02г/л;

4, 5 – образцы, обработанные кадмием в концентрации 0,002 г/л;

6 – отрицательный контроль.

Преимущество первого метода заключалось в том, что процесс идет в изотермическом режиме, этим обуславливается уменьшение скорости дезактивации ферментов и увеличение скорости анализа за счет того, что не происходит затрат времени на циклические изменения температур в реакционном блоке. Однако при всем удобстве и универсальности данного подхода у него имеется существенный недостаток невысокая чувствительность при низкой концентрации кДНК матрицы, и, несмотря на отсутствие стадий изменения температур, относительно большая длительность процесса.

Второй метод характеризуется повышенной чувствительностью даже при низких концентрациях кДНК матрицы, но здесь необходимым этапом является построение кривых плавления. Вместе с тем, в данных экспериментах не стояла задача количественного определения уровня экспрессии этого гена, и анализ носил качественный характер. Обе методики давали схожие результаты, при этом наглядно прослеживался индуцибельный характер активности фитохелатинсинтазного гена при воздействии кадмием.

Клонирование и секвенирование промотора фитохелатинсинтазы риса.

В соответствии с поставленными задачами в результате поиска по базе данных была найдена полная последовательность гена GenBank фитохелатинсинтазы риса. Была идентифицирована предполагаемая промоторная зона, располагающаяся между концом предыдущего гена и началом кодирующей части гена фитохелатинсинтазы, суммарная длина которой составила 900 п.н. К данной промоторной области были подобраны соответствующие праймеры, и продукты амплификации были клонированы в векторе pGEM-T и затем секвенированы (рис. 3).

А Б Рис. 3. Результаты клонирования и секвенирования предполагаемой промоторной области фитохелатинсинтазы риса.

А. Электрофоретический анализ плазмид, предположительно несущих вставку промотора фитохелатинсинтазного гена.

1 - контроль (плазмида pGEM-T, не содержащая вставок);

2, 3, 4 – ДНК рекомбинантных колоний E.coli.

Б. Фрагмент последовательности клонированной промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса в сравнении с последовательностью данного участка генома риса, приведенной в базе данных GenBank.

Из рисунка 3 Б следует, что клонированная и секвенированная промоторная область гена фитохелатинсинтазы гомологична с последовательностью, приведенной в базе данных GenBank.

Создание экспрессионной конструкции на основе промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса.

Для изучения работы клонированной промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса использовали специально разработанную фирмой Cambia (Австралия) векторную систему, предназначенную для оценки активности промоторов в трансгенных растениях pCAMBIA 1291Z.

Полилинкер этого вектора содержит недостаточно сайтов рестрикции, необходимых для клонирования в него исследуемой промоторной области из вектора pGEM-T, поэтому промоторную последовательность предварительно субклонировали в вектор pAL-TA, имеющий более удобный для работы полилинкер. Поиск клонов, содержащих вставку промоторной области, проводили при помощи агарозного гель-электрофореза и ПЦР. Наличие вставки промоторной последовательности в выбранных клонах после электрофоретического анализа было подтверждено амплификацией и рестрикцией, в ходе которой по сайту EcoRI выщеплялся фрагмент, соответствующий длине промоторной области гена фитохелатинсинтазы (Рис. 4).

Рис. 4. Рестрикционный анализ клонов, содержащих промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса в векторе pCAMBIA1291Z.

1 - маркер, амплификат промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса 2, 3 - ДНК исследуемых клонов после рестрикции EcoRI.

Затем вектор pCAMBIA1291Z, несущий промоторную область гена фитохелатинсинтазы, был клонирован в агробактерии Agrobacterium tumefaciens штамма AGLO. В полученной генетической конструкции под контролем промоторной последовательности гена фитохелатинсинтазы риса находился маркерный ген GUS, по экспрессии которого возможно судить об индукции данной промоторной области.

Создание трансгенных растений табака, несущих промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса, и ее экспрессия в них.

Для оценки работы промоторной последовательности гена фитохелатинсинтазы риса требуется создание серии трансгенных модельных растений, содержащих эту последовательность в составе векторной конструкции. Таким требованиям удовлетворяют растения табака Nicotiana tabaccum линии SR1, предназначенные специально для генно-инженерных целей. После агробактериальной трансформации листовых пластинок табака нами проводилась селекция полученных эксплантов, c использованием среды, содержащей антибиотик гигромицин, а затем в этих эксплантах на четвертой неделе селекции была визуально гистохимически выявлена активность маркерного гена GUS в генетической конструкции при индукции 200 и 300 мкМ кадмия (рис.5).

200 мкМ Cd2+ 300 мкМ Cd2+ контроль Рис. 5. Гистохимический анализ GUS-активности эксплантов табака, обработанных кадмием.

