авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Анализ генов предрасположенности к развитию бронхиальной астмы в республике башкортостан

На правах рукописи

ФЕДОРОВА ЮЛИЯ ЮРЬЕВНА

АНАЛИЗ ГЕНОВ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ

БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Уфа – 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт биохимии и

генетики Уфимского научного центра РАН доктор биологических наук, профессор

Научный руководитель:

Хуснутдинова Эльза Камилевна доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Мустафина Ольга Евгеньевна Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и генетики УНЦ РАН доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна ГУ Медико-генетический научный центр РАМН Учреждение Российской академии наук

Ведущая организация:

Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится «22» декабря 2009г. в «16.00» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биохимии и генетики УНЦ РАН по адресу:

450054, Уфа, просп. Октября, 71.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71 и на сайте Учреждения Российской академии наук Институт биохимии и генетики УНЦ РАН: www.ibg.anrb.ru/dissov.html, e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан «21» ноября 2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Бронхиальная астма (БА) – это распространенное воспалительное заболевание дыхательных путей, в котором принимают участие многие клетки и клеточные элементы. По социально-экономическому ущербу, влиянию на уровень здоровья и качество жизни пациентов, бронхиальная астма входит в число первых трех патологий в структуре заболеваний человека. Хроническое рецидивирующее течение БА, часто проявляющееся в раннем детстве и продолжающееся в течение всей жизни, может быть причиной не только инвалидности, но и смертельных исходов, что определяет необходимость исследования сложных невыясненных механизмов развития данной патологии с целью разработки эффективных методов диагностики и профилактики [Геппе Н.А. и др., 2002;

Под ред. Чучалина А.Г., 2005;

GINA, 2007].

Бронхиальная астма является классическим примером многофакторной патологии, развивающейся при взаимодействии многочисленных факторов окружающей среды и наследственной предрасположенности. Генетические механизмы БА в последние годы стали областью активных международных исследований. На сегодняшний день более 15 исследовательских групп опубликовали результаты полногеномных анализов сцепления при атопии, атопическом дерматите и астме в различных популяциях [Ober C. et al., 2006;

Scirica C.V. et al., 2007;

Weiss S.T., 2009]. Согласно выводам этих работ, для хромосомных областей (2p16, 2q32-33, 5q31-33, 6p21-24, 11q12-13, 12q14-24, 13q14-22, 14q24, 16p12, 17q21, 20p13) показана высокая степень сцепления с астмой и сопутствующими с ней признаками [Daniels S.E. et al., 1996;

CSGA, 1997;

Ober C. et al., 1998;

Yokouchi Y. et al., 2000;

Haagerup A. et al., 2002;

Hakonarson H.

et al., 2002;

Van Eerdewegh P. et al., 2002;

Evans D.M. et al., 2004;

Nicolae D. et al., 2005;

Postma D.S. et al., 2005;

Pillai S.G. et al., 2006;

Moffatt M.F. et al., 2007].

Многочисленные ассоциативные исследования свидетельствуют, что в патогенезе БА принимают участие множество функционально взаимосвязанных генов (генных сетей), в том числе главные, ключевые гены и гены-модификаторы, фенотипический эффект которых зависит от факторов окружающей среды [Баранов В.С. и др., 2008]. Существенная часть исследований посвящена генам цитокиновой сети, которые играют решающую роль в развитии аллергического воспаления [Rosenwasser L.J. et al., 1995;

Kruse S. et al., 1999;

Kips J.C., 2001;

Markova S. et al., 2007;

Settin A. et al., 2008;

Castro-Giner F. et al., 2009]. Большой опыт накоплен и в отношении генов системы детоксикации, отвечающих за деградацию и выведение из организма ксенобиотиков [Баранов В.С. и др., 2000, 2008;

Ляхович В.В. и др., 2002;

Niewinski P. et al., 2003;

Фрейдин М.Б. и др., 2002, 2006;

Polonikov A.V. et al., 2009]. Позиционно-клонированный ген ADAM33 (A Disintegrin and Metalloprotease 33) рассматривается в качестве одного из главных кандидатов тяжести течения БА [Van Eerdewegh P. et al., 2002;

Howard T.D. et al., 2003;

Cheng E. et al., 2004;

Jie Z. et al., 2009]. Взаимосвязь полиморфных вариантов как генов цитокиновой сети, так и генов системы биотрансформации, с бронхиальной астмой у жителей России изучена несколькими группами исследователей [Ляхович В.В. и др., 2002;

Фрейдин М.Б. и др., 2002, 2006;

Карунас А.С. и др., 2004, 2007;

Баранов В.С. и др., 2008;

Polonikov A.V. et al., 2009]. Полученные результаты, однако, весьма противоречивы и не дают однозначного ответа на вопрос об их патогенетической роли в развитии астмы.

Исследование гена ADAM33 у больных БА в отечественных работах ранее не проводилось. Это свидетельствует о необходимости комплексного исследования генетических механизмов развития данного заболевания для оценки факторов риска развития БА и последующей разработки профилактических мероприятий с учетом индивидуальных особенностей каждого больного.



В связи с вышесказанным были определены цели и задачи исследования.

Цель работы Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов, генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и гена дизинтегрина и металлопротеазы ADAM33 с развитием бронхиальной астмы в Республике Башкортостан.

Задачи исследования 1. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов цитокинов IL4 (-590CT), IL4RA (Ile50Val), IL10 (-627CA), TNFA (-308GA), IL1B (3953СT) и IL1RA (VNTR) у больных бронхиальной астмой и здоровых индивидов.

