авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Астрологический Прогноз на год: карьера, финансы, личная жизнь


Нелинейно-оптические эффекты и многофотонное поглощение фемтосекундных импульсов в микрохирургии ранних эмбрионов млекопитающих

на правах рукописи

Залесский Александр Дмитриевич НЕЛИНЕЙНО-ОПТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ И МНОГОФОТОННОЕ ПОГЛОЩЕНИЕ ФЕМТОСЕКУНДНЫХ ИМПУЛЬСОВ В МИКРОХИРУРГИИ РАННИХ ЭМБРИОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 01.04.17 – химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учной степени кандидата физико-математических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической физики им. Н.Н. Семнова Российской академии наук (ИХФ РАН).

Научный консультант: Надточенко Виктор Андреевич, доктор химических наук, профессор, ИХФ РАН, зав. лаб.

Официальные оппоненты: Гурия Георгий Теодорович, доктор физико-математических наук, профессор, ГНЦ МЗ РФ, зав. лаб.

Смирнов Вячеслав Александрович, доктор физико-математических наук, ИПХФ РАН, в.н.с.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем лазерных и информационных технологий Российской академии наук (ИПЛИТ РАН).

Защита диссертации состоится «20» марта 2013 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.012.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической физики им. Н.Н. Семнова Российской академии наук (ИХФ РАН) по адресу:119991, Москва, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. Н.Н. Семнова Российской академии наук (ИХФ РАН).

Автореферат разослан «20» февраля 2013 года.

Учный секретарь диссертационного совета Д 002.012.02, кандидат физико-математических наук М.Г. Голубков.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Диссертационная работа посвящена экспериментальному и теоретическому изучению взаимодействия лазерного излучения с искусственными и биологическими мезоскопическими объектами. Основной задачей работы является исследование взаимодействия остросфокусированных лазерных пучков с эмбриональными клетками и разработка экспериментальных методик.

Актуальность работы определяется фундаментальным интересом к механизмам взаимодействия сверхкоротких лазерных (фемтосекундных) импульсов с биологическими объектами, что определяется развитием новых клеточных биотехнологий. Остросфокусированное лазерный луч можно использовать в качестве «пинцета» за счет различных опто-механических эффектов, и осуществлять манипулирование мезоскопическими биообъектами. При использовании фемтосекундных импульсов в фокальной плоскости объектива можно получить высокую плотность мощности излучения в результате чего оптически прозрачный биологический материал становится поглощающим за счет нелинейно-оптических эффектов.

Фемтосекундные импульсы обеспечивают высокую плотность мощности излучения при невысокой энергии импульса и в результате удается сфокусированный лазерный луч использовать в качестве лазерного «скальпеля» без значительного теплового повреждения биообъекта. На основе оптического «пинцета» и «скальпеля» представляется возможным создать методики манипулирования биообъектами в которых операции можно осуществлять с биоклетками без нарушения целостности оболочки.

Этот подход открывает новые возможности в биотехнологии клеток.

Фундаментальными основами такого подхода служит исследование фотохимических и фотофизических процессов в биообъектах индуцированных многофотонным поглощением фемтосекундных импульсов.

В данной работе решаются задачи разработки экспериментальных методов лазерной нанохирургии с использованием множества оптических «скальпелей» и «пинцетов», сформированных методами динамической голографии, с использованием фемтосекундного и непрерывного лазерного излучения с различными спектральными характеристиками.

Задачи и цели работы.

Цель работы состоит в разработке и реализации методик оптического манипулирования с использованием лазерных импульсов фемтосекундной длительности. Данная работа решает следующие задачи:

1. Исследовать возможность использования фемтосекундных лазерных импульсов для реализации оптического манипулирования мезоскопическими объектами и осуществления активного физико химического воздействия на объект изучения.

2. Разработать и реализовать новую методику голографического оптического манипулирования мезоскопическими объектами с использованием фемтосекундных импульсов, исследовать возможности и ограничения новой методики.

3. Разработать фундаментальные основы технологии получения генетически модифицированных животных при помощи лазерного манипулятора с использованием принципов многофотонной фотохимии.

4. Разработать фундаментальные основы технологии терапевтического клонирования с использованием методов лазерного манипулирования мезоскопическими объектами.

Научная новизна.

Разработана и реализована не имеющая аналогов экспериментальная установка лазерного манипулирования микрообъектами, с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров. Таким образом, реализован новый метод оптического манипулирования, совмещающий возможности фемтосекундного лазерного скальпеля и «голографического оптического пинцета».

Экспериментально установлены параметры лазерного излучения (длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц, длина волны 800 нм, энергия импульса 1 нДж, длительность экспозиции 30 мс) необходимые для проведения неинвазивного лазерного слияния двух бластомеров эмбриона мыши. Также установлены параметры воздействия фемтосекундным скальпелем (длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц, длина волны 800 нм, энергия импульса 1 нДж, длительность экспозиции 10 мс) для слияния яйцеклетки мыши с соматической клеткой. Выявлены различия при слиянии двух клеток равного размера и клеток, размеры которых различаются на порядок величины.



