авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Гены микрорнк, подверженные метилированию в опухолях легкого и толстой кишки, и их диагностическое значение

На правах рукописи

РЫКОВ СЕРГЕЙ ВИКТОРОВИЧ

Гены микроРНК, подверженные метилированию в

опухолях легкого и толстой кишки, и их

диагностическое значение

03.01.03 "Молекулярная биология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2013

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИ генетика»)

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор, ФГУП «ГосНИИ генетика», г. Москва Брага Элеонора Александровна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, г. Москва Лебедев Юрий Борисович Доктор биологических наук, профессор, ФГБУН «Институт молекулярной генетики» РАН, г. Москва Сломинский Петр Андреевич

Ведущая организация: ФГБУН «Институт биологии гена» РАН, г.Москва

Защита состоится «28» мая 2013 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика».

Реферат разослан « » апреля 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, Т. Л. Воюшина кандидат химических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В развитых странах онкологические заболевания занимают второе место в структуре смертности, сменив инфекционные заболевания. Рак легкого стоит на третьем месте по заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей, как в мире, так и в России (Мукерия и Заридзе, 2010). На немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) приходится 85-87% всех мировых случаев выявления новообразований.

Пятилетняя выживаемость при диагностике на I-II стадии составляет 57-67%, на III - 5-25% и на IV - менее 1%.

Рак толстой кишки (РТК) в России является чрезвычайно насущной проблемой, занимая четвертое место в структуре женской онкологической заболеваемости (~10 % в 2011 году в России) и пятое место (5.8% в 2011 году в России) в структуре мужской заболеваемости (Чиссов и др., 2012). Тяжесть заболевания и низкая выживаемость при раке толстой кишки связаны, прежде всего, с поздним выявлением опухоли. Так, при первичном обращении пациентов к врачу запущенные формы рака (III-IV стадии) диагностируются у 71% больных. Пятилетняя выживаемость больных РТК при выявлении заболевания на I стадии составляет 96%, на II - 87%, на III - 55% и на IV только 5%.

Аномальное функционирование и измененный профиль экспрессии генов, контролирующих клеточный цикл, апоптоз и дифференцировку, являются ключевым свойством злокачественного процесса (Hanahan and Weinberg, 2010). Исследования последних лет показывают, что эпигенетические нарушения (метилирование ДНК и модификации гистонов), в совокупности с генетическими изменениями, составляют комплекс механизмов, ответственных за формирование фенотипа трансформированной клетки (Godfrey et al., 2007). Изменение степени метилирования ДНК происходит при различных патологиях и характерно для онкологических заболеваний, при которых на фоне глобального деметилирования генома происходит избирательное гиперметилирование промоторов генов, проявляющих опухоль супрессорные свойства (Jones and Baylin, 2007).

МикроРНК относятся к классу малых некодирующих РНК длиной 19- нуклеотида, выполняющих функцию посттранскрипционного регулятора экспрессии целевых генов (Макарова и Крамеров, 2007). Показана важная роль дифференциальной экспрессии генов микроРНК в процессах злокачественной трансформации, причем профили экспрессии микроРНК носят опухоль специфичный характер (Melo and Esteller, 2011).

Экспрессия генов микроРНК также подвержена регуляции посредством метилирования CpG-динуклеотидов в составе CpG-островков, перекрывающих промоторные участки генов (Lopez-Serra and Esteller, 2012). Следует отметить, что для генов микроРНК метилирование является более характерным эпигенетическим механизмом подавления экспрессии, чем для белок кодирующих генов. Так, 11,5% всех генов микроРНК подвержены регуляции посредством метилирования (122 из 1048 генов микроРНК по состоянию на 2011 год), для белок-кодирующих генов этот показатель составляет 1-2% (Kunej et al., 2011).

Цель работы. Целью данной работы явилось изучение вовлеченности метилирования CpG-островков, перекрывающих промоторные участки генов микроРНК в патогенез НМРЛ и РТК и оценка диагностических качеств панелей маркеров на основе исследованных генов.

Задачи исследования.

1. Исследовать статус и частоту метилирования CpG-островков 14 генов микроРНК: mir-9-1, mir-9-3, mir-34b/c, mir-107, mir-124a3, mir-125b1, mir-130b, mir-137, mir-129-2, mir-193a, mir-203, mir-212, mir-375 и mir-1258 на представительной выборке клинических образцов первичных опухолей и гистологически нормальной ткани легкого пациентов с НМРЛ и ткани легкого доноров без онкопатологий.

2. Исследовать статус и частоту метилирования CpG-островков семи генов микроРНК mir-9-1, mir-9-3, mir-34b/c, mir-129-2, mir-193a, mir-203 и mir-212 на представительной выборке клинических образцов опухолей и гистологически нормальной ткани толстой кишки пациентов с РТК и ткани толстой кишки доноров без онкопатологий.



3. Исследовать корреляции между частотой метилирования изучаемых генов и клинико-патологическими свойствами первичных опухолей РТК и НМРЛ, а также их подтипов.

4. Разработать на основе полученных данных о частотах метилирования группы генов микроРНК панели молекулярных маркеров для ранней диагностики опухолей легкого и толстой кишки.

Научная новизна. В результате проведенного исследования опухоль специфичное метилирование CpG-островков, перекрывающих регуляторные участки генов микроРНК, при НМРЛ впервые выявлено для генов: mir-125b1, mir-129-2, mir-212, mir-375 и mir-1258. Кроме того, впервые исследовано метилирование гена mir-137 на клиническом материале опухолей НМРЛ и определена частота метилирования CpG-островка этого гена в первичных опухолях легкого. Впервые показано отсутствие метилирования CpG-островков при НМРЛ генов mir-130b и mir-107. Выявлено специфичное метилирование CpG-островка гена mir-1258 при НМРЛ, что представляет первое сообщение о вовлеченности метилирования гена mir-1258 в процесс онкогенеза. Впервые показано специфичное метилирование гена mir-9-3 на клиническом материале первичных опухолей РТК.

