авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Астрологический Прогноз на год: карьера, финансы, личная жизнь


Характеристика генов гороха (pisum sativum l.), вовлечённых в формирование арбускулярной микоризы

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА

Елена Владиславовна

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ ГОРОХА (PISUM SATIVUM L.),

ВОВЛЕЧЁННЫХ В ФОРМИРОВАНИЕ АРБУСКУЛЯРНОЙ

МИКОРИЗЫ

03.02.07 Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010 2

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ) РАСХН, лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий, Санкт-Петербург, Пушкин и в Национальном институте сельскохозяйственных исследований Франции (Institut National de la Recherche Agronomique - INRA), Дижон Научные руководители: доктор биологических наук Борисов Алексей Юрьевич лаб. генетики растительно-микробных взаимодействий ВНИИСХМ РАСХН, Санкт-Петербург, Пушкин профессор, доктор Джианиназзи-Пирсон Вивиен (Gianinazzi-Pearson Vivienne) институт INRA, Дижон, Франция

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук Миронова Людмила Николаевна Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург кандидат биологических наук Андронов Евгений Евгеньевич лаб. микробиологического мониторинга и биоремедиации почв ВНИИСХМ РАСХН, Санкт-Петербург, Пушкин Ведущее учреждение: Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится “ ” 2010 г. в часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан “ ” 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д.212.232. кандидат биологических наук Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Симбиоз между растениями и грибами арбускулярной микоризы (АМ) является одним из наиболее древних и широко распространнных взаимовыгодных растительно-микробных взаимодействий. Его возникновение около миллионов лет назад, вероятно, явилось ключевым фактором, способствовавшим колонизации растениями суши (Remy et al., 1994). Более 80% видов наземных растений формируют АМ, что способствует улучшению их минерального питания (преимущественно фосфатного) и дополнительному поступлению воды в растение (Harrison et al., 2005). Была доказана роль АМ симбиоза в повышении устойчивости растений к биотическим (патогены корней) и абиотическим (наличие тяжлых металлов, засолнность почв, засуха) стрессовым факторам (Dumas-Gaudot et al., 2000;

Gianinazzi et al., 2005). В свою очередь растение предоставляет грибу ассимилированный при фотосинтезе углерод, который он самостоятельно получает сапротрофным путм в недостаточном для нормальной жизнедеятельности количестве. Было подсчитано, что все растения земли передают АМ грибам около 5 миллиардов тонн углерода в год (Parniske et al., 2004). Таким образом, научная, агрономическая и экологическая значимость данных взаимовыгодных растительно-грибных взаимодействий огромна.

Большую роль в процессе определения генетических детерминант симбиоза играет получение и изучение симбиотических (SYM) мутантов растений с нарушениями развития АМ, что дат возможность исследовать симбиоз на конкретных этапах его формирования.

Клонирование SYM генов позволяет определить молекулярные основы мутаций и предположить функцию молекулярных продуктов изучаемых генов.

Другим приоритетным направлением генетики симбиоза является идентификация генов растений и АМ грибов, экспрессия которых существенно изменяется в процессе формирования и функционирования АМ симбиоза. Такие гены можно рассматривать в качестве молекулярных маркеров процессов (сигналинга, защитных реакций, метаболизма), происходящих в растении и грибе при симбиозе. Использование в исследованиях такого рода симбиотических мутантов растений с блоком развития АМ существенно увеличивает информативность подхода и позволяет связать происходящие изменения с конкретными стадиями развития симбиоза.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение роли поздних симбиотических генов гороха PsSym36, PsSym33 и PsSym40 в формировании функционального АМ симбиоза. Были поставлены следующие задачи исследования:

1. изучение эффекта мутаций в генах PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на экспрессию генов Glomus intraradices при формировании АМ симбиоза;

2. изучение экспрессии генов гороха (Pisum sativum L.), предположительно связанных с формированием АМ симбиоза, при микоризации корней растений дикого типа и мутантов RisNod24 (Pssym36), SGEFix--2 (Pssym33) и SGEFix--1 (Pssym40);

3. анализ экспрессии генов G.intraradices в растительных клетках, содержащих арбускулы;

4. разработка молекулярных маркеров и анализ сцепления генов PsSym36, PsSym40 и маркеров для локализации генов на генетической карте гороха с целью их последующего точного картирования и позиционного клонирования.

