авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Астрологический Прогноз на год: карьера, финансы, личная жизнь


Анализ молекулярно-генетических особенностей штаммов vibrio cholerae о1 классического и эль тор биоваров

На правах рукописи

Кульшань Татьяна Алексеевна

АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ШТАММОВ

VIBRIO CHOLERAE О1 КЛАССИЧЕСКОГО И ЭЛЬ ТОР БИОВАРОВ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Саратов - 2013

2

Работа выполнена в ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Смирнова Нина Ивановна

Официальные оппоненты:

Замараев Валерий Семенович - доктор медицинских наук, профессор, ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, главный научный сотрудник лаборатории функциональной геномики Микшис Наталья Ивановна – доктор медицинских наук, ФКУЗ «Российский научно исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, ведущий научный сотрудник лаборатории вакцинологии и иммунопрофилактики

Ведущая организация:

ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт»

Роспотребнадзора

Защита состоится «18» июня 2013 г. в часов на заседании совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан «_» 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Холера - острая диарейная инфекционная болезнь, представляющая серьезную угрозу общественному здравоохранению (Бароян О.В., 1971;

Ломов Ю.М. и др., 2004;

Онищенко Г.Г. и др., 2005;

Москвитина Э.А. и др., 2012;

Weil A.A., et al., 2012). Известно три эпидемически опасных варианта возбудителя холеры:

Vibrio cholerae О1 серогруппы классического биовара, V. cholerae О1 серогруппы Эль Тор биовара и V. cholerae О139 серогруппы. Этиологическим агентом 5 – 6-ой пандемий холеры из 7-ми известных были V. cholerae О1 классического биовара. Возбудителем текущей, 7-ой, пандемии, начавшейся в 1961 году и продолжающейся до сих пор, является V. cholerae О1 биовара Эль Тор (Бароян О.В., 1971;

Ломов Ю.М. и др., 2004;

Faruque S.M.

et al., 1993;

Mekalanos J.J. et al., 1997). В течение этой пандемии геном возбудителя претерпел существенные изменения. Одним из наиболее эволюционно значимых событий явилось появление в начале 90-х годов прошлого столетия новых генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор (Смирнова Н.И. и др., 2010;

Nair G.B. et al., 2002;

Morita M. et al., 2008;

Safa A. et al., 2010;

Borkakoty B. et al., 2012). Эти штаммы отличались от типичных изолятов возбудителя присутствием в геноме профага CTX, кодирующего холерный токсин (CT), гена ctxB классического типа (ctxB1), характерного для V. cholerae классического биовара. В результате этих и других изменений генома геноварианты стали более вирулентными по сравнению с типичными изолятами (Nair G.B. et al., 2002;

Morita M. et al., 2008;

Okada K. et al., 2012) и вытеснили типичные Эль Тор штаммы во многих эндемичных по холере регионах, что определяет реальную возможность завоза данного возбудителя и на территорию Российской Федерации (Смирнова Н.И. и др., 2010, 2011;

Ломов Ю.М. и др., 2011;

Миронова Л.В. и др., 2011;

Москвитина Э.А. и др., 2011;

Савельев В.Н. и др., 2012;

Nair G.B. et al., 2006;

Safa A. et al., 2010;

Tappero J.W. et al.

2011).

Возбудитель холеры способен обитать не только в организме человека, заселяя его тонкий кишечник, но и является естественным обитателем морей и устьев рек, где обычно в составе биопленки способен выживать на биотических и абиотических поверхностях (Tamplin M.L., et al., 1990;

Halpern M. et al., 2004). Способность возбудителя адаптироваться к различным условиям существования определяется присутствием на двух хромосомах различных мобильных генетических элементов (МГЭ), несущих гены вирулентности и жизнеобеспечения (профаги CTX и RS1, острова патогенности (ОП) VPI-1 и VPI-2, острова пандемичности VSP-I и VSP-II, остров персистенции EPI, SXT генетический элемент, а также интегронный остров) (Ильина Т.С. и др., 2003;

Смирнова Н.И., Кутырев В.В., 2004;

Karaolis D.K. et al., 1998;

Hochhut B. et al., 2001;

Dziejman M. et al., 2002;

Heidelberg J.F. et al., 2002;

Mutreja A. et al., 2011;

Taylor J.L. et al., 2012).

Мозаичная структура генома V. cholerae обусловливает широкое фенотипическое и генетическое разнообразие штаммов. Такая ситуация определяет необходимость изучения распространенности основных генов патогенности, пандемичности, персистенции и резистентности к лекарственным препаратам среди штаммов V. cholerae О1 серогруппы обоих биоваров, изолированных на различных территориях и в разные годы, для оценки вариабельности их генома. Несмотря на то, что V. cholerae классического биовара был выделен более 120 лет назад и давно утратил эпидемическую значимость, этот возбудитель остается природным резервуаром генов патогенности. В то же время, до сих пор отсутствуют полные данные о генетическом разнообразии штаммов возбудителя холеры этого биовара, что связано с наличием в международных коллекциях микроорганизмов лишь нескольких известных изолятов. В этой связи очевидна актуальность исследований, направленных на изучение вариабельности генома штаммов V. cholerae классического биовара, поскольку полученные данные будут способствовать пониманию механизма возникновения новых вариантов V. cholerae различных серогрупп, возникших в результате приобретения генетической информации от возбудителя азиатской холеры. Актуальным остается вопрос о причинах изменчивости вирулентных свойств холерного вибриона Эль Тор, изолированных как от больных, так и из объектов окружающей среды. Кроме того, до сих пор нет убедительных ответов на вопрос, за счет каких механизмов происходит формирование потенциально опасных нетоксигенных штаммов, сохранивших токсин корегулируемые пили (ТСР), являющиеся не только основным фактором колонизации, но и рецептором для профага CTX с генами холерного токсина. Открытым остается вопрос о генетических связях типичных и генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, а так же о генетическом разнообразии последних.



Цель работы. Сравнительный анализ вариабельности генома различных штаммов V. cholerae О1 серогруппы классического и Эль Тор биоваров, выделенных от больных, вибрионосителей и объектов окружающей среды.

Задачи исследования:

1. Оценить вариабельность участков генома, содержащих мобильные элементы с основными генами вирулентности и жизнеобеспечения, у природных штаммов V. cholerae О1 классического и Эль Тор биоваров, изолированных в разные временные периоды на различных территориях с помощью современных молекулярно-генетических методов.

2. Выявить и изучить в модельных экспериментах вариабельность генома типичных и генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор при их попадании в водную среду.

3. Провести сравнительный анализ фенотипических свойств вирулентных штаммов и их спонтанных нетоксигенных мутантов после пребывания V. cholerae в водной среде.

4. Изучить конкурентную способность и устойчивость исходных вирулентных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор и их спонтанных нетоксигенных мутантов к действию неблагоприятных факторов окружающей среды.