2. Провести исследование полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYP1A1 (4887СА, 4889AG, 6235TC), CYP2C9 (430СT, 1075AC), CYP2C19 (681GA), CYP2D6 (1934GA), GSTM1 (делеция), GSTT1 (делеция), NAT2 (481СТ, 590GA, 857GA), MTHFR (677CT) у больных бронхиальной астмой и здоровых индивидов.

3. Провести генотипирование и гаплотипирование полиморфных вариантов гена дизинтегрина и металлопротеазы ADAM33 у больных бронхиальной астмой и здоровых индивидов.

4. Провести анализ ассоциаций исследованных полиморфных вариантов генов с развитием БА у детей и индивидов старше 18 лет. Проанализировать распределение частот аллелей и генотипов изученных полиморфных локусов с учетом этнической принадлежности индивидов, формы и степени тяжести БА.

5. Провести анализ роли межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов цитокинов, гена ADAM33 и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в развитии бронхиальной астмы.

Научная новизна исследования Впервые с помощью биочипа, разработанного в лаборатории биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, в диссертационной работе определены частоты полиморфных вариантов генов системы биотрансформации CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 у больных БА и здоровых индивидов из РБ. Впервые проведен анализ ассоциаций полиморфных локусов гена ADAM33 с бронхиальной астмой.

Выявлены генетические маркеры риска развития заболевания у индивидов с учетом их этнической принадлежности, формы и степени тяжести БА. Впервые с помощью программы GMDR исследовано межгенное взаимодействие генов цитокинов, ферментов системы биотрансформации и гена дизинтегрина и металлопротеазы ADAM33, а также изучена их взаимосвязь с учетом возраста индивидов и клинических проявлений БА.

Научно-практическая значимость работы Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к бронхиальной астме. Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих исследований по определению генетических факторов риска развития БА и разработки адекватных лечебно-профилактических мероприятий. Результаты исследования также могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация работы Основные положения диссертации были представлены на школе-семинаре «Биомика-наука XXI века» (Уфа, 2007), European Human Genetics Conference (Barcelona, 2008;

Vienna, 2009), European Respiratory Society Annual Congress (Berlin, 2008;

Vienna 2009), Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Warsaw, 2009), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, и одна монография.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 228 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 19 рисунков и 69 таблиц. Список литературы включает 293 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы исследования В работе использованы образцы ДНК 510 неродственных индивидов, больных бронхиальной астмой, в возрасте от 2 до 60 лет. Из них число детей, больных БА, составило 265 человек (от 2 до 18 лет). Все обследованные являлись пациентами детского отделения Клиники Башкирского государственного медицинского университета, пульмонологического и аллергологического отделений городской клинической больницы № 21 г. Уфы. Диагноз БА устанавливался в соответствии с критериями Глобальной стратегии лечения и профилактики бронхиальной астмы (GINA, 2007) и критериями отечественных программных документов по диагностике, лечению и профилактике БА [Под ред. Чучалина А.Г., 2005;

GINA, 2007].

Состав больных по этнической принадлежности был следующим: русские – 172, татары – 101, башкиры – 65, метисы – 172. В зависимости от формы бронхиальной астмы выборка больных была разделена на следующие группы: 1) с аллергической – 282 человека;

2) с неаллергической – 113 человек;

3) со смешанной – 89 человек. Среди пациентов с БА 100 индивидов имели легкое течение заболевания, 256 индивидов – среднетяжелое и 127 человек – тяжелое течение БА. В качестве контроля исследована группа здоровых лиц без каких-либо признаков аллергических заболеваний с очень низким или низким уровнем IgE, состоящая из 366 человек различной этнической принадлежности (123 русских, татар, 51 башкир и 101 метиса).





Методы исследования ДНК была выделена из периферической крови методом фенольно хлороформной экстракции [Mathew C.C. et al., 1984]. Анализ полиморфных вариантов генов IL4, IL4RA, IL10, IL1RA, IL1B, TNFA, ADAM33 осуществляли методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на амплификаторе “Терцик” производства компании «ДНК-технология» (г. Москва) и ПДРФ анализом с последующим электрофорезом в 7-8% полиакриламидном геле.

Исследование 11 полиморфных локусов и 2 делеций в восьми различных генах ФБК – CYP1A1 (4887CA, 4889AG, 6235TC), CYP2D6 (1934GA), GSTT (делеция), GSTM1 (делеция), NAT2 (481CT, 590GA, 857GA), MTHFR (677CT), CYP2C9 (430CT, 1075AC) и CYP2C19 (681GA) – проводилось при помощи биочипа, разработанного в лаборатории биологических микрочипов ИМБ им. В.А.

Энгельгардта РАН [Глотов А.С. и др., 2005].

Статистическая обработка Математическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ: MS Office Excel 2003 [Microsoft], STATISTICA v.6.0. [StatSoft], BIOSTAT [Гланц С., 1999]. При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовался критерий c2 (р) для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Иэйтса на непрерывность. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов Odds Ratio (OR) [Schlesselman J. et al., 1982]. Для оценки неравновесия по сцеплению пары полиморфных локусов использовался показатель D', рассчитанный с помощью программы Определение частот LDA [http://www.chgb.org.cn/lda/lda.htm].

гаплотипов и тестирование различий в распределении частот гаплотипов в группах пациентов и в контроле осуществлялось с помощью программы CHAPLIN Анализ [www.genetics.emory.edu/labs/epstein/software/chaplin/index.htm].