Впервые выявлена статистически значимая ассоциация частоты метилирования CpG-островка гена mir-125b1 с со стадией НМРЛ (P=0,036) и наличием метастазов в региональных лимфоузлах (P=0,0496). Впервые выявлена статистически значимая ассоциация частоты метилирования CpG островка гена mir-137 со стадией НМРЛ (P=0,023).

Составлены оригинальные системы маркеров метилирования, позволяющие с высокой чувствительностью и специфичностью различать опухолевую ткань НМРЛ и здоровую ткань легкого.

Теоретическая и практическая значимость. Идентифицированы новые гены микроРНК, подверженные аномальному метилированию при НМРЛ.

Показана высокая частота метилирования CpG-островков группы генов микроРНК при злокачественных новообразованиях легкого и толстой кишки.

Показана связь метилирования генов mir-125b1 и mir-137 с прогрессией НМРЛ.

Предложена система из 7 маркеров, которая позволяет с чувствительностью 81% и специфичностью 83% различить злокачественную опухоль НМРЛ от окружающей гистологически нормальной ткани легкого при обнаружении метилирования более чем в одном локусе из панели.

Предложенная система маркеров позволяет различить злокачественную опухоль пациентов с НМРЛ от ткани легкого человека без онкопатологий с чувствительностью 81% и специфичностью 95% при обнаружении метилирования более чем в одном локусе из панели.

Предложена система из 4 маркеров, которая позволяет с чувствительностью 82% и специфичностью 93% различить злокачественную опухоль РТК от окружающей гистологически нормальной ткани тостой кишки при обнаружении метилирования более чем в двух локусах из панели.

Предложенная система маркеров позволяет различить злокачественную опухоль пациентов с РТК от ткани тостой кишки человека без онкопатологий с чувствительностью 97% и специфичностью 78% при обнаружении метилирования более чем в одном локусе из панели.

Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» 28 марта 2013 г. Материалы работы были представлены на 7-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения 2011» (Санкт-Петербург, апрель, 2011), научной конференции «Актуальные проблемы онкогенетики» (Москва, октябрь, 2011), XV Российском онкологическом конгрессе (Москва, ноябрь, 2011).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации, 4 материала конференций, зарегистрирована заявка на патент.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего источников. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 32 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Выборка образцов. Парные образцы опухолевой и гистологически нормальной ткани получали в Отделе патологической анатомии опухолей человека НИИ Клинической Онкологии ГУ РОНЦ РАМН. Использовали ткани только тех больных, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию. Выборка включала 87 случаев: 48 случаев немелкоклеточного рака легкого и 39 случаев рака толстой кишки. Все случаи НМРЛ и РТК классифицированы клинически по системе TNM и типированы гистологически в отделе патоморфологии опухолей НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ РАМН. 20 образцов ткани легкого и 14 образцов ткани толстой кишки от постмортальные лиц, без выявленных онкопатологий (по данным анамнеза), были получены в патологоанатомическом отделе НИИ Скорой Помощи им.

Склифосовского. Далее постмортальные лица без онкопатологий в анамнезе будут обозначены как доноры.

Выделение геномной ДНК. Выделение геномной ДНК осуществляли по стандартному протоколу (Sambrook et al., 1989).

Бисульфитная конверсия ДНК. Бисульфитную конверсию геномной ДНК проводили по стандартному протоколу (Damman et al., 2000).

Метил-специфичная полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР). МС ПЦР проводили на бисульфит-конвертированной ДНК с праймерами, специфичными к метилированному и неметилированному аллелю. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, либо в 10% полиакриламидном геле. Для каждой пары праймеров проверяли отсутствие продукта ПЦР на неконвертированной ДНК. Конвертированную ДНК клеточной линии L-68 (“СибЭнзим”, Россия) использовали как контроль для неметилированных аллелей. В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования использовали конвертированную ДНК клеточной линии L-68, обработанную метилтрансферазой SssI (“СибЭнзим”, Россия).





Секвенирование продукта МС-ПЦР. Продукт МС-ПЦР наносили на 1,5 % агарозный гель и очищали с использованием QIAquick Gel Extraction Kit (“Qiagen”, Германия). Секвенирование проводили на секвенаторе SEQ (“Beckman-Coulter”, США) в Центре коллективного пользования в "ГосНИИ генетика".

Бисульфитное секвенирование. Бисульфитную конверсию образцов ДНК осуществляли набором EZ DNA Methylation Kit (“Zymo research”, США), амплифицировали, очищали с использованием Invisorb Spin DNA Extraction Kit (“Stratec molecular”, США), клонировали с помощью набора CloneJET PCR Cloning Kit (“Thermo Scientific”, США) и секвенировали клоны на приборе ABI 3730 (“Applied Biosystems”, США).

Статистическая обработка результатов. Расчет значимости различий между выборками выполняли с помощью точного критерия Фишера с применением программы AtteStat. При проведении ROC-анализа применяли программы MedCalc v.11.5 и AtteStat.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ На основании анализа биоинформационных баз данных и данных литературы были отобраны и экспериментально исследованы 14 генов микроРНК: mir-9-1, mir-9-3, mir-34b/c, mir-107, mir-124a-3, mir-125b1, mir-130b, mir-137, mir-129-2, mir-193a, mir-203, mir-212, mir-375 и mir-1258.

Экспериментальная часть включает исследование выборки парных образцов опухолей и гистологически нормальной ткани от пациентов с немелкоклеточным раком легкого и раком толстой кишки, а также образцов ткани тех же органов от доноров без онкопатологии в анамнезе. В качестве основного метода исследования использован метод метил-специфичной ПЦР (МС-ПЦР). Корректность результатов, полученных методом МС-ПЦР, проверена и подтверждена с применением метода бисульфитного секвенирования на примере генов mir-34b/c и mir-124a-3 в отдельных образцах НМРЛ. Анализ метилирования гена mir-34b/c выполнен прямым секвенированием продукта МС-ПЦР, а гена mir-124a-3 с помощью секвенирования предварительно полученных клонов бисульфит конвертированной ДНК.