5. Провести молекулярное типирование типичных и генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор методом MLVA по пяти VNTR-локусам vc0147, vc0436-7, vc1650, vca0171, vca0283.

Научная новизна работы. Получены новые данные о генетическом разнообразии штаммов V. cholerae классического и Эль Тор биоваров, выделенных в разные годы на различных территориях. На основании комплексного изучения штаммов, циркулирующих в эндемичных по холере очагах и завезенных на территорию РФ, установлено, что геномный полиморфизм штаммов V. cholerae классического биовара выражается в разной структуре промоторной области оперона ctxAB (3-7 копий повторов TTTTGAT), кодирующего холерный токсин, а также гена tcpA (однонуклеотидная замена G/Т в позиции), определяющего продукцию основного белка токсин-корегулируемых пилей.

Вместе с тем, при сравнении участков хромосомы, содержащих МГЭ с генами патогенности и жизнеобеспечения, была выявлена бльшая стабильность генома V.

cholerae классического биовара по сравнению с таковой V. cholerae биовара Эль Тор.

Обнаружено, что все изученные штаммы возбудителя азиатской холеры содержат CRISPR систему, защищающую клетку от проникновения чужеродной ДНК, что может быть одной из причин стабильности генома этого патогена.

В отличие от холерных классических вибрионов, в геноме штаммов V. cholerae биовара Эль Тор CRISPR-система отсутствует, что, видимо, определило возможность приобретения этим возбудителем новой генетической информации от V. cholerae классического биовара и V. cholerae О139.

Впервые обнаружено, что типичные клинические штаммы V. cholerae биовара Эль Тор при попадании в водную среду могут утрачивать профаг CTX, несущий гены холерного токсина. Потеря профага CTX сопровождатся изменением экспрессии ряда генов, кодирующих дополнительные факторы патогенности (гемолизин и подвижность).

Впервые проведен сравнительный протеомный анализ изогенных токсигенных и нетоксигенных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор. Показано, что утрата профага CTX сопровождается изменением уровня экспрессии 17 белков, включая белки, участвующие в энергетическом обмене, транспорте глюкозы, хемотаксисе и биосинтезе пуриновых оснований. Впервые установлено, что потеря профага CTX в 5-15 раз увеличивает устойчивость клеток нетоксигенных штаммов к различным стрессовым воздействиям (солевой и окислительный стрессы). Новыми являются данные о том, что при совместной инкубации изогенных токсигенных и нетоксигенных штаммов в водной среде нетоксигенные мутанты обладали в 2-5 раз большей выживаемостью, что, возможно, является одним из основных условий длительного сохранения бактериальной популяции в окружающей среде.

Показана возможность дифференциации типичных и генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, методом MLVA по пяти VNTR-локусам vc0147, vc0436-7, vc1650, vca0171, vca0283. Занесенные на территорию РФ геноварианты V. cholerae биовара Эль Тор являются генетически неоднородными. Впервые показана возможность дифференциации геновариантов, различающихся между собой по эпидемическому потенциалу, методом MLVA.

Практическая значимость работы. В государственной коллекции патогенных бактерий депонированы изогенные штаммы V. cholerae О1 биовара Эль Тор (5 штаммов) с разным набором генов патогенности, которые могут быть использованы для изучения механизма образования нетоксигенных штаммов.

Оформлены методические рекомендации «Получение нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae О1 биовара Эль Тор», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб»

(протокол № 2 от 20 апреля 2012 г.) и утвержденные директором института 20 апреля г.

Полученные данные по распространенности основных генов патогенности, пандемичности, персистенции и жизнеобеспечения среди природных штаммов V. cholerae могут быть использованы для последующей генетической паспортизации штаммов, хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий.

Материалы исследований по изучению генетической организации штаммов V. cholerae О1 серогруппы используются при чтении лекций «Микробиология и генетика возбудителя холеры» на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Геномный полиморфизм штаммов V. cholerae классического биовара, изолированных в разные годы на территории различных стран, проявляется в разной структуре промоторной области оперона ctxАB, а также гена tcpA, кодирующих основные факторы вирулентности – холерный токсин и основной белок токсин-корегулируемых пилей соответственно. Выявленная вариабельность выражается в присутствии 3- повторов TTTTGAT в промоторной области оперона ctxАB у различных штаммов, а также однонуклеотидной синонимической замене в гене tcpA (G/Т). Вместе с тем, участки генома возбудителя азиатской холеры, связанные с патогенностью и персистенцией, являются относительно стабильными, поскольку у проверенных штаммов присутствовали все тестируемые гены вирулентности и жизнеобеспечения (15 генов), локализованные в коровой области хромосомы (toxR, hapA, rtxА, attRS) и на 4-х мобильных элементах (CTX, VPI-1 и VPI-2, EPI).

2. Геном клинических и изолированных из окружающей среды штаммов V. cholerae биовара Эль Тор является вариабельным, что проявляется как в утрате различных фрагментов ДНК, связанных с синтезом факторов патогенности (участки генома CTX, VPI-1 и VPI-2) и адаптацией к меняющимся условиям окружающей среды (VSP-I и VSP II), так и в приобретении новой генетической информации от V. cholerae классического биовара (аллель гена ctxB1) и V. cholerae О139 (SXT-генетический элемент).

3. В водной среде значительная часть изученных типичных вирулентных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор (55%) утрачивают профаг CTX, в состав которого входят гены ctxAB, кодирующие биосинтез ключевого фактора патогенности - холерного токсина.

Делеция профага CTX сопровождается изменением экспрессии ряда других генов, связанных с патогенностью. Согласно данным протеомного анализа у нетоксигенных мутантов из 400 выявленных белков изменяется уровень экспрессии 17, включая идентифицированных протеинов, участвующих в энергетическом обмене, транспорте глюкозы, хемотаксисе и биосинтезе пуриновых оснований.





4. Отсутствие профага CTX в 5-15 раз увеличивает устойчивость клеток нетоксигенных штаммов к различным стрессовым воздействиям (солевой и окислительный стрессы) и в 2-5 раз повышает их выживаемость в водной среде.