межгенных взаимодействий проводился с помощью программы GMDR (MDR) (Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction) [Lou X.Y. et al., 2007;

http://www.healthsystem.virginia.edu/internet/addiction-genomics/Software/].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов цитокинов с бронхиальной астмой в Республике Башкортостан Цитокины играют ключевую роль на всех стадиях реализации аллергических реакций. Особенно важным является IL4, переключающий В лимфоциты на производство и осуществляющий свои функции, IgE взаимодействуя с клетками-мишенями через специфический рецептор (IL4R), расположенный на их поверхности. TNF принимает участие в регуляции процессов дифференцировки, роста и метаболизма клеток, является медиатором воспалительных процессов. IL1 является цитокином широкого спектра действия:

обуславливает пусковые реакции иммунитета, играет ключевую роль в развитии воспаления. Его рецепторный антагонист рассматривается как (IL1RA) противовоспалительный фактор локального действия, также как и IL10, основными биологическими функциями которого является ограничение и завершение воспалительных процессов [Ярилин А.А., 1999;

Фрейдин М.Б. и др., 2006;

Баранов В.С. и др., 2008].

Нами проведено исследование полиморфных локусов шести генов цитокинов IL4, IL4RA, IL1B, IL1RA, IL10, TNFA у больных БА и индивидов контрольной группы различной этнической принадлежности с учетом возраста, формы и степени тяжести бронхиальной астмы.

Анализ полиморфного варианта -590СT гена IL у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе Проведенный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта -590СT гена IL4 в контрольных выборках выявил статистически значимые отличия между башкирами и русскими (2=6,59, p=0,01 и 2=7,79, p=0,02). Различия в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса -590СT гена IL4 были достоверными и между группами больных с аллергической формой БА и здоровых индивидов русской этнической (2=9,29, 2=11,99, принадлежности Ассоциация с p=0,002, p=0,002).

аллергической формой БА была определена для генотипа IL4-590*T/T (17,71% vs 4,10%, p=0,0009, OR=5,04, 95%CI 1,78-14,21) и аллеля IL4-590*T (39,06% vs 25,41%, p=0,002, OR=1,88, 95%CI 1,25-2,83). Гомозиготный генотип IL4-590*C/C и аллель являются маркерами пониженного риска развития IL4-590*C аллергической формы БА у русских (p=0,04, OR=0,57, 95%CI 0,33-0,99 и p=0,002, OR=0,53, 95%CI 0,35-0,80, соответственно) (рис. 1).

T OR=1, C OR=3, TT OR=0, OR=5, CT СС OR=0, 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00% 70,00% 80,00% Контрольная группа Больные с тяжелым течением БА Больные аллергической формой БА Рис. 1. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта -590СT гена IL4 у больных БА и контроля русской этнической принадлежности.

Распределение частот аллелей и генотипов данного полиморфного варианта в зависимости от степени тяжести заболевания показало, что у больных с тяжелым течением БА русской этнической принадлежности частота генотипа IL4-590*Т/T (13,33%) была также значительно выше, чем у здоровых индивидов (4,10%, p=0,03, OR=3,60, 95%CI 1,04-12,45) (рис. 1).

При сравнении детской выборки больных БА и соответствующей контрольной группы русской этнической принадлежности обнаружены статистически значимые различия по распределению частот аллелей и генотипов полиморфного локуса -590CT гена IL4 (c2=6,84, p=0,009 и c2=10,23, p=0,006, соответственно). Отмечено значительное увеличение частоты гомозиготного генотипа IL4-590*T/T (20,51%) и аллеля IL4-590*T (43,59%) в группе пациентов по сравнению с индивидами без признаков аллергических заболеваний (1,85% и 27,78%, соответственно). Показатель отношения шансов для носителей генотипа IL4-590*T/T составил 13,68 (p=0,004, 95%CI 1,76-106,58), для носителей аллеля IL4-590*T – 2,01 (p=0,009, 95%CI 1,19-3,40). Аллель IL4-590*C является маркером пониженного риска развития БА у детей (OR=0,50, 95%CI 0,29-0,84) (рис. 2). В данном случае, маркеры риска заболевания обуславливают развитие именно аллергической формы бронхиальной астмы, которая является основной у детей.

T OR=2, C OR=0, TT OR=13, CT СС 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00% 70,00% 80,00% Дети с аллергической формой БА Контрольная группа Рис. 2. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта -590СT гена IL4 у детей, больных БА, и в контрольной группе русской этнической принадлежности.

Полученные данные согласуются с результатами других исследований.

Ассоциация аллеля IL4-590*T с астмой была показана у детей из Японии [Noguchi E. et al., 1998]. Обнаружена ассоциация аллеля IL4*-590T с развитием астмы в тайваньской популяции, а также с угнетением функции внешнего дыхания у американцев европеоидного происхождения [Burchard E.G. et al., 1999;

Chiang C.H.

et al., 2007]. Повышение риска развития БА у носителей аллеля IL4*-590T, возможно, объясняется тем, что полиморфная замена C на T в -590 положении ведет к образованию нового сайта связывания факторов транскрипции семейства NFAT и к повышенной транскрипции гена IL4 [Rosenwasser L.J. et al., 1997;

Rockman M.V. et al., 2003], продукт которого является ключевым цитокином в развитии аллергического воспаления.

