авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Астрологический Прогноз на год: карьера, финансы, личная жизнь


Изучение механизмов резистентности клеток меланомы человека к противоопухолевой терапии

На правах рукописи

Кондрашева Ирина Григорьевна

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕЗИСТЕНТНОСТИ КЛЕТОК

МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА К ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ

03.00.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2008

1

Диссертация выполнена в Государственном учреждении здравоохранения г.

Москвы "Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии" Департамента здравоохранения г. Москвы

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Москалева Елизавета Юрьевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Белушкина Наталья Николаевна доктор биологических наук, Берман Альберт Ефимович

Ведущая организация Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится "11"_декабря 2008 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01. при ГУ НИИ БМХ РАМН по адресу:

119121, Москва, ул. Погодинская, д.10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ БМХ РАМН.

Автореферат разослан "_" 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Е.А. Карпова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

Актуальность проблемы. Меланома – чрезвычайно злокачественная опухоль, развивающаяся из меланоцитов и характеризующаяся высокой природной устойчивостью к противоопухолевым препаратам, биохимические механизмы которой не известны (Serrone L. et al., 1999;

Helmbach H. et al., 2003).

Действие большей части противоопухолевых препаратов приводит к индукции апоптоза в опухолевых клетках в результате повреждения молекулы ДНК или других внутриклеточных мишеней (Zhivotovsky B. et al., 2003). Кроме того, важную роль при действии и химиотерапевтических средств и опухолеспецифических цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) играет Fas-зависимый путь индукции апоптоза (Friesen C. et al., 1999, Classen C. et al., 1999). В тоже время существуют метаболические системы, препятствующие повреждению клеток. Это процессы, формирующие уровень внутриклеточных антиоксидантов;

системы репарации ДНК;

генетические особенности, приводящие к блокированию индукции и ингибированию процессов апоптоза;

белки теплового шока, в частности Hsp70, и АТФ-зависимые транспортеры, обеспечивающие выброс токсических веществ из клеток, и тем самым препятствующие образованию их эффективных концентраций. В клетках меланомы обнаружены гены АВС транспортеров (АВС – ATP-binding cassette) ABCB1 (MDR1), ABCB5, АВСС1 (MRР1) и ABCG2 (BCRP), кодирующие белки, которые осуществляют АТФ-зависимый транспорт как гидрофобных, так и некоторых гидрофильных соединений из клеток в среду (Gottesman M.M. et.al., 2002;

Choi C.H., 2005;

Frank N.Y. et.al., 2005;

Monzani E. еt.al., 2007).

Вариабельность активности каждой из названных систем может приводить к формированию различных механизмов резистентности клеток меланомы к противоопухолевой терапии.

В связи с этим целью работы явилось исследование биохимических механизмов устойчивости клеток меланомы человека различных линий к действию противоопухолевых препаратов и новых подходов к ее снижению.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

- изучение чувствительности клеток меланомы человека различных линий к противоопухолевым препаратам с разным механизмом действия и к новому N1,N6-бис[2,2,6,6-тетракис(трифторметил)-3,6-дигидро-2H-1,3,5 препарату оксадиазин-4-ил]-1,6-гександиамину (БТОГ);

- изучение содержания белка MDR1 на мембране клеток разных линий меланомы человека и его связи с устойчивостью клеток к противоопухолевым препаратам;

- исследование накопления Rho-123 клетками меланомы и скорости его выхода для оценки функциональной активности АВС-транспортеров;

- изучение содержания белка Hsp70 в клетках меланомы человека как фактора устойчивости к противоопухолевым препаратам;

- анализ содержания белков Fas и FasL в клетках меланомы человека различных линий и их связи с чувствительностью клеток меланомы к действию противоопухолевых препаратов и ЦТЛ;

- исследование влияния рекомбинантного белка MIS человека (rhMIS) на выживаемость клеток меланомы человека и их чувствительность к дакарбазину.

Научная новизна работы. Впервые показано, что новый препарат БТОГ обладает высокой противомеланомной активностью, которая не зависит от содержания белка MDR1 в опухолевых клетках.

Впервые обнаружено, что в клетках меланомы человека с фенотипом MDR1-происходит быстрое выведение Rho-123, чувствительное к верапамилу.

Впервые показано, что верапамил повышает чувствительность клеток меланомы человека с фенотипом MDR1- к действию доксорубицина, дакарбазина и препарата БТОГ.

Впервые показано, что все линии меланомы человека содержат значительную фракцию клеток, не включающих Rho-123, размер которой не зависит от действия верапамила (за исключением линии MDR1+) и возрастает при действии противоопухолевых препаратов.

Впервые показано, что обнаруженный в клетках меланомы человека высокий уровень содержания белка Hsp70 коррелирует с их устойчивостью к противоопухолевым препаратам.

Впервые показано, что rhMIS сенсибилизирует клетки меланомы человека к действию дакарбазина, а повторная обработка клеток белком rhMIS приводит к усилению его антипролиферативного и сенсибилизирующего действия.



Практическая значимость исследования. Обнаруженная высокая противомеланомная MDR1-независимая активность нового препарата N1,N6 бис[2,2,6,6-тетракис-(три-фторметил)-3,6-дигидро-2H-1,3,5-оксадиазин-4-ил] 1,6-гександиамина (БТОГ) позволяет рекомендовать этот препарат для проведения доклинических испытаний на животных.

