авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Исследование воздействия ионизирующих излучений и химфармпрепаратов на биологические мембраны

На правах рукописи

Алексеева Полина Юрьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ

И ХИМФАРМПРЕПАРАТОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ

01.04.16 – физика атомного ядра и элементарных частиц

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

Москва-2007

Работа выполнена на кафедре физики ускорителей высоких энергий физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор физико-математических наук, профессор Черняев Александр Петрович доктор физико-математических наук, профессор Козлова Елена Карловна

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, Яковенко Леонид Владимирович доцент доктор биологических наук, Потапенко Александр Яковлевич профессор

Ведущая организация:

Московский инженерно-физический институт (государственный университет)

Защита состоится _01_ ноября 2007 года в _14:00_ на заседании Диссертационного совета Д.501.001.65 на Биологическом факультете Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу:

119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория _.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 28 » сентября 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Т. В. Веселова

Общая характеристика работы

Актуальность работы В настоящее время различные виды ионизирующих излучений получили широкое применение в медицине. В частности, действие пучков электронов и излучения как на организм в целом, так и на отдельные клетки, остается актуальным в связи с развитием методов лучевой терапии, предотвращения патологий при пересадке тканей, радионейрохирургии, стерилизации суспензий.

Распространено применение ультрафиолетового излучения (УФ) в фотохимиотерапии при лечении заболеваний кожи, используются его бактерицидные свойства.

В ряде случаев ионизирующее излучение применяется совместно с химфармпрепаратами. Для уменьшения воздействия на клетки тканей свободных радикалов, возникающих при действии ионизирующего излучения, используют антиоксидантные препараты. При операционных вмешательствах, в том числе с использованием методов лучевой терапии, применяются анестезирующие вещества. В ряде клинических процедур при критических состояниях и в плановой терапии различных заболеваний используются газотранспортные кровезаменители.

Как правило, исследуется эффекты, характерные для совместной реакции систем организма в целом. Использование ионизирующего излучения и химфармпрепаратов приводит к изменению состояния мембран клеток, выполняющих жизненно важные клеточные функции. Является актуальным изучение в модельном эксперименте механизма действия физико-химических факторов на отдельные структуры, в том числе, клеточные мембраны, и установление оптимальных доз излучения и концентраций химфармпрепаратов.

В результате воздействия ионизирующего излучения и химфармпрепаратов могут возникнуть скрытые (потенциальные) повреждения, которые проявятся через длительное время. Метод калиброванной электропорации позволяет оценить степень поражения биологических мембран сразу после воздействия.

Представляется интересным использование метода для исследования динамики повреждений мембран клеток.

В настоящее время для оптимизации методов лучевой терапии предлагается использовать комбинированное воздействие на клетки ионизирующего излучения, химфармпрепаратов и импульсного электрического поля. Необходимо изучение состояния мембран эритроцитов при совместном действии разнородных факторов.

Актуальным остается исследование действия на мембраны ионизирующего излучения как в летальных дозах, так и в малых дозах, при которых наблюдается нелинейный отклик системы.

Целью работы является экспериментальное исследование воздействия пучков электронов, - и УФ излучения в сочетании с химфармпрепаратами на мембраны эритроцитов.

Задачи исследования 1. Экспериментальное исследование воздействия пучков электронов в дозах 750 – 2500 Гр в сочетании с химфармпрепаратами в различных концентрациях на мембраны эритроцитов.

2. Выявление скрытых повреждений биологических мембран при воздействии -излучения в малых дозах (1 - 35 Р) и химфармпрепаратов в малых концентрациях методом калиброванной электропорации.

3. Исследование воздействия УФ излучения на мембраны эритроцитов в сочетании с различными концентрациями химфармпрепаратов.

4. Оптимизация метода калиброванной электропорации для выявления скрытых повреждений мембран эритроцитов в результате воздействия пучка ускоренных электронов, -излучения, УФ излучения и химфармпрепаратов.

5. Оценка количества повреждений мембран эритроцитов в результате воздействия ионизирующих излучений и химфармпрепаратов.

Научная новизна работы 1. Показано, что воздействие ионизирующего излучения (пучок электронов в дозе 2500 Гр) и химфармпрепарата (эсмерон в концентрациях 1 мкл на 1 мл крови) вызывает нелинейную зависимость константы скорости гемолиза от концентрации эритроцитов в суспензии.

2. Экспериментально установлено, что воздействие пучка электронов в сочетании с миорелаксантом (эсмероном) на суспензию вызывает скрытые повреждения мембран эритроцитов.



3. Показано, что при воздействии пучка электронов на суспензию эритроцитов кровезаменитель (перфторан) может выполнять протекторную функцию.

4. Показано, что при воздействии ионизирующего излучения и химфармпрепаратов по отдельности и при их сочетании изменяется значение порогового потенциала электрического пробоя мембран.

5. Физическим методом показано, что при воздействии УФ излучения на суспензию эритроцитов антиоксиданты (таурин, глютатион) и спирт (этанол) изменяют константу скорости гемолиза клеток.

6. В результате воздействия -излучения в малых дозах (1 - 35 Р) выявлены скрытые повреждения биологических мембран.

7. Показано, что малые концентрации химфаримпрепаратов (глютатион 0,02 - 2 мкг/мл, таурин 0,02 - 20 мкг/мл, этанол 0,04 - 50 мкл/мл), а также их сочетание с УФ излучением вызывают скрытые повреждения биологических мембран.

8. Установлена зависимость степени скрытых повреждений мембран эритроцитов от температурных и временных параметров суспензии с помощью метода калиброванной электропорации.