5. Молекулярное типирование штаммов V. cholerae биовара Эль Тор методом MLVA по пяти VNTR - локусам (vc0147, vc0436-7, vc1650, vca0171, vca0283) позволяет дифференцировать их на типичные и генетически измененные, различающиеся между собой по вирулентности и эпидемическому потенциалу. Занесенные на территорию РФ варианты V. cholerae биовара Эль Тор являются генетически неоднородными.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье»

(Суздаль, 2005), Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербурге, 2007 г.), заседании проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2005, 2012 гг.), на X съезде Всероссийского научно практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), на IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012), на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов 2006, 2011- 2012 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, их них 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 234 цитируемых работы, из них 46 отечественных и 188 зарубежных. Общий объем диссертации составляет страницы. Текст иллюстрирован 19 таблицами и 24 рисунком.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе было использовано 324 штамма V. cholerae O серогруппы (40 штаммов классического и 284 штамма Эль Тор биоваров), выделенные от больных и из источников окружающей среды. Культивирование штаммов осуществляли на LB агаре, LB и AKI бульонах при 37оС в условиях повышенной аэрации и без нее. Для изучения гемолитической активности штаммов использовали плотную питательную среду с добавлением 1% взвеси эритроцитов барана (Singh D.V. et al., 2001). Продукцию растворимой гемагглютинин/протеазы (РГА/П) оценивали на плотной питательной среде, содержащей 10% обезжиренного молока (Finkelstein R.A. et al., 1992), подвижность - на 0,6% агаре LB (рН 7,2). Уровень биосинтеза СТ определяли с помощью иммуноферментного метода GM1 ELISA (Svennerholm A.M. et al., 1983). Чувствительность штаммов к антимикробным препаратам оценивали методом серийных разведений в агаре (МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры», 6.7.1.1.) с добавлением их в разных концентрациях. Изучение способности штаммов к формированию биопленки проводили в полистироловых плашках по методу Nesper J. с соавт. (2001). Вирулентность штаммов определяли по методу Dutta N.K. и Habbu M.K. (1953). Для изучения колонизирующей способности штаммов использовали метод Pierce N.F. с соавт. (1988).

Выделение бактериальной ДНК осуществляли в соответствии с МУ 1.3.2569- «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

ДНК-ДНК гибридизацию по Саузерну проводили на приборе Hybridization oven/shaker фирмы “Amersham Pharmacia Biotech” (США) по методу Маниатис Т.И. с соавт. (1984).

ПЦР проводили на программируемых термоциклерах. Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 1-2% агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл этидия бромида.

Секвенирование ДНК проводили на приборе «CEQ8000» (Beckman Coulter, США).

Первичный анализ последовательностей ДНК осуществляли с использованием программ «Data Collection v1.0» и «Sequencing Analysis Software v5.4». Для дальнейшего анализа использовалось программное обеспечение «BioEdit 7.1.3», «Mega 4» и «BioNumerics 6.6».

В качестве референтных штаммов для сравнения нуклеотидных последовательностей изученных генов использовали V. cholerae О395 классического биовара и N16961 биовара Эль Тор, нуклеотидные последовательности которых представлены в GenBank.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Сравнительный анализ геномов природных штаммов V. cholerae классического и Эль Тор биоваров, выделенных на территории различных регионов Российской Федерации и зарубежных стран Сведения о молекулярно-генетических свойствах природных штаммов холерного вибриона, выделенных в разных регионах в разные временные периоды, являются основной для прогнозирования формирования патогенных клонов с ранее неизвестными свойствами, а также для создания баз данных геномных «портретов» выделяемых штаммов. В этой связи было проведено исследование, направленное на изучение генетического разнообразия штаммов V. cholerae О1, изолированных до начала и в разные периоды 7-ой пандемии холеры. Поскольку холерные вибрионы классического биовара на эндемичных по холере территориях не были полностью замещены вибрионами Эль Тор вплоть до 1992 г., являясь при этом природным резервуаром генов патогенности, то на первом этапе работы мы сочли необходимым оценить генетическое разнообразие этих штаммов, изолированных на территории не только Азии, но и России. В этой связи методом ПЦР было изучено присутствие в геноме 40 штаммов V. cholerae классического биовара, изолированных в 1937-1962 гг., 20 генов вирулентности и жизнеобеспечения, локализованных на семи МГЭ (CTX, RS1, VPI-1, VPI-2, VSP-I, VSP-II, EPI), а также в коровой части хромосомы (toxR, hapA, rtxА, attRS). Установлено, что у всех изученных штаммов присутствовали 15 тестируемых генов, локализованных в коровой части хромосомы, а также на четырех МГЭ – профаге CTX, ОП VPI-1 и VPI-2, острове персистенции EPI. Вместе с тем, в их геноме отсутствовали 5 генов (rstC, deo0175, tnp и vco0490, vco0496), входящих в состав трех МГЭ (RS1, VSP-I и VSP-II). Эти данные полностью совпадают с результатами ранее проведенных исследований 3-х штаммов:

569В, О395, NIH41 (Dziejman M. et al., 2002).

Поскольку для ряда штаммов V. cholerae биовара Эль Тор характерна вариабельность генома профага CTX и ОП VPI-1 (Olsvik O. et al., 1993;

Choi S.Y. et al., 2010;

Safa A. et al., 2010;

Talkington D. et al., 2011), мы провели сравнительный анализ нуклеотидной последовательности двух участков фагового генома (гена ctxB и промоторной области оперона ctxAB), а также гена tcpA из VPI-1 у 20 штаммов V. cholerae классического биовара. При сравнении нуклеотидной последовательности гена ctxB, кодирующего В-субъединицу СТ, было установлено, что все изученные штаммы содержали один и тот же аллель этого гена, а именно ctxB1, характерный для референтного штамма V. cholerae O395 классического биовара и содержащий в позициях 115 и цитозин в отличие от референтного штамма V. cholerae N16961 биовара Эль Тор, имеющего в тех же положениях тимин.

Что касается второго участка генома профага CTX – промоторной области оперона ctxАB (РctxАB), то ранее было установлено, что классические вибрионы содержат в ней 7- копий повторов TTTTGAT (Mekalanos J.J. et al., 1983;

Miller V.L. et al., 1984;

Hung D.T., Mekalanos J.J., 2005). Вместе с тем, в результате сравнения нуклеотидной последовательности промоторной области оперона ctxАB у 20 штаммов нами была установлена их неоднородность. Оказалось, что лишь 3 из 20 изученных штаммов имели копий гептаповторов. У 1 штамма было обнаружено 6 копий этой регуляторной последовательности. Следующая группа изолятов (3 штамма) содержала 5 копий TTTTGAT. Для самой большой группы штаммов (12 изолятов) было характерно присутствие в РctxАB 4-х копий гептаповторов. И, наконец, был обнаружен 1 штамм с 3-мя копиями TTTTGAT (рис.1).

Рис. 1 — Нуклеотидные последовательности промоторной области оперона ctxAB V. cholerae классического биовара.

R означает нуклеотидную последовательность повторов TTTTGAT, являющихся сайтами связывания с регуляторным белком ToxR. O395 и N16961 – референтные штаммы V. cholerae соответственно классического и Эль Тор биоваров (нуклеотидные последовательности взяты из GenBank). М8, М9, М14, М16, М18, М19, М22, М29, М30, М34, М35, М41, 16002В, 27Kor, 66, 76, 110, 4Afg, 76(1-2), B-53-1 – штаммы V. cholerae классического биовара.