Выявленное повышение чувствительности клеток меланомы человека к дакарбазину в присутствии верапамила может быть использовано в клинической практике при лечении меланомы.

Обнаруженное снижение выживаемости клеток меланомы человека в присутствии белка rhMIS, и его способность сенсибилизировать клетки меланомы к действию дакарбазина, позволяют рекомендовать этот белок для клинических исследований.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Всероссийском форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт Петербурге " (2004 г., Санкт-Петербург), II Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (2004 г., Москва), XIV Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (2007 г., Москва), XI Российском Онкологическом конгрессе с международным участием (2007 г., Москва), Российской конференции по меланоме совместно со Всемирной рабочей группой по меланоме и Европейской школой онкологии (2008 г., Москва).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ: статьи, из них 3 опубликованы в журналах, состоящих в перечне ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК и публикаций представленных материалами конференций.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машино писного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы и список цитированной литературы, включающий 189 источников.

Работа иллюстрирована 27 рисунками и таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Культивирование клеток меланомы человека. Клетки перевиваемых линий меланомы человека Bro-B19 и MS культивировали в среде DMEM, а Mel-3 - Mel-10 - в полной культуральной среде, cостоящей из смеси сред RPMI-1640 и DMEM в соотношении 1:1, содержащей 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота (СПК) и 50 мкг/мл гентамицина в пластиковых культуральных флаконах в СО2-инкубаторе при +37оС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2.

2. Определение цитотоксической активности различных препаратов in vitro. Выживаемость клеток после инкубации с исследуемыми соединениями в различных концентрациях в течение 72 часов в 96-луночных планшетах определяли с помощью МТТ-теста по методу Mossman (1983). Для этого за часа до окончания инкубации в каждую лунку добавляли раствор МТТ (3 [4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетрозолий бромид). Затем среду удаляли, кристаллы формазана растворяли в ДМСО и измеряли интенсивность окраски. Выживаемость клеток оценивали в процентах от соответствующего контроля и по кривым выживаемости рассчитывали IC – концентрацию препарата, при которой наблюдается гибель 50% клеток.

3. Исследование содержания белка MDR1 на мембране клеток проводили с использованием моноклональных антител (МкАт) к белку MDR1, меченных фикоэритрином (клон UIC2), в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Анализировали интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL и определяли значение средней интенсивности флуоресценции (MFI).

4. Исследование накопления флуоресцентного красителя Rho- клетками меланомы человека и скорости его выхода из клеток. К суспензии клеток в бессывороточной среде добавляли Rho-123 (0,1 мкг/мл), и инкубировали их 60 мин при +37°С. Для исключения погибших клеток, в пробу добавляли раствор йодистого пропидия (2 мкг/мл) непосредственно перед цитофлуориметрией. Флуоресценцию клеток измеряли с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL в красной и зеленой области спектра при длине волны возбуждения 488 нм и полосой пропускания для зеленой области спектра – 525 нм (FL1), а для красной – 620 нм (FL3).

Анализировали 50 000 тыс. клеток.

5. Внутриклеточное окрашивание клеток МкАт к Hsp70. Клетки меланомы промывали ФСБ с 1% БСА и 0,1% NaN3 и фиксировали в 2% параформальдегиде. Клетки пермеабилизировали в течение 5 минут при комнатной температуре в буфере для пермеабилизации (отмывочный буфер, содержащий 0,5% сапонина и 1% инактивированной сыворотки человека).





Пробы инкубировали с ФИТЦ-меченными МкАт к Hsp70 клон 3А (“HyTest”, Финляндия) в течение 1 часа при +40С, отмывали, фиксировали 2% параформальдегидом и измеряли их флуоресценцию на цитофлуориметре EPICS-XL (“Coulter Electronics”, США).

6. Иммуноблотинг проводили по стандартному протоколу Towbin et al.

(1979). После фракционирования лизатов клеток с помощью Ds-Na-ПААГ электрофореза по Laemmli, переносили белки на мембрану с использованием установки для электропереноса (Hoefer TE 70 series, “Amersham Pharmacia Biotech”). Мембрану инкубировали с первичными МкАт к Hsp70 (клон 3А3) и к -актину, после чего проводили инкубацию со вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена. Иммунные комплексы на мембране проявляли, используя субстрат, содержащий 3,3-диаминобензидин, хлорнафтол и Н2О2.

7. Исследование содержания белков Fas и FasL в опухолевых клетках проводили с помощью иммуноцитохимического метода при окрашивании клеток, фиксированных на стеклах 4% параформальдегидом, с использованием непрямого стрептавидин-биотин-пероксидазного метода.

Использовали антитела к Fas клон UT2 ("Сорбент") и к FasL клон G247- ("Pharmingen") при визуализации специфического связывания с помощью световой микроскопии и цифровой камеры DXM 1200 ("NIKON").

8. Приготовление лимфоцитов и дендритных клеток (ДК). Лимфоциты выделяли из фракции мононуклеарных лейкоцитов периферической крови после отделения моноцитов с помощью адгезии. ДК получали из моноцитов с использованием цитокинов ГМ-КСФ и ИЛ-4, нагружали лизатом опухолевых клеток и индуцировали созревание ДК, добавляя "Лейкинферон" и ФНОальфа. Опухолевые клетки лизировали при замораживании оттаивании суспензии клеток в фосфатно-солевом буфере (ФСБ).