Практическая значимость работы Установленные в модельном эксперименте диапазоны концентраций химфармпрепаратов с выраженными радиопротекторными свойствами могут быть приняты во внимание при планировании лучевой терапии в клинике.

Установленные данные могут быть учтены при разработке технологий воздействия ионизирующих излучений и химфармпрепаратов на красные клетки крови.

Результаты, полученные в диссертации, могут быть включены в программу лекций и практических занятий студентов высших учебных заведений, специализирующихся в области ядерной физики, радиобиологии, биофизики и медицины.

Достоверность научных результатов и выводов обеспечена строгим соблюдением методик экспериментов, высокой воспроизводимостью экспериментальных данных. Полученные данные согласуются с экспериментальными данными и выводами работ других авторов, новые данные согласуются с современными представлениями по рассматриваемой проблеме.

Основные положения, выносимые на защиту 1. При воздействии ионизирующего излучения на биологические мембраны экспериментально определены концентрации химфармпрепаратов, уменьшающие и увеличивающие скрытые структурные дефекты мембраны.

2. Ионизирующее излучение (-излучение) в малых дозах и антиоксиданты в малых концентрациях вызывают нестабильный биологический ответ наноструктур (мембран эритроцитов).

3. В результате воздействия пучка электронов константа скорости гемолиза в зависимости от концентрации эритроцитов изменяется нелинейно.

Апробация работы Основные результаты диссертации докладывались на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах: 4th International Workshop on Space Radiation Research and 17th Annual NASA Space Radiation Health Investigators’ Workshop (Москва, 2006);

III Съезд биофизиков России (Воронеж, 2004);

II Евразийский конгресс по медицинской физике (2005);

2nd, 3rd and 4th International Summer Student School “Nuclear Physics Methods and Accelerators in Biology and Medicine (2003, 2005 и 2007);

V и VI Межвузовская научная школа молодых специалистов «Концентрированные потоки энергии в космической технике, электронике, экологии и медицине» (Москва, 2004, 2005);

«Ломоносовские чтения» (Москва, 2005, 2006);

XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2004);

Всероссийская конференция «Радиобиологические основы лучевой терапии» (Москва, 2005);

European Association for Red Cell Research,15th and 16 th Meeting (Murten, Switzerland, 2005, England, Oxford, 2007);

57 International conference on nuclear physics «Nucleus 2007»

(Voronezh, 2007).

Работы в данной области поддержаны грантом РФФИ № 71/07-Р и награждены серебряной медалью 7 Московского международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2007).

Публикации По теме диссертации опубликовано 17 научных работ. Из них 11 статей в реферируемых журналах: «Вестник Московского университета» - 2, «Технологии живых систем» - 1, «Медицинская физика» - 1, «Радиационная биология.

Радиоэкология» - 1, «Общая реаниматология» - 6;

2 патента на изобретение.

Личный вклад автора Экспериментальные и методические исследования выполнены при непосредственном участии автора на кафедре физики ускорителей высоких энергий физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, в НИИЯФ МГУ им.

Д. В. Скобельцына, на кафедре медицинской и биологической физики ММА им.

И.М. Сеченова, в ГУ НИИ общей реаниматологии РАМН и в городской клинической больнице № 33 им. А. А. Остроумова. Теоретические оценки сделаны лично автором.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, пяти глав текста, заключения, списка литературы. Работа изложена на 123 страницах, включая 75 рисунков и 7 таблиц.

Список литературы включает 107 наименований.

Содержание работы Методика экспериментальных исследований Источники излучения. В работе представлены исследования по воздействию пучков электронов, -излучения, УФ излучения и химфармпрепаратов (антиоксиданты, миорелаксанты, газотранспорный кровезаменитель) на мембраны эритроцитов.

Для изучения воздействия пучка электронов использовали импульсный разрезной микротрон НИИЯФ им. Д.В. Скобельцына. Эксперименты проводились при следующих параметрах пучка электронов: энергия электронов E e = 20, 30, МэВ, длительность импульсов = 4 мкс, частота следования импульсов f = 10 Гц, значение тока в импульсе Iпик = 1,3;





2 мА, время облучения tе = 3 – 10 мин. На выходе пучка электронов помещалось рассеивающее стекло (толщина d = 4 мм) для равномерного распределения электронов по диаметру полипропиленовой кюветы (цилиндр внутренним диаметром d = 15 мм, длина l = 30 мм, толщина верхней и нижней стенок порядка 102 мкм), в которую помещали рабочую суспензию эритроцитов (объем V = 5,3 мл).

В качестве источников -излучения использовали радионуклиды 226Ra с активностью 2,04 и 9,25 мКи (34.23·107 и 7.55·107 Бк). Основные спектральные линии -излучения E = 0,295;

0,352;

0,61 МэВ, время облучения t = 5 с – 3 ч, мощность экспозиционной дозы P = 1,25 и 5 Р/час. В изолированный металлический кожух помещалась 5 мм емкость с радионуклидом и экспериментальные кюветы (внутренний диаметр d = 18 мм) с суспензией эритроцитов (объем V = 5 мл, высота h суспензии в пробирке 20 мм). Облучение кюветы с рабочей суспензией проводилось на расстоянии 30 мм от радионуклида.

В качестве источника УФ излучения использовали ультрафиолетовый облучатель УФС-254 с длиной волны -квантов = 254 нм. Цилиндрическая кювета (внутренний диаметр d = 40 мм) с рабочей суспензией эритроцитов (объем V = мл) помещалась под УФ излучение (длина волны = 254 нм, интенсивность I = 0, Вт/см2). Высота суспензии в кювете равнялась 4 мм. Время облучения tУФ = 5 и мин.