Секвенирование гена tcpA, кодирующего белок TcpA - основной компонент токсин корегулируемых пилей, у 20 штаммов классического вибриона показало, что у 5 штаммов структура этого гена была идентична таковой референтного штамма О395 классического биовара. Вместе с тем, у 15 штаммов в гене tcpA была выявлена одна нуклеотидная замена:

в позиции 117 гуанин был заменен на тимин (G/Т). Однако такая точечная мутация не привела к изменению аминокислотной последовательности белка TcpA.

Таким образом, несмотря на давнее возникновение возбудителя азиатской холеры, изученные участки его генома в целом остаются стабильными, поскольку не было выявлено штаммов с утратой хотя бы одного из 15 тестируемых генов, размещенных как в коровой области хромосомы, так и на 4-х указанных выше МГЭ. Вместе с тем, представленные данные свидетельствуют о том, что штаммы холерного вибриона классического биовара различаются между собой по структуре промоторной области оперона ctxАB, а также гена tcpA, кодирующих ключевые факторы патогенности.

Другая важная особенность возбудителя азиатской холеры состоит в том, что в его геноме имеется недавно описанная CRISPR – система (Clustered Regularly Interspaced Shot Palindromic Repeats) (Шашкова А.В. и др., 2011;

Пугач К.С. и др., 2012;

Ishino Y. et al., 1987;

Makarova K.S. et al., 2006). Обнаружение ранее лишь у одного штамма этого биовара (V. cholerae О395) CRISPR – системы (Oost J. et al., 2009), которая защищает клетку от проникновения чужеродной ДНК, позволяет предположить, что именно эта система могла быть одной из причин относительной стабильности генома возбудителя азиатской холеры.

Для проверки этого предположения мы определили присутствие CRISPR – системы в геноме 25 штаммов V. cholerae классического биовара. Для ПЦР-идентификации CRISPR системы был выбран ген cas3, кодирующий нуклеазу/хеликазу, которая производит разрезание чужеродной ДНК и находится в непосредственной близости от CRISPR кассеты. В результате было установлено присутствие гена cas3 и, следовательно, CRISPR системы в хромосоме всех 25 изученных штаммов V. cholerae классического биовара. Из этого следует, что CRISPR – система, видимо, вносит определенный вклад в обеспечение стабильности генома возбудителя азиатской холеры.

На следующем этапе работы было изучено генетическое разнообразие клинических штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, изолированных в разные периоды 7-ой пандемии холеры. Для его оценки с помощью моно- и мультилокусной ПЦР мы определяли присутствие в геноме 92 штаммов тех же 20 генов, что и в случае V. cholerae классического биовара. Оказалось, что все тестируемые гены коровой области хромосомы (toxR, hapA, rtxА, attRS) присутствовали в хромосоме всех изученных штаммов. Что касается МГЭ, то в геноме 96% штаммов V. cholerae биовара Эль Тор помимо четырех геномных островов (CTX, VPI-1, VPI-2, EPI), обнаруженных у V. cholerae классического биовара, имелись три дополнительных генных блока – профаг RS1 и два острова пандемичности VSP-I, VSP-II. Эти данные полностью совпадают с ранее опубликованными результатами и говорят о том, что возбудитель холеры Эль Тор мог приобрести их в процессе эволюции через горизонтальный перенос генетической информации от неизвестных до сих пор доноров (Faruque S.M., Mekalanos J.J., 2003;

Murphy A., Boyd F., 2008;

Faruque S.M., Mekalanos J.J., 2012). В этой связи особого внимания заслуживает тот факт, что, согласно нашим данным, ни один из исследованных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор не имел гена cas3 и, следовательно, CRISPR – системы, которая могла бы ограничить горизонтальный перенос генов.

Далее, мы оценили вариабельность генома клинических штаммов V. cholerae Эль Тор биовара. Оказалось, что среди 92 штаммов четыре изолята были лишены профага CTX, кодирующего СТ, либо несли дефектный профаг, не имеющий гена ctxA. К тому же один нетоксигенный штамм (М885) был лишен и второго профага RS1. Кроме того, у трех штаммов (М867, М868, М870), наряду с отсутствием гена ctxA из профага CTX, не было островов пандемичности VSP-I и VSP-II, а остров патогенности VPI-2 был дефектным, поскольку не содержал краевых генов hel1740 и rep1803 при наличии гена nanH. Таким образом, генетическое разнообразие клинических штаммов V. cholerae Эль Тор выражалось в следующем: отсутствие профагов CTX и RS1, островов пандемичности VSP-I и VSP-II, а также наличие дефектного профага CTX и/или дефектного геномного острова VPI-2.

Поскольку вариабельность генома может выражаться не только в утрате генов, но и в изменении их нуклеотидных последовательностей, на следующем этапе работы было проведено секвенирование генов ctxB из профага CTX и tcpA из VPI-1, связанных с вирулентностью. Как и ожидалось, изученные нами штаммы, изолированные в 1970- гг., кроме штамма Р13762, выделенного в Узбекистане в 1988 г., относились к типичным штаммам биовара Эль Тор и несли аллель ctxB3, характерный для референтного штамма N16961 биовара Эль Тор. В то же время у штаммов, выделенных с 1991 г. и позже, типичный ген ctxB3, входящий в состав профага CTX вибрионов Эль Тор, был заменен на аллель ctxB1, характерный для классических вибрионов. Об этом свидетельствует появление в нуклеотидной последовательности гена ctxB двух однонуклеотидных замен в положениях 115 и 203 (С/Т), что подтверждает ранее полученные сведения о возникновении в 1990-х годах природных генетически измененных штаммов возбудителя холеры (Смирнова Н.И. и др., 2010, 2011;

Миронова Л.В. и др., 2011;

Савельев В.Н. и др., 2012;

Nair G.B. et al., 2002;

Morita M. at al., 2008;

Safa A. at al., 2010;

Borkakoty B. at al., 2012).

При сравнении нуклеотидной последовательности гена tcpA типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, стало очевидно, что его структура у всех проверенных штаммов была идентична и не отличалась от таковой референтного штамма N биовара Эль Тор. Следовательно, в отличие от классических холерных вибрионов, ген tcpA типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор оказался стабильным.

Таким образом, изучение генетического разнообразия штаммов возбудителя холеры двух биоваров с помощью методов ПЦР и секвенирования показало, что штаммы классического биовара, несмотря на давнее происхождение, являются в целом генетически более стабильными по сравнению с V. cholerae биовара Эль Тор.

Далее было изучено распространение среди клинических штаммов V. cholerae биовара Эль Тор SXT – генетического элемента, несущего гены лекарственной устойчивости (Hochhut B. et al., 1999, 2001;

Mutreja A., 2011). Для этого была использована мультилокусная ПЦР-система (Ramachandran D. et al., 2007). В результате установлена четкая временная связь между обнаружением первого источника SXT – генетического элемента - V. cholerae О139 и появлением штаммов V. cholerae биовара Эль Тор с множественной устойчивостью к лекарственным препаратам, кодируемым генами этого элемента. Так, штаммы, выделенные в начале текущей пандемии (1970-1990 гг.) не несли в своем геноме SXT-элемента с генами лекарственной устойчивости к сульфометоксазолу, триметоприму и стрептомицину и были чувствительны к указанным препаратам. Однако, начиная с 1993 г., изученные нами штаммы в 100% содержали в хромосоме SXT – элемент с генами устойчивости к нескольким лекарственным препаратам и были резистентны к ним, что согласуется с ранее полученными данными.