9. Индукция меланомаспецифических ЦТЛ с помощью ДК. Для индукции ЦТЛ 2х106 лимфоцитов и 100х105 ДК, обработанных опухолевыми антигенами, инкубировали в питательной среде IMDM с 10% СПК в 24 луночных платах. На следующий день и дважды в неделю в последующем к культурам добавляли 30 ед/мл ИЛ-2. Раз в неделю культуры рестимулировали нагруженными лизатом ДК. После двух рестимуляций лимфоциты использовали для анализа цитотоксической активности (ЦТА).

10. Определение ЦТА лимфоцитов человека. К опухолевым клеткам мишеням в 96-луночном планшете добавляли суспензию лимфоцитов в соотношении клетки-мишени:клетки-эффекторы, равном от 1:1 до 1:40.

Через 72 ч инкубации лимфоциты отмывали, опухолевые клетки окрашивали МТТ по методу Mossman (1983) и измеряли количество выживших клеток.

ЦТА лимфоцитов расчитывали по формуле: ЦТА = [Амишень - Амишень+эффектор]:

Амишеньx100%, где А(мишень+эффектор) и А(мишень) – оптическая плотность проб, где инкубировались опухолевые клетки-мишени с клетками-эффекторами и только клетки-мишени, соответственно.

11. Исследование связывания rhMIS с поверхностной мембраной клеток проводили с использованием rhMIS-ФИТЦ при его инкубации с клетками при +4оС в течение 1 часа. После отмывания клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Выявление MIS-связывающего белка внутри клеток проводили, как описано в п.8 при внутриклеточном окрашивании МкАт к Hsp70. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL.

12. Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов по методу Стьюдента и корреляционный анализ проводили с использованием компьютерной программы "Origin".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Исследование чувствительности клеток меланомы человека к противоопухолевым препаратам с различным механизмом действия и N1,N6-бис[2,2,6,6-тетракис- (трифторметил)-3,6-дигидро-2H-1,3,5-оксади азин-4-ил]-1,6-гександиамину (БТОГ).

Исследование проведено при использовании двух известных перевиваемых линий меланомы человека из международных коллекций - MS и Bro-B19 и восьми новых линий, полученных из фрагментов опухолей. Значения IC дакарбазина, паклитакселя, доксорубицина и БТОГ определяли в параллельных экспериментах (табл.1). Непролиферирующие (нестимули рованные) лимфоциты человека были достаточно устойчивы к исследованным препаратам, но среди меланом 1 из 10 линий была более устойчива к дакарбазину, чем лимфоциты (Mel-7), 1 из 10 – к доксорубицину (Mel-8) и 1 из 10 к паклитакселю (Mel-7). При сравнении меланом с пролиферирующими лимфоцитами обнаружено, что из 10 линий 5 были более устойчивы, чем лимфоциты к дакарбазину, 8 – к доксорубицину и 5 к паклитакселю. Таким образом, клетки меланомы человека различных линий устойчивы к действию противоопухолевых препаратов по сравнению с пролиферирующими и даже покоящимися нормальными клетками человека и чувствительность отдельных линий значительно варьирует.

При исследовании нового препарата БТОГ обнаружено, что 2 из линий меланом более устойчивы к этому препарату, чем покоящиеся лимфоциты и 4 из 10 линий меланом более устойчивы, чем стимулированные конканавалином А лимфоциты. Препарат БТОГ, так же как и дакарбазин, в отличие от доксорубицина и паклитакселя, был высоко активен как Таблица 1. Чувствительность клеток различных линий меланомы и лимфоцитов человека к противоопухолевым препаратам с разным механизмом действия.

Линия клеток Дакарбазин Доксорубицин Паклитаксель БТОГ IC50, мМ IC50, мкМ Bro-B19 0,14±0,08 0,08±0,01 0,04±0,02 0,38±0, MS 0,12±0,01 0,08±0,02 0,05±0,01 0,50±0, Mel-3 2,07±0,19 0,13±0,01 0,3±0,12 0,76±0, Mel-4 0,12±0,02 0,63±0,15 3,64±0,09 0,51±0, Mel-5 0,15±0,05 0,15±0,07 5,65±0,35 0,70±0, Mel-6 2,30±0,15 0,14±0,03 56,30±0,41 1,28±0, Mel-7 5,90±0,24 0,64±0,08 150 3,64±0, Mel-8 0,12±0,07 4,53±0,30 2,76±0,02 0,67±0, Mel-9 2,30±0,18 2,80±0,25 0,17±0,01 4,25±0, Mel-10 1,37±0,45 0,39±0,01 0,05±0,01 1,40±0, Нестимулирован ные лимфоциты 3,47±0,32 2,90±0,28 100 1,82±0, Стимулированные КонА лимфоциты 0,32±0,03 0,10±0,01 1,58±0,21 0,68±0, А Б Доксорубицин Паклитаксель 1 - IC50 = 0,07 мкг/мл = 0,08 мкМ 1 - IC50 = 0,09мкг/мл = 0,15 мкМ 100 100 2 - IC50 = 4,00 мкг/мл = 4,60 мкМ 2 - IC50 = 2,17мкг/мл = 3,67 мкМ Выживаемость,% 80 Выживаемость,% 60 40 20 20 0 0.1 1 0.1 Концентрация, мкг/мл Концентрация, мкг/мл Г В Дакарбазин БТОГ 100 1 - IC50 = 280 мкг/мл = 1600 мкМ 1 - IC50 = 0,26 мкг/мл = 0,30 мкМ 2 - IC50 = 50 мкг/мл = 260 мкМ 2 - IC50 = 0,41 мкг/мл = 0,48 мкМ 80 Выживаемость,% Выживаемость,% 60 40 40 20 0 0.1 1 10 0.01 0.1 Концентрация, мкг/мл Концентрация, мг/мл Рис.1. Чувствительность клеток исходной (1) и резистентной MDR1+ (2) линии хронической миелогенной лейкемии человека К562 к противоопухолевым препаратам.