Успешное слияния бластомеров эмбриона мыши происходило при образовании кавитационного пузыря при воздействии фемтосекундным лазерным скальпелем. При этом не наблюдалось заметного изменения морфологии клеток сразу после воздействия, полное слияние происходило через 20 – 30 минут. При слиянии ооцита (яйцеклетки) мыши и фибробласта (размер фибробласта на порядок величины меньше размера ооцита) процедура протекало успешно при отсутствии кавитационного пузыря. При этом сразу после воздействия фемтосекундного скальпеля наблюдалось образование «перемычки» между клетками.

Практическая значимость работы. Методики, разработанные на основе полученных в ходе работы данных, имеют непосредственное прикладное значение в биологии, медицине и фармацевтике. Предложенная новая технология получения генетически модифицированных животных («чистые линии») находится на стадии патентования.

Получение индивидуальных эмбриональных стволовых клеток человека и на сегодняшний день является актуальнейшей задачей современной биомедицины. Одним из важнейших результатов работы является демонстрация возможности использовать разработанную методику лазерного манипулирования для проведения терапевтического клонирования, т.е. получения индивидуальных эмбриональных стволовых клеток.

Личный вклад автора. Экспериментальные установки для проведения экспериментов были собраны лично автором. Все приведнные в диссертации экспериментальные результаты получены автором лично либо при его участии. Постановка задачи, а также обсуждение результатов всех представленных экспериментальных данных происходило при непосредственном участии автора.

Апробация работы. Основные результаты, вошедшие в диссертацию, были представлены в докладах на следующих научных конференциях:

1. 51-я научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», г. Москва – Долгопрудный, 2008 г.

2. Всероссийская научная конференция с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008», г. Москва, 2008 г.

3. 52-я научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», г. Москва – Долгопрудный, 2009 г.

4. «Конференция-конкурс молодых физиков», г. Москва, 2010 г.

5. «14-я Пущинская международная школа-конференция молодых учных», г. Пущино, 2010 г.

6. ICONO/LAT, Kazan, 7. «15-я Пущинская международная школа-конференция молодых учных», г. Пущино, 2011 г.

8. «Химическая физика вчера, сегодня, завтра», г. Москва, 2011 г.

9. XXIV Семновские чтения, г. Москва, 2012 г.

10.II-я Международная конференция «Модели инновационного развития фармацевтической и медицинской промышленности на базе университетов, как интеграторов науки и индустрии», г.

Долгопрудный, 2012 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в реферируемых журналах, входящих в перечень ВАК.

Объм и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения и списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении приведено обоснование актуальности выбранной темы, перечислены основные цели и задачи работы, говорится о е научной новизне и практической значимости, коротко излагается содержание диссертации.

Первая глава диссертации является обзором научной литературы по тематике работы. В этой главе кратко изложены основные принципы оптического манипулирования, рассмотрена история развития этой методики, представлены модели взаимодействия фемтосекундного лазерного излучения с биообъектами, которое приводит к практически важному результату – локальной деструкции биоматериала или микрохирургии.

Во второй главе описываются разработанные экспериментальные установки и предварительные экспериментальные результаты. Установка создана в лаборатории био- и нанофотоники Института химической физики им. Н.Н. Семнова РАН.

В третьей главе теоретически рассматривается возможность реализации оптического захвата и манипулирования при помощи фемтосекундных лазерных импульсов, обсуждается вопрос возможности реализации голографического оптического манипулирования фемтосекундными импульсами.

В четвртой главе приведены результаты различных подготовительных экспериментов, демонстрирующих широкие возможности предлагаемой методики манипулирования биообъектами при помощи лазерного излучения. Описываются экспериментальные результаты по микрохирургическому воздействию на ранние эмбрионы мышей при использовании двух источников лазерного излучения – непрерывного и фемтосекундного. Приведены данные по развитию эмбрионов после воздействия, выполнено сравнение с контрольными группами. Сделаны выводы о влиянии лазерного воздействия на последующее развитие эмбрионов. Рассмотрены особенности лазерного слияния бластомеров эмбриона, приведены экспериментальные результаты по слиянию этих клеток, рассмотрены возможные механизмы слияния.





В пятой главе, исходя из предыдущих результатов, предлагаются две новые, практически важные, неинвазивные методики для клеточной инженерии – методика получения «чистых линий» животных и методика лазерного терапевтического клонирования. Кратко обосновывается важность предлагаемых разработок и актуальность этих тематик. Приводятся экспериментальные данные по получению реконструированного эмбриона, как в процессе получения «чистой линии», так и в случае терапевтического клонирования. Приведены результаты развития подобных реконструированных эмбрионов до стадии бластоцисты – стадии, на которой возможна имплантация реципиенту и дальнейшее получение потомства.

В Заключении датся перечень результатов, выносимых на защиту, обсуждается их практическая и научная значимость.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Принцип действия оптического манипулятора.

Оптический манипулятор основан на оптическом захвате объекта.