Анализ полиморфного локуса Ile50Val гена IL4RA у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе Проведено исследование однонуклеотидной замены Ile50Val гена IL4RA у больных БА и в контрольной группе. Обнаружены статистически значимые различия по распределению частот аллелей данного полиморфного локуса при сравнении детской выборки больных БА и контроля татарской этнической принадлежности (c2=5,36, p=0,02). В группе пациентов отмечено статистически достоверное увеличение частоты аллеля IL4RA*50Val, на долю которого приходилось 48,28% случаев по сравнению с контролем, где частота данного аллеля составила 32,65% (OR=1,93, 95%CI 1,10-3,36). Генотип IL4RA*50Ile/Ile и аллель IL4RA*50Ile среди детей, больных БА, определялись реже (в 24,14% и 51,72% случаев), чем в соответствующей контрольной группе (44,90% и 67,35%, соответственно). Показатель отношения шансов для носителей генотипа IL4RA*50Ile/Ile составил 0,39 (р=0,02, CI95% 0,17-0,89), для носителей аллеля IL4RA*50Ile – 0,52 (CI95% 0,30-0,91) (рис. 3). В данной группе все пациенты имеют аллергическую форму заболевания, следовательно, выявленные маркеры риска ассоциированы с аллергической БА. Согласно литературным данным, значимая ассоциация гаплотипа гена IL4RA, содержащего аллель IL4RA*50Val, с аллергической астмой была показана и у жителей Швеции [Hytonen A.M. et al., 2004].

OR=1, 70,00% OR=0, 60,00% OR=0, 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% Il IV VV I V Дети с аллергической формой БА Контрольная группа Рис. 3. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта Ile50Val гена IL4RA у детей, больных БА, и в контрольной группе татарской этнической принадлежности.

Анализ полиморфного варианта -308GA гена TNFA у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта -308GA гена TNFA не выявил достоверных отличий между контрольными группами различной этнической принадлежности (p0,05). Учитывая отсутствие межэтнических различий по данному локусу и высокий уровень метисации населения РБ, нами рассматривались группы больных и контроля без учета их этнической принадлежности.

При сравнении выборок детей, больных аллергической формой БА, и соответствующего контроля выявлены статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов данного локуса – 2=7,10, p=0,008 и 2=6,46, p=0,04, соответственно. В группе больных частота гетерозиготного генотипа TNFA*-308G/A (24,47%) была выше по сравнению с контролем, где данный генотип был обнаружен в 16,50% случаев (p=0,04, OR=1,64, 95%CI 1,02 2,64). Частота генотипа TNFA*-308G/G у детей с аллергической формой БА была ниже (71,31%), чем у детей без признаков атопических заболеваний (81,50%, p=0,01, OR=0,56, 95%CI 0,36-0,89). Анализ распределения частот аллелей показал, что в группе пациентов наблюдается увеличение в 1,5 раза частоты аллеля TNFA* 308A по сравнению со здоровыми индивидами (16,46% и 10,25%, соответственно) (p=0,008, OR=1,72, 95%CI 1,15-2,58) и уменьшение частоты аллеля TNFA*-308G (83,54% и 89,75%, соответственно, OR=0,58, 95%CI 0,39-0,87) (рис. 4).

OR=2,66 OR=0, A OR=1, G OR=6, AA OR=0, OR=0, OR=0, GA OR=1, GG 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00% 70,00% 80,00% 90,00% Контрольная группа Дети с тяжелым течением БА Дети с аллергической формой БА Рис. 4. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта -308GA гена TNFA у детей, больных БА, и в контрольной группе.

Обнаружены статистически значимые различия по распределению частот аллелей и генотипов полиморфного локуса -308GA гена TNFA между выборками детей с тяжелым течением БА и здоровых индивидов (c2=11,38, p=0,0007 и c2=10,96, p=0,004, соответственно). В группе пациентов отмечено статистически достоверное увеличение частоты гомозиготного генотипа TNFA*-308A/A, на долю которого приходилось 11,11% по сравнению с контрольной группой, где частота данного генотипа достигала лишь 2,00% (p=0,01, OR=6,13, 95%CI 1,58-23,82) (рис. 4). Аллель TNFA*-308A в выборке детей с тяжелым течением БА определялся также чаще (в 23,33% случаев), чем в контрольной группе (10,25%, р=0,0007, OR=2,66, 95%CI 1,48-4,79). Генотип TNFA*-308G/G и аллель TNFA*-308G среди детей, больных БА, определялись реже (в 64,44% и 76,67% случаев), чем в соответствующей контрольной группе (81,50%, p=0,01, OR=0,41 и 89,75%, p=0,0007, OR=0,38, соответственно) (рис. 4).

Значительная ассоциация аллеля TNFA*-308A с астмой отмечается во многих исследованиях. Gаo J. с соавт. провели мета-анализ, включивший в себя 15 исследований случай-контроль на выборках более чем в 5 тыс. человек. В результате установлены положительные ассоциации между аллелем TNFA*-308A и астмой в 9 исследованиях [Gao J. et al., 2006]. В европейских популяциях была обнаружена значимая ассоциация полиморфного варианта TNFA(-308GA) со средней степенью тяжести бронхиальной астмы, а также с БА, ведущей к летальному исходу [Chagani T. et Кроме того, в клетках al., 1999].

бронхоальвеолярного лаважа, в биоптате легких, слюне астматиков по сравнению с образцами здоровых людей обнаруживается высокий уровень экспрессии TNFA [Taki F. et al., 1991;

Cembrzynska-Nowak M. et al., 1993], ассоциированный с аллелем TNF*-308A [Wilson A.G. et al., 1997].