Самостоятельный интерес представляло изучение генетического разнообразия штаммов, выделенных из воды. При исследовании 139 штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, изолированных из водных источников с 1970 по 2004 гг., на наличие 20 генов было установлено, что эти штаммы могут быть разделены на три группы. Первую группу составили типично водные штаммы (85 штаммов или 61%), содержащие лишь гены коровой области хромосомы и ген mshA острова персистенции EPI. При этом у 13-х из них отсутствовала последовательность attRS. Во вторую группы вошли штаммы (25 штаммов или 18%), имеющие все тестируемые гены вирулентности, локализованные на МГЭ, а также гены коровой области хромосомы (toxR, hapA, rtxА, attRS). Третья группа состояла из штаммов (29 штаммов или 21%), претерпевших ряд геномных перестроек: 1) утрату генов профагов СТХ и RS1 (гены ctxA, zot, ace, rstC) при наличии других тестируемых генов;

2) сохранение в геноме авирулентных штаммов гена nanH из VPI-2;

3) присутствие дефектных островов пандемичности VSP-I и VSP-II, сохранивших лишь один из генов, входящих в состав данных МГЭ - deo0175, tnp0185, vco0490, vco0496. Особенности генотипа таких штаммов подтверждают ранее высказанное предположение, что они могли произойти от вирулентных в результате утраты ими в водной среде многих МГЭ, несущих ключевые гены патогенности (Костромитина Е.А., 2004). При этом все проверенные штаммы были лишены SXT-элемента. В целом полученные данные свидетельствуют о более значительных вариациях генного состава штаммов V. cholerae О1 биовара Эль Тор, выделенных из воды открытых водоемов, по сравнению с клиническими изолятами.

2. Изучение механизмов адаптации возбудителя холеры к действию неблагоприятных факторов окружающей среды Обнаружение штаммов холерного вибриона биовара Эль Тор, лишенных ряда МГЭ или содержащих их дефектные варианты, ставит вопрос об их происхождении. Возможно, что такие генетические изменения могут происходить при адаптации вибрионов к действию неблагоприятных факторов окружающей среды. В этой связи были проведены исследования, направленные на выявление генетических изменений вирулентных штаммов при их существовании в неблагоприятных условиях. В модельные эксперименты было взято 30 штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, среди которых 20 были типичными, а 10 генетически измененными. Все штаммы содержали в хромосоме 7 МГЭ (CTX, RS1, VPI 1, VPI-2, VSP-I, VSP-II, EPI). Поскольку холерные вибрионы являются обитателями водных биоценозов, в качестве среды их пребывания использовали стерилизованную речную воду (рН 6,5), температура инкубации составляла 4С. Эксперимент проводился в закрытой системе.

В связи с тем, что наиболее часто из объектов внешней среды выделяют штаммы, лишенные профага СТХ или части его генов (Телесманич Н.Р. и др., 2004;

Монахова Е.В.

и др., 2007;

Boyd E.F. et al., 2000;

Reidl J. et al., 2002;

Faruque S.M. et al., 2003;

McLeod S.M.

et al., 2005), на первом этапе у изучаемых штаммов определяли присутствие в хромосоме гена ctxA, входящего в состав профага CTX. В результате установлено, что из типичных штаммов в популяции 11 изолятов (или 55%) после пребывания в речной воде через разные временные промежутки (4-75 суток) были обнаружены клетки, утратившие ген ctxA. Вместе с тем, популяция большинства штаммов была гетерогенной, так как в ней наряду с ctxA- клонами, так же присутствовали и ctxA+ варианты. Следует особо отметить тот факт, что все 10 генетически измененных штаммов стабильно сохраняли ген ctxA в течение всего периода наблюдения (до 90 суток).

Далее, у выявленных ctxA- клонов мы определили наличие других генов, входящих в состав коровой области профага CTX (ctxB, zot, ace, orfU, cep). Было обнаружено, что геном профага всех ctxA- мутантов претерпел значительные изменения, выражающиеся в отсутствии всех тестируемых генов. Это означает, что у ctxA- мутантов была утрачена, по крайней мере, коровая область профага. Вместе с тем, все проверенные нетоксигенные мутанты сохранили профаг RS1 и другие МГЭ.

Таким образом, в результате проведенных исследований экспериментально доказано, что у типичных штаммов возбудителя холеры Эль Тор в водной среде могут происходить генетические изменения, выражающиеся в потере ряда генов профага CTX, в частности, генов, кодирующих синтез СТ – основного фактора патогенности.

Поскольку после пребывания в воде ctxA-B- мутанты были обнаружены лишь среди типичных штаммов при отсутствии таковых у генетически измененных вариантов, необходимо было установить причины способности штаммов к утрате генов профага СТХ. Одно из возможных предположений – разное количество копий профага СТХ в сравниваемых группах. Для его проверки мы определили количество копий профага СТХ в геноме 10 типичных штаммов. Обнаружено, что в их хромосоме присутствует только одна копия профага СТХ, локализованная на Pst1-хромосомных фрагментах размером 8, т.п.н. (рис. 2, А). Вместе с тем, согласно ранее полученным данным (Заднова С.П. и др., 2012), все исследованные генетически измененные штаммы содержали две копии профага СТХ.

Присутствие двух копий RS1, фланкирующих СТХ, может обеспечить его эффективную делецию за счет рекомбинации между гомологичными нуклеотидными последовательностями. В этой связи была определена копийность профага RS1 у типичных штаммов путем ДНК-гибридизации по Саузерну с молекулярным зондом RS (амплифицированным фрагментом гена rstC, размером 238 п.н., входящим в состав RS1).

Показано, что в хромосоме всех штаммов присутствуют две копии профага RS1, локализованные на PstI/BglII-хромосомных фрагментах размером 4,6 и 4,9 т.п.н (рис. 2, Б).

Таким образом, установлено, что все изученные типичные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор содержали одну копию профага СТХ и две копии профага RS1. Наличие двух копий RS1, фланкирующих копию профага СТХ, видимо, обеспечило делецию профага СТХ у ряда штаммов.