Описание физики захвата зависит от отношения размера частицы и длины волны излучения, с помощью которого производится захват. Существует два предельных случая: 1) размер частицы много меньше длины волны и 2) размер частицы много больше длины волны.

В первом случае полагают, что частица в фокусе объектива под действием лазерного излучения становится однородно поляризованной, и далее е рассматривают как точечный диполь. На частицу подобного типа, в общем случае, действуют силы, обусловленные поглощением, рассеянием света ( Fпогл. и Fрасс. ), а также градиентом интенсивности излучения (Fград.).

Сила Fград пропорциональна поляризуемости:

Fград (1) E2, и всегда направлена вдоль градиента интенсивности к дифракционно ограниченному фокальному пятну. Эта сила может превосходить другие упомянутые силы (Fпогл. и Fрасс.), что приводит к эффекту «ловушки»: частица попадает в потенциальную яму, которую в данном приближении можно x x описывать гармоническим потенциалом: U 1 k, где k является характеристической константой захвата и x0 - центр ловушки.

Поведение прозрачных частиц, размеры которых много больше длины волны падающего излучения, описывается классическими теориями преломления и отражения.

Движения частицы в потенциальной яме под действием света.

С целью установления необходимых параметров установки при использовании фемтосекундного лазера для оптического захвата, было проведено теоретическое описание перемещения броуновской частицы импульсным лазером.

Для непрерывного лазера рассмотрим поведение захваченной частицы в потенциальной яме U (r) U (r ) глубины Ub и ширины lw (рис.1).

Последняя величина определяется из равенства U (lw ) kBT. Потенциал обусловлен U (r ) взаимодействием частицы с электрическим полем [см. формулу (1)]:

U (r ) E 2 (r ) ~ W (r ), (2).

Рис. 1. Потенциальная яма которое пропорционально квадрату оптической «ловушки».

электрического поля лазерного излучения E(r), т.е. мощности лазера W (r ) ~ E 2 (r ) и поляризуемости частицы. Ширина lw и глубина Ub ямы определяются длиной волны лазера, мощностью излучения W, фокусирующим объективом (есть зависимость от параметров установки).

Кинетика движения частицы описывается функцией распределения (ФР) (r, t ) этой частицы, которая удовлетворяет уравнению Смолуховского Dr 2 / r[r 2 ( / r u / r )], где u (r ) U (r ) /(kBT ).

Модуляция напряжнности электрического поля лазера E(r,t) приводит к зависимости потенциала от времени. Пусть зависимость E(t) имеет импульсный вид, Ep - амплитуда импульсов, p - их длительность, а d время между импульсами, причм d p.

В пределе быстрой модуляции E(r,t), когда за время «модуляции» p d частица практически не смещается внутри потенциальной «ямы»: D lw, где p d, поставленная задача существенно упрощается. В этом пределе кинетика частицы может быть описана с помощью ФР, усредннной по некоторому периоду Te,который удовлетворяет неравенствам Te lw / D : t T / (r, t ) Te1 t T / 2 dt1 (r, t1 ).

e e (r, t ) ФР подчиняется усредннному уравнению Смолуховского D( u ), где u (r ) U (r ) /(kT ), в котором средний потенциал U ( r ) не зависит от времени и определяется потенциалом U p (r ) E p (r ) ~ W p (r ) :

t T / U (r ) Te1 t Tee/ 2 dt1U (r, t1 ) p ( d p ) 1U p (r ).

(3) Таким образом, в пределе быстрой модуляции кинетика броуновской частицы также описывается уравнением Смолуховского [аналогичным уравнению, относящемуся к случаю непрерывного лазера, т.е. остатся захваченной], но с потенциалом U(r), заменнным на средний U (r ), который может быть легко определн. Можно сделать следующий вывод: для успешного оптического захвата броуновской частицы необходимо использовать импульсный лазер с высокой частотой повторения импульсов, чтобы за время между импульсами частица не успевала значительно сместиться из точки захвата. Воспользоваться формулой Стокса для определения коэффициента диффузии D (kT ) /(6 a), в которой вязкость растворителя и a радиус частицы (предполагается, что частица имеет сферическую форму). Для невязкого растворителя, такого как вода при комнатной температуре, для a 104 см эта формула дат D ~ 10-9см2/с, для быстрой модуляции D lw -6 a 107 см получаем D ~ 10 см /с. Условие выполняется как в первом, так и во втором случае для лазера с частотой повторения импульсов порядка 1 МГц. Таким образом, оптический захват фемтосекундными импульсами возможен для широкого диапазона размеров объектов.

Отметим, что в рассмотренном пределе d p усредннная потенциальная яма намного мельче ямы U p (r ) : U (r ) ( p / d )U p (r ) U p (r ).

Также видно, что в рассмотренном пределе при равенстве мощности излучения непрерывного лазера и средней мощности импульсного лазера поведение броуновской частицы идентично.

Эффект движения потенциальной ямы.