2.1 Профиль метилирования генов микроРНК при НМРЛ Первичный скрининг перечисленных 14 генов микроРНК при НМРЛ был проведен на образцах опухолей и гистологически нормальной ткани легкого пациентов и ткани легкого 14 доноров без онкопатологии в анамнезе. По результатам первичного скрининга дальнейшее исследование генов mir-107 и mir-130b признано неперспективным, т.к. для этих генов показано практически полное отсутствие метилирования.

Анализ метилирования 12 генов микроРНК при НМРЛ выполнен на выборках, включающих от 39 до 46 парных образцов опухолей и гистологически нормальной ткани пациентов с НМРЛ и 20 образцов ткани легкого от доноров без онкопатологии.

При проведении МС-ПЦР, специфичной к неметилированному аллелю, продукт амплификации выявлен во всех анализированных образцах ДНК опухолей. Образование такого продукта при анализе ДНК первичных опухолей связывают, главным образом, с их загрязнением прилежащей гистологически нормальной тканью и наличием в опухолевом очаге клеток иммунной системы и ассоциированных фибробластов. Таким образом, наличие метилирования определяли по результатам МС-ПЦР с праймерами, специфичными к метилированным аллелям. Корректность результатов, полученных методом МС-ПЦР, проверена и подтверждена с применением секвенирования продукта МС-ПЦР локуса mir-34b/c. Карты CpG-островков, перекрывающих регуляторные районы генов микроРНК и положение соответствующих сайтов связывания праймеров показаны на примере четырех генов (mir-203, mir-212, mir-375 и mir-1258) на рис. 1.

На основании результатов анализа метилирования методом МС-ПЦР рассчитаны частоты метилирования 12 генов микроРНК при НМРЛ (39- случаев), в т.ч. ПРЛ (32 случая) и АД (16 случаев);

результаты анализа показаны графически на рис. 2, 3 и 4, отражая профили метилирования 12 генов микроРНК при НМРЛ, ПРЛ и АД.

Как следует из полученных данных частоты метилирования CpG островков 9-ти генов микроРНК (mir-9-1, mir-9-3, mir-34b/c, mir-124a3, mir 125b1, mir-129-2, mir-193a, mir-212, mir-375) в опухолях при НМРЛ достигают 46-63%. Статистически значимые различия (p0.05 по Фишеру) между частотами метилирования в образцах опухолей и гистологически нормальной ткани пациентов с НМРЛ установлены для 10-ти генов: mir-9-1, mir-9-3, mir 34b/c, mir-124a-3, mir-125b1, mir-137, mir-129-2, mir-212, mir-375 и mir-1258.

Рисунок 1. Локализация CpG-островков в промоторных регионах и дизайн праймеров для четырех генов микроРНК (mir-203, mir-212, mir-375 и mir-1258). Праймеры подобраны с помощью программ Primer Select (“DNAstar”, США) и MethPrimer Express (“Invitrogen”, США). Участок связывания включал от 4 до 7 CpG на пару праймеров и от 4 до 10 цитозиновых остатков, окружающих CpG-динуклеотиды.

MF/MR - прямой и обратный праймеры к метилированному аллелю;

UF/UR – прямой и обратный праймеры к неметилированному аллелю;

100 п.о. – масштаб.

Рисунок 2. Профиль метилирования 12 генов микроРНК в образцах опухолевой и гистологически нормальной ткани (условная норма) тех же пациентов с НМРЛ, а также нормальной ткани легкого от доноров без онкопатологий в анамнезе (норма).

Показаны статистически значимые вероятности, рассчитанные с помощью точного теста Фишера.

Рисунок 3. Профили метилирования 12 генов микроРНК в образцах опухолевой и гистологически нормальной ткани тех же пациентов с ПРЛ. Статистическую значимость рассчитывали при помощи точного теста Фишера. Даны показатели достоверных (p0.05) различий и показатели маргинальной значимости (0.05p0.1) (когда обнаруженное различие достоверно на 94% в отличие от стандартного доверительного интервала 95% при p=0.05).

Рисунок 4. Профили метилирования 12 генов микроРНК в образцах опухолевой и гистологически нормальной ткани (условная норма) тех же пациентов с АД. Статистическую значимость рассчитывали при помощи точного теста Фишера.

Даны показатели достоверных (p0.05) различий и показатели маргинальной значимости (0.05p0.1) (когда обнаруженное различие достоверно на 94% в отличие от стандартного доверительного интервала 95% при p=0.05).

Следует отметить, что у семи генов микроРНК (mir-34b/c, mir-124a3, mir 125b1, mir-137, mir-129-2, mir-212, mir-1258) из 12 изученных частоты метилирования в образцах тканей легкого от 20 доноров без онкопатологии варьировали 0-5%, и составили 10% у mir-375. Интересно, что частота метилирования этих восьми генов была в 2-3 раза выше в гистологически нормальной ткани легкого пациентов с НМРЛ. Повышение частоты метилирования гена в условной норме по сравнению с нормой по донорам может означать, что события, выявленные нами на молекулярном уровне, опережают изменения на морфологическом уровне, и может указывать на вовлеченность в онкогенез ткани, близлежащей к опухоли. Можно предполагать также, что метилирование этих генов относится к ранним событиям в патогенезе легкого.

Напротив, для генов mir-9-1, mir-9-3 и mir-193a отмечены высокие частоты метилирования и в образцах гистологически нормальной ткани легкого пациентов с НМРЛ, и в образцах тканей легкого от 20 доноров без онкопатологии, составившие 20, 35 и 37-40%, соответственно. Для генов mir-9 1, mir-9-3 и mir-193a, по данным литературы, выявлены черты онкосупрессоров и показана роль метилирования в эпигенетической инактивации при раке легкого (Lujambio et al., 2008;

Tan et al., 2010;

Kitano et al., 2011;

Heller et al., 2012). С учетом таких данных, можно предположить специфическое метилирование этих онкосупрессорных генов в тканях легкого здоровых людей региона России, возможно обусловленное экологическими особенностями нашего региона.