Для количественных спектрофотометрических и флуорометрических измерений использовались растения месячного возраста. При этом фенотипически схожие растения делились на две группы, одна группа растений обрабатывалась Cd2+ в концентрации 200 мкМ, другая - 400 мкМ.

Для каждой группы имелись контрольные растения без обработки.

Обработку растений кадмием проводили в течение 6 суток. Из опытных и контрольных растений был выделен тотальный белок, в котором проводилось измерение содержания -глюкуронидазы с помощью субстрата по флуоресценции 4-MUG (4-метилумбеллиферил--D-глюкуронид) продукта реакции 4-MU (4-метилумбеллиферон). Измерения проводили на спектрофлуориметре после 0,5 и 1 часа работы фермента. Результаты были выражены в пкмоль 4-MU мин-1мг-1 белка (рис. 6).

Рис. Зависимость величины экспрессии промотора 6.

2+ фитохелатинсинтазы риса от концентрации индуктора Cd с учетом времени ферментативного действия, P 0,95.

Конститутивная активность маркерного гена GUS в контрольных образцах была низкой и составляла при 200 мМ Cd2+ - 23 и 40 пкмоль 4-MU мин-1мг-1 через 30 и 60 минут, соответственно, и при 400 мМ Cd2+ - 38 и пкмоль 4-MU мин-1мг-1, что свидетельствует об индуцибельном характере работы промоторной области фитохелатинсинтазы риса в трансгенных растениях табака. При этом, хотя и наблюдались различия при разных концентрациях индуктора, они были невелики, что можно объяснить особенностями функционирования данного промотора или несущественным увеличением его активности при очень больших концентрациях индуктора, как в эксперименте с 400 мкМ Cd2+. При этой концентрации практически не наблюдалось различий и по времени ферментативного действия. Но при воздействии 200 мкМ Cd2+, некоторое увеличение активности промотора происходит и в заданных промежутках времени. Такой эффект предположительно должен проявиться заметнее, при снижении концентрации индуктора, однако для данной работы были выбраны такие концентрации кадмия, при которых априори обязательно имела бы место уверенная индукция в случае принципиального наличия таковой для анализируемой генетической системы.

Такой характер индукции промотора фитохелатинсинтазы был подтвержден и на уровне РНК, постановкой ПЦР-РВ с переносом резонансной энергии флуоресценции с использованием праймеров, фланкирующих единственный интрон гена GUS, и несущих флуоресцентные метки FAM и ROX (рис. 7).

Рис. 7. ПЦР-РВ с переносом флуоресцентной резонансной энергии.

1 - отрицательный контроль 2 – контрольные образцы растений (без обработки) 3, 4 – образцы, обработанные 200 мкМ Cd2+ 5, 6 - образцы, обработанные 400 мкМ Cd2+.

В основе полученных результатов могут лежать ряд причин, например, особенности активности данного промотора в исследуемых растениях, которые зависят от геномного окружения сайта встраивания. Немаловажную роль играет первоначальная затравочная активность промотора, когда в клетке содержится некоторое количество РНК, что ускоряет реакцию растения на воздействие тяжелыми металлами, но эта активность не является конститутивной, ввиду того, что по достижении определенной концентрации РНК постоянная (базовая) работа промотора прекращается, и он становится практически полностью индуцибельным. Таким образом, результаты проведенных экспериментов позволяют сделать вывод, что регуляторные элементы промотора находятся в пределах этой последовательности размером 900 п.н., и их выявление требует создания трансгенных растений, несущих делеционные варианты промотора.

Создание делеционного варианта промотора фитохелатинсинтазы риса и его экспрессия в трансгенных растениях табака.

Наиболее простым, надежным и удобным способом создания делеционного варианта является использование эндонуклеаз рестрикции и выщепление с их помощью небольших последовательностей от концов промоторной последовательности. Нас интересовали сайты узнавания уникальных гексануклеотидных рестриктаз, с непременным условием их наличия в полилинкере вектора pCAMBIA1291Z. Этим требованиям удовлетворяла рестриктаза PstI, при действии которой от 5-конца промоторной области вырезался фрагмент размером 189 п.н., с образованием последовательности, несущей предполагаемую промоторную область длиной 711 п.н. Затем генетическая конструкция, содержащая делеционный вариант промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса, была перенесена в агробактерии штамма AGLO с последующей трансформацией листовых пластинок табака. После получения и селекции серии трансгенных растений табака был произведен сравнительный гистохимический анализ растений, несущих генетическую конструкцию до положения -900п.н. промоторной последовательности и с делеционными вариантами до положения -711п.н.

(рис. 8). В результате эксперимента растения, несущие делеционный вариант промотора фитохелатинсинтазы, также окрашивались, как и в случае с последовательностью -900п.н. Предположительно, удаление на 5-конце фрагмента размером 189 п.н. могло не затронуть важных элементов промоторной области гена фитохелатинсинтазы, поскольку эта последовательность, согласно базе данных начиналась GenBank, непосредственно от предыдущего гена.