Кинетика движения броуновской частицы в потенциальной яме, которая перемещается в пространстве, также может быть описана с помощью уравнения, Смолуховского но с заменой потенциала U (r ) на U t (r, t ) U (r rp (t )) : D( ut ), где ut (r, t ) U (r - rp (t )) /(kT ). В этом случае процесс удобно анализировать в системе отсчта, связанной с потенциальной ямой, т.е. в координате x r - rp (t ), в которых уравнение имеет вид: Dx (x xux ), где ux (x, t ) U x ( x, t ) /( kT ) u ( x) f p (t ) x и f p (t ) Fp (t ) /(kT ) v p (t ) / D. (4) Сила Fp (t ) (kT / D) v p (t ) v p (t ) /, в которой = D/(kT) – подвижность частицы, описывает эффект «трения».

действующего со стороны среды на Броуновскую частицу. Потенциал U x ( x, t ) Рис. 2. Вид потенциала при схематически изображн движении оптической на рис. 2 как функция координаты x «ловушки».

вдоль вектора vp.

Энергия Ua может быть оценена как Ua ~ (kT)flw, т.о. потенциальная яма «разрушается» (частица «уходит» из ямы с большой скоростью), когда U a (kT ) f plw U b, т.о. v p ( D / lw )(U b / kT ) (U b / lw ). (5) Формула (5) дат зависимость максимальной скорости перемещения броуновской частицы с помощью фемтосекундного оптического захвата от характеристик частицы (подвижность, поляризуемость) и установки(значение глубины потенциальной ямы зависит от мощности лазерного излучения).

Проведм небольшую оценку: для невязкого растворителя, такого как вода и -9 a 104 см, D ~ 10 см /с (получено ранее).Тогда для Ub/(kT) = и lw = ~ 810-5см мы получаем значение предельной скорости перемещения vp ~2 мкм/с. Таким образом, используя фемтосекундный оптический захват, можно манипулировать захваченным объектом. Следует отметить, что предельная скорость перемещения напрямую зависит от формы потенциальной ямы, которая, в свою очередь, зависит от параметров установки. Следовательно, полученная из формулы (5) скорость v p может использоваться как критерий эффективности фемтосекундного оптического захвата.

Голографический захват с использованием фемтосекундного излучения.

Схема установки представлена на рис. 3. Основными элементами установки являются: фемтосекундный лазер Mаi –Tai фирмы Newport\Spectra Physics (длительность 100 фс, частота повторения 80 МГц, спектральный диапазон 690-1000 нм), непрерывны Nd : YVO4 лазера c удвоением гармоники Milenia фирмы Newport\Spectra Physics (длина волны 532 нм, средняя мощность 3.5 Вт), титан-сапфировый резонатор для генерации непрерывного излучения в ближнем ИК- диапазоне (750-850 нм) фирмы Avesta, инвертированный микроскоп OLYMPUS IX71, пространственные оптические модуляторы (ПОМ) SLM Holoeye HEO 1080P (размером 15. 8.64 мм2 и разрешением 1920 1080 пикселей) и SLM Brillian (размером 16.39 10.56 мм2 и разрешением 1920 1200 пикселей), платформа атомно силовой зондовой микроскопии NTEGRA фирмы NT-MDT.

При помощи пары линз достигалась коллимация и растягивание диаметра фемтосекундного пучка до размеров первого ПОМ. Для непрерывного лазера также использовалась пара линз с целью коллимации и увеличения диаметра пучка до размеров второго ПОМ. Фемтосекундное и непрерывное лазерное излучение, отражнное каждое от своего ПОМ, совмещалось при помощи дихроичсекого зеркала. Далее, использовалась ещ одна пара линз и дихроическое зеркало для заведения фемтосекундного и непрерывного лазерного излучения в объектив (Olympus 100х UPLSAPO с числовой апертурой 1.4 или Olympus 60х LUCPLFLN с числовой апертурой 0.7) инвертированного микроскопа. Кроме того, в установке используется призменный компрессор для чирпирования фемтосекундных импульсов, что позволяет менять длительность действия оптической ловушки в предметной плоскости.

Компьютер ПОМ Интерфейсные Непрерывный лазер блоки Образец Предметный столик Объектив ПОМ CCD камера Спектрограф Диодный лазер Видеокамера Фемтосекундный лазер Рис. 3. Общая схема установки.

Призменный блок чирпирования импульса Флуоресценция образца собиралось этим же объективом, направлялось на CCD-камеру Andora. Также в установке используется электро механический затвор (Thorlabs SH05), позволяющий получать цуги фемтосекудных импульсов минимальной длительностью 10 мс. Измерение длительности оптических ловушек на предметном столике микроскопа осуществлялось при помощи автокоррелятора (Avesta). В работе использовалось разработанное нами программное обеспечение, позволяющее создавать и перемещать множество оптических ловушек в трехмерном пространстве, одновременно как для фемтосекундного, так и для непрерывного излучения. Установка оснащена дополнительным источником лазерного излучения – непрерывный диодный лазер с возможностью контроля времени экспозиции, длина волны 1,48 мкм, мощность 500 мВт.

Данный лазер используется нами для осуществления микрохирургического воздействия, в тех случаях, когда не требуется высокая степень локализации, а напротив, необходимо выполнить микрохирургию на участке в несколько микрометров.