Статус метилирования промоторного участка mir-34b/c при НМРЛ по данным литературы изучен подробно, однако окончательной ясности в этом вопросе нет. Так, частота выявления метилирования локуса mir-34b/c различается в опубликованных работах от 41% до 26% (Watanabe et al.,2011;

Tanaka et al., 2012). Причем при анализе клеточных линий и первичных опухолей рака легкого оказалось, что метилирование локуса mir-34b/c встречается существенно чаще при МРЛ, чем при НМРЛ (p0.001) (Tanaka et al., 2012). Согласно нашим результатам частота метилирования CpG-островка промоторного района локуса mir-34b/c в первичных опухолях НМРЛ достигает 63%, в гистологически нормальных тканях легкого пациентов – 20% и в образцах тканей легкого доноров без онкопатологии – 5%. Данные литературы наряду с нашими результатами убедительно свидетельствуют в пользу онкосупрессорной функции гена mir-34b/c.

Ранее гиперметилирование локуса mir-124a-3 в опухолях легкого было выявлено с частотой 48-50% (Lujambio et al., 2007;

Tan et al., 2010;

Kitano et al., 2011). Согласно нашим результатам частота метилирования промоторного района гена mir-124a-3 в опухолях НМРЛ составляет 48%, в условной норме пациентов – 13% и в образцах ткани легкого от доноров метилирование не обнаружено. Полученные результаты хорошо согласуются с данными литературы.

Метилирование CpG-островков девяти генов микроРНК (mir-129-2, mir 203, mir-212, mir-107, mir-130b, mir-137, mir-125b1, mir-375, mir-1258) исследовано в первичных опухолях НМРЛ впервые. Статистически значимые различия между частотой метилирования в опухолях и гистологически нормальной ткани легкого пациента выявлены для шести генов: mir-129-2, mir 212, mir-137, mir-125b1, mir-375 и mir-1258. Ранее для каждого из этих генов имелись экспериментальные данные о вовлеченности в патогенез эпителиальных опухолей.

Так, при НМРЛ выявлено снижение экспрессии гена mir-137 (Dacic et al., 2010) и на клеточных линиях с помощью деметилирующего агента показана роль метилирования в подавлении активности этого гена (Zhu et al., 2013).

Нами впервые определена частота метилирования CpG-островка mir-137 в первичных опухолях легкого, составившая 31%.

Данные литературы о роли mir-375 в патогенезе легкого неоднозначны.

Так, показано повышение экспрессии mir-375 при МРЛ (Zhao et al., 2012), нейроэндокринном раке легкого (Nishikawa et al., 2011) и аденокарциноме (Yu et al., 2010). При НМРЛ, напротив, показано снижение экспрессии mir- (Friboulet et al., 2011;

Li et al., 2012). Выявленное нами впервые гиперметилирование mir-375 в первичных опухолях НМРЛ с частотой до 56% может быть механизмом подавления активности этого гена в опухолях легкого, что позволяет предположить опухоль-супрессорную функцию mir-375 при НМРЛ.

Нами впервые обнаружено метилирование CpG-островка гена mir- при НМРЛ с частотой 36%. Ранее установлено 3-х кратное снижение уровня экспрессии mir-1258 при НМРЛ (Liu et al., 2012). Наши данные о гиперметилировании mir-1258 показывают, что механизм подавления mir- при НМРЛ может быть связан с метилированием этого гена. Ранее было также показано, что ген mir-1258 при НМРЛ и РМЖ выполняет функцию негативного регулятора экспрессии гена гепараназы (HPSE), участвующей в регуляции ростовых и ангиогенных процессов (Zhang et al., 2011;

Liu et al., 2012). HPSE характеризуется повышенной экспрессией в опухолях разных локализаций, которая увеличивается с метастазированием. Сопоставление наших и литературных данных позволяет предположить, что гиперметилирование mir 1258 может быть опосредованно вовлечено в активацию гена HPSE при НМРЛ.

Данные литературы о роли mir-212 в патогенезе НМРЛ неоднозначны.

Рядом исследований показана повышенная экспрессия mir-212 в опухолях легкого с различной гистологией (Yanaihara et al., 2006;

Rabinowits et al., 2009).

С другой стороны, in vivo и in vitro показано, что ген mir-212 снижает свою экспрессию в клеточных линиях и первичных опухолях НМРЛ (Incoronato et al., 2010). Причем, восстановление экспрессии mir-212 в клеточных линиях НМРЛ активирует пролиферацию, процессы миграции и инвазии (Li et al., 2012). Сделано предположение, что модификации гистонов (H3K27me3, H3K9me2 и H3K9Ac) ответственны за подавление экспрессии mir-212 при НМРЛ (Incoronato et al., 2011).

Нами впервые изучено метилирование гена mir-212 в первичных опухолях НМРЛ. Согласно нашим результатам, CpG-островок гена mir-212 метилирован в опухолях при НМРЛ с частотой 48%, в условно нормальной ткани легкого пациентов с частотой 11% и в ткани легкого у доноров без онкопатологии с частотой 5%. Эти данные могут означать вовлеченность метилирования mir 212 в патогенез НМРЛ и, возможно, в эпигенетическую инактивацию этого гена.

Связь с прогрессией заболевания НМРЛ Проведен анализ возможных корреляций частот метилирования 12 генов микроРНК с показателями прогрессии НМРЛ, и раздельно ПРЛ и АД. На основании полученных результатов были рассчитаны возможные корреляции частот метилирования генов микроРНК с клинической стадией (III/IV vs. I/II), со степенью анаплазии (ld vs. md/hd), с размером опухоли (T3/T4 vs. T1/T2) и с появлением метастазов в регионарных узлах (N1/N2 vs. N0). Выявленные корреляции представлены на рис. 5 и 6.