Научная новизна. Впервые проведено исследование влияния мутаций в симбиотических генах гороха посевного (Pisum sativum L.) PsSym36, PsSym33 и PsSym на экспрессию восьми генов P. sativum и десяти генов G. intraradices, предположительно вовлечнных в формирование функционального АМ симбиоза. Было показано, что блокирование развития арбускул в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36) приводит к существенному снижению экспрессии большей части анализированных грибных и растительных генов, в то время как более высокие темпы микоризации корней мутанта SGEFix--1 (Pssym40) коррелируют с более высоким, чем у растений дикого типа, уровнем экспрессии изученных грибных генов. Мутации в генах PsSym33 и PsSym40 имеют менее выраженный эффект на экспрессию анализированных генов гороха, чем мутация в гене PsSym36. Использование метода микродиссекции клеток лазером позволило осуществить выделение РНК из клеток, содержащих арбускулы, и впервые продемонстрировать преимущественную экспрессию генов G. intraradices, кодирующих супероксиддисмутазу (SOD), стеароил-CoA-десатуразу (DESAT) и пептидил-пролил-изомеразу (PEPISOM), в арбускулах.



Методическая и практическая значимость. Методология и молекулярные инструменты, разработанные в данном исследовании, могут быть использованы в дальнейшем при изучении растительных и грибных генов, контролирующих формирование и функционирование АМ. Полученный растительный материал (популяции растений поколений F1 и F2), разработанные молекулярные маркеры, а также данные картирования могут существенно облегчить дальнейшую работу по локализации генов гороха PsSym36 и PsSym40 на генетической карте для последующего точного картирования и позиционного клонирования данных генов. Полученные данные экспрессии растительных и грибных генов могут послужить базой для последующей работы по определению роли генов PsSym36, PsSym33 и PsSym40 в формировании симбиотических взаимоотношений растения с клубеньковыми бактериями и грибами арбускулярной микоризы. Результаты проведнных исследований могут быть использованы в курсах генетики развития и функционирования растительно-микробных систем профильных институтов и университетов.

Финансовая поддержка. Стипендия Департамента Науки, технологии и космоса Французского посольства в Москве, гранты РФФИ (07-04-01558, 07-04-01171).

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международном симпозиуме и школе молодых учных «The third Baltic sea region symposium and postgraduate course on agro-biotechnology focused on root-microbe systems» (Saint-Petersburg, Russia, 2007), конференциях «Plant-Microbial Interactions 2008 Conference» (Krakow, Poland, 2008), «Forum des Jeunes Chercheurs» (Besancon, France, 2008), «International Conference on Mycorrhiza 2009 ICOM6» (Belo Horizonte, Brazil, 2009), 9-м конгрессе IPMB «Leading Biology through Plant Science» (St. Louis, USA, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов докладов на международных научных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, четырх глав, включающих обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводов, списка литературы (259 наименований) и приложения.





Работа изложена на 191 странице, содержит 23 рисунка и 19 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Растительный материал. В работе были использованы формообразцы и линии гороха посевного Pisum sativum L. из коллекции Всероссийского научно исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (SGE, SGEFix-- (Pssym40), SGEFix--2 (Pssym33)), Всероссийского института растениеводства им. Н.И.

Вавилова (К3034, К1693, К7128,К8274), Д.Дюка (cv Finale, RisNod24 (Pssym36);

INRA, Дижон, Франция), Северного генного банка (NGB1238, NGB 851, NGB2715).

Изолят АМ гриба. В работе был использован гриб Glomus intraradices Schenck & Smith (BEG 141), предоставленный Международным банком Glomeromycota INRA, Дижон, Франция.

Штамм клубеньковых бактерий. Для инокуляции гороха был использован штамм Rhizobium leguminozarum bv. vicea CIAM1026 из коллекции ВНИИСХМ, Пушкин, Санкт-Петербург, Россия (Safronova, Novikova, 1996).

Условия вегетации растений.

Для экспериментов по анализу экспрессии генов семена проращивали в темноте на чашках Петри на смоченной дистиллированной водой фильтровальной бумаге. На 3-й день проростки были пересажены в 200 мл сосуды, содержащие смесь почвы и инокулюма, либо только почву (в зависимости от варианта опыта), по одному растению на сосуд. Растения выращивали в условиях климатической камеры (24/19 – температура день/ночь, 16ч – длина светого дня, 420 µmol m-2s-1, 70% - относительная влажность воздуха). Минеральное питание обеспечивалось модифицированным раствором Long Ashton (Hewitt, 1966), не содержащим соединений фосфора.