Суспензия эритроцитов как модельная система для исследования. Для исследования воздействия физико-химических факторов на структурно функциональное состояние биологических мембран была выбрана модельная система эритроцитов человека. Для создания рабочей суспензии эритроцитов кровь разводилась изотоническим 0,9 % солевым раствором хлористого натрия в 330 раз.

Структурно-функциональные изменения мембран клеток в результате воздействия физико-химических факторов влияют на скорость и характер гемолиза клеток. Уменьшение числа эритроцитов в рабочей суспензии вследствие гемолиза оценивали по изменению ее оптической плотности D. Оптическая плотность раствора D = -lg(I/I 0 ), где Io и I - интенсивности падающего и прошедшего пучков света. Оптическая плотность измерялась с помощью концентрационного фотоэлектрического колориметра КФК-2МП. На длине волны = 760 нм оптическая плотность суспензии определяется в основном рассеянием света на эритроцитах (вклад образовавшихся после выхода гемоглобина теней эритроцитов, гемоглобина и других форменных элементов крови составляет ~3%). При малых концентрациях раствора наблюдается линейная зависимость оптической плотности D(t ) = k N (t ), где k - коэффициент от концентрации эритроцитов:

пропорциональности. Поскольку оптическая плотность суспензии прямо пропорциональна количеству эритроцитов, находящихся в суспензии в данный момент времени, назовем зависимость D(t) кинетической кривой гемолиза эритроцитов.

Выявление скрытых дефектов модифицированной мембраны эритроцитов с помощью метода калиброванной электропорации. Внешнее воздействие приводит к структурным изменениям мембран, к нарушению их функциональности и даже к гибели клеток. Для выявления скрытых дефектов мембран в результате внешних воздействий, которые не приводят к гибели клеток в течение первых суток, применялся разработанный метод воздействия калиброванным импульсом электрического поля – метод калиброванной электропорации. В качестве источника однородного импульсного электрического поля использовали клинический дефибриллятор «Lifepak» 7 США. Рабочую суспензию (2,4 мл) помещали в кварцевую кювету с титановыми электродами (расстояние между силовыми электродами l = 14,5 мм). На электроды подавали импульс электрического поля. Разность потенциалов между электродами = 1600 В, длительность импульса 10 мс. Электропорация мембран импульсным электрическим полем имеет пороговый характер. При таких параметрах импульса значение наведенного трансмембранного потенциала превышает критическое значение порогового потенциала электрического пробоя мембран (300 – 500 мВ), и происходит их необратимая электропорация. В зависимости от состояния мембран изменяются порог электрического пробоя и константа скорости гемолиза эритроцитов. Кинетические кривые гемолиза эритроцитов могут быть описаны экспоненциальной функцией: N(t)=N0 exp(-t)+N1, где – константа скорости уменьшения числа эритроцитов, N1 – остаточный уровень клеток, N0+ N1 – начальное число эритроцитов.

Физико-химические факторы при параметрах, рассматриваемых в работе, не вызывали гемолиз эритроцитов в первые сутки после воздействия, и значения констант скоростей гемолиза 0 без воздействия импульсного электрического поля стремились к 0 (кривая 0 на рис. 3). Скрытые дефекты выявляли последующей электропорацией мембран эритроцитов. Далее на графиках представлены результаты, полученные с помощью метода калиброванной электропорации.

Константу скорости гемолиза эритроцитов в результате только электропорации принимали за контрольную К. По степени изменения порога электрического пробоя и константы скорости гемолиза i относительно контрольного значения К в результате воздействия можно судить о степени воздействия внешнего фактора на мембрану эритроцитов.

Все экспериментальные данные были обработаны с помощью стандартных методов математического статистического анализа.

Зависимость критического значения порогового потенциала пробоя от температуры и параметров суспензии. Внешние факторы, такие как температура, изменение состояния и свойств эритроцитов со временем (после выделения из организма), условия хранения рабочей суспензии, могут влиять на конечный результат. Кривая зависимости константы скорости гемолиза эритроцитов от температуры на отрезке 10 – 37 0С имеет сигмоидальный характер (рис. 1).

По результатам методических опытов для воспроизводимости стандартной кинетической кривой гемолиза эритроцитов была выбрана рабочая точка 20 0С, воздействие проводилось через 60 мин после создания суспензии.

Зависимость значения порогового потенциала пробоя мембраны эритроцитов от возраста донора. С возрастом донора, в результате изменений индивидуальных особенностей функционирования клеток и организма в целом, изменяется значение критического порогового потенциала пробоя мембран.

Экспериментально показано, что наблюдалась близкая к линейной зависимость константы скорости гемолиза эритроцитов от возраста y (y = 20 – 70 лет):

= ky, где k = (2,4 ± 0,2)·10-3 1/(мин·год).

, 1/мин 0, Констатна скорости гемолиза 0, 0, 0, 0, 10 15 20 25 30 35 Температура, С Рис. 1. Зависимость константы скорости гемолиза эритроцитов от рабочей температуры (10 – 37 0С) Результаты исследования воздействия пучка электронов, -излучения и УФ излучения в сочетании с химфармпрепаратами на биологические мембраны Результаты экспериментов по воздействию пучка электронов и миорелаксанта эсмерона на мембраны эритроцитов в крови (100 % эритроцитов) и в суспензии (до 0,3 % эритроцитов).