Демонстрация возможности использования фемтосекундных импульсов света для одновременной манипуляции несколькими объектами показана на рис.4 - 5. В наших экспериментах использовалась фемтосекундная голографическая установка. В первом эксперименте несколько оптических ловушек создавалось на пластинке, покрытой флуоресцентной краской (максимум поглощения близок к 400 нм).

Двухфотонная флуоресценция возбуждалась фемтосекундными импульсами на длине волны 800нм (длительность 100 фс, средняя мощность излучения мВт). С помощью компьютера задавались траектории движения нескольких ловушек. Они перемещались одновременно и независимо друг от друга.

Направления перемещений указаны стрелками. На рисунке представлены два кадра из видеозаписи эксперимента: первый и последний. В оптической схеме использовалось делительное зеркало, пропускающее видимое излучение, и не пропускающее в видеокамеру ИК-излучение (засветка камеры отражнным ИК-излучением практически отсутствовала).

Рис.4. Последовательность кадров из видеозаписи (пунктиром обозначены изначально заданные траектории).

Во втором эксперименте (рис. 5) использовались полимерные шарики диаметром 4,4мкм. Была реализована манипуляция пятью шариками одновременно, причм каждый шарик перемещался независимо от остальных. Использовались фемтосекундные импульсы на длине волны нм (длительность 100 фс, средняя мощность 80 мВт). Управление положением шариков осуществлялось в автоматическом режиме при помощи компьютера. На представленном рисунке приведена последовательность кадров из видеозаписи эксперимента. На первом кадре стрелками обозначены направления движения шариков.

Рис.5. Управление полимерными шариками (пунктиром обозначены траектории частиц изначально заданные траектории движения частиц).

Лазерная энуклиация ооцита (яйцеклетки) мыши.

Процедуру энуклеации (инактивации метофазной пластинки ооцита, содержащей генетический материал клетки) можно условно разбить на несколько этапов. Первый этап: нужно локализовать генный материал, который содержится в ооците. Было выполнено флуоресцентное окрашивание (Ххст 33342, флуоресценция 460-490) генного материала, после чего с использованием методики сканирующей двухфотонной микроскопии (длина волны 800 нм, длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц, время экспозиции 30мс, энергия импульса 0,13 нДж, размер области сканирования 40*40 мкм) была локализована область в ооците содержащая генный материал (рис. 6).

10 мкм Рис. 6. Флуоресцентное изображение метофазной пластинки в яйцеклетке (ооците) мыши.

После локализации мы переходили ко второму этапу: энергия лазерного излучения увеличивалась, производилось облучение области, содержащей генный материал, и одновременно регистрировался сигнал дфухфотонной флуоресценции. В нашей работе мы обнаружили два режима воздействия, зависящих от энергии фемтосекундных импульсов: первый режим реализовывался при высоких значениях энергии импульса и сопровождался видимым образованием микропузырьков кипения (или кавитационных пузырьков). Второй режим реализовывался при меньших значениях энергии импульса. В этом режиме не наблюдалось такого локального «вскипания» как в первом режиме, при этом мы наблюдали, что флуоресцирующая область уменьшалась от сканирования к сканированию.

Зависимость значения площади флуоресцирующей области от номера сканирования, соответствующего времени облучения, приведена на рис. 7. В этом режиме энергия импульса составляла 0,33 нДж, длина волны 800 нм, длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц, экспозиция в точке 30 мс, область сканирования составляла 40*40 мкм.

площадь, мкм 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 номер сканирования Рис. 7. Зависимость площади флуоресцирующей метофазной пластинки от номера последующего сканирования.

Такие различия между первым и вторым режимом воздействия мы интерпретируем следующим образом: в первом режиме происходит пороговое разрушение биоматериала с выделением тепла, во втором режиме происходит разрушение биоматериала, связанное с разрывом химических связей при многофотонном поглощении света практические без выделения тепла. Мы полагаем, что второй режим хоть и происходит медленнее, чем первый, однако он является перспективным для осуществления энуклеации, так как он связан с более «мягким» процессом разрушения генного материала. Эти данные в настоящее время являются предварительными, и мы планируем дополнительную работу для их проверки.

Микрохирургия при помощи диодного лазера.

При помощи диодного источника лазерного излучения выполнены эксперименты по микрохирургическому воздействию на блестящую оболочку эмбриональных клеток, находящихся на различных стадиях развития. Найдены параметры воздействия необходимые для локального разрушения блестящей оболочки эмбриональных клеток. Дальнейшее инкубирование и контроль развития облучнных клеток показал, что такое воздействие не сказывается на жизнеспособности эмбрионов.

Выполнено микрохирургическое воздействие на блестящую оболочку двухклеточного эмбриона и его дальнейшее развитие. Длина волны лазера – 1,48 мкм, мощность в предметной плоскости – 80 мВт, длительность экспозиции 15 мс. Осуществлялось воздействие несколькими импульсами по 15 мс для получения в блестящей оболочке отверстия нужного размера. При последующем инкубировании наблюдалось развитие эмбриона до стадии бластоцисты.