Рис. 2 - Блот-гибридизация по Саузерну хромосомной ДНК типичных вирулентных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, рестрицированной эндонуклеазами PstI, с зондом на ген ctxА, размером 564 п.н. (А) и PstI/BglII с зондом RS1 (ампликон гена rstC, размером 238 п.н. из профага RS1) (Б). А) 1 - C197 (нетоксигенный штамм, взятый в качестве отрицательного контроля);

2 - М888;

3 - М887;

4 - М961;

5 - М962;

6 - М892;

7 - М893;

8 М943;

9 - Р3644, 10 - Р3646;

М - 641;

М - маркер молекулярных масс (EcoRI/HindIII – рестрикты ДНК фага ). Б) 1 - М888, 2 - М887, 3 - М961, 4 - М962, 5 - М892, 6 - 893, 7 М943, 8 - Р3644, 9 – М641, M - ДНК фага, рестрицированная EcoRI/HindIII.

Для подтверждения утраты способности к продукции СТ у ctxA-B- штаммов с помощью иммуноферментного метода GM1 ELISA был определен уровень синтеза ими этого белка. Обнаружено, что ctxA-B- мутанты действительно не продуцировали СТ, тогда как все исходные штаммы синтезировали этот белок. Утрата токсигенности мутантами ctxA-B- привела к изменению их вирулентности. Так, при оценке вирулентности изогенных ctxA+B+ и ctxA-B- штаммов на модели крольчат-сосунков, оказалось, что все животные, зараженные токсигенным штаммом, погибали через 24-48 ч. При их вскрытии наблюдалась типичная холерогенная реакция. Иная картина инфекционного процесса у кроликов отмечалась при заражении их ctxA-B- штаммом. Животные не погибали после заражения, и видимых изменений в тонком отделе кишечника обнаружено не было. Таким образом, полученные данные подтверждают нетоксигенность и авирулентность ctxA-В мутантов.

В связи с образованием в водной среде нетоксигенных вариантов возникает вопрос о том, влияет ли утрата профага СТХ на экспрессию генов, кодирующих другие факторы, определяющие либо вирулентность штаммов, либо выполняющих защитную функцию в клетке. Для выяснения этого вопроса был проведен сравнительный фенотипический анализ изучаемых штаммов, у которых определяли продукцию гемолизина, растворимой гемагглютинин/протеазы (РГА/П), подвижность, биосинтез белков внешней мембраны, а также способность к формированию биопленки. Установлено, что утрата профага CTX с генами ctxAВ сопровождалась изменением экспрессии ряда генов, связанных с вирулентностью. В 80% повышалась продукция термолабильного гемолизина, но понижалась подвижность. Вместе с тем, сравниваемые штаммы были способны формировать биопленку. Это свидетельствует о том, что как токсигенные так и нетоксигенные штаммы могут длительно сохраняться в окружающей среде в составе биопленки.

Для получения дополнительных сведений об изменении экспрессии генов у мутантов, утративших профаг СТХ, совместно с сотрудниками протеомного центра при НИИ БМХ им. В.Н. Ореховича РАМН, был проведен сравнительный протеомный анализ изогенных ctxA+В+ и ctxA-В- вариантов штамма V. cholerae М888. Согласно полученным данным, в клетках двух сравниваемых вариантов экспрессировалось около 400 белков. При сопоставлении протеомным карт было выявлено, что потеря генов профага СТХ сопровождалась изменением экспрессии 17 белков, из которых синтез 10 белков индуцировался, а 7 - репрессировался. Из 5-ти идентифицированных белков, участвующих в энергетическом обмене, транспорте глюкозы, хемотаксисе и биосинтезе пуриновых оснований, биосинтез 4-х повышался, а 1-го понижался.

Далее, были проведены исследования, направленные на оценку устойчивости вирулентных штаммов и их нетоксигенных мутантов к действию различных неблагоприятных факторов внешней среды. В качестве стрессовых факторов были использованы высокие концентрации соли (3 моль) или перекиси водорода (20 ммоль). В результате установлено, что все исследованные нетоксигенные мутанты были в 5-15 раз более устойчивы к действию солевого и окислительного стрессов по сравнению с исходными токсигенными штаммами.

Выявленные изменения в уровне экспрессии ряда белков, связанных с энергетическим обменом, а также повышенная устойчивость нетоксигенных мутантов к стрессовым воздействиям, ставят вопрос о том, может ли утрата генов профага СТХ иметь селективную ценность для бактериальной популяции. В этой связи были проведены эксперименты по определению конкурентной способности токсигенных и нетоксигенных штаммов (ctxA+В+ и ctxA-В-) на модели трех пар изогенных клонов. Оказалось, что при совместном культивировании тестируемых штаммов в речной воде при температуре 20 22С уровень выживаемости нетоксигенных штаммов был в 2-5 раз выше, чем исходных токсигенных.

Суммируя полученные сведения, следует отметить, что смена холерными вибрионами среды обитания (человек – водная среда) может привести к реорганизации генома патогенных клонов. При этом было установлено, что генетические изменения токсигенных штаммов в неблагоприятных условиях обитания повлекли за собой изменения фенотипа и уровня экспрессии белков. К тому же нетоксигенные мутанты оказались более устойчивыми к действию солевого и окислительного стрессов и отличались повышенной жизнеспособностью в водной среде. Приведенные результаты важны для понимания механизмов адаптации бактериальных популяций к неблагоприятным условиям обитания, что обеспечивает их длительное существование в природных системах.

3. Молекулярное типирование типичных и генетически измененных природных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор методом MLVA Возникновение геновариантов возбудителя холеры Эль Тор с повышенной вирулентностью и высоким эпидемическим потенциалом (Nair G.B. et al., 2002;

Safa A. et al., 2008;

Taviani E. et al., 2010) определяет необходимость разработки современных молекулярных методов, позволяющих дифференцировать типичные и генетически измененные изоляты. Для установления генетического родства между различными штаммами геновариантов и выявления возможного источника инфекции используются различные методы молекулярного типирования, в том числе и метод MLVA (multilocus varible tandem repeat analysis), основанный на оценке числа вариабельных тандемных повторов (VNTR), который обладает максимальной разрешающей способностью и воспроизводимостью (Водопьянов А.С. и др., 2001;

Водопьянов С.О. и др., 2002;

Danin Poleg Y. et al., 2007;

Li W. et al., 2009). В связи с этим была поставлена задача – определить генетические связи типичных и генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, выделенных на территории РФ, оценить генетическое разнообразие последних, а так же выяснить вопрос о происхождении геновариантов. Для решения этой задачи в исследование был взят 51 клинический штамм V. cholerae биовара Эль Тор, выделенный от больных в разные периоды 7-ой пандемии (1965 – 2010 гг.) в России, а также ближнем и дальнем зарубежье. Среди изученных 22 штамма были типичными, а 29 - генетически измененными вариантами, содержащими в профаге CTX классический аллель гена ctxB (ctxB1).

В качестве вариабельных участков генома V. cholerae было использовано 5 локусов, обозначенных vc0147, vc0436-7, vc1650, vca0171, vca0283 (Водопьянов А.С. и др., 2001;

Danin-Poleg Y. et al., 2007;

Choi S. Y. et al., 2010). Локусы vc0147 (AACAGA), vc0436- (GACCCTA), vc1650 (GATAATCCA) находятся на I хромосоме, в то время как локусы vca0171 (TGCTGT) и vca0283 (ACCAGA) расположены на II хромосоме (штамм N16961, GenBank).