А Б контроль 200 мкМ 400 мкМ Рис. 8. Сравнительный гистохимический анализ активности гена глюкуронидазы в трансгенных растениях табака, несущих полную (А), и делеционную (Б) последовательность промотора фитохелатинсинтазы.

На основании данного предположения, экспрессионная активность делеционного варианта промотора фитохелатинсинтазы риса была также измерена флуориметрически по экспрессии маркерного гена GUS, как описано выше для полноразмерного промотора. Сравнительные результаты по экспрессии полной последовательности промотора и его делеционного варианта представлены на рис. 9. -711п.н. делеционный вариант промотора фитохелатинсинтазы риса показал аналогичные его полноразмерному аналогу параметры в зависимости от времени воздействия и концентрации кадмия при обработке. Однако «сила промотора» была даже несколько выше, что, скорее всего, объясняется удалением при создании делеционного варианта последовательностей, несущественных для «балластных»

проявления активности истинного промотора.

Рис. 9. Сравнение активности «полноразмерной» и делеционной последовательности промотора фитохелатинсинтазы риса по активности репортерного гена GUS.

Конструирование, клонирование и экспрессия псевдофитохелатинового гена.

Природные фитохелатины, продуцируемые растениями, имеют общую структуру (-GluCys)n–Gly, что говорит о их нематричной природе, благодаря наличию -связи и, таким образом, они не являются первичными генными продуктами, а синтезируются ферментативным путем. Кроме того, известно, что в фитохелатинах основную нагрузку по связыванию тяжелых металлов выполняют повторяющиеся мотивы через (GluCys) комплексообразование. Проведенный анализ литературы показал, что не имеется каких-либо серьезных препятствий для создания и функционирования в растениях таких генов, а также для существования самих псевдофитохелатинов с обобщенной формулой Met(-GluCys)nGly (где n - количество повторяющихся мотивов (GluCys). Так, нами выбор был остановлен на варианте псевдофитохелатина со следующей последовательностью аминокислот: Met(-GluCys)4Gly, и с учетом частот встречаемости тех или иных кодонов в растениях была воссоздана его нуклеотидная последовательность. Для конструирования и клонирования этого гена были синтезированы соответствующие комплементарные друг другу олигонуклеотидные блоки протяженностью по 64 нуклеотида каждый.

В состав формирующегося таким образом двуцепочечного фрагмента ДНК, помимо 10-ти кодирующих триплетов, входил также терминирующий кодон Последовательности олигонуклеотидов c целью направленного TAG.

клонирования в бинарном векторе pCAMBIA1305.1 по сайтам узнавания рестрикционных эндонуклеаз NcoI и PmlI были составлены таким образом, что при их отжиге и формировании двуцепочечной молекулы на 5’-конце возникал выступающий “липкий” конец CATG, а другой конец был “тупой”., В этом векторе экспрессия псевдофитохелатинового гена должна происходить под управлением вирусного конститутивного 35S промотора вместо маркерного гена GUS. На рис. 10 представлены результаты электрофоретического анализа ДНК полученных клонов.

Рис. 10. Электрофореграмма ДНК клонов, предположительно несущих вставку псевдофитохелатинового гена.

1 - маркер, вектор pCAMBIA1305.1, 2-9 - образцы, взятые для дальнейшего анализа.

В ДНК выбранных клонов наличие вставки псевдофитохелатинового гена выявляли при помощи ПЦР с праймерами, ограничивающими как саму вставку, так и прилегающие к вставке участки вектора.

Создание трансгенных растений, несущих псевдофитохелатиновый ген и его экспрессия в них.

После подтверждения наличия целевой вставки, плазмидами из выбранных клонов были трансформированы агробактерии штамма AGLO.

Затем была проведена трансфекция листовых пластинок табака. В этом случае детекция трансгенных растений была затруднена в связи с отсутствием маркерного гена GUS и велась длительное время на среде с антибиотиком гигромицином. Кроме того, наличие псевдофитохелатинового гена, встроенного в геном растений, проверялось амплификацией с хромосомной ДНК предположительно трансгенных и контрольных растений с тем же комплектом праймеров, как и при определении содержания вставки этого гена в бактериальных клонах (рис. 11).

Рис. 11. Электрофоретический анализ наличия в трансгенных растениях псевдофитохелатинового гена с использованием фланкирующих его праймеров.

1 - маркер, плазмида pBluescript, обработанная рестриктазой HpaII, 2 - отрицательный контроль, ДНК нетрансгеннного табака, 3 – ДНК предположительно трансгенного растения, не содержащего искомого гена, 4, 5 - трансгенные растения табака, содержащие псевдофитохелатиновый ген.