Пучок электронов. Экспериментально определенные зависимости значений констант скорости гемолиза контрольной К и облученной е суспензий от концентрации эритроцитов, полученные с помощью метода калиброванной электропорации, представлены на рис. 2 (энергия E e = 20 МэВ, время облучения tе = 10 мин). При концентрациях суспензий 10 – 100 % от концентрации эритроцитов в крови отношение констант скоростей гемолиза эритроцитов облученной е и контрольной К суспензий не зависело от концентрации клеток и е / К = 1,50 ± 0,16. При уменьшении концентраций от 10 до 0,3 % е / К резко возрастало. Для концентрации 0,3 % е / К = 5,0 ± 0,5. Данная зависимость может быть принята во внимание при установлении прямого и косвенного действия пучка электронов в данном диапазоне доз.

Эсмерон (используется при анестезии как миорелаксант, действующий на структуры нервно-мышечной системы). Аналогичная зависимость действия от концентрации эритроцитов наблюдалась для эсмерона в концентрации 1 - 10 мкл на 1 мл суспензии. При концентрации 0,3 % Э / К = 5 ± 0,5.

, 1/мин 0, 1 контрольные суспензии Константа скорости гемолиза 2 облученные суспензии 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,04 0, С, % 0 20 40 60 80 Концентрация эритроцитов Рис. 2. Зависимость константы скорости гемолиза контрольной К (1) и облученной е (2) суспензий от концентрации эритроцитов Результаты экспериментов по воздействию пучка электронов и УФ излучения на суспензию с химфармпрепаратами (антиоксиданты, миорелаксанты, кровезаменители). Химические соединения подобно физическим факторам в зависимости от концентраций могут изменять состояние и проницаемость биологических мембран. В работе исследовали действие пучка электронов, - и УФ излучения на мембраны эритроцитов при добавлении в рабочую суспензию следующих групп химфармпрепаратов: антиоксидантов (глютатион, таурин), спирта (этанол), миорелаксанта (эсмерон) и кровезаменителя (перфторан).

В суспензию эритроцитов добавляли препарат в заданной концентрации согласно клиническим дозировкам. Система «эритроциты + химфармпрепарат»

подвергалась воздействию излучения. Для выявления возможных скрытых дефектов мембран сразу после физико-химического воздействия эритроциты подвергались воздействию калиброванной электропорацией. Сравнивались относительные константы скоростей гемолиза эритроцитов отдельно для каждой конкретной концентрации. Относительная константа скорости гемолиза эритроцитов – это отношение константы скорости гемолиза эритроцитов в рабочей суспензии i и константы скорости гемолиза эритроцитов контрольной суспензии К: i = i / К.

Для оценки степени неаддитивности биологического ответа в данных экспериментах сравнивался эффект от воздействия излучения и химфармпрепарата на эритроциты ( ХФП+ И ) с действием по отдельности излучения ( И ) и ( ХФП ).

химфармпрепарата В результате рассчитывался относительный коэффициент неаддитивности k:

k ХФП + И = ( ХФП + И К ) (( И К ) + ( ХФП К )), ( ХФП + И К ) (( И К ) + ( ХФП К )) или k ХФП + И =.

К Относительный коэффициент неаддитивности k показывает вклад препарата в интегральный эффект при воздействии излучения за вычетом вклада самого препарата без облучения и излучения без препарата.

Результаты экспериментов по воздействию УФ излучения и антиоксидантов на мембраны эритроцитов. При воздействии УФ излучения на мембраны эритроцитов на промежутке времени 2 – 15 мин наблюдалась линейная зависимость константы скорости гемолиза эритроцитов от времени облучения.

Время облучения рабочих суспензий tУФ = 5 и 7 мин.

В результате экспериментов по воздействию УФ излучения и антиоксидантов на мембраны эритроцитов экспериментально выделены 2 зоны с различной эффективностью воздействия препарата: зона А (уменьшение константы скорости гемолиза) и зона В (увеличение константы скорости гемолиза). В зоне А относительные константы скоростей гемолиза эритроцитов систем «эритроциты + химфармпрепарат» ХФП меньше относительных констант скоростей гемолиза эритроцитов контрольных суспензий К : ХФП К. Гемолиз эритроцитов в суспензии с антиоксидантом шел медленнее, чем в суспензии без антиоксиданта. В зоне В – наоборот: ХФП К. При переходе из зоны А в зону В ХФП = К. При облучении систем «эритроциты + химфармпрепарат» зона перехода АВ (из А в В) сдвигалась в сторону меньших концентраций препаратов, менялась ширина зоны перехода АВ, а отношение ХФП+ И к И облученных суспензий с и без препарата становилось больше. Для каждого препарата зоны имели свой разброс концентраций.

Для концентрации таурина СТ = 50 мкг/мл (зона А) (рис. 3) кинетическая кривая гемолиза эритроцитов суспензии с таурином 3 проходит незначительно выше кривой контрольной суспензии 1: Т / К = 0,9 ± 0,1 ;

для кривых облученных суспензий с таурином 4 и без таурина 2 разница увеличивается:

Т +УФ / УФ = 0,6 ± 0,1. Обе кинетические кривые облученных суспензий (с таурином и без него) проходят ниже контрольной кривой: Т +УФ / К = 1,1 ± 0,1 ;

УФ / К = 2,3 ± 0,2.

Таурин D, отн.ед.