Так, установлены значимые корреляции частоты метилирования генов mir-125b1 и mir-137 со стадией НМРЛ и mir-125b1 – с метастазированием при НМРЛ, а также маргинально значимые корреляции частоты метилирования генов mir-124a-3 со стадией НМРЛ и mir-125b1, mir-137 и mir-203 с увеличением размера опухоли. При ПРЛ выявлены только маргинально значимые корреляции для гена mir-125b1 с клинической стадией и размером опухоли и для гена mir-203 с метастазированием. Причем, показана тенденция связи активного метастазирования с деметилированием гена mir-203.

Рисунок 5. Корреляция частоты метилирования генов микроРНК с прогрессией НМРЛ. Анализ выполнен с учетом клинико-гистологических данных пациентов: А, клинической стадии (I+II/III+IV);

Б, размера опухоли (T1/T2/T3+T4);

В, отсутствия (N0) или наличия (N1/2) метастазов в лимфоузлах. Статистическую значимость рассчитывали при помощи точного теста Фишера.

Согласно данным литературы, для гена mir-125b1 показана связь экспрессии с клинико-патологическими свойствами опухолей. Так, показано, что к генам-мишеням mir-125b1 относится ген ETS1, для которого установлена повышенная экспрессия при метастазирующем РМЖ и корреляция с плохим прогнозом (Soto-Reyes et al., 2012). Ранее также показано, что эпигенетическая инактивация mir-125b1 вносит вклад в формирование инвазивного фенотипа при гепатоцеллюлярной карциноме. В частности, mir-125b1 подавляла экспрессию MMP-2 и MMP-9 – генов, участвующих в деградации межклеточного матрикса (Alpini et al., 2011).

Рисунок 6. Корреляция частоты метилирования генов микроРНК с прогрессией ПРЛ.

Анализ выполнен с учетом клинико-гистологических данных пациентов: клинической стадии (I+II/III+IV);

размера опухоли (T1/T2/T3+T4);

отсутствия (N0) или наличия (N1/2) метастазов в лимфоузлах. Статистическую значимость рассчитывали при помощи точного теста Фишера.

Нами впервые показана статистически значимая (p 0.05) корреляция частоты метилирования гена mir-125b1 с клинической стадией НМРЛ (44% при I+II против 83% при III+IV) и наличием метастазов в региональных лимфоузлах (41% при N0 против 76% при N1+N2). Кроме того, нами показана маргинально значимая корреляция частоты метилирования mir-125b1 с размером опухоли (46% при T1+T2 против 82% при T3+T4) (рис. 5).

Метилирование промотора гена mir-137 ассоциировано с худшим прогнозом заболевания при опухолях головы и шеи (Wang et al., 2011).

Нами впервые показано, что метилирование CpG-островка гена mir- связано с прогрессией НМРЛ. Так, частота метилирования гена mir- статистически значимо (P 0.05) ассоциирована со стадией НМРЛ (19% при I+II против 58% при III+IV) и маргинально значимо – с размером опухоли (21% при T1+T2 против 55% при T3+T4) (рис. 5).

В нашей работе показаны маргинально значимая корреляция повышения частоты метилирования mir-203 с размером опухоли при НМРЛ (P=0,086), но понижения частоты метилирования mir-203 с метастазированием при ПРЛ (P=0,06) (рис. 5 и 6). Данные литературы по свойствам и функции гена mir- также весьма противоречивы. Например, для РТК показана ассоциация гиперэкспрессии гена mir-203 с агрессивным характером опухолей (Yantiss et al., 2009), однако в другой работе показано, что гиперэкспрессия mir-203 может подавлять пролиферацию и активировать апоптоз (Li et al., 2011).

Анализ метилирования методом бисульфитного секвенирования Корректность результатов, полученных методом МС-ПЦР, проверена и подтверждена с применением метода бисульфитного секвенирования на примере локуса mir-124a-3. Анализ метилирования mir-124a-3 выполнен с применением секвенирования предварительно полученных клонов амплифицированного фрагмента этого гена с праймерами, специфичными к бисульфит-конвертированной последовательности. Изучены парные образцы НМРЛ №709 и №831. На рис. 7 приведена последовательность локуса mir 124a-3 и результаты бисульфитного секвенирования для случая №831.

Рисунок 7. Результаты бисульфитного секвенирования промоторного района гена mir-124a-3 в образцах 831-T и 831-N. А - Нуклеотидная последовательность бисульфитно конвертированной ДНК региона гена mir-124a-3. Позиции праймеров подчеркнуты;

позиции CpG-динуклеотидов выделены и пронумерованы;

Б – результаты анализа метилирования 28 CpG-динуклеотидов этого региона в 14 клонах ДНК опухоли (831-T) и в 14 клонах ДНК гистологически нормальной ткани легкого того же пациента (831-N).

Результаты бисульфитного секвенирования согласуются с данными, полученными с применением метода МС-ПЦР. Бисульфитным секвенированием метилирование в образце опухоли 831-T обнаружено с частотой 40%, а в образце гистологически нормальной ткани легкого 831-N с частотой 3%. При этом методом МС-ПЦР в образце опухоли 831-T метилирование обнаружено, а в образце 831-N не обнаружено. В образце опухоли 709-T метилирование обнаружено с частотой 6,6%, а в образце 709-N с частотой 3,2%, что соответствовало отсутствию метилирования в этих образцах при использовании метода МС-ПЦР.