в отношении исходных клеток линии К562, так и в отношении резистентных клеток К562Adr с высоким уровнем белка MDR1 (рис.1).

Таким образом, препарат БТОГ обладает высокой противомеланомной активностью и обращает множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток, обусловленную MDR1.

2. Исследование содержания белка MDR1 в клетках разных линий меланомы человека и его связь с устойчивостью клеток к противоопухолевым препаратам.

Данные, полученные при исследовании содержания белка MDR1 на поверхностной мембране клеток, позволили разделить изученные линии на две группы: с фенотипом MDR1- и MDR1+. Группу MDR1- составили клетки 6 из 10 линий, в которых присутствовало от 0,2 до 3,3% MDR1+ клеток с очень низким содержанием этого белка. Группу MDR1+ составили 4 из линий клеток, в которых доля MDR1+ клеток составляла от 17,8 до 72,5% с высоким содержанием белка MDR1. Значение MFI для клеток этих линий меланомы составляло от 2,3 до 9,0 усл. ед. Результаты исследования чувствительности линий меланом человека с фенотипом MDR1- и MDR1+ к различным противоопухолевым препаратам представлены в таблице 2.

Таблица 2. Чувствительность MDR1- и MDR1+ линий меланом человека к различным противоопухолевым препаратам.

IC50, мкМ MDR1+ Название MDR препарата Bro-B19, MS, Mel-5 - 7, -10 Mel-3, -4, -8, - Дакарбазин 1460±950 1150± Доксорубицин 0,24±0,09 2,65±1,01* БТОГ 1,32±0,49 1,54±0, *р0, Полученные результаты свидетельствуют о том, что цитотоксическое действие дакарбазина и препарата БТОГ не зависит от присутствия MDR1 на клеточной мембране меланом. По данным табл.1 можно заключить, что MDR1+ линии меланом были более устойчивы и к паклитакселю, но чувствительность отдельных линий клеток к паклитакселю сильно варьировала, что не позволило использовать средние значения IC50 для сравнения чувствительности MDR1- и MDR1+ линий.

Присутствие даже небольшой доли MDR1+-клеток среди клеток меланом отдельных линий свидетельствует о том, что при химиотерапии препаратами аналогичными доксорубицину существует высокая вероятность быстрого развития множественной лекарственной устойчивости меланом и что природная устойчивость клеток меланом различных линий к химиотерапевтическим препаратам обусловлена иными механизмами, не связанными с функционированием белка MDR1.

3. Исследование накопления родамина-123 и скорости его выхода из клеток меланом человека с фенотипом MDR1- и MDR1+.

Накопление Rho-123 клетками меланом разных линий и скорости его выхода для оценки функциональной активности белков-транспортеров исследовали с использованием проточной цитофлуориметрии. Для регистрации накопления Rho-123 флуоресценцию измеряли одновременно в зеленой (525 нм) и красной (620 нм) области спектра (рис.2А, Б) или только в зеленой области (рис.2В, Г). При изучении клеток меланом человека разных линий оказалось, что все проанализированные линии содержали как клетки, активно накапливающие Rho-123, так и клетки, не накапливающие Rho-123 и образующие по этому признаку побочную популяцию – side population – SP (рис.2, табл.3, 4).

Клетки разных линий значительно отличались по способности накапливать Rho-123 (табл.3). Накопление красителя клетками MDR1- было достоверно и существенно более высоким, чем накопление Rho-123 клетками MDR1+, что свидетельствует об активном участии белка MDR1 в выбросе красителя из таких клеток. Обработка клеток ингибитором белка MDR верапамилом приводила к классическому увеличению накопления красителя только в линии Mel-8 с высоким уровнем MDR1. В остальных линиях клеток воздействие VP вызывало даже снижение накопления Rho-123 (табл.3).

Для анализа скорости выхода Rho-123 клетки после инкубации с красителем отмывали и инкубировали в растворе Хенкса в присутствии и без VP в течение 60 мин и измеряли интенсивность флуоресценции клеток.

Рис.2. Исследование накопле ния Rho-123 клетками мелано мы человека линии Bro-B19 с помощью проточной цитофлуо риметрии при анализе флуорес ценции в красной и в зеленой области спектра (А, Б) или только в зеленой области (В, Г).

А, В - аутофлуоресценция клеток, Б, Г – флуоресценция клеток после инкубации с Rho 123. А, Б - по оси абсцисс интенсивность зеленой флуорес ценции, по оси ординат – крас ной флуоресценции, усл.ед;

В, Г – по оси абсцисс – интенсивность зеленой флуоресценции, усл.ед, по оси ординат – количество клеток, усл.ед., 1 – аутофлуорес ценция клеток, 2 – клетки, накап ливающие Rho-123, 3 - клетки, не накапливающие Rho-123 (SP).