Для оценки уровня экспрессии псевдофитохелатинового гена в растениях табака, листовые пластинки выращивали на среде, содержащей различные концентрации кадмия. Были выбраны концентрации в 100, 200, 300, 400 мкМ Cd2+. Эксперимент проводили в течение месяца, в каждой группе с заданной концентрацией имелись опытные и контрольные растения.

Нами была произведена оценка реакции растений на сам псевдофитохелатин в виде пептида (постоянные высокие концентрации его предположительно могли быть токсичными для растения), их выживаемости в условиях жесткого и экстремального токсического стресса, вызванного воздействием тяжелых металлов, а также особенности роста и развития. Наиболее значимые результаты были получены в эксперименте с 200 мкМ кадмия. На рис. 12 видно, что рост контрольных растений заметно подавлен (слева), тогда как у трансгенных начинается рост и дифференцировка (справа).

контроль трансгенные растения Рис. 12. Воздействие кадмия (200 мкМ) на контрольные и трансгенные растения.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов могут свидетельствовать о том, что в исследуемых модельных трансгенных растениях табака заметно повышалась устойчивость к кадмию, благодаря активно функционирующему псевдофитохелатиновому гену, находящегося под контролем вирусного конститутивного промотора 35S.

Выводы Показана эффективность методов оценки экспрессии эукариотических 1.

генов с помощью технологии циклирующей пробы и ПЦР-РВ в присутствии РНКазы Н при определении индукции промотора фитохелатинсинтазы риса в растениях Oryza sativa.

На основе клонированной последовательности промотора 2.

фитохелатинсинтазы риса созданы экспрессируемые конструкции в векторе pCAMBIA 1291Z, в которых под контролем данного промотора находится маркерный ген -глюкуронидазы GUS.

Созданы трансгенные растения табака, несущие промоторную область 3.

гена фитохелатинсинтазы риса и показано, что регуляторные элементы находятся в пределах исследуемой промоторной последовательности гена фитохелатинсинтазы риса, при этом транскрипционная активность промотора носит индуцибельный характер при воздействии различных концентраций кадмия.

Обнаружено, что трансгенные растения табака, содержащие 4.

делеционный вариант промоторной последовательности до положения - п.н. от старт-кодона гена фитохелатинсинтазы риса, содержат достаточные для транскрипции регуляторные элементы.

Созданы генно-инженерные конструкции на основе бинарного вектора 5.

pCAMBIA 1305.1, содержащие псевдофитохелатиновый ген.

Показано, что полученные трансгенные растения табака, содержащие 6.

псевдофитохелатиновый ген, кодирующий пептид Met(GluCys)4Gly, обладают повышенной устойчивостью к действию тяжелых металлов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Постригань Б.Н. Клонирование промотора и кодирующей части гена фитохелатинсинтазы риса Oryza sativa // Материалы конференции молодых ученых «Ломоносов». Т. IV – М.: Изд-во МГУ, 2006.

2. Постригань Б.Н., Князев А.В., Чемерис А.В. Индукция промотора фитохелатинсинтазы риса и экспрессия псевдофитохелатинового гена в модельных трансгенных растениях табака и перспективы их применения для фиторемедиации загрязненных тяжелыми металлами почв // Аграрная Россия. – 2009. – спец. выпуск. - С. 129-130.

3. Гарафутдинов Р.Р., Никоноров Ю.М., Чемерис Д.А., Постригань Б.Н., Чубукова О.В., Талипов Р.Ф., Вахитов В.А., Чемерис А.В. Новые способы генерации сигнала флуоресценции при анализе однонуклеотидных замен с помощью химерных гибридизационных зондов в реальном времени // Биоорганическая химия. – 2009. – Т.35, № 5. – С. 665-673.

4. Постригань Б.Н., Яхин О.И. Применение ПЦР-РВ, основанной на эффекте FRET, на платформе “УФА” для детекции экспрессии эукариотических генов // Мат. школы-конференции «Биомика-наука XXI века». - Уфа – 2007.

5. Матниязов Р.Т., Князев А.В., Чемерис Д.А., Постригань Б.Н., Чемерис А.В.

Надежное подтверждение произошедшего трансгеноза при получении трансгенных растений с помощью агробактериальной трансформации // Материалы Школы-семинара молодых ученых УНЦ РАН и Волго Уральского региона по физико-химической биологии "Биомика-наука XXI века", г. Уфа, 2007., С.89-91.

6. Матниязов Р.Т., Гималов Ф.Р., Чемерис Д.А., Никоноров Ю.М., Вахитов В.А., Чемерис А.В., Магданов Э.Г., Постригань Б.Н., Князев А.В. Способ детекции в режиме реального времени специфичных фрагментов РНК с помощью полимеразной цепной реакции без применения ДНКазы // Заявка на патент РФ № 2007138956 с приоритетом от 22 октября 2007 г.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.