2.2 Профиль метилирования генов микроРНК при РТК Были исследованы CpG-островки семи генов микроРНК (mir-9-1, mir-9-3, mir-34b/c, mir-129-2, mir-193a, mir-203 и mir-212) в парных образцах опухолевой и морфологически не измененной ткани толстой кишки пациентов с РТК, а также в образцах ткани толстой кишки доноров без онкопатологии в анамнезе. Суммарная выборка составила 39 случаев РТК (а именно, аденокарциномы толстой кишки) и 14 доноров без онкопатологии. В исследованной выборке РТК представлены опухоли, локализованные во всех отделах толстой кишки – ободочной, сигмовидной и прямой кишке.

Метилирование CpG-островков четырех генов микроРНК (mir-9-1, mir-9 3, mir-34b/c, mir-129-2) исследовано на полной выборке из 39 случаев РТК, а трех генов микроРНК (mir-193a, mir-203, mir-212) на выборке из 11-24 случаев РТК. Метилирование четырех генов (mir-9-3, mir-193a, mir-203 и mir-212) исследовано в первичных опухолях РТК впервые.

На основании полученных данных рассчитаны частоты метилирования семи генов микроРНК при РТК;

результаты анализа представлены графически на рис. 8, который отражает профиль метилирования этих генов микроРНК при РТК. Частоты метилирования семи генов микроРНК (mir-9-1, mir-9-3, mir 34b/c, mir-129-2, mir-193a, mir-212, mir-203) в опухолях при РТК варьируют от 38% до 85%. Статистически значимые различия (p0.05 по Фишеру) между частотами метилирования в образцах опухолей и гистологически нормальной ткани пациентов установлены для 4-х генов: mir-9-1, mir-9-3, mir-34b/c, mir 129-2 (рис. 8).

Частоты метилирования генов mir-9-1, mir-9-3 и mir-34b/c в образцах ткани толстой кишки доноров без онкопатологии варьировали от 21% до 36 %, а в условной норме от 28% до 36%. Высокая частота обнаружения метилирования данных генов микроРНК в образцах ткани толстой кишки и в условной норме, и у доноров без онкопатологии, возможно, является свойством данного вида ткани, связанным с выполняемой функцией.

Частота метилирования гена mir-129-2 повышается от 0% в ткани толстой кишки доноров без онкопатологии до 26 % в гистологически нормальной ткани пациентов с РТК. Данное изменение носит выраженный опухоль специфичный характер.

Рисунок 8. Профиль метилирования 7 генов микроРНК на выборке опухолевой и гистологически нормальной ткани (условная норма) пациентов с РТК и нормальной ткани толстой кишки от доноров без онкопатологии в анамнезе (норма). Показаны статистически значимые вероятности, рассчитанные с помощью точного теста Фишера.

Сравнение профилей метилирования генов микроРНК при НМРЛ и РТК показывает, что для РТК в целом характерна более высокая частота обнаружения метилирования CpG-островков генов микроРНК, чем для НМРЛ.

Метилирование гена mir-212 наблюдается в 50% случаев НМРЛ и только в 40% случаев РТК и, по-видимому, более специфично для НМРЛ.

По данным литературы поведение генов mir-9-1 и mir-9-3 при РТК отличается двойственностью. Повышенной экспрессией генов семейства mir- характеризуются опухоли РТК с отдаленными метастазами (Zhu et al., 2012). В в других работах показано, что mir-9-1 и mir-9-3 метилированы в клеточных линиях РТК, ген mir-9-1 метилирован в первичных опухолях РТК с частотой 56% и метилирование mir-9-1 ассоциировано с присутствием метастазов в лимфоузлах (Bandres et al., 2009;

Vinci et al., 2013). Полученные в данной работе результаты о высокой частоте метилирования генов mir-9-1 и mir-9- при РТК (рис. 8) и данные литературы позволяют предполагать роль онкосупрессоров для этих генов на стадиях онкогенеза до метастазирования.

Можно отметить, что в нашей работе впервые исследовано метилирование mir 9-3 на клиническом материале РТК и определена частота метилирования этого гена в первичных опухолях, достигающая почти 80% (рис. 8).

Метилирование промоторной области гена mir-34b/c, по данным литературы, ассоциировано со снижением содержания этих микроРНК mir-34b и mir-34c в клеточных линиях и образцах первичных опухолей РТК, причем частота метилирования достигала 90% (Toyota et al., 2008). Результаты, полученные в нашей работе, согласуются с данными литературы и показывают важную роль метилирования гена mir-34b/c в патогенезе РТК.

По данным литературы метилирование гена mir-129-2 обнаружено в клеточных линиях и первичных опухолях толстой кишки с частотой 91% (Bandres et al., 2009). Наши результаты согласуются с данными литературы.

Нами показано, что mir-129-2 метилирован в первичных опухолях РТК с частотой до 77%, в условной норме пациентов с частотой 26% и в ткани толстой кишки доноров без онкопатологии метилирование mir-129-2 не обнаружено.

2.3 Диагностическое применение систем маркеров, основанных на анализе метилирования генов микроРНК, при НМРЛ и РТК В качестве молекулярных маркеров широко используются тесты по изменению экспрессии наборов генов микроРНК в тканях опухолей, крови, плазме и других биологических жидкостях пациента. Панели маркеров на основе экспрессии генов микроРНК позволяют различать типы опухолей легкого (МРЛ и НМРЛ) и подтипы НМРЛ – АД и ПРЛ (Wu et al., 2011), выявлять заболевание на ранней стадии по анализу плазмы крови (Ren Y., 2011), а также выделять группы пациентов с плохим прогнозом выживаемости (Jassem and Skrzypski, 2012). Возможности использования метилирования CpG островков генов микроРНК для диагностики и прогностических целей при НМРЛ и РТК изучены слабее. Имеется единственный патент для диагностики опухолей разных локализаций, основанный на определении экспрессии и/или статуса метилирования генов mir-148, mir-34b/c и генов семейства mir- (Lujambio and Esteller, 2010). Хотя применение этих методов при анализе опухолевой ткани и/или биологических жидкостей пациента позволяет различать опухоли с метастатическим потенциалом и при наличии метастазов.