Таблица 3. Накопление Rho-123 клетками различных линий меланомы человека без и в присутствии ингибитора активности MDR1 верапамила (VP). Приведены средние значения трех независимых экспериментов или данные отдельных экспериментов. MFI – средняя интенсивность флуоресценции окрашенных Rho-123 клеток.

Линия Фенотип MFI, усл. ед.

клеток MDR1 Без VP В присутствии VP Bro-B19 69,6±19,4 27,3±2, MDR1 MS 28,4 21, Меl-5 90,8 79, Меl-10 61,6±13,5 39,3±4, MDR1+ Меl-8 4,5±0,1* 18,4±6,0** *р0,005 для клеток линий с фенотипом MDR1+ и MDR1-;

** р0,005 для клеток одной линии без и с верапамилом.

Показано, что клетки меланом различных линий существенно различались по способности выбрасывать Rho-123 и по чувствительности этого процесса к VP. Так скорость выхода составила 3,5;

20,4;

22,0;

39,0 и 19,4 % от исходного уровня Rho-123 за час, а степень ингибирования выхода Rho-123 в присутствии VP составила 60,0;

50,1;

61,8;

78,7 и 27,3% для линий Bro-B19, MS, Mel-5, Mel-8 и Mel-10, соответственно.

Белок MDR1 в линиях с фенотипом MDR1- может присутствовать в следовых количествах, но, как следует из данных по накоплению Rho-123 в присутствии VP (табл.3), VP не влияет на накопление красителя в таких клетках. В то же время, как сказано выше, VP ингибировал выход Rho-123 из клеток меланом всех MDR1- линий. Это позволяет предположить, что в клетках меланом присутствует другой транспортер, способный активно выводить Rho-123 из клеток, и также как MDR1 чувствительный к VP.

Для определения вклада в устойчивость клеток меланомы с фенотипом MDR1- процессов, чувствительных к VP, на примере линии Mel- исследовали чувствительность клеток данной линии к противоопухолевым препаратам в присутствии VP.

Обнаружено, что в присутствии VP чувствительность клеток повышается ко всем исследованным препаратам. В случае совместного действия доксорубицина и VP чувствительность возрастает почти в 4 раза (IC50 снижается с 0,3 до 0,08 мкМ);

в случае дакарбазина – почти в 3 раза (IC50 снижается с 2,0 до 0,7 мМ) и в 1,5 раза при действии БТОГ (IC снижается с 3,0 до 2,1 мкМ).

В предыдущих экспериментах было показано (табл.2), что цитотоксическое действие препаратов дакарбазин и БТОГ не зависит от присутствия белка MDR1. Однако, полученные данные по сенсибилизирующему действию VP для этих препаратов в линии с фенотипом MDR1-, подтверждают предположение о присутствии в клетках меланомы линии Mel-10 другого переносчика, отличного от MDR1, но также чувствительного к специфическому для MDR1 ингибитору VP. Для такого переносчика(ов), по-видимому, субстратом является не только доксорубицин, но и дакарбазин и этот переносчик также обуславливает устойчивость клеток не только к доксорубицину, но и к дакарбазину.

Величина SP в разных линиях колебалась от 0,9% (Mel-10) до 2,7% (MS), а в линии Mel-8 достигала 65,1% (табл.4). При анализе влияния VP на размер SP оказалось, что ее снижение в присутствии ингибитора обнаруживается только для клеток линии Mel-8 с высоким уровнем белка MDR1. Полученные результаты позволяют однозначно считать, что если белок MDR присутствует в значительном количестве на плазматической мембране клеток, то он имеет определяющее значение в формировании SP, как в случае линии Mel-8. После ингибирования MDR1 верапамилом в этой линии SP сохраняется, но ее размер снижается в среднем до 4%, что свидетельствует о присутствии и участии в формировании SP и других транспортеров, отличных от MDR1. В остальных исследованных линиях размер SP не зависел от присутствия MDR1, т.к. обработка VP клеток других линий меланомы с фенотипом MDR1- не влияла на размер SP (табл.4).

Чтобы оценить влияние на размер SP обработки клеток меланомы противоопухолевыми препаратами, были поставлены эксперименты с клетками линий MDR1- и MDR1+, которые обрабатывали препаратами в концентрации IC50 и через 72 часа исследовали размер SP.

Таблица 4. Размер SP в различных линиях меланомы человека после инкубации с Rho-123 без и в присутствии ингибитора активности MDR верапамила (VP).

Линия Фенотип Доля неокрашенных клеток (SP), % клеток MDR1 Без VP В присутствии VP Bro-B19 1,5±0,6 2,5±0, MDR1 MS 2,7±0,2 2,3±0, Меl-5 2,0±1,2 0,5• 0,6• Меl-10 0,9±0,3 0,9±0, MDR1+ Меl-8 65,1±4,0 4,1±1,1* *- p0,005 при действии VP;

• - данные одного эксперимента.

Показано, что в MDR1- клетках в указанных условиях наблюдали увеличение SP при действии доксорубицина во всех трех исследованных линиях, а при действии дакарбазина - только в двух, а в линии Mel- наблюдали снижение размера SP (рис.3А).