Рис. 8. Микрохирургия блестящей оболочки эмбриона мыши на стадии двух клеток, и выход эмбриона из под блестящей оболочки на стадии бластоцисты.

Аналогичные результаты получены для эмбрионов, находящихся на стадии восьми бластомеров.

Рис. 9. Микрохирургия блестящей оболочки эмбриона мыши на стадии восьми клеток, и выход эмбриона из под блестящей оболочки на стадии бластоцисты.

Технология получения химерных животных и «чистых линий» животных.

В данной работе предлагается методами лазерной микрохирургии вносить модифицированный ген не в бластоцисту, а в любые стадии развития доимплантационного эмбриона на стадии 2, 4 и 8 бластомеров.

Отработанная методика неинвазивного слияния бластомеров внутри эмбриона позволяет создавать тетраплоидные, гексаплоидные и т.д.

эмбрионы, в которые будут вводиться стволовые клетки. В полученных таким образом эмбрионах, полиплоидные бластомеры будут образовывать только вне эмбриональные ткани, а введенные диплоидные стволовые клетки – собственно сам эмбрион. Таким образом, могут быть получены в одной технологической операции чистые линии модельных животных.

Получение «чистой линии» из двухклеточного (двухбластомерного) эмбриона.

Была выполнена серия экспериментов, демонстрирующих возможность получения «чистой линии» из двухклеточного эмбриона мыши и модифицированных стволовых клеток. Стволовые клетки содержали ген, кодирующий зелный флуоресцирующий белок (GFP). После проведения экспериментов по получению реконструированных эмбрионов и стадии культивирования, используя метод флуоресцентной микроскопии, проводился анализ распределения введнных клеток в бластоцисте.

Сам эксперимент по получению реконструированного эмбриона, который в дальнейшем может быть развит до генетически модифицированного животного, можно разделить на следующие этапы.

Первый этап: при помощи фемтосекундного лазера (100 фс, 80 МГц частота повторения, длина волны 800нм, энергия 1,5 нДж в импульсе, экспозиция мс) выполняется слияние двух бластомеров эмбриона путм облучения участка естественного контакта (параметры лазерного излучения указаны выше). Второй этап: диодным лазером (длина волны 1,48 мкм, мощность в предметной плоскости 80 мВт, длительность экспозиции 15 мс) выполняется микрохирургия блестящей оболочки эмбриона в области максимально удалнной от бластомеров. Воздействие осуществляется несколькими импульсами по 15 мс до получения в блестящей оболочке отверстия нужного размера (порядка 10-12 мкм). Третий этап: при помощи непрерывного лазера (длина волны 790 нм, мощность в предметной плоскости 10-15 мВт) выполняется оптический захват модифицированных эмбриональных стволовых клеток и их поочердное перемещение под блестящую оболочку эмбриона через полученное ранее отверстие. Все этапы этого эксперимента были отработаны отдельно несколькими сериями экспериментов и были описаны в главе 4.

Рис. 10. Иллюстрация методики получения «чистой линии» животного: лазерное фемтосекундное слияние бластомеров эмбриона;

микрохирургия непрерывным диодным лазером блестящей оболочки;

оптический захват и перемещение модифицированных стволовых клеток под блестящую оболочку эмбриона.

Полученный реконструированный эмбрион содержит одну клетку с исходным генетическим материалом в двойном наборе, и модифицированные эмбриональные стволовые клетки, генетический материал которых и будет далее развит до стадии внутренней клеточной массы бластоцисты, а в после трансплантации, до организма. На рисунке ниже приведены фотографии каждого этапа эксперимента – фемтосекундное слияние бластомеров, микрохирургия блестящей оболочки эмбриона, оптический захват и перемещение модифицированных стволовых клеток.

На следующем рисунке представлен результат флуоресцентной микроскопии бластоцисты, которая была получена культивированием полученного ранее реконструированного эмбриона. Видно, что основной сигнал флуоресценции наблюдается от внутренней клеточной массы. Это свидетельствует о том, что внутренняя клеточная масса полученной бластоцисты образована введнными модифицированными стволовыми клетками. Таким образом, если далее осуществить трансплантацию этой бластоцисты, то геном родившейся мыши будет соответствовать геному модифицированных стволовых клеток.

Рис. 11. Реконструированный эмбрион на стадии бластоцисты: флуоресцентное изображение;

оптическое изображение в проходящем свете;

совмещение первых двух изображений.

Практическая значимость предложенной технологии заключается в следующем. Во-первых, одновременное использование трех лазеров позволяет быстро и технологично вводить стволовые клетки с модифицированным геномом в эмбрион мыши на различных стадиях развития и с разной плоидностью бластомеров в один этап. Это дат возможность сразу получать чистые линии с более высокой эффективностью, без потери времени и затрат на последующее скрещивание химер, с целью выведения чистых линий. Во-вторых, в практической медицине предлагаемая технология получения чистых линий генетически модифицированных мышей позволит получить оригинальные модели заболеваний, в том числе и модели социально значимых заболеваний.

Создание моделей болезни позволит понять механизм возникновения и развития патологии, выявить роль различных генов в этом процессе. Такой подход принципиально важен для поиска и тестирования новых лекарственных препаратов.