Для экспериментов по генетическому картированию растения выращивали в почве (pHKCl 5.5, P2O5 18.5 мг/100г почвы, K2O 4.3 мг/100г почвы) или стерильном песке (в зависимости от задач) в вегетационных домиках в климатических условиях Ленинградской области.

Методы исследования.

Анализ микоризации растений проводили на 21-е и 28-е сутки после инокуляции.

Корни окрашивали с помощью чрной туши (Sheaffer Manufacturing Co., USA) по методике Верхейлиг (Vierheilig et al., 1998). Активность щелочной фосфатазы в микоризованных корнях определяли по методике Тиссеран (Tisserant et al., 1993).

Параметры микоризации определяли по методике Тровло (Trouvelot et al., 1986).

Анализ экспрессии генов в корнях растений гороха. РНК выделяли из корней растений на 21-е и 28-е сутки после инокуляции G. intraradices по методике Логеманн (Logemann et al., 1987) с учтом модификаций Франкен и Градинер (Franken, Gradinger, 1994). ДНК удаляли, используя набор реактивов SV Total RNA Isolation System (Promega).

Синтез кДНК проводили согласно протоколу Вейдманн (Weidmann et al., 2004). Уровень экспрессии генов определяли методом абсолютного количественного ПЦР «в реальном времени», используя набор реактивов Absolute QPCR SYBR Green (ABgene, UK), в термоциклере ABI PRISM 7900 (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA). Определяли абсолютное количество транскриптов в трх биологических и трх технических повторностях. Полученные данные нормализовали относительно уровня экспрессии генов контроля G. intraradices TEF (фактор элонгации 1, - субъединица) и P. sativum GAPDH (глицеральдегид-фосфатдегидрогеназа).

Для анализа были выбраны следующие гены:

G. intraradices, кодирующие H+-АТФазу (H+-АТPase), щелочную фосфатазу (ALP), ингибитор диссоциации RHO/GDP (RHO), пептидил-пролил-изомеразу (PEPISOM), субъединицу 2 протеасомы 26S (26S), регуляторную субъединицу протеасомы 26S (26SREG), стеароил-CoA-десатуразу (DESAT), тиоредоксин пероксидазу (THIO), супероксиддисмутазу (SOD) и белок неизвестной функции (VACU);

P. sativum, кодирующие H+-АТФазу (H+-АТPase), фосфатный транспортер (PT4), «голубой» медь связывающий белок (BCOP), белок устойчивости к болезням (DRP), ингибитор трипсина (TI), глутатион-S-трансферазу (GST), МАР киназу (MAPK) и серин протеазу (SERPROT).

Анализ экспрессии генов в клетках, содержащих арбускулы. Экспрессию генов определяли в корнях мутанта SGEFix--1 (Pssym40) на 28-е сутки после инокуляции.

Корни фиксировали раствором Farmer’s fixative solution, окрашивали раствором эозина, заключали в парафин. Срезы толщиной 10µм делали на микротоме Jung RM 2065 (Leika).

Депарафинизацию образцов осуществляли раствором Histoclear II непосредственно перед микродиссекцией. Вырезание клеток осуществляли на Arcturus™Microdissection instrument (ARCTURUS NIKON inverse XT100). Для выделения РНК использовали набор реактивов PicoPure RNA Isolation kit (Arcturus), выделение проводили согласно протоколу производителя. Синтез кДНК осуществляли с использованием набора реактивов TargetAmp™2-Round aRNA amplification kit (Epicenter Biotechnologies, Madison,WI) согласно протоколу производителя. Уровень экспрессии генов определяли методом абсолютного количественного ПЦР «в реальном времени», как было описано ранее.

Разработка молекулярных маркеров и генетическое картирование. ДНК выделяли, используя CTAB буфер, согласно протоколу Роджерс и Бендич (Rogers, Bendich, 1985).

Для картирования в качестве молекулярных маркеров были использованы гены известной локализации на генетической карте гороха. Амплификацию проводили методом ПЦР с использованием праймеров, нуклеотидные последовательности которых были ранее опубликованы, либо проводили конструирование праймеров на основе консервативных участков гомологичных генов у разных видов растений. Для определения нуклеотидного полиморфизма между родителями продукты амплификации секвенировали, используя набор реактивов GenomeLab™ DTCS Quick Start kit (Beckman Coulter) и секвенатор CEQ™8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter) согласно протоколу производителя.