В клетках линии Mel-8 MDR1+, как следует из рис.3Б, ни один из двух исследованных препаратов не снижал размер SP, более того, при действии всех препаратов отмечено увеличение размера SP. При измерении SP в обработанных доксорубицином клетках линии Mel-8 в присутствии VP обнаружено, что размер SP возрастал с 2,7% в контроле до 50,1%. При измерении SP в тех же условиях после действия дакарбазина наблюдали снижение размера SP по сравнению с размером SP контрольных клеток, обработанных VP, с 2,7 до 1,5%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что после обработки клеток доксорубицином, но не дакарбазином, в составе SP возрастает доля клеток, устойчивых к действию VР, что может быть связано с индукцией в этих условиях других АВС-транспортеров, отличных от MDR1.

А Б Контроль 12, 14 97, Доксорубицин Дакарбазин 12 82, 77, Доля SP, % Доля SP, % 10 6, 8 50, 3, 3, 3, 2,0 2 0, 0,4 2, 0,3 1, VP- VP+ VP- VP+ VP- VP+ Bro-B19 Mel-5 Mel- Контроль Доксорубицин Дакарбазин Рис.3. Содержание SP в линиях меланомы человека с фенотипом MDR1- (А) и в линии Mel-8 с фенотипом MDR1+ (Б) через 72 часа после обработки противоопухолевыми препаратами в концентрации IC50. Размер SP исследовали: А без VP, Б – без VP (VР-) и в присутствии VP (VР+).

Таким образом, все исследованные линии меланом человека содержат SP, размер которой составляет в линиях MDR1- от 0,9 до 2,7% и не изменяется при исследовании накопления Rho-123 в присутствии ингибитора активности белка MDR1 верапамила. Формирование SP в этих клетках определяется транспортерами, отличными от MDR1. При высоком содер жании и активности этого белка размер SP может достигать 65% (Mel-8).

Присутствие в меланомах фракции высоко резистентных клеток, образующих SP, свидетельствует о том, что именно они могут сохраняться при химиотерапии и определять рецидивирование опухоли и развитие множественной лекарственной устойчивости благодаря высокой активности как белка MDR1, так и белков-транспортеров, отличных от MDR1, природу которых предстоит выяснить.

4. Содержание белка Hsp70 в клетках меланомы человека как фактор устойчивости к противоопухолевым препаратам.

В клетках меланомы человека различных линий исследовали содержание белка Hsp70 в стандартных условиях (Hsp70) и после индукции при тепловом стрессе при прогревании до +420С в течение 1 часа и последующего культивирования в стандартных условиях (Hsp70t). На рис.4 приведены гистограммы интенсивности флуоресценции клеток меланомы различных линий после внутриклеточного иммунофлуоресцентного окрашивания Hsp ФИТЦ-меченными МкАт. Из приведенных данных видно, что белок Hsp был обнаружен во всех линиях меланом, но содержание этого белка значительно варьировало в клетках различных линий. Необходимо отметить, что среди клеток некоторых линий (Mel-4, Mel-6) обнаруживается высокая гетерогенность клеток по содержанию Hsp70.

Динамика изменения уровня Hsp70t после воздействия теплового шока отличалась в клетках меланом различных линий: у линий с низким исходным уровнем Hsp70 (MS и Bro-B19) уровень Hsp70t возрастал только через часа после теплового шока. В клетках линии Mel-6 с наиболее высоким исходным уровнем Hsp70 уровень Hsp70t незначительно повышался через часов и возвращался к исходному значению через 24 часа. Высокое содержание этого белка в клетках меланомы человека может быть отражением стрессового состояния этих клеток. Действительно, при индукции Hsp70 с помощью теплового шока дополнительное повышение его содержания было незначительным. Для оценки вклада Hsp70 в развитие устойчивости клеток меланомы человека анализировали связь между содержанием Hsp70 и чувствительностью опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам. При анализе корреляции устойчивости клеток меланомы к препаратам паклитаксель, доксорубицин, БТОГ и дакарбазин с уровнем Hsp70 обнаружена прямая корреляция между устойчивостью клеток меланомы человека к дакарбазину (R=0,77), паклитакселю (R=0,83) и БТОГ (R=0,89). В случае паклитакселя и БТОГ корреляция была статисти чески значимой (р0,05).

Корреляции между уровнем Hsp70 и устойчивостью клеток меланомы к доксору бицину не выявлено, но клетки с низким содержа нием Hsp70 (линии Bro-B и MS) были достоверно бо лее чувствительны к доксо рубицину, чем линии с его высоким содержанием.

Рис.4. Hsp70 в клетках меланом при внутриклеточном окра шивании ФИТЦ-меченными антителами к Hsp70.

Левый пик – аутофлуоресценция клеток;

правый – флуоресценция при внутриклеточном окра шивании. По оси абсцисс – интенсивность флуоресценции, усл.ед.;

по оси ординат – количество клеток, усл.ед.

Полученные результаты позволяют заключить, что уровень Hsp70 в клетках меланомы вносит значительный вклад в их устойчивость к противоопухолевым препаратам.

5. Исследование содержания белков Fas и FasL в клетках меланомы человека различных линий: связь с чувствительностью к противоопухолевым препаратам и к действию ЦТЛ.