1, 0, Оптическая плотность 0, 0,7 0, 0, 0, 0, t, мин 0, 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Время после воздействия Рис. 3. Кинетические кривые D(t) (t – время после воздействия импульсного электрического поля в первые 45 мин) для контрольной (кривая 1), облученной УФ (кривая 2), с таурином (кривая 3) и облученной УФ с таурином (кривая 4) суспензий эритроцитов. Значение оптической плотности кривой 0 D0 = соответствует контрольной, облученной, с таурином и облученной с таурином суспензиям без воздействия импульсного электрического поля. Время облучения tУФ = 7 мин, концентрация таурина СТ = 50 мкг/мл На рис. 4 показано изменение относительных констант скоростей гемолиза эритроцитов системы «эритроциты + таурин» для разных концентраций препарата СТ. Видно, что зона перехода АВ для суспензии с таурином находилась в концентрации 230 – 280 мкг/мл, для облученной суспензии с таурином она сдвинулась в 90 – 100 мкг/мл.

Т, отн.ед. 1 таурин 2,4 2 таурин + УФ Относительная константа А В 2, скорости гемолиза 1,6 УФ В А 1, контроль 0, 0, C, м л кг/м 0, 0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 Конце нт р а ц ия т а ури на в 1 мл с ус пе нз ии Рис. 4. Зависимость относительной константы скорости гемолиза эритроцитов необлученной (кривая 1) и облученной УФ (7 мин) (кривая 2) суспензий эритроцитов с таурином Т от концентрации препарата (на промежутке 0,02 – 400 мкг/мл) kТ+УФ, отн.ед.

Относительный коэффициент 0, 0, неаддитивности 0, 0, 0 50 100 150 200 250 300 350 -0,2 С, мкл/мл -0, -0, Концентрация таурина -0, Рис. 5. Зависимость относительного коэффициента неаддитивности процессов в облученной УФ (7 мин) суспензии с таурином kТ+УФ от концентрации препарата На основании зависимостей (С) для каждой концентрации таурина (рис. 4) определялся относительный коэффициент неаддитивности kТ+УФ и строилась кривая kТ+УФ (СТ) (рис. 5). Отрицательный знак kТ+УФ соответствует случаям, когда таурин уменьшал результат действия УФ излучения на мембрану эритроцитов, положительный – когда усиливал действие УФ излучения. Аналогичные зависимости действия от концентрации химфармпрепарата наблюдались для глютатиона и этанола. Кривая для этанола kЭТ+УФ(СЭТ) приведена на рис. 6.

Этанол kЭт+УФ, отн.ед.

1, Относительный коэффициент 1, неаддитивности 0, 0, 0, С, мкл/мл 0, 0 25 50 75 100 125 150 175 200 -0, -0, Концентрация 50 % этанола -0, Рис. 6. Зависимость относительного коэффициента неаддитивности процессов в облученной УФ (5 мин) суспензии с 50% этанолом kЭТ+УФ от концентрации препарата При концентрациях, меньших точки перехода из зоны А в зону В в 5 - 10 раз (в зависимости от препарата), наблюдалась зона нестабильности биологического ответа (флуктуации).

Результаты исследования изменения значения порогового потенциала пробоя мембраны эритроцитов в результате воздействия излучения и химфармпрепаратов. Физико-химические факторы в зависимости от степени воздействия вызывали изменения свойств мембран и порогового потенциала пробоя. Изменение порогового потенциала электрического пробоя мембран эритроцитов наблюдалось в результате воздействия пучка электронов, УФ излучения и химфармпрепаратов. В экспериментах изменяли разность потенциалов между электродами, соответственно – напряженность поля в растворе.

Константа скорости гемолиза эритроцитов увеличивалась с определенного порогового значения: = 1600 В, E = / l = 1100 В/см.

Из рис. 7 следует, что порог электрического пробоя мембраны эритроцитов при воздействии УФ излучения (7 мин) УФ, антиоксиданта глютатиона (СГ = мкг/мл) Г и их совместного воздействия Г+УФ был меньше контрольного значения К: К УФ Г Г+УФ. А константа скорости гемолиза эритроцитов для одних и тех же значений разности потенциалов была больше:

при = 1600 В, К = 0,0070± 0,0005 1/мин, УФ = 0,10 ± 0,01 1/мин, Г = 0,56 ± 0, 1/мин, Г+УФ = 1,1 ± 0,1 1/мин. Пороговый эффект электропорации при воздействии физико-химических факторов сохранялся во всех случаях.

, 1/мин 1,8 1 Контроль Констатна скорости гемолиза 2 УФ (7 мин) 1, 3 Глютатион (С = 40 мкг/мл) 1,4 4 Глютатион (С = 40 мкг/мл) + УФ (7 мин) 1, 1,0 0, 0, 0, 0,, В 0, 0 300 600 900 1200 1500 Разность потенциалов между электродами Рис. 7. Зависимость константы скорости гемолиза эритроцитов от разности потенциалов между электродами (25 – 2000 В) в различных суспензиях:

кривая 1 – контрольная (без облучения), кривая 2 – облученная УФ, кривая 3 – с глютатионом, 4 – облученная УФ с глютатионом. Длина волны УФ излучения = 254 нм, tУФ = 7 мин;

концентрация глютатиона в СГ = 40 мкг/мл Результаты экспериментов по воздействию пучка электронов и химфармпрепаратов на мембраны эритроцитов. Для изучения воздействия ионизирующего излучения на мембраны эритроцитов с химфармпрепаратом рабочая суспензия облучалась пучком электронов. В качестве химфармпрепаратов был выбран миорелаксант (эсмерон) и газотранспортный кровезаменитель (перфторан). Для энергий пучка электронов 20, 30, 40 МэВ наблюдалась экспоненциальная зависимость константы скорости гемолиза эритроцитов от времени облучения на промежутке 3 – 10 мин.