В результате исследования ДНК 51 штамма было установлено, что для локусов I хромосомы характерно присутствие 3-5 аллелей, тогда как локусы II хромосомы представлены 14-15 аллелями. Эти данные совпадают с результатами других исследователей (Мишанькин Б.Н. и др., 2004;

Danin-Poleg Y. et al., 2007;

Choi S. Y. et al., 2010;

Kendall E. A. et al., 2010).

Анализ полученных результатов показал, что 51 изученный штамм относился к различным генотипам. При этом 22 типичных штамма, выделенных в разные периоды 7-ой пандемии (1965-1990 гг.), принадлежали к 14 генотипам, тогда как 27 генетически измененных штаммов (1991-2010 гг.) - к 22 генотипам. Эти данные свидетельствует о значительной вариабельности генома обеих групп взятых штаммов, которая, возможно, обусловлена временной (1965-2010 гг.) и географической разобщенностью изолятов, а также связана с эволюционными процессами.

Анализ филогенетического дерева, построенного методом «maximum parsimony tree», BioNumerics v. 6.6., на основе MLVA по 5 указанным выше локусам, позволяет выделить пять клональных комплексов, каждый из которых содержит группу близкородственных штаммов, имеющих один и тот же или близкий генотип (рис. 3, А).

Все типичные штаммы, образовавшие I, II, III комплексы, несут профаг CTX с геном ctxB3. Среди них самым большим является комплекс I, который представлен 14 изолятами.

Эти штаммы в основном связаны с первым заносом холеры Эль Тор на территорию бывшего СССР в 1970-1975 гг. Они различались лишь по числу повторов в 2-х наиболее вариабельных локусах II-ой хромосомы. В тоже время локусы из I-ой хромосомы были идентичны, что может свидетельствовать о клональном происхождении этих изолятов. Что касается двух других минорных комплексов II и III, то они включают в себя по два и четыре штамма соответственно, занесенных либо в тот же период пандемии (1970 г.) в Украину (II-ой комплекс), либо через 20 лет после этих событий (1990 г.) в Ставрополь и Пермь (III-й комплекс) из стран Юго-Восточной Азии. Эти изоляты отличаются друг от друга и от штаммов I комплекса по структуре не только вариабельных локусов II-ой хромосомы, но и двух более консервативных локусов I-ой хромосомы.

А Б Рис. 3 – Филогенетическое дерево штаммов V. cholerae биовара Эль Тор на основе MLVA по 5 локусам (А) и по 3 локусам I хромосомы (Б). А) штрихами выделены V клональных комплексов, которые образуют типичные (I, II, III) и генетически измененные (IV и V) штаммы. Б) штрихами выделены IV клональных комплекса, состоящих из типичных (I и II) и генетически измененных (III и IV) штаммов. В кружках указаны изученные штаммы, место и год их выделения.

Это может означать, что вспышки холеры в Украине (1970 г.), Перми и Ставрополе (1990 г.) были связаны с независимым заносом других клонов возбудителя, имеющих генотипические отличия от штаммов I клонального комплекса. Однако, небольшая в целом степень генетических различий по MLVA-профилю между типичными штаммами из трех разных клональных комплексов, свидетельствует об их близком родстве между собой.

Особый интерес представляют вспышки и отдельные случаи холеры на территории России (1993-2010 гг.), вызванные заносом генетически измененных вариантов возбудителя, которые отличаются от типичных штаммов структурой профага CTX и в ряде случаев острова пандемичности VSP-II. Появление в геноме VSP-II геновариантов протяженной делеции сопровождалось повышением их эпидемического потенциала, поскольку такие новые геноварианты к настоящему времени практически вытеснили штаммы с интактным VSP-II во многих эндемичных по холере регионах (Taviani E. et al., 2010;

Chin C.S. et al., 2011;

Bhuiyan N.A. et al., 2012). Такая ситуация указывает на необходимость дифференциации разных групп геновариантов. По данным проведенного MLVA – анализа генетические варианты образуют два клональных комплекса – IV ( штаммов) и V (15 штаммов). Их аллельные идентификационные формулы, определенные даже по трем наименее вариабельным локусам I хромосомы существенно отличаются от таковых типичных штаммов I, II, III комплексов. Это означает, что MLVA – типирование позволяет дифференцировать генетически измененные и типичные штаммы возбудителя холеры. Более того, выявлены четкие различия между разными группами геновариантов, завезенными на территорию России из эндемичных очагов в различные временные периоды (1991-1993 гг. – штаммы IV-го комплекса, и 1997-2010 гг. – штаммы V-го комплекса). Четко выраженная разная аллельность взятых локусов указывает на существование заметных генетических различий между ними и может служить в пользу предположения о том, что сравниваемые группы геновариантов не ведут своего происхождения от одного клона. Следовательно, эпидемии холеры, зарегистрированные в современный период в различных странах, скорее всего, вызваны геновариантами, имеющими поликлональное происхождение и возникшими, видимо, одновременно или последовательно в разных эндемичных по холере регионах. Это предположение совпадает с гипотезой о происхождении различных геновариантов, высказанной ранее рядом исследователей (Kendall E. A. et al., 2010;

Morita М. et al., 2010).

Следует особо отметить тот факт, что MLVA-анализ позволил обнаружить гетерогенность геновариантов, входящих в один и тот же клональный комплекс. Так, V клональный комплекс представлен 4-мя различными подгруппами (рис. 3, А). Штаммы из 1-oй и 2-ой подгрупп, выделенные от больных в период эпидемических осложнений в Дагестане в 1998 г., Казани в 2001 г., отличаются от типичных изолятов только по структуре профага CTX. В то же время штаммы из 3-ей и 4-ой подгрупп, помимо профага CTX с геном ctxB1, несут делетированный остров пандемичности VSP-II. При этом распределение штаммов между двумя подгруппами было прямо связано с размером делеции. У штаммов 3-ей подгруппы из заносного очага в Ачинске (1997 г.) по данным ПЦР-анализа в VSP-II из 13 тестированных генов было делетировано 4, тогда как все изоляты из 4-ой-подгруппы, выделенные от больных в более поздние годы (Белорецк, г.;

Тверь, 2005 г.;

Мурманск, 2006 г.;

Москва, 2010 г.) имеют в VSP-II более протяженную делецию, а именно 7 генов (Смирнова Н.И. и др., 2011). Поскольку существует прямая связь между структурой VSP-II и эпидемическим потенциалом штаммов, то выявленная возможность дифференциации изолятов с интактным и делетированным островом пандемичности методом MLVA заслуживает большого внимания.