При исследовании содержания белков Fas и FasL с помощью иммуноцитохимического анализа выявлены значительные различия в содержании этих белков в клетках различных линий меланомы человека. В двух линиях - Bro-B19 и Mel-4 - обнаружено отсутствие белка Fas, в трех линиях его содержание было низким, в четырех – высоким. Белок Fas обнаруживался в цитоплазме и на мембране клеток. FasL обнаружен во всех исследованных линиях, кроме Mel-7. В четырех линиях обнаружен высокий уровень белка FasL. FasL был выявлен на мембране и в перинуклеарной области клеток. В линиях Mel-5, Mel-8 и Mel-9 при этом одновременно отмечено присутствие и FasL и Fas, что позволяет предполагать существование дефектов в системе проведения сигнала индукции апоптоза через рецептор Fas в этих линиях, и, следовательно, устойчивость таких клеток к Fas-зависимому апоптозу.

При сравнении чувствительности клеток меланом к противоопухолевым препаратам с уровнем белков Fas и FasL статистически значимой связи между этими показателями не обнаружено.

Для исследования роли белка Fas в чувствительности клеток меланомы человека к действию меланомаспецифических ЦТЛ использовали ЦТЛ, индуцированные с помощью ДК. Для нагрузки ДК опухолеспецифическими антигенами их инкубировали либо с лизатом клеток меланомы-мишени, либо со смесью лизатов нескольких меланом для использования одинаковых для всех линий опухолеспецифических антигенов. В этих экспериментах были использованы три линии клеток меланомы человека: MS и Mel-5 - Fas+ линии и Bro-В19 - Fas- линия. Результаты этих экспериментов, представленные на рис.5, свидетельствуют, о том, что исследованные клетки меланом различаются по чувствительности к ЦТЛ: высоко устойчивой оказалась линия Bro-B19, а чувствительными - линии MS и Mel-5. При этом линия Bro В19 была устойчива к действию ЦТЛ, индуцированных при нагрузке ДК как лизатом клеток линии Bro-B19, так и смесью лизатов трех меланом, т. е. при использовании общих антигенов для всех линий. Высокая устойчивость клеток Fas- линии Bro-В19 к действию меланомаспецифических ЦТЛ, подтверждает важную роль Fas-зависимого пути индукции апоптоза опухолевых клеток под действием ЦТЛ. Отсутствие этого белка в клетках меланомы может быть причиной их устойчивости к индукции апоптоза.

Приводить к устойчивости к действию ЦТЛ могут и дефекты в системе проведения сигнала индукции апоптоза, предполагаемые в клетках меланомы из-за одновременного присутствия белков Fas и FasL.

48,1 Рис.5. Чувствитель ность клеток Fas- и 45 Fas+ меланомы челове ка к меланомаспеци фическим ЦТЛ, инду цированным ДК, ЦТЛ нагруженными лиза 17 ЦТЛ 20 тами клеток мелано 15 мы-мишени (ЦТЛ 1) 10 или смесью лизатов 5 меланом (ЦТЛ 2).

0 Bro-B19/Fas- MS/Fas+ Mel-5/Fas+ Таким образом, в клетках меланомы различных линий содержание белков Fas и FasL не может служить маркером устойчивости этих клеток к действию противоопухолевых препаратов. В тоже время как отсутствие белка Fas, так и высокий уровень белка FasL свидетельствуют об устойчивости таких опухолевых клеток к действию опухолеспецифических ЦТЛ, а, следовательно, и об устойчивости таких опухолей ко многим методам клеточной иммунотерапии.

7. Исследование влияния рекомбинантного белка MIS человека на выживаемость клеток меланомы человека и их чувствительность к дакарбазину.

При изучении связывания ФИТЦ-меченного rhMIS с культивируемыми опухолевыми клетками меланомы различных линий показано, что rhMIS связывается с поверхностной мембраной опухолевых клеток (за исключением линии Mel-8), и что все опухолевые клетки содержат рецептор MIS внутри клеток. Содержание рецепторов MIS на клеточной мембране было пропорционально их количеству в клетке (r=0,74, p=0,05).

Показано, что выживаемость клеток в присутствии rhMIS снижалась в тех линиях клеток, где этот рецептор обнаруживался на клеточной мембране.

Повторное добавление rhMIS к опухолевым клеткам приводило к усилению их гибели. Показано, что однократная обработка клеток линии MS препаратом rhMIS за 30 мин до добавления дакарбазина повышала их чувствительность к действию этого противоопухолевого препарата, и значение IC50 снижалось с 0,61 до 0,40 мМ. Повторная обработка клеток меланомы rhMIS усиливала его сенсибилизирующее действие: значение IC снижалось до 0,24 мМ. Полученные результаты позволяют заключить, что белок rhMIS может служить эффективным модификатором биологического ответа клеток меланомы человека на дакарбазин – наиболее эффективный при этом заболевании противоопухолевый препарат.

ВЫВОДЫ.

1. Обнаружена высокая MDR1-независимая цитотоксическая активность нового препарата N1,N6-бис[2,2,6,6-тетракис(трифторметил)-3,6-дигидро-2H 1,3,5-оксадиазин-4-ил]-1,6-гександиамин (БТОГ) в отношении клеток меланомы человека.

2. Белок MDR1 определяет природную устойчивость клеток меланомы человека только в отдельных случаях (в 4 из 10 линий) и только к доксорубицину, но не к дакарбазину и препарату БТОГ.

В клетках меланомы человека с фенотипом MDR1- обнаружено 3.

быстрое и чувствительное к верапамилу выведение Rho-123 и сенсибилизирующее действие верапамила в отношении не только доксорубицина, но и дакарбазина и препарата БТОГ.