Таким образом, в результате проведенного исследования установлена ассоциация полиморфных вариантов генов IL4, IL4RA и TNFA с развитием БА в РБ. Кроме того, обнаружены статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов между контрольными группами русской и башкирской этнической принадлежности по полиморфному локусу -627CA гена IL10 (2=7,24, p=0,007 и 2=6,55, p=0,04). Анализ полиморфных вариантов IL10 (-627CA), IL1B (3953CT), IL1RA (VNTR) показал отсутствие ассоциации данных ДНК-локусов с бронхиальной астмой.

2. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов системы биотрансформации с бронхиальной астмой в Республике Башкортостан В настоящее время подавляющее число распространенных заболеваний человека в той или иной мере обусловлено воздействием неблагоприятных факторов внешней среды. Различные химические токсины, так называемые ксенобиотики, могут провоцировать начало и способствовать развитию этих заболеваний [Баранов В.С. и др., 2000].

Ферменты первой фазы биотрансформации, а именно, цитохромы семейства Р-450, участвуют в метаболизме множества липофильных, биологически активных ксенобиотиков, которые включают большое количество терапевтических средств и токсичные вещества окружающей среды [Баранов В.С. и др., 2008;

Ляхович В.В.

и др., 2002;

Фрейдин М.Б. и др., 2006;

Polonikov A.V. et al., 2009]. В нашей работе проведено исследование полиморфных локусов генов CYP1A1 (4887CA, 4889AG, 6235TC), CYP2D6 (1934GA), CYP2C9 (430CT, 1075AC), CYP2C (681GA), в результате которого не установлено ассоциаций данных ДНК-локусов с бронхиальной астмой в РБ. По полиморфному локусу CYP2D6 (1934GA) обнаружены статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов между контрольными группами русской и татарской этнической принадлежности (2=6,73, p=0,009 и 2=6,87, p=0,03, соответственно).

Анализ ассоциации полиморфных вариантов 481СТ, 590GA и 857GA гена NAT2 у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта 481СТ гена NAT2 в контрольных выборках различной этнической принадлежности обнаружил достоверные отличия между русскими и татарами (2=12,72, p=0,0004 и 2=13,29, p=0,001). Последующее исследование данного полиморфного локуса выявило, что у пациентов русской этнической принадлежности генотип NAT2*481T/T встречается реже (13,77%), чем в контроле (24,51%, p=0,03, OR=0,49, 95%CI 0,26-0,92).

OR=1,88 OR=0, 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% CC CT TT C T Дети с аллергической формой БА Контрольная группа Рис. 5. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта 481СT гена NAT2 у детей, больных БА, и в контрольной группе русской этнической принадлежности.

Различия в распределении частот аллелей данного полиморфного локуса между группами больных БА и контроля с учетом возраста были статистически значимы у детей русской этнической принадлежности (2=4,77, p=0,03). Аллель NAT2*481C является маркером повышенного риска развития БА (в данном случае, аллергической формы) у детей русской этнической принадлежности (OR=1,88, 95%CI 1,06-2,98), аллель NAT2*481T – маркером пониженного риска (OR=0,56, 95%CI 0,34-0,94) (рис. 5). Полученные ассоциации согласуются с исследованиями российских ученых, которые установили, что аллель NAT2*481T является протективным, а отсутствие этого аллеля связано с развитием астмы у русских детей [Makarova S.I. et al., 2000].

В то же время, у больных БА татарской этнической принадлежности, напротив, выявлено достоверное повышение частоты генотипа NAT2*481T/T (20,00%) по сравнению с контрольной группой (7,07%, p=0,008, OR=3,29, 95%CI 1,31-8,23). Маркером повышенного риска развития БА у татар является аллель NAT2*481T (p=0,04, OR=1,54, 95%CI 1,01-2,35), маркером пониженного риска – аллель NAT2*481C (OR=0,65, 95%CI 0,43-0,99) (рис. 6).

OR=0, 80,00% 70,00% OR=1, 60,00% OR=3, 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% CC CT TT C T Больные БА Контрольная группа Рис. 6. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта 481СT гена NAT2 в группах больных БА и контроля татарской этнической принадлежности.

Обнаруженные по данному локусу ассоциации с бронхиальной астмой у татар согласуются с результатами других исследований. Так, в работах Zielinska E. с соавт. было показано, что медленные ацетиляторы преобладают в группе пациентов с аллергией, проживающих на территории центральной Польши, по сравнению с контролем [Zielinska E. et al., 1997]. Необходимо отметить, что соотношение быстрых и медленных аллелей гена NAT2 значительно варьирует в популяциях с различным этническим и географическим происхождением, разные аллельные варианты гена NAT2 могут модулировать риск развития БА у лиц различной этнической принадлежности [Lin H.J. et al., 1994;

Голденкова-Павлова И.В. и др., 2001;

Hamdy S.I. et al., 2003].

В результате проведенного анализа полиморфных вариантов 590GA и 857GA гена NAT2 не обнаружено ассоциаций данных ДНК-локусов с развитием бронхиальной астмы в РБ. Анализ полиморфных локусов генов GSTT1 и GSTM1, кодирующих ферменты II-ой фазы детоксикации, не выявил достоверных отличий между исследуемыми выборками больных БА и контроля.