Системы маркеров для диагностики НМРЛ На основе полученных результатов по изменению метилирования группы генов микроРНК нами проведена оценка диагностических качеств панелей маркеров. Были оценены системы маркеров по способности различать опухолевую и нормальную ткань. Методом сравнения диагностических качеств панелей генов микроРНК был выбран метод ROC-анализа. В качестве группы «случай» использованы данные полной выборки образцов НМРЛ (48 случаев) без разбиения на подтипы;

в качестве группы «контроль» использованы выборка гистологически нормальной ткани легкого (условная норма) от тех же пациентов (48 случаев) и выборка ткани легкого от 20 доноров без онкопатологии в анамнезе.

При использовании в качестве маркера какой-либо одной из исследованных микроРНК, не достигается требуемых практикой значений чувствительности и специфичности. Для подбора системы маркеров был проведен анализ сочетаний генов микроРНК для достижения наилучшего соотношения чувствительности, специфичности и AUC. Панели генов микроРНК оценивали по параметру индекса метилирования с определением оптимального отсекающего значения для максимизации чувствительности и специфичности. Под индексом метилирования понимается отношение числа метилированных локусов к общему числу локусов модели.

По результатам предварительного анализа сочетаний двух, трех и более маркеров были отобраны гены, которые вносят наибольший вклад в повышение диагностических характеристик системы маркеров: mir-125b1, mir-375, mir-129 2, mir-34b/c, mir-124a-3, mir-137 и mir-1258. Расчеты проведены для панели, составленной из пяти генов микроРНК, выявленных впервые в данной работе (mir-125b1, mir-375, mir-129-2, mir-137 и mir-1258, рис. 9), и для панели семи наиболее представительных маркеров, включающих также гены mir-34b/c, mir 124a-3, описанные в литературе ранее (рис. 10).

Более показательным можно считать сравнение данных для опухоли с данными для нормы (доноры без онкопатологии), чем с условной нормой пациентов. На рис. 9 и 10 показано построение ROC-кривых для двух вариантов (контроль – условная норма, либо норма по донорам без онкопатологии).

Рисунок 9. ROC-анализ по параметру индекс метилирования для системы из пяти маркеров: mir-125b1, mir-129-2, mir-137, mir-375, mir-1258. А – результаты, полученные при сравнении образцов опухолей и нормы (доноры без онкопатологии в анамнезе);

Б – результаты, полученные при сравнении образцов опухолей и условной нормы. Se - чувствительность;

100-Sp – доля ложноположительных результатов. AUC – показатель интегральной оценки качества и предсказательной способности модели;

критерий – критерий отсечения ROC-кривой.

Рисунок 10. ROC-анализ по параметру индекс метилирования для системы из семи маркеров: mir-125b1, mir-375, mir-129-2, mir-34b/c, mir-124a3, mir-137, mir-1258. А – результаты, полученные при сравнении образцов опухолей и нормы (доноры без онкопатологии в анамнезе);

Б – результаты, полученные при сравнении образцов опухолей и условной нормы. Se - чувствительность;

100-Sp – доля ложноположительных результатов;

AUC – показатель интегральной оценки качества и предсказательной способности модели;

критерий – критерий отсечения ROC кривой.

Как следует из рис. 9 и 10, каждая из рассмотренных систем (из 5 и маркеров) имеет преимущества по какому-либо параметру (специфичности и чувствительности) и может найти применение в тестировании конкретного пациента. Качество модели (интегральный параметр) у обеих систем (если сравнение проводить с нормой по донорам) можно считать отличным – AUC варьирует между 0,9 и 1. В случае применения выборки норм от доноров без онкопатологии в анамнезе в качестве группы «контроль» значение критерия отсечения (порог отсечения) для панели из 5 генов равен «0», что означает возможность диагностики уже по одному идентифицированному локусу из панели. В случае выборки условных норм от тех же пациентов для постановки диагноза необходимо обнаружить метилирование минимум 2-х локусов из панели. В случае панели из 7 генов критерий отсечения равен одному локусу и, следовательно, для постановки диагноза необходимо обнаружить метилирование минимум 2-х локусов из панели.

Системы маркеров для диагностики РТК Аналогичным образом, метод ROC-анализа применили для формирования и оценки системы маркеров для диагностики РТК. В качестве группы «случай» использованы данные полной выборки образцов опухолей РТК (39 случаев);

в качестве группы «контроль» использованы выборка условных норм от пациентов (39 случаев) и выборка ткани толстой кишки от доноров без онкопатологии в анамнезе. Для анализа взяты только те гены микроРНК, которые показали опухоль специфичное гиперметилирование: mir 9-1, mir-9-3, mir-34b/c, mir-129-2. Далее проведен анализ сочетаний генов микроРНК для достижения наилучшего соотношения чувствительности, специфичности и AUC. Панели групп генов микроРНК оценивали по параметру индекса метилирования с определением оптимального отсекающего значения для максимизации чувствительности и специфичности. Расчеты проведены для панели из 4-х генов и представлены на рис. 11.

Критерий отсечения для норм доноров составил 1 локус, для условных норм составил 2 локуса. Качество модели можно считать отличным – AUC составляет 0,95 и 0,93. Если сравнивать с нормой (доноры без онкопатологии), чувствительность системы составляет 97%, а специфичность – 79%. При сравнении с условной нормой чувствительность системы ниже и равна 82%, а специфичность оказалась выше – до 92%. Но повышение этой величины при сравнении с условной нормой скорее связано с особенностями выборок, тем более что их численность составила 39 случаев РТК и только 14 норм доноров без онкопатологии. Тем не менее, диагностическое значение этой системы для раннего выявления опухолей толстой кишки очевидно.