4. Обнаружено, что все линии меланомы человека содержат значительную фракцию клеток, не включающих Rho-123, размер которой не зависит от действия верапамила (за исключением линий MDR1+) и возрастает при действии противоопухолевых препаратов.

5. В клетках меланомы человека обнаружен высокий уровень содержания белка Hsp70, который коррелирует с их устойчивостью к противоопухолевым препаратам.

6. В клетках меланомы человека различных линий обнаружены нарушения в системе Fas/FasL в виде отсутствия белка Fas и/или высокого уровня белка FasL. При отсутствии Fas обнаружена устойчивость клеток к действию опухолеспецифических ЦТЛ.

7. Белок rhMIS обладает антипролиферативной активностью в отношении клеток меланомы человека, имеющих рецепторы к этому белку, и сенсибилизирует их к действию дакарбазина. Повторная обработка клеток белком rhMIS приводит к усилению его противоопухолевого и сенсибилизирующего действия.

Рекомендации по практическому использованию результатов диссертации.

1. Целесообразно проведение доклинических испытаний нового препарата БТОГ на животных для изучения возможности его применения в клинической практике в качестве противомеланомного препарата.

2. Рекомендуется проведение доклинических испытаний сенсибилизирующего действия верапамила при использовании дакарбазина для лечения меланомы.

3. Рекомендуется проведение клинических исследований совместного действия белка rhMIS и дакарбазина для повышения эффективности химиотерапии при меланоме.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Кондрашева И.Г., Филатов А.В., Москалева Е.Ю., Попова О.Н., Северин Е.С., Северин С.Е. Характеристика моноклональных антител UT1 и UT2 к белку Fas и исследование экспрессии белков Fas и FasL и Fas-зависимого апоптоза в опухолевых клетках человека различных линий //Иммунология. - 2004. - Т. 2. – С. 68-72.

2. Кутняк О.В., Кондрашева И.Г., Гукасова Н.В., Кешелава В.В., Корженевский Д.А., Коростелев С.А., Северин С.Е., Северин Е.С. Индукция меланомаспецифических ЦТЛ с помощью дендритных клеток, нагруженных смесью лизатов клеток различных линий меланомы человека//Материалы конференции "Дни иммунол.огии в Санкт-Петербурге-2004". - Медицинская иммунология. – Санкт-Петербург, 2004. – Т. 6(3-5). - С. 458-459.

3. Кондрашева И.Г., Хомякова А.В., Москалева Е.Ю. Индукция апоптоза лимфоцитов человека при их взаимодействии с опухолевыми клетками in vitro.//Тезисы II Всемирного конгресса по иммунопатологии и аллергии. - Аллергология и иммунология. – Москва, 2004. – Т. 5, №1. – С. 35.

4. Кутняк О.В., Кондрашева И.Г., Гукасова Н.В., Кешелава В.В., Корженевский Д.А., Коростелев С.А., Северин С.Е., Северин Е.С. Сравнение эффективности индукции меланомаспецифических ЦТЛ с помощью дендритных клеток, нагруженных лизатом сингенных и смесью аллогенных опухолевых клеток//Физиология и патология иммунной системы. – 2005. №7. - С. 25-31.

5. Кондрашева И.Г., Москалева Е.Ю., Крюкова Л.Ю., Крюков Л.Н., Северин С.Е. Противомеланомная активность полифторсодержащего производного 1,3,5-оксадиазина//Материалы XIV Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство". – Москва, 2007. - С. 616.

6. Северин C.Е., Крюкова Л.Ю., Крюков Л.Н., Посыпанова Г.А., Кондрашева И.Г., Москалева Е.Ю., Северин Е.С. Полифторсодержащие производные 1,3,5-оксадиазина как новый класс потенциальных противоопухолевых соединений//Материалы XI Российского Онкологического конгресса. – Москва, 2007. - С. 239-240.

7. Кондрашева И.Г., Гукасова Н.В., Москалева Е.Ю., Попова О.Н., Макаров В.А., Морозова Н.С., Северин С.Е., Северин Е.С. Вклад белка gp170 и белка теплового шока Hsp70 в устойчивость клеток меланомы человека к противоопухолевым препаратам//Материалы XI Российского Онкологичес кого конгресса. – Москва, 2007. - С. 171-172.

8. Родина А.В., Гукасова Н.В., Макаров В.А., Кондрашева И.Г., Хомякова А.В., Попова О.Н., Москалева Е.Ю., Северин С.Е. Антипролиферативная активность rhMIS человека и локализация его рецептора в различных линиях опухолевых клеток человека//Материалы XI Российского Онкологического конгресса. – Москва, 2007. - С. 239.

9. Родина А.В., Гукасова Н.В., Макаров В.А., Кондрашева И.Г., Хомякова А.В., Попова О.Н., Москалева Е.Ю., Северин С.Е. Локализация рецепторов, связывающих MIS, в различных линиях опухолевых клеток человека//Биохимия. – 2008 – Т. 73. - Вып. 7. - С. 989-998.

10. Кондрашева И.Г., Москалева Е.Ю., Крюкова Л.Ю., Крюков Л.Н., Попова О.Н., Северин С.Е., Северин Е.С. Чувствительность клеток меланомы человека к новому полифторсодержащему производному 1,3,5-оксадиазина в сравнении с известными химиотерапевтическими препаратами//Молеку лярная медицина. – 2008. - №2. - С. 28-33.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.