Анализ ассоциации полиморфного варианта 677СТ гена MTHFR у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе Проведен анализ полиморфного варианта 677СТ гена MTHFR у больных БА и в контрольной группе из РБ. Анализ распределения частот аллелей и генотипов данного полиморфного локуса в группе индивидов старше 18 лет татарской этнической принадлежности выявил статистически значимые различия между больными и здоровыми индивидами (2=10,54, p=0,001 и 2=9,85, p=0,007, соответственно). В группе пациентов отмечалось понижение частоты генотипа MTHFR*677T/T (2,17%) по сравнению с контролем (17,95%, p=0,03, OR=0,10, 95%CI 0,01-0,87) и повышение частоты генотипа MTHFR*677С/С (67,39%), выявляемого у здоровых индивидов в 38,46% случаев (p=0,008, OR=3,31, 95%CI 1,35-8,07). Аллель MTHFR*677C в выборке пациентов встречался в 82,61% случаев, тогда как у здоровых индивидов частота аллеля MTHFR*677C была значительно ниже (60,26%, OR=3,13, 95%CI 1,55-6,34). Также обнаружена более низкая частота аллеля MTHFR*677T в группе пациентов (17,39%) по сравнению с контролем (39,74%, OR=0,32, 95%CI 0,16-0,65) (рис. 7).

90,00% OR=3, 80,00% OR=3, 70,00% 60,00% OR=0, 50,00% OR=0, 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% CC CT TT C T Больные БА старше 18 лет Контрольная группа Рис. 7. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта 677СT гена MTHFR в группах больных БА и контроля старше 18 лет татарской этнической принадлежности.

Таким образом, в результате проведенного исследования установлена ассоциация полиморфных вариантов генов NAT2 и MTHFR с развитием БА в РБ.

3. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена ADAM33 с бронхиальной астмой в Республике Башкортостан ADAM33 принадлежит к семейству генов, участвующих в межклеточных взаимодействиях и миграции клеток. ADAM33 экспрессируется преимущественно в гладкой мускулатуре и фибробластах дыхательных путей, что, по всей видимости, свидетельствует о важной роли данного гена в ремоделировании дыхательных путей [Van Eerdewegh P. et al., 2002;

Holgate S.T. et al., 2006].

Проведен анализ полиморфного варианта 11434CA (ST+4) гена ADAM33 у больных БА и здоровых индивидов из РБ. Значительное увеличение частоты гомозиготного генотипа ADAM33*11434A/A (55,56%) и аллеля ADAM33*11434A (70,0%) отмечалось в группе пациентов с тяжелым течением БА русской этнической принадлежности по сравнению со здоровыми индивидами (28,46% и 53,66%, соответственно). Показатель отношения шансов для носителей генотипа ADAM33*11434A/A составил 3,14 (p=0,001, 95%CI 1,55-6,37), для носителей аллеля ADAM33*11434A – 2,02 (p=0,007, 95%CI 1,20-3,38). Генотип ADAM33*11434A/C и аллель ADAM33*11434C являются маркерами пониженного риска развития тяжелой формы БА у индивидов русской этнической принадлежности (OR=0,40, 95%CI 0,19-0,83 и OR=0,50, 95%CI 0,30-0,83) (рис. 8).

OR=2, 70,00% OR=3, 60,00% OR=0, 50,00% OR=0, 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% AA AC CC A C Больные с тяжелым течением БА Контрольная группа Рис. 8. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта 11434СA гена ADAM33 в группах больных с тяжелым течением БА и контроля русской этнической принадлежности.

В детской группе больных аллергической астмой русской этнической принадлежности отмечалось значительное увеличение частоты гомозиготного генотипа ADAM33*11434A/A (50,00%) по сравнению с русскими детьми без признаков атопических заболеваний (27,27%, p=0,009, OR=2,67, 95%CI 1,27-5,59).

Генотип ADAM33*11434A/C является маркером пониженного риска развития БА у детей русской этнической принадлежности (p=0,0004, OR=0,28, 95%CI 0,13-0,58) (рис. 9).

OR=2,67 OR=0, 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% AA AC CC A C Дети с аллергической формой БА Контрольная группа Рис. 9. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта 11434СA гена ADAM33 в группах детей, больных БА, и контроля русской этнической принадлежности.

У индивидов старше 18 лет русской этнической принадлежности обнаружена ассоциация аллеля с риском развития ADAM33*11434A неаллергической формы БА, частота встречаемости которого среди больных данной группы составила 65,56%, среди контроля – 50,74% (p=0,03, OR=1,85, 95%CI 1,07-3,20). Частота аллеля ADAM33*11434C была значительно ниже в выборке пациентов (34,44%), чем в контроле (49,26%, OR=0,54, 95%CI 0,31-0,94) (рис. 10).

Полученные результаты согласуются с исследованиями других авторов. В работе Van Eerdewegh P. с соавт. также отмечается повышенная частота аллеля ADAM33*11434A в выборке пациентов с БА европейского происхождения по сравнению с контрольной группой [Van Eerdewegh P. et al., 2002]. Обнаружена ассоциация полиморфного локуса ADAM33 (ST+4) с общим уровнем IgE у латиноамериканцев и афро-американцев [Horward T.D. et al., 2003].

OR=1,85 OR=0, 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% AA AC CC A C Индивиды с неаллергической формой БА старше 18 лет Контрольная группа Рис. 10. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта 11434СA гена ADAM33 в группах индивидов, больных БА, и контроля старше лет русской этнической принадлежности.