Эсмерон. Установлено, что для миорелаксанта эсмерона характерен рост константы скорости гемолиза эритроцитов с увеличением концентрации препарата (выражена зона В). В результате воздействия пучка электронов в дозах 100 – Гр, эсмерона в концентрациях 0,2 – 2 мкл на 1 мл суспензии и их совместного действия наблюдалась аддитивность процессов (рис. 8). Эффект от воздействия пучка электронов на систему «эритроциты + эсмерон» был равен сумме эффектов от воздействия ионизирующего излучения и препарата по отдельности:

( Э + е К ) ( е К ) + ( Э К ), k Э + е 0. При увеличении дозы облучения и концентрации препарата проявлялась неаддитивность процессов, эффект от совместного действия нелинейно увеличивался.

i, отн.ед.

Относительная константа скорости гемолиза 2 С, мкг/мл 0, 0,2 Концентрация эсмерона на 1 мл суспензии Рис. 8. Гистограммы значений относительных констант скоростей гемолиза эритроцитов i для трех концентраций эсмерона (0,2;

0,7 и 2 мкл/мл):

столбик 1 – контрольная (без лекарства, без облучения), столбик 2 – облученная пучком электронов, столбик 3 – с эсмероном и 4 – облученная с эсмероном суспензии. Энергия электронов 20 МэВ, доза 750 Гр Перфторан. Экспериментально показано, что изменение кинетики гемолиза эритроцитов при добавлении в исходную суспензию газотранспортного кровезаменителя перфторана в результате воздействия импульсным электрическим полем зависело от концентрации препарата в рабочей суспензии (рис. 9). При добавлении перфторана в концентрациях 2 - 15 мкл/мл процесс гемолиза в результате калиброванной электропорации замедлялся (в точке минимума - в 1, раза) (зона А), в концентрациях 25 - 500 мкл/мл – ускорялся (в 2-6 раз) (зона В), на промежутке концентраций 15 – 25 мкл/мл – был близок к контролю (зона перехода АВ).

Относительная константа скорости П, о тн.е д.

1, 1, 1, 1, А В гемолиза 1, конт роль 1, 0, 0,8 зона А В 0, 0, С, м к л /м л 0, 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 К о н ц е н тр а ц и я п е р ф то р а н а К о н с е н т р а ц и я п е р ф т о р а н а С, м к л /м л Рис. 9. Зависимость относительной константы скорости гемолиза эритроцитов суспензии с перфтораном от концентрации препарата (значение константы контроля равно 1) При воздействии пучка электронов в дозе 2300 Гр на суспензию эритроцитов с добавлением перфторана в концентрации, замедляющей гемолиз (10 мкл/мл) статистически отличимой разницы константы скорости гемолиза облученной суспензии и суспензии с перфтораном не наблюдалось. При облучении суспензии эритроцитов с добавлением перфторана в концентрации 100 мкл/мл кинетическая кривая вела себя как кривая с перфтораном без облучения. Константа скорости гемолиза эритроцитов облученной суспензии с перфтораном е+ П была меньше суммы констант скоростей гемолиза эритроцитов облученной суспензии e и суспензии с перфтораном П : е + П e + П. Константы скорости гемолиза эритроцитов суспензии с перфтораном П и облученной суспензии с перфтораном е+ П равнялись между собой П е+ П и были больше константы скорости гемолиза эритроцитов облученной суспензии e в 2 - 3 раза. (рис. 10).

D, отн.ед.

1, 0, Оптическая плотность 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, t, мин 0, 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Время после воздействия Рис. 10. Кинетические кривые гемолиза эритроцитов D(t) (t – время после воздействия импульсного электрического поля в первые 50 мин): кривая 1 – контрольная, кривая 2 – облученная пучком электронов, кривая 3 – с перфтораном, кривая 4 – облученная с перфтораном суспензии. Энергия 40 MэВ, доза 2300 Гр, концентрация перфторана СП = 100 мкл/мл Результаты экспериментов по воздействию -излучения в малых дозах (1 – Р) и химфармпрепаратов в малых концентрациях на мембраны эритроцитов.

-излучение. При воздействии -излучения и химфармпрепаратов на мембраны эритроцитов в дозах и в концентрациях, которые не вызывали заметного изменения константы скорости гемолиза эритроцитов в течение нескольких дней, наблюдалась нестабильность отклика системы на внешнее воздействие с помощью метода калиброванной электропорации. Условия электрического пробоя мембран изменялись.

При воздействии -излучения в дозах 1 – 35 Р наблюдались флуктуаций значений константы гемолиза эритроцитов в зависимости от дозы облучения.

Эффект зависел от температуры, при которой проводились эксперименты (рис. 11).

При облучении суспензии в течение 27 часов (доза 135 Р, температура 20 С0) изменение относительной константы скорости гемолиза составило 1,5 – 1,7.

, отн. ед.

Относительная константа скорости 3, 2, 2, 1, контроль 1, 0, Доза, P 0, 0 5 10 15 20 25 Рис. 11. Зависимость относительной константы скорости гемолиза эритроцитов от дозы облучения 226Ra (активность А = 9,25 мКи) для разных температур проведения эксперимента: 1 – 14 0С, 2 – 17 0С, 3 – 20 0С. Контроль соответствует температуре проведения эксперимента, ошибки контроля показаны тонкими линиями. Средние значения, соответствующие разным температурам, для наглядности соединены пунктирными линиями В условиях экспериментов по воздействию -излучения на суспензию эритроцитов с добавлением перфторана в концентрации 20 мкл/мл и их последующей электропорации значения констант скоростей гемолиза облученной и не облученной суспензий с препаратом были равны П. При этом константа скорости гемолиза эритроцитов в результате электропорации облученной суспензии без перфторана была больше константы контрольной суспензии К.