Получение «химеры» из доимплантного эмбриона.

Предложенная технология получения «чистых линий» также может быть использована для получения «химерных» организмов. Для этого выполняются аналогичные операции, с той разницей, что исходный эмбрион может быть взят на стадии более двух бластомеров(4-х клеточный,8-ми клеточный эмбрион и т.д.) Используя отработанные лазерные методики манипулирования, и подбирая нужную стадию развития эмбриона, можно варьировать отношение исходного и привнеснного генетического материала в конечной химере. Ниже приведн результат одного из экспериментов по получению химерной бластоцисты из эмбриона, находящегося на стадии морулы.

Рис. 12. Иллюстрация методики получения «химерного» животного: микрохирургия непрерывным диодным лазером блестящей оболочки эмбриона на стадии морулы;

оптический захват и перемещение модифицированных стволовых клеток под блестящую оболочку эмбриона.

Также можно выделить основные этапы эксперимента. Первый этап:

диодным лазером (длина волны 1,48 мкм, мощность в предметной плоскости 80 мВт, длительность экспозиции 15 мс) выполняется микрохирургия блестящей оболочки эмбриона в области максимально удалнной от бластомеров. Воздействие осуществляется несколькими импульсами по 15 мс до получения в блестящей оболочке отверстия нужного размера (порядка 10 12 мкм). Второй этап: при помощи непрерывного лазера (длина волны нм, мощность в предметной плоскости 10-15 мВт) выполняется оптический захват модифицированных эмбриональных стволовых клеток и их перемещение под блестящую оболочку эмбриона через полученное ранее отверстие. Полученный эмбрион содержит клетки, содержащие как исходный генетический материал, так и клетки, содержащие модифицированный генетический материал. Дальнейшее инкубирование и трансплантация такого реконструированного эмбриона даст «химерный» организм. На следующем рисунке представлен результат флуоресцентной микроскопии бластоцисты, которая была получена культивированием полученного ранее реконструированного эмбриона. Видно, что сигнал флуоресценции равномерно распределн по всей бластоцисте. Это свидетельствует о том, что внеснные модифицированные стволовые клетки делились и встраивались как во внутреннюю клеточную массу, так и в трофобласт – клетки, которые далее будут служить питательной средой для дальнейшего развития эмбриона до организма.

Рис. 13. Реконструированный эмбрион на стадии бластоцисты: флуоресцентное изображение;

оптическое изображение в проходящем свете;

совмещение первых двух изображений.

Неинвазивная лазерная методика терапевтического клонирования.

Выполнены эксперименты по созданию реконструированного эмбриона с использованием только лазерного манипулирования (оптический захват, лазерная микрохирургия, лазерное слияние). Весь эксперимент условно можно разделить на стадии.

А) Лазерная инактивация генетического материала. На рис. 13 представлено начальное состояние ооцита и момент фемтосекундной лазерной инактивации (энергия импульса составляла 1 нДж, длина волны 800 нм, длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц, экспозиция мс).

Рис. 14. Фемтосекундная инактивация генетического материала (метофазной пластинкии) ооцита мыши.

Б) Далее была проведена микрохирургия блестящей оболочки с помощью диодного лазера (длина волны 1,48 мкм, мощность в предметной плоскости 80 мВт, длительность экспозиции 15 мс).

Рис. 15. Микрохирургия блестящей оболочки ооцита непрерывным диодным лазером.

На рисунках представлено состояние блестящей оболочки после первой экспозиции 15 мс диодным лазером и конечное состояние после завершение операции.

В) Затем, выполнялся оптический захват соматической клетки (фибробласта) и приведение его в плотный контакт с мембраной ооцита. Оптический захват и дальнейшее перемещение соматической клетки выполнялось непрерывным лазером (длина волны 790 нм, средняя мощность в предметной плоскости составляла 20 мВт).

Рис. 16. Оптический захват и перемещение фибробласта до получения контакта с ооцитом при помощи непрерывного лазера.

Г) Далее было выполнено лазерное слияние мембран ооцита и соматической клетки при помощи фемтосекундного лазера (энергия импульса составляла нДж, длина волны 800 нм, длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц, экспозиция 30 мс).

На рис.16 представлены момент облучения фемтосекундым излучением и конечное состояние через минуту после облучения. Во время проведения процедуры слияния непрерывный лазер продолжал удерживать фибробласт, обеспечивая плотный контакт с ооцитом.

Рис. 17. Фемтосекундное лазерное слияние фибробласта и ооцита.

Д) Так выглядит конечное состояние после проведения всех этапов лазерного клонирования.

Рис. 18. Реконструированный эмбрион.

Е) Через два часа после слияния соматической клетки и ооцита Рис. 19. Реконструированный эмбрион после двух часов культивирования в СО2 инкубаторе.

Ж) Стадия морулы и З) Стадия бластоцисты Рис. 20. Реконструированный эмбрион после 48 и 72 часов культивирования в СО2 инкубаторе.