Проведенный нами анализ полиморфного варианта 6716GC гена ADAM показал отсутствие ассоциации данного ДНК-локуса с БА в РБ.

Полиморфные локусы 11434СA и 6716GC гена ADAM33 находятся в неравновесии по сцеплению друг с другом (D'=0,317, 2=151). В результате гаплотипического анализа было обнаружено 4 гаплотипа. Показано, что гаплотип ADAM33*11434C/6716C достоверно реже встречался как в общей выборке пациентов русской этнической принадлежности (LR=16,11, p=0,00006, =–0,99), так и при разделении ее по возрастным группам: у детей, больных БА (LR=4,86, p=0,03, =–0,82), и у пациентов старше 18 лет (LR=11,24, p=0,0008, =–1,13), по сравнению с соответствующими контрольными группами.

4. Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к бронхиальной астме Помимо оценки влияния отдельных полиморфных вариантов на развитие многофакторных заболеваний, необходимо учитывать воздействие, обуславливаемое другими генами и факторами окружающей среды.

Непараметрическая программа GMDR (MDR) (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction), использующая подход редукции размерных величин, была разработана для поиска ген-генных и ген-средовых взаимодействий [Ritchie et al., 2001;

Lou X.Y. et al., 2007]. С помощью программы GMDR была определена модель ген-генного взаимодействия ДНК-локусов, ассоциированная с развитием БА в РБ: IL10 (-627CA), IL4 (-590CT) и ADAM33 (11434CA). Тестируемая сбалансированная точность (Bal.Acc.) данной модели составила 0,57. Кроме того, при исследовании межгенных взаимодействий была определена шестифакторная модель взаимодействия полиморфных вариантов генов цитокинов, детерминирующая развитие аллергической формы БА у детей русской этнической принадлежности: TNFA (-308GA), IL10 (-627CA), IL4 (-590CT), IL4RA (Ile50Val), IL1RA (VNTR) и IL1B (3953CT). Тестируемая сбалансированная точность (Bal.Acc.) данной модели составила 0,69. Обнаружена комбинация трех локусов (IL4 (-590CT), IL1RA (VNTR) и ADAM33 (11434CA)), которая ассоциирована с неаллергической формой БА у индивидов старше 18 лет русской этнической принадлежности. Сбалансированная точность (Bal.Acc.) данной модели составила 0,68. У индивидов старше 18 лет татарской этнической принадлежности выявлена четырехфакторная модель взаимодействия следующих ДНК-локусов: CYP1A1, GSTM1, MTHFR (677CT), NAT2 (481CT).

Сбалансированная точность (Bal.Acc.) данной модели составила 0,72.

В большинстве случаев в детском возрасте бронхиальная астма связана с атопией и проявляется в виде аллергической формы заболевания. Выявленные «цитокиновые модели» риска БА у детей хорошо укладываются в IgE-зависимый механизм развития астмы в раннем возрасте, в то время как взаимодействие полиморфных вариантов генов детоксикации может обуславливать неаллергический механизм развития заболевания в более позднем возрасте.

Структурная перестройка бронхиального дерева (гипертрофия и гиперплазия гладких мышечных клеток и субэпителиальный фиброз) является важным компонентом патогенеза заболевания как у детей, так и в старшем возрасте.

Присутствие в моделях межгенного взаимодействия гена ADAM33, участвующего в ремоделировании дыхательных путей, свидетельствует о несомненном вкладе этого гена в развитие БА у индивидов из РБ [Holgate S.T., 2008;

Grammatikos A.P., 2008;

Weiss S.T., 2009].

Таким образом, проведено молекулярно-генетическое исследование БА, в результате которого показан вклад полиморфных вариантов генов IL4, IL4RA, TNFA, NAT2, MTHFR, ADAM33 в формирование генетической структуры предрасположенности к бронхиальной астме в Республике Башкортостан.

Определены маркеры повышенного и пониженного риска развития аллергической и неаллергической БА, а также обнаружена ассоциация полиморфных локусов генов-кандидатов с тяжестью течения заболевания. Выявлены ключевые межгенные взаимодействия, детерминирующие развитие бронхиальной астмы.

ВЫВОДЫ Обнаружены значимые отличия по распределению частот аллелей и 1.

генотипов полиморфных локусов IL4 (-590CT), IL10 (-627CA), CYP2D (1934GA), NAT2 (481CT) между контрольными выборками русских, татар и башкир.

Выявлено, что маркерами повышенного риска развития аллергической 2.

формы бронхиальной астмы у детей русской этнической принадлежности являются генотипы IL4*-590T/T, ADAM33*11434A/A и аллели IL4*-590T, NAT2*481С, маркерами пониженного риска – генотип ADAM33*11434A/C и аллель IL4*-590С.

Установлено, что маркером повышенного риска развития аллергической 3.

формы БА у татар в детском возрасте является аллель IL4RA*50Val, маркерами пониженного риска – генотип IL4RA*50Ile/Ile и аллель IL4RA*50Ile.

Выявлено, что маркерами повышенного риска развития аллергической 4.

формы БА у детей являются генотип TNFA*-308G/A и аллель TNFA*-308A, маркерами пониженного риска – генотип TNFA*-308G/G и аллель TNFA* 308G. Генотип TNFA*-308A/A ассоциирован с тяжелым течением БА у детей.

Обнаружено, что у индивидов старше 18 лет русской этнической 5.

принадлежности маркером повышенного риска развития неаллергической формы БА является аллель ADAM33*11434A. У индивидов старше 18 лет татарской этнической принадлежности маркерами повышенного риска развития БА являются генотип MTHFR*677C/C и аллель MTHFR*677C.