Радиопротектор этанол. При действии химфармпрепаратов на мембраны эритроцитов зона нестабильности биологического отклика (зона ) наблюдалась при концентрациях меньших точки перехода из зоны А в зону В в 5 - 10 раз: для таурина – от 0,02 до 20 мкг/мл, для глютатиона – от 0,02 до 2 мкг/мл, для этанола – от 0,04 до 50 мкг/мл.

При воздействии УФ излучения на суспензию с химфармпрепаратами в заданных концентрациях наблюдался сдвиг зоны по оси концентраций и изменение ее ширины по оси относительной константы скорости гемолиза эритроцитов ХФП (рис. 4). На рис. 12 проиллюстрирована зона нестабильности на примере этанола.

Э, отн.ед.

4, Относительная константа скорости 1 Этанол 4, 2 Этанол + УФ 3, 3,0 гемолиза 2, УФ 2, 1, контроль 1, 0, С, мкл/мл 0, 0 5 10 15 20 25 30 35 Концентрация 50 % этанола на 1 мл суспензии Рис. 12. Зависимость относительной константы скорости гемолиза эритроцитов необлученной (кривая 1) и облученной (кривая 2) суспензий эритроцитов с 50 % этанолом Э от концентрации препарата в зоне (на промежутке 0,04 – 45 мкг/мл). Для наглядности точки на графике соединены прямыми. Контрольная необлученная (контроль) и облученная УФ (7 мин) (УФ) суспензии представлены с ошибками в виде пунктирных прямых. Представлены результаты отдельного опыта В данной области времен облучения и концентраций химфармпрепаратов влияние посторонних факторов становится значительным. Проблема неустойчивости эффекта в зоне требует специального исследования.

Оценка числа центров повреждения при действии ионизирующего излучения и химфармпрепаратов В работе рассмотрены три механизма взаимодействия ионизирующего излучения и химфармпрепаратов: уменьшение концентрации активных продуктов радиолиза (антиоксиданты, радиопротекторы), экранировка мембраны эритроцита (перфторан), независимое действие (эсмерон). Различные механизмы могут действовать в системе одновременно, зависимо или не зависимо друг от друга. В работе не обсуждаются молекулярные механизмы этих взаимодействий, а также, какой из механизмов доминирует в том или ином случае.

Пучок электронов + эсмерон. В условиях экспериментов эритроцит пересекают ~ 105 – 106 электронов:

I имп имп te f e RЭР 1,2 106.

= N e на 1 ЭР Sпучка При рабочих концентрациях эсмерона на 1 эритроцит приходится около молекул.

Кинетика гемолиза эритроцитов зависит от параметров пучка электронов, концентраций эсмерона и эритроцитов. Из экспериментальных данных установлено, что при дозах облучения 100 – 1000 Гр, концентрациях эсмерона CЭ = 0,02 – 2 мкг/мл и концентрации эритроцитов 14·106 клеток/мл наблюдалась аддитивность воздействия. В этом случае суммарный биологический эффект является суперпозицией эффектов от воздействия пучка электронов и эсмерона по отдельности (рис. 8) и может быть описан следующей зависимостью:

теор(te,CЭ) = exp(0,88·CЭ) + exp(0,04·te1,68) – 1, где CЭ – концентрация эсмерона, te – время облучения. При увеличении концентрации препарата и дозы облучения эффект от совместного действия нелинейно увеличивался.

Пучок электронов + перфторан. Диаметр частицы перфторана в среднем составляет 80 нм. При концентрации перфторана CП = 100 мкл/мл на 1 эритроцит приходится 2·104 частиц перфторана, частицы перфторана закрывают (экранируют) практически всю поверхность эритроцита. Эффективность воздействия ионизирующего излучения может уменьшаться (рис. 10). При меньшей концентрации перфторана CП = 10 мкл/мл частицы закрывают (экранируют) лишь около 8 % поверхности эритроцита. Такой концентрации перфторана не достаточно для «защиты» мембраны эритроцита от воздействия пучка электронов.

Гамма-излучение в малых дозах. В диссертации приводится оценка количества центров повреждения в биологической мембране при действии излучения в малых дозах. Показано, что при дозе 35 Р могут возникнуть несколько десятков центров повреждения в мембране эритроцита.

Основные выводы 1. При воздействии пучка электронов в дозе 2500 Гр установлена нелинейная зависимость константы скорости гемолиза от концентрации эритроцитов в суспензии. При уменьшении концентрации эритроцитов с 10 до 0, % отношение констант скоростей гемолиза эритроцитов облученной е и контрольной К суспензий возрастает (для концентрации 0,3 % е / К = 5,0 ± 0,5 ).

При концентрации эритроцитов 10 – 100 % отношение е / К не зависит от концентрации клеток ( е / К = 1,50 ± 0,16). Соизмеримые по величине эффекты наблюдаются в суспензии с анестетиком эсмероном.

2. При действии пучка электронов в дозах 100 – 1000 Гр, концентрациях эсмерона 0,02 – 2 мкг/мл и концентрации суспензии 14·106 эритроцитов/мл наблюдается суперпозиция эффектов от воздействия пучка электронов и эсмерона по отдельности. При увеличении концентрации препарата и дозы облучения эффект от их совместного действия нелинейно увеличивается.