Статистическая обработка данных. Для обработки данных микоризации использовали критерий Стьюдента. Достоверность различий в уровне экспрессии генов (количество транскриптов) определяли методом однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа. Генетическое картирование проводили с помощью программы MapL98 (Prof. Yasui Ukai, Biometrics Laboratory, Graduate School of Agricultural Life Science, the University of Tokyo).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние мутаций в генах PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на формирование арбускулярной микоризы. Для анализа влияния мутаций в SYM генах гороха на уровень транскрипции отобранных генов растения и АМ гриба была изучена колонизация корней растений грибом. Параметры микоризации определяли на 21-е и 28-е сутки после инокуляции G. intraradices. Для визуализации АМ грибов использовали окрашивание чрной тушью, а для анализа функциональной активности симбиоза определяли активность щелочной фосфатазы. Мутация в гене PsSym36 приводила к блокированию процесса формирования арбускул, а также к снижению колонизации корней в целом (табл.

1). В корнях мутанта по гену PsSym33 было показано снижение интенсивности АМ колонизации на 21-е сутки после инокуляции, в то время как достоверных различий в параметрах микоризации между мутантом и диким типом на сроке 28 дней после инокуляции отмечено не было, что свидетельствует о замедленном развитии АМ в корнях данного мутанта (табл. 2). В корнях мутанта SGEFix--1 (Pssym40) было показано увеличение интенсивности микоризации и формирования арбускул по сравнению с растениями дикого типа как на 21-е, так и на 28-е сутки после инокуляции (табл. 2).

Показанные нарушения АМ фенотипа у мутантов по генам PsSym36, PsSym33 и PsSym соответствуют данным более ранних исследований (Gianinazzi-Pearson et al., 1992;

Jacobi et al., 2003).

Таблица 1. Параметры микоризации растений дикого типа (wild type- wt) cv Finale и мутанта RisNod24 (Pssym36) на 28 сутки после инокуляции G. intraradices Линия гороха А, % F, % M, % m, % a, % Окрашивание тушью 83.8 ± 5.3 47.6 ± 7.0 55.6 ± 5.4 19.9 ± 3.1 9.8 ± 2. Finale (wt) 61.2 ± 6.8 11.6 ± 3.0 18.4 ± 3.6 4.6 ± 0.7 0.6 ± 0. RisNod24 (Pssym36) Структуры гриба с активной щелочной фосфатазой 78.5 ± 3.7 9.1 ± 2.7 11.1 ± 2.8 19.0 ± 3.8 2.0 ± 1. Finale (wt) 69.8 ± 6.1 6.0 ± 0.9 8.7 ± 1.1 13.8 ± 2.0 0.8 ± 0. RisNod24 (Pssym36) F – частота микоризации корневой системы;

M – интенсивность АМ колонизации корневой системы;

m – интенсивность АМ колонизации микоризованных фрагментов корня;

A – содержание арбускул в корневой системе;

a – содержание арбускул в микоризованных фрагментах корня.

Таблица 2. Параметры микоризации растений дикого типа (wild type- wt) SGE и мутантов SGEFix--2 (Pssym33), SGEFix--1 (Pssym40) на 28 сутки после инокуляции G. intraradices Линия гороха А, % F, % M, % m, % a, % Окрашивание тушью 99.1 ± 0.9 36.3 ± 5.6 36.5 ± 5.5 21.5 ± 3.6 9.1 ± 3. SGE (wt) SGEFix--2 (Pssym33) 99.1 ± 0.9 27.7 ± 3.0 27.9 ± 3.0 24.8 ± 1.9 7.0 ± 1. SGEFix--1 (Pssym40) 99.2 ± 0.8 29.3 ± 1.9 29.6 ± 2.1 25.1 ± 3.5 7.5 ± 1. Структуры гриба с активной щелочной фосфатазой 93. ± 3.71 15.0 ± 3.2 15.9 ± 3.0 22.5 ± 4.8 3.8 ± 1. SGE (wt) SGEFix--2 (Pssym33) 94.1 ± 2.8 11.6 ± 1.5 11.8 ± 1.6 23.2 ± 5.1 2.7 ± 0. SGEFix--1 (Pssym40) 95.7 ± 2.3 29.5 ± 4.2 30.5 ± 3.9 24.5 ± 3.7 7.3 ± 1. Обозначения как и к табл. 1.