В связи с тем, что два локуса, расположенные на II хромосоме, являются гипервариабельными, их исключение из MLVA-анализа могло повысить достоверность данных относительно филогенетических связей между изучаемыми штаммами. Поэтому на следующем этапе работы при MLVA-анализе мы учитывали число VNTR-повторов лишь в трех локусах из I хромосомы. В результате число MLVA-типов или генотипов у исследуемого изолята снизилось с 36 до 10 (рис. 3, Б). В результате анализа филогенетического дерева штаммы 10 генотипов были разделены на четыре клональных комплекса, в два из которых (I и II) входят типичные штаммы, а в два (III и IV) – геноварианты. В целом, полученные данные были аналогичны результатам MLVA анализа, основанным на использовании пяти локусов. Типичные штаммы представляют собой генетически гомогенную группу. Геноварианты обособлены от них и входят в состав 2-х комплексов III и IV. При этом геноварианты, выделенные в разные годы (1993-1994 гг.

и 1997-2010 гг.), заметно различаются между собой по структуре генома и входят в состав двух разных комплексов, что подтверждает их поликлональное происхождение.

Таким образом, в ходе проведенного MLVA-анализа показана возможность внутривидовой дифференциации штаммов V. cholerae биовара Эль Тор на типичные и генетически измененные, которые различаются между собой по вирулентности и эпидемическому потенциалу, а также получены данные о существенном генетическом разнообразии геновариантов и их поликлональном происхождении.

ВЫВОДЫ 1. Геномный полиморфизм штаммов V. cholerae классического биовара, изолированных в разные временные периоды на территории Азии и России проявляется в разной структуре промоторной области оперона ctxAB (3-7 повторов TTTTGAT), кодирующего холерный токсин, а также гена tcpA (одна нуклеотидная замена G/T), определяющего продукцию основного белка токсин-корегулируемых пилей. Вместе с тем, исследованные участки генома возбудителя азиатской холеры являются относительно стабильными, что выражается в присутствии у всех изученных штаммов 15 тестируемых генов, связанных с вирулентностью и жизнеобеспечением и размещенных в коровой части хромосомы (toxR, hapA, rtxА, attRS) и на МГЭ (CTX, VPI-1, VPI-2, EPI).

2. Геном штаммов V. cholerae Эль Тор отличается от V. cholerae классического биовара присутствием протяженных вариабельных участков, в состав которых входят профаги CTX и RS1, остров патогенности VPI-2 и остров пандемичности VSP-II.

Вариабельность генома возбудителя холеры Эль Тор выражается в потере различных фрагментов ДНК, связанных с патогенностью и эпидемическим потенциалом, а так же в приобретении нового генетического материала.

3. Обнаружено, что типичные клинические штаммы V. cholerae биовара Эль Тор при попадании в водную среду могут утрачивать профаг CTX, несущий гены холерного токсина. Потеря профага CTX сопровождатся изменением экспрессии ряда генов, кодирующих дополнительные факторы патогенности (гемолизин и подвижность).

4. При сравнительном анализе протеомов выявлены существенные различия между изогенными токсигенными и нетоксигенными штаммами V. cholerae биовара Эль Тор в уровне экспрессии белков, участвующих в энергетическом обмене, транспорте глюкозы, хемотаксисе и биосинтезе пуриновых оснований.

5. Установлено, что у нетоксигенных мутантов значительно повышен (в 5-15 раз) уровень устойчивости к солевому и окислительному стрессу, а также выживаемость (в 2- раз) в водной среде по сравнению с исходными токсигенными штаммами.

6. С помощью метода MLVA по 5 локусам получены данные, позволяющие дифференцировать штаммы V. cholerae биовара Эль Тор на типичные и генетически измененные, различающиеся между собой по вирулентности и эпидемическому потенциалу. Показано, что геноварианты генетически неоднородны и имеют поликлональное происхождение.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Топорков А.В., Кульшань Т.А., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Генетическое разнообразие штаммов V. сholerae биовара Эль Тор, выделенных из различных источников на территории России (1970-2002 годы) // Материалы Всеросс. Научно-практ.

Конф «Окружающая среда и здоровье», Суздаль. – 2005. – С. 23-26.

2. Топорков А.В., Кульшань Т.А., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Генетическая неоднородность популяции холерных вибрионов биовара Эль Тор, выделенных на территории Астраханской области (1970-2002 годы) // Сб. матер. проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» Ростов – на – Дону. - 2005. - №.18. - С. 79 81.

3. Кульшань Т.А., Топорков А.В., Смирнова Н.И. Генетические изменения вирулентных штаммов холерных вибрионов биовара Эль Тор при их обитании в водной среде // Проблемы особо опасных инфекций - 2006. - Вып 1(91). - С. 41-44.

(журнал из перечня ВАК) 4. Смирнова Н.И., Кульшань Т.А., Челдышева Н.Б., Осин А.В. Структурные и функциональные изменения генома возбудителя холеры в водной среде // Эпидемиол.

и инфекцион. болезни. - 2007. - №5. – С. 22-27. (журнал из перечня ВАК) 5. Смирнова Н.И., Осин А.В., Нефедов К.С., Кульшань Т.А., Заднова С.П., Ливанова Л.Ф., Топорков А.В., Кутырев В.В. Вариабельность генома профага CTX и ее роль в изменении вирулентных свойств Vibrio cholerae биовара Эль Тор // Журн.

микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 2007. - №.6 - С. 20-26. (журнал из перечня ВАК) 6. Кульшань Т.А., Челдышева Н.Б. Изучение связи между структурой генома Vibrio cholerae и его персистентными свойствами // Материалы Всероссийской медико биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт Петербург. - 2007. - С. 228-229.

7. Kulshan T.A., Cheldyshova N. B., Smirnova N.I. Studying the mechanism of origination of Vibrio cholerae El Tor biovar // тээл (Natural infectious and emerging and re emerging diseases) – Scintific Journal - 2007. - №15. – Р. 238-245.

8. Шашкова А.В., Кульшань Т.А., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Молекулярно генетический анализ и изучение генетического родства измененных вариантов холерного вибриона биовара Эль Тор, выделенных в Российской Федерации // Материалы Х съезда ВНПОЭМП (Москва), Инфекция и иммунитет. - 2012. – Т. 2, вып. 1-2. - С. 344.

9. Кульшань Т.А., Краснов Я.М., Смирнова Н.И. Молекулярное типирование клинических штаммов V. cholerae О1 классического и Эль Тор биоваров с помощью метода MLVA // Материалы совещания специалистов Роспотребнадзора «Холера и патогенные для человека вибрионы», Ростов-на-Дону. - 2011. - №. 24. – С. 10-11.

10. Кульшань Т.А., Краснов Я.М., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И.

Молекулярное типирование методом MLVA типичных и генетически измененных природных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор // Проблемы особо опасных инфекций – 2012. - №4 - С. 39-43. (журнал из перечня ВАК)

 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.