3. При воздействии пучка электронов в дозе 2500 Гр на суспензию эритроцитов с перфтораном в концентрации 100 мкл/мл константы скоростей гемолиза облученной и необлученной суспензий совпадают.

4. В результате воздействия пучка электронов, УФ излучения и химфармпрепаратов изменяется значение порогового потенциала электрического пробоя мембран эритроцитов. При воздействии УФ излучения (интенсивность I = 0,1 Вт/см2, время облучения tУФ = 7 мин), концентрации глютатиона 40 мкг/мл пороговые потенциалы соотносятся как: КОНТР УФ ГЛЮТ ГЛЮТ+УФ.

5. Антиоксиданты в зависимости от концентрации уменьшают или увеличивают эффект воздействия ультрафиолета на мембраны эритроцитов. При интенсивности УФ излучения I = 0,1 Вт/см2, времени облучения tУФ = 7 мин и концентрации таурина СТ = 50 мкг/мл относительная константа скорости гемолиза эритроцитов облученной суспензии с таурином Т+УФ уменьшается на 40 – 55 %.

6. При воздействии -излучения в малых дозах (1 – 35 Р) на суспензию эритроцитов наблюдается зона нестабильности биологического отклика.

Аналогичные эффекты наблюдаются при малых концентрациях химфармпрепаратов в суспензии (для таурина – от 0,02 до 20 мкг/мл, для глютатиона – от 0,02 до 1,5 мкг/мл, для этанола – от 0,04 до 50 мкг/мл).

Воздействие УФ излучения (I = 0,1 Вт/см2) уменьшает данные диапазоны концентраций химфармпрепаратов в 2 – 4 раза.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Козлова Е.К, Черныш А.М., Мороз В.В., Богушевич М.С., Черняев А.П., Алексеева П.Ю. Комбинированное действие гамма-излучения, импульсного электрического поля и перфторана на мембраны эритроцитов // Медицинская физика. 2004. № 4. С. 49 – 54.

2. Козлова Е.К., Мороз В.В., Богушевич М.С., Алексеева П.Ю., Черныш А.М.

Способ определения степени повреждений мембран эритроцитов // Патент на изобретение. № 2269127. 2004.

3. Мороз В.В., Богушевич М.С., Черныш А.М., Козлова Е.К., Волков А.В., Алексеева П.Ю., Способ определения защиты мембран эрироцитов крови от воздействия пробойным импульсным электрическим полем // Патент на изобретение. № 2283096. 2004.

4. Козлова Е.К., Черняев А.П., Черныш А.М., Алексеева П.Ю. Исследование воздействия гамма-излучения на эритроциты с помощью электропорации // Вестник Московского университета. Серия 3. Физика. Астрономия. 2005. № 3.

С. 19 – 22.

5. Козлова Е.К., Черняев А.П., Алексеева П.Ю., Черныш А.М., Долгополова А.А., Назарова М.А. Диагностика скрытых повреждений биологических мембран при действии малых доз гамма-излучения. Вестник Московского Университета. Сер.

3. Физика и астрономия. 2005. № 6.С. 14 – 16.

6. Козлова Е.К., Черняев А.П., Алексеева П.Ю., Близнюк У.А., Черныш А.М., Назарова М.А. Диагностика состояния биологических мембран после воздействия малых доз гамма-излучения // Радиационная биология.

Радиоэкология. 2005. Т. 45, № 6. С. 653 – 656.

7. Мороз В.В., Козлова Е.К., Богушевич М.С., Алексеева П.Ю., Черныш А.М.

Перфторан в суспензии крови. Эффекты закрепляющего и разрушающего действия на модифицированные электрическими импульсами мембраны // Общая реаниматология. 2005. Т.1, № 3. С. 5 – 10.

8. Козлова Е.К., Мороз В.В., Богушевич М.С., Алексеева П.Ю., Черныш А.М.

Влияние формы электрического импульса на электропорацию мембран эритроцитов // Общая реаниматология. 2005. Т.1. № 1. С. 42 – 46.

9. E.K.Kozlova, A.M. Chernysh, A.P. Chernyaev, V.V. Moroz, M.S. Bogushevich, P.

Yu. Alekseeva. Membrane electroporation under the combined action of physicochemical factors on erythrocytes // European Association for Red Cell Research, 15th Meeting, Murten, Switzerland, April, 2005. P. 78.

10. В.В. Мороз, Е.К.Козлова, М.С. Богушевич, А.М.Черныш, У.А. Близнюк, А.П.

Козлов, П.Ю. Алексеева. Состояние мембран эритроцитов у доноров различных возрастных групп. Общая реаниматология. 2006. Том II, № 3. С. 9- 12.

11. В.В. Мороз, А.М.Черныш, М.С. Богушевич, Е.К. Козлова, У.А. Близнюк, П.Ю.

Алексеева, А.П. Козлов. Скрытые повреждения эритроцитарных мембран при физических и фарамакологических воздействиях. Общая реаниматология. 2006.

Том II, № 5. С. 55-60.

12. В.В. Мороз, М.С. Богушевич, Е.К.Козлова, А.М.Черныш, А.С. Шаракшанэ, П.Ю. Алексеева. Дефибрилляция сердца. Проблемы электропорации биологических мембран комбинированным воздействием. Фундаментальные проблемы реаниматологии. Труды института реаниматологии РАМН. Том IV.

Москва 2006. С. 221 – 259.

13. E.K. Kozlova, A.P. Chernyaev, A.M. Chernysh, P.Yu. Alexeeva, U.A. Bliznuk, A