Экспрессия генов Glomus intraradices при формировании АМ у мутантов гороха RisNod24 (Pssym36), SGEFix--2 (Pssym33) и SGEFix--1 (Pssym40). Исследования проводили на 21-е и 28-е сутки после инокуляции. Для анализа были выбраны гены G.

intraradices, связь экспрессии которых с формированием функционального АМ симбиоза была показана в более раннем исследовании (Seddas et al., 2009). Это гены G. intraradices, кодирующие белки, гипотетически вовлеченные в процессы транспорта, сигналинга, транскрипции, синтеза белков, первичного и вторичного метаболизма (список генов в разделе «Материалы и методы»). Проведнный анализ транскрипции показал, что мутация в гене PsSym36, приводящая к блокированию формирования симбиоза на стадии арбускул, оказывает также существенное влияние на экспрессию генов G. intraradices. Количество транскриптов большинства вовлечнных в анализ генов, было существенно ниже в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36), чем у растений дикого типа (рис. 1). В свою очередь, мутация в гене PsSym40, результатом которой являются более высокие темпы микоризации и деградации арбускул, привела к существенному увеличению экспрессии части анализированных грибных генов (рис. 2). Мутация в гене PsSym33 оказала наименьший эффект на экспрессию грибных генов, что согласуется с менее выраженным отклонением параметров микоризации корней мутанта от дикого типа (табл. 2).

Так, в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36), имеющего дефект развития арбускул, было показано существенное по сравнению с диким типом снижение экспрессии гена, кодирующего H+-АТФазу, функция которой, как известно, заключается в обеспечении активного транспорта веществ через мембрану. Отсутствие обмена метаболитами между симбионтами в корнях мутанта по гену PsSym36 также объясняет низкий уровень экспрессии гена DESAT, который играет роль в модификации метаболизма липидов в грибной клетке, а именно, в биосинтезе жирных кислот. В корнях же мутанта по гену PsSym40 было отмечено существенное по сравнению с растениями дикого типа увеличение количества транскриптов генов H+-АТPase и DESAT, что отражает более высокую метаболическую активность АМ в корнях этого мутанта.

H+ATPase ALP b 600 a b a 0 RHO PEPISOM a a b 60 30 b 0 26S 26SREG 3000 a nd nd b DESAT THIO a a a b b b 0 SOD VACU a a b b 0 21 28 21 Сутки после инокуляции G. intraradices Рисунок 1. Экспрессия генов G. intraradices в микоризованных корнях растений дикого типа Finale ( ) и мутанта RisNod24 (Pssym36) ( ) на 21 и 28 сутки после инокуляции.

Буквами обозначены достоверные различия в уровне экспрессии генов (P0.05). – стандартная ошибка. nd – экспрессия не определяется.

H+ATPase ALP 800 b 600 a 500 400 300 100 RHO PEPISOM b a 26S 26SREG b b b a a a 0 DESAT THIO 90000 b b a a 0 SOD VACU 21 28 Сутки после инокуляции G. intraradices Рисунок 2. Экспрессия генов G. intraradices в микоризованных корнях растений дикого типа SGE ( ) и мутанта SGEFix--1 (Pssym40) ( ) на 21 и 28 сутки после инокуляции. Буквами обозначены достоверные различия в уровне экспрессии генов (P0.05). – стандартная ошибка.

В корнях мутантов RisNod24 (Pssym36) и SGEFix--1 (Pssym40) было показано изменение экспрессии генов PEPISOM и 26SREG, кодирующих шаперон и белок, участвующий в выборочной деградации аномальных и нормальных короткоживущих белков, а также генов антиоксидативного метаболизма, THIO и SOD, являющихся частью защитной системы гриба, активируемой при колонизации корней растения. Неожиданным стало увеличение экспрессии гена ALP в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36), имеющего дефект развития арбускул, а также в корнях мутанта SGEFix--2 (Pssym33) на 21 сутки после инокуляции, когда микоризация корней мутанта ещ сильно отставала от растений дикого типа. Как предполагают, щелочная фосфатаза гриба может играть роль в транспорте фосфата от гриба к растению. Увеличение экспрессии гена ALP в условиях не полностью сформированного симбиоза, установленное в данном исследовании, может свидетельствовать как об аккумуляции транскриптов гена до полного формирования симбиоза, так и о функции фермента, несколько отличной от предполагаемой.

В целом уровень транскрипции генов, кодирующих белки различных функциональных групп, в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36) был ниже, чем в корнях растений дикого типа, что, вероятно, является результатом создания неоптимальных условий развития и активности гриба внутри корня мутанта. Увеличение экспрессии части исследованных генов в корнях мутанта SGEFix--1 (Pssym40) может быть связано с более высокими темпами развития АМ симбиоза в его корнях.

Дифференциальная экспрессия генов Pisum sativum L., предположительно связанных с формировнием АМ, в корнях мутантов гороха RisNod24 (Pssym36), SGEFix--2 (Pssym33) и SGEFix--1 (Pssym40). Со стороны растения в качестве молекулярных маркеров АМ симбиоза было отобрано 8 известных генов, предположительно вовлечнных в процессы формирования и/или функционирования АМ симбиоза (Krajinski et al., 2002;

Wulf et al., 2003;

Liu et al., 2003;

Brechenmacher et al., 2004;

Grunwald et al., 2004;

Massoumou et al., 2007). Список генов представлен в разделе «Материалы и методы». Нуклеотидные последовательности генов гороха H+-АТPase, PT4, GST и SERPROT были не известны. По этой причине первоначально была проведена работа по конструированию ген-специфичных праймеров и амплификации фрагментов данных генов у гороха.

Проведнный анализ экспрессии показал, что все гены активны как в микоризованных, так и в неинокулированных корнях растений дикого типа и мутантов.

Наибольший эффект на экспрессию генов имела мутация в гене PsSym36 (рис. 3), в то время как изменения экспрессии генов в корнях мутантов SGEFix--2 (Pssym33) и SGEFix- 1 (Pssym40) были менее выражены. Зависимость экспрессии от процессов формирования и функционирования АМ симбиоза была показана для всех генов гороха за исключением гена, кодирующего H+-АТФазу. Особо следует отметить гены PT4, TI и GST, экспрессия которых существенно увеличивалась при инокуляции растений дикого типа и мутантов по генам PsSym33, PsSym40 и не изменялась (по сравнению с неинокулированным диким типом) при микоризации мутанта по гену Pssym36, что свидетельствует о связи функции генов с формированием функциональных арбускул. Ген PsPT4 имеет высокую степень гомологии с АМ специфичным фосфатным транспортером люцерны и, вероятно, его функция в арбускулах связана с транспортом фосфата в растение. Глутатион-S трансфераза (GST) играет важную роль в защитных механизмах растений (Anderson and Davis, 2004). Ингибитор трипсина (TI), вероятно, вовлечн в контроль развития гриба внутри растительной клетки. Более точное определение функции изучаемых генов в АМ симбиозе требует дальнейших исседований.

Сутки после инокуляции G. intraradices Рисунок 3. Экспрессия генов гороха в микоризованных и неинокулированных корнях растений дикого типа cv Finale (, ) и в микоризованных и неинокулированных корнях мутанта RisNod24 (Pssym36) (, ) на 21 и 28 сутки. Буквами обозначены достоверные различия в уровне экспрессии генов (P0.05). – стандартная ошибка.

Анализ транскрипции генов G. intraradices в клетках, содержащих арбускулы.

Одной из задач исследования являлась идентификация генов G. intraradices, экспрессия которых связана с формированием и/или функционированием арбускул. Основываясь на полученных данных экспрессии грибных генов в корнях мутантов RisNod24 (Pssym36) и SGEFix--1 (Pssym40), для анализа, в качестве наиболее вероятных кандидатов, были отобраны гены SOD, DEASAT и PEPISOM (рис. 1, рис. 2). Исследование проводили в корнях мутанта SGEFix--1 (Pssym40), для которого характерен более быстрый оборот арбускул. Количество транскриптов определяли в вырезанных лазером клетках, содержащих арбускулы, и в образцах (срезах), не подвергавшихся микродиссекции (рис.

4, рис. 5). Полученные данные нормализовали относительно количества транскриптов гена контроля TEF.

С D A B Рисунок 4. Вырезание лазером из микоризованных корней мутанта SGEFix--1 (Pssym40) кортикальных клеток, содержащих арбускулы. A – отображение образца на мониторе компьютера;

B – выделение клеток, содержащих арбускулы, используя графическое компьютерное обеспечение;

C - LCM Cap, содержащая вырезанные клетки;

D – клетки, вырезанные ИК лазером.

Рисунок 5. Экспрессия генов G. intraradices в образцах, не подвергавшихся микродиссекции (контроль) ( ), и в вырезанных лазером клетках, содержащих арбускулы ( ).

SOD DESAT PEPISOM Проведнные исследования позволило подтвердить преимущественную экспрессию генов SOD, DESAT и PEPISOM в арбускулах мутанта SGEFix--1 (Pssym40).

Было установлено, что количество транскриптов генов SOD, DESAT и PEPISOM в клетках, содержащих арбускулы, превышает количество транскриптов этих генов в образцах, не подвергавшихся микродиссекции, в 60, 6 и 2117 раз соответственно.

Показанная активация гена антиоксидативного метаболизма SOD, вероятно, является результатом ответной реакции гриба на генерацию растением реакций защиты и/или стресса, которые, как было показано ранее (Gianinazzi-Pearson et al., 1996), имеют место в клетках, содержащих арбускулы. Значительное увеличение экспрессии гена DESAT, кодирующего стеароил-СоА-десатуразу, с одной стороны, может быть связано с получением грибом фотосинтетического углерода от растения при формировании арбускул, с другой – с его участием в модификации плазматической мембраны грибов в процессе формирования арбускул. Ген PEPISOM, кодирующий пептидил-пролил изомеразу, являющуюся шапероном, наиболее вероятно играет роль в процессе формирования и деградации арбускул. Однако, несмотря на полученные данные, требуется дальнейшее детальное изучение роли генов SOD, DESAT и PEPISOM в процессах формирования и функционирования АМ симбиоза в целом и арбускул в частности.

Локализация генов PsSym36 и PsSym40 на генетической карте гороха. В проведнном ранее картировании с использованием небольшой (50 растений) популяции F2 (В. Жуков, личное сообщение) было обнаружено сцепление гена PsSym36 с морфологическим маркером wb. В данной работе была получена выборка F2 большего объма (217 растений) и проверено сцепление данных генов. Было показано, что гены PsSym36 и Wb не сцеплены. Для локализации гена PsSym40 было отобрано 34 гена известной локализации на генетической карте гороха в группах сцепления I, II, III и V. На основе обнаруженного нуклеотидного полиморфизма между родителями было сконструировано 18 молекулярных маркеров. Однако проведнное картирование не привело к локализации гена PsSym40 на генетической карте гороха. Поскольку использованные молекулярные маркеры перекрывают большую часть генетической карты I, II, III и V групп сцепления гороха (рис. 6), локализация гена PsSym40 в изученных сегментах данных групп сцепления может быть исключена.

Рисунок 6.

Локализация молекулярных маркеров на генетической карте гороха Цветом выделены области, в которых локализация гена PsSym40 может быть исключена.

ВЫВОДЫ Мутация в гене PsSym36 приводит к нарушению формирования арбускул, в то 1.

время как мутации в генах PsSym33 и PsSym40 – к изменениям скорости и интенсивности микоризации растений, что подтверждает данные более ранних исследований.

Эффект мутаций в генах гороха PsSym36, PsSym33 и PsSym40 проявляется как в 2.

нарушении колонизации и морфологической дифференциации грибов Glomus intraradices в процессе формирования арбускулярной микоризы, так и в изменении активности генов Pisum sativum L. и Glomus intraradices Schenck & Smith, определенный уровень экспрессии которых необходим для функционирования данного симбиоза.

Мутация в гене PsSym36 приводит к существенным изменениям, большей частью к 3.

снижению, экспрессии генов G. intraradices и P. sativum, что, очевидно, отражает роль данного гена в развитии арбускул в клетках корня растения.

Мутация в гене PsSym33 оказывает менее выраженный эффект на экспрессию 4.

генов G. intraradices и P. sativum, также как и на формирование и функционирование АМ симбиоза, чем мутации в генах PsSym36 и PsSym40.

Мутация в гене PsSym40 приводит к увеличению уровня экспрессии большинства 5.

проанализированных генов G. intraradices, а также части генов P. sativum, что, вероятно, связано с более высокими темпами формирования АМ симбиоза в корнях мутанта по гену Pssym40.

Увеличение уровня экспрессии генов intraradices, кодирующих 6. G.

супероксиддисмутазу (SOD), стеароил-СоА-десатуразу (DESAT) и пептидил пролил-изомеразу (PEPISOM), в клетках корня мутанта SGEFix--1 (Pssym40), содержащих арбускулы, является доказательством роли данных генов в формировании и функционировании арбускул.

Анализ сцепления гена PsSym40 с набором молекулярных маркеров позволил 7.

исключить локализацию данного гена в изученных районах групп сцепления гороха I, II, III и V.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Борисов, А.Ю. Регуляторные гены гороха посевного (Pisum sativum L.), контролирующие развитие азотфиксирующих клубеньков и арбускулярной микоризы: фундаментальные и прикладные аспекты / А.Ю. Борисов, А.Г.

Васильчиков, В.А. Ворошилова … Е.В. Кузнецова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. – 2007.- Vol. 43, N 3. - C. 265 – 271.

2. Zhukov, V.A. Gene-based markers of pea linkage group V for mapping genes related to symbioses / V.A. Zhukov, E.V. Kuznetsova, E.S. Ovchinnikova et al. // Pisum Genetics. 2007. –Vol. 39. - P. 19-25.

3. Seddas-Dozolme, P. Expression profiling of fungal genes during arbuscular mycorrhiza symbiosis establishment using direct fluorescent in situ RT-PCR. / P. Seddas-Dozolme, C. Arnould, M. Tollot, E. Kuznetsova et al. // Molecular and Cell Biology Methods for Fungi. Berlin-Heidelberg, 2009. – P. 137-152.

4. Kuznetsova, E. Symbiosis-related pea genes modulate fungal and plant gene expression during the arbuscule stage of mycorrhiza with Glomus intraradices / E. Kuznetsova, P.

Seddas-Dozolme, C. Arnould et al. // Mycorrhiza.- 2010. – Vol. 20, N 6. – P. 427-43.

Тезисы конференций:

1. Kuznetsova, E. Effect of pea (Pisum sativum L.) gene PsSym36 on Glomus intraradices Schenck &Smith gene expression / E. Kuznetsova, P. Seddas-Dozolme, V. Gianinazzi Pearson, A. Borisov // The third Baltic sea region symposium and postgraduate course on agro-biotechnology focused on root-microbe systems:

Abstract

book (St.Petersburg, Russia, 25 June- 2 July, 2007).- St. Petersburg, 2007.- p. 33.

2. Zhukov, V.A. Genome synteny of pea and model legumes: from mutations through genetic mapping to the genes / V.A. Zhukov, A.Y. Borisov, E.V. Kuznetsova et al. // 15th International Congress on Nitrogen Fixation: Abstract book (Cape Town, Suth Africa, 21-26 January, 2007). - Cape Town, Suth Africa, 2007. - p. 62.

3. Gianinazzi-Pearson, V. Signposting compatibility events driving the mycorrhizal rout / V. Gianinazzi-Pearson, P. Seddas, M. Tollot, E. Kuznetsova et al. // Plant-Microbial Interactions 2008 Conference: Abstract book (Krakow, Poland, 2-5 July, 2008). Krakow, Poland, 2008. – p. 37.

4. Kuznetsova, E. Effect of mutations in pea genes PsSym36, PsSym33 and PsSym40 on Glomus intraradices gene expression / E. Kuznetsova, Seddas P., V. Gianinazzi-Pearson et al. // Forum des Jeunes Chercheurs: Abstract book (Besancon, France, 12-13 June, 2008). - Besancon, France, 2008. – p. 51.

5. Kuznetsova, E. Pea genes modulate symbiosis-associated fungal and plant molecular responses during late stages of the arbuscular mycorrhizal symbiosis / E. Kuznetsova, P.

Seddas-Dozolme, C. Arnould et al. // The International Conference on Mycorrhiza ICOM6: Abstract book (Belo Horizonte, Brazil, 9-14 August, 2009). - Belo Horizonte, Brazil, 2009. – p. 35.

6. Kuznetsova, E. Pea genes modulate symbiosis-associated fungal and plant molecular responses during late stages of the arbuscular mycorrhizal symbiosis / E. Kuznetsova, P.

Seddas-Dozolme, C. Arnould et al. // 9th IPMB Congress “Leading Biology through Plant Science”: Abstract book (St. Louis, MO – USA, 25-30 October, 2009). - St. Louis, USA, 2009. – p. 27.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.