Внутренняя клеточная масса полученной бластоцисты - это эмбриональные стволовые клетки, обладающие геномом соматической клетки, ядро которой было помещено в ооцит методом слияния ооцита и соматической клетки. Таким образом, проведнный эксперимент показывает, что развитая методика оптического манипулирования, совмещнная с фемтосекундной микрохирургией, может успешно решить задачу неинвазивного терапевтического клонирования.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Разработана и изготовлена оригинальная экспериментальная установка 1.

голографического оптического манипулятора-скальпеля с использованием фемтосекундного и непрерывных лазеров формирующих множество оптических ловушек. Разработаны методы независимого управления каждой отдельной из множества оптических ловушек по заданной программе, что позволяет выполнять сложные операции с мезоскопическими биологическими объектами с использованием только лазерного излучения, без использования механических или иных микроманипуляторв.g Теоретически и экспериментально доказана возможность 2.

манипулирования мезообъектами при помощи фемтосекундного лазера с использованием методов голографической оптики.

На основе проведенных физико-химических исследований 3.

взаимодействия остро сфокусированного лазерного излучения с биоклетками разработаны оригинальные экспериментальные методики оптического манипулирования биологическими клетками (клетки крови, нейроны, скопление эпителиальных клеток и пр.), диссекции стенок и мембран эукориотических клеток (эмбриональные клетки, нейроны, нервные волокна, фибробласты) и прокариотических клеток (сине-зелные бактерии Anabena), неинвазивной инактивации ядра ДНК в эмбрионах без повреждения зоны пелюцида эмбриона.

На основе полученных результатов по оптическому манипулированию 4.

и фемтосекундной лазерной нанохирургии, разработаны фундаментальные основы технологии получения генетически модифицированных животных (т.н. «чистые линии» животных) без использования механических манипуляторов, электрослияния и других инвазивных методы манипулирования клетками.

Впервые экспериментально продемонстрирована возможность 5.

выполнить процесс терапевтического клонирования (получение истинных эмбриональных клеток с заданным геномом), используя только неинвазивные лазерные методы манипулирования.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Залесский А.Д., Бучанов В.В., Державин В.А., Решетов И.В., Шушин 1) А.И., Саркисов О.М., «Оптический лазерный манипулятор фемтосекундными импульсами», Труды МФТИ Том 1, №1, 53-58, г.

2) Buchanov V.V., Derzhavin V.A., Zalesskii A.D., Reshetov I.V., Sarkisov O.M., Shushin A.I., “Optical manipulators of microparticles using femtosecond laser radiation”, Quantum Electronics 40(5), 446-450, 3) Залесский А.Д., Данильченко Н.А., Максименко Ю.Б., Барбашов Ю.В., Западинский Б.И., Саркисов О.М., «Голографический фемтосекундный лазерный манипулятор», Приложение к журналу Физическое образование в вузах, Том 16, №1, 2010 г.

4) Барбашов Ю.В., Залесский А.Д., Айбушев А.В., Саркисов О.М., Радциг М.А., Хмель И.А., Кокшарова О.А.,. Надточенко В.А., «Фемтосекундная оптоперфорация стенки цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120 в присутствии наночастиц золота», Российские нанотехнологии, Том 6, № 9 –10, 136-141, 2011 г.

5) Барбашов Ю.В., Залесский А.Д., Березуцкая М.А., Максимов Г.В., Рубин А.Б., Саркисов О.М., Надточенко В.А., «Нелинейно-оптическое воздействие фемтосекундного лазерного излучения ближнего ИК диапазона на морфологию и структуру нервной клетки в поле оптической ловушки», Химическая физика, Том 31, № 6, 9-15, 2012 г.

6) Залесский А.Д., Саркисов О.М., «Оптический захват: реализация и применения оптического манипулирования микрообъектами», Труды 50 й научной конференции МФТИ, сборник тезисов, г. Москва – Долгопрудный, 2007 г.

7) Залесский А.Д., Бучанов В.В., Державин В.А., Решетов И.В., Шушин А.И., Саркисов О.М., «Фемтосекундный оптический лазерный «пинцет», Труды 51-й научной конференции МФТИ, сборник тезисов, г. Москва – Долгопрудный, 2008 г.

8) Залесский А.Д., Бучанов В.В., Державин В.А., Решетов И.В., Шушин А.И., Саркисов О.М., «Фемтосекундный оптический голографический «пинцет» в онкологии», Всероссийская научная конференция с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008», сборник тезисов, г. Москва, 2008 г.

9) Залесский А.Д., Данильченко Н.А., Максименко Ю.Б., Барбашов Ю.В., Шушин А.И., Державин В.И., Решетов В.И., Саркисов О.М., «Фемтосекундный лазерный манипулятор», 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых учных, сборник тезисов, Том 1,г. Пущино, 2010 г.

10) Zalesskiy A.D., Danilchenko N.A., Maksimenko J.B., Barbashov Yu.V., Zapadinskiy B.I., Maksimov G.V., Sarkisov O.M., “Holographic femtosecond optical tweezers and scalpel”, thesis ICONO/LAT V.1, Kazan,

 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.