Выявлено межгенное взаимодействие полиморфных локусов генов 6.

цитокинов, детерминирующее развитие аллергической формы БА у детей русской этнической принадлежности – TNFA, IL10, IL4, IL4RA, IL1RA, IL1B. Определены комбинации полиморфных вариантов генов IL4, IL1RA, предрасполагающие к развитию неаллергической формы ADAM33, бронхиальной астмы у русских старше 18 лет. Обнаружены сочетания полиморфных вариантов генов, ассоциированные с развитием бронхиальной астмы у татар старше 18 лет – CYP1A1, GSTM1, MTHFR, NAT2.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Федорова Ю.Ю., Гра О.А., Карунас А.С., Хузина А.Х., Рамазанова Н.Н., Юлдашева А.А., Бикташева А.Р., Эткина Э.И., Наседкина Т.В., Голденкова-Павлова И.В., Хуснутдинова Э.К. Ассоциация полиморфных вариантов генов системы биотрансформации с атопическими заболеваниями у русских детей из Республики Башкортостан // Молекулярная биология. – 2009. – Т.43. – №6. – С. 1032-1039.

2. Федорова Ю.Ю., Карунас А.С., Гра О.А., Рамазанова Н.Н.. Гурьева Л.Л., Эткина Э.И., Голденкова-Павлова И.В., Хуснутдинова Э.К. Ассоциация полиморфных вариантов генов системы биотрансформации с бронхиальной астмой у татар // Якутский медицинский журнал. – 2009. – №2. – С. 93-95.

3. Khusnutdinova E.K., Karunas A.S., Fedorova U.U., Gilyazova I.R. Association of candidate genes polymorphism with asthma in Bashkortostan Republic of Russia // In: Molecular Polymorphism of Man. Ed.: S.D. Varfolomyev, G.E.

Zaikov. Moscow, 2009. – P. 540-582.

4. Федорова Ю.Ю., Карунас А.С., Рамазанова Н.Н., Эткина Э.И., Хуснутдинова Э.К. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов с атопической бронхиальной астмой в Республике Башкортостан // Биомика – наука XXI века: Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии. – Уфа, 2007 – C. 126-127.

5. Y. Fedorova, A.Karunas, N. Ramazanova, E.Etkina, E.Khusnutdinova.

Association analysis of interleukin gene polymorphisms with childhood asthma in Volga-Ural region of Russia // European Respiratory Society 18-th annual congress. – Berlin, 2008 – P. 362s.

6. Y. Fedorova, A.Karunas, N. Ramazanova, E.Etkina, E.Khusnutdinova. The role of cytokine gene polymorphisms in the pathogenesis of childhood asthma // European Human Genetics Conference. – Barcelona, 2008 – P. 294.

7. Гра О.А., Кожекбаева Ж.М., Гра Д.В., Федорова Ю.Ю., Скотникова О.И., Киселева Н.П., Киселев Ф.Л., Голденкова-Павлова И.В., Наседкина Т.В.

Биочиповые технологии в диагностике социально-значимых многофакторных заболеваний // Вестник биотехнологии и физико химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. – 2009 – Т.5 – №1 – С.

14-18.

8. Федорова Ю.Ю., Карунас А.С., Измайлова А.Р., Исламгулов Д.Р., Хуснутдинова Э.К. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1, CYP1A1) с бронхиальной астмой в Республике Башкортостан // Аграрная Россия. – Москва, 2009. – C. 132-133.

9. Федорова Ю.Ю., Карунас А.С., Гра О.А., Рамазанова Н.Н., Эткина Э.И., Голденкова-Павлова И.В., Хуснутдинова Э.К. Ассоциация полиморфных вариантов генов биотрансформации ксенобиотиков с развитием бронхиальной астмы у детей // V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. – Москва, 2009. – С. 386.

10.Y. Fedorova, A. Karunas, O. Gra, I. Goldenkova-Pavlova, E. Khusnutdinova.

Biochip analysis of the role of xenobiotic-metabolizing gene polymorphisms in the pathogenesis of bronchial asthma in Volga-Ural region of Russia // XXVIII Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology. – Poland, 2009. – P. 187.

11.Y. Fedorova, A. Karunas, O. Gra, I. Goldenkova-Pavlova, E. Khusnutdinova.

Biochip analysis of xenobiotic-metabolizing gene polymorphisms in children with bronchial asthma // 19 th Annual Congress European respiratory Society. – Vienna, 2009. – P. 137s.

12.Y. Fedorova, A. Karunas, N. Ramazanova, O. Gra, I. Goldenkova-Pavlova, E.

Khusnutdinova. Association analysis of xenobiotic-metabolizing gene polymorphisms with asthma in Volga-Ural region of Russia // European Human Genetics Conference. - Vienna, 2009. – P. 234.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ БА Бронхиальная астма ПДРФ Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов GMDR - Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction Иммуноглобулин E IgE Интерлейкин 1, 4, IL1, 4, 10 -цепь рецептора интерлейкина IL4RA Рецепторный антагонист интерлейкина IL1RA Фактор некроза опухолей TNFA Дизинтегрин и металлопротеаза ADAM Цитохром Р CYP Глутатион-S-трансфераза GST Метилентетрагидрофолатредуктаза MTHFR Ариламин-N-ацетилтрансфераза NAT Соотношение шансов OR Доверительный интервал 95%CI

 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.