Рисунок 11. ROC-анализ по параметру индекс метилирования для системы из четырех маркеров: mir-9-1, mir-9-3, mir-34b/c, mir-129-2. А – результаты, полученные при сравнении образцов опухолей и норм (доноры без онкопатологии в анамнезе);

Б – результаты, полученные при сравнении образцов опухолей и условной нормы. Se чувствительность;

100-Sp – доля ложноположительных результатов. AUC – показатель интегральной оценки качества и предсказательной способности модели;

критерий – критерий отсечения ROC-кривой.

ВЫВОДЫ 1. Исследовано метилирование CpG-островков 14 генов микроРНК при немелкоклеточном раке легкого. Метилирование CpG-островков девяти генов микроРНК (mir-129-2, mir-203, mir-212, mir-107, mir-130b, mir-137, mir-125b1, mir-375, mir-1258) исследовано в первичных опухолях НМРЛ впервые. Повышение частоты метилирования в опухолях по сравнению с гистологически нормальной тканью легкого статистически значимо для группы генов микроРНК: mir-9-1, mir-9-3, mir-34b/c, mir-124a-3, mir-212, mir-129-2, mir-137, mir-125b1, mir-375 и mir-1258.

2. Идентифицирован новый локус, подверженный метилированию в опухолях, – CpG-островок, перекрывающий ген mir-1258. Изменение статуса метилирования шести генов микроРНК (mir-212, mir-129-2, mir-137, mir 125b1, mir-375 и mir-1258) в первичных опухолях НМРЛ выявлено нами впервые, причем повышение частоты метилирования в опухолях по сравнению с гистологически нормальной тканью легкого статистически значимо..

3. Исследовано метилирование CpG-островков семи генов микроРНК в первичных опухолях толстой кишки, из них для четырёх генов (mir-9-3, mir 193a, mir-203, mir-212) впервые. Показано статистически значимое повышение частоты метилирования генов: mir-9-1, mir-9-3, mir-34b/c и mir 129-2. Профили метилирования семи генов микроРНК при НМРЛ и РТК в целом похожи, хотя для РТК характерны более высокие частоты метилирования, чем для НМРЛ.

4. Впервые выявлена статистически значимая ассоциация частоты метилирования CpG-островка гена mir-125b1 с со стадией НМРЛ и наличием метастазов в региональных лимфоузлах, и гена mir-137 – со стадией НМРЛ.

5. Составлены системы информативных маркеров, позволяющие с высокой чувствительностью и специфичностью определять опухоль легкого и толстой кишки, причем в панель маркеров НМРЛ входят пять генов, исследованных в первичных опухолях легкого впервые (mir-129-2, mir-137, mir-125b1, mir-375 и mir-1258).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Ходырев Д.С., Пронина И.В., Рыков С.В., Береснева Е.В., Фридман М.В., Казубская Т.П., Логинов В.И., Брага Э.А. Метилирование группы генов микроРНК вовлечено в регуляцию экспрессии генов-мишеней RAR-beta2 и NKIRAS1 при раке легкого. Молекулярная биология. 2012. Т.46, № 5, C.773 785.

Рыков С.В., Ходырев Д.С., Береснева Е.В., Пронина И.В., Корчагина Е.Л., Казубская Т.П., Логинов В.И., Брага Э.А. Профили метилирования группы генов микроРНК в опухолях легкого, почки и толстой кишки. Медицинская генетика. 2012. Т. 11, № 8, С.26-31.

Рыков С.В., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Казубская Т.П., Логинов В.И., Брага Э.А. Новые гены микроРНК, подверженные метилированию в опухолях легкого. Генетика. 2013. Т. 49, №7, С. 911-915.

Ходырев Д.С., Рыков С.В., Пронина И.В., Казубская Т.П., Логинов В.И., Брага Э.А. Система маркеров на основе группы генов микроРНК для диагностики немелкоклеточного рака легкого, включая плоскоклеточный рак и аденокарциному, и набор праймеров для маркера miR-375 этой системы. // Патентная заявка РФ 2012 №142228 от 04.10.2012.

Рыков С.В., Ходырев Д.С., Логинов В.И., Береснева Е.В., Пронина И.В., Казубская Т.П., Брага Э.А. Анализ метилирования промоторных областей генов микроРНК в опухолях толстого кишечника и легкого. Материалы 7-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения 2011». Санкт-Петербург, апрель, 2011. Приложение к Вопросам Онкологии, Т.

57, № 2, С. 54-55.

Рыков С.В., Д.С. Ходырев, Е.В. Береснева, И.В. Пронина, М.В. Фридман, Т.П.

Казубская, В.И. Логинов, Э.А. Брага. Метилирование группы генов микроРНК в опухолях легкого, включающих плоскоклеточный рак и аденокарциному.

Материалы научной конференции «Актуальные проблемы онкогенетики», Москва, Россия, октябрь, 2011. Медицинская генетика Т. 10, № 10, 2011. С. 20 21.

Ходырев Д.С., С.В. Рыков, Е.В. Береснева, И.В. Пронина, М.В. Фридман, Т.П.

Казубская, В.И. Логинов, Э.А. Брага. Группа генов микроРНК подверженных метилированию при раке толстого кишечника. Материалы научной конференции «Актуальные проблемы онкогенетики», Москва, Россия, октябрь, 2011. Медицинская генетика Т. 10, № 10, 2011. С. 23-24.

Рыков С.В., Д.С. Ходырев, Е.В. Береснева, И.В. Пронина, Т.П. Казубская, В.И.

Логинов, Э.А. Брага. Метилирование группы генов микроРНК в опухолях толстой кишки и легкого. Материалы XV Российского онкологического конгресса, Москва, Россия, ноябрь, 2011. С. 220-221.

Список сокращений AUC - Area Under Curve АД – аденокарцинома легкого ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота МРЛ – мелкоклеточный рак легкого МС-ПЦР – метилспецифичная ПЦР НМРЛ – немелкоклеточный рак легкого п.о. – пара оснований ПРЛ – плоскоклеточный рак легкого ПЦР – полимеразная цепная реакция РМЖ – рак молочной железы РТК – рак толстой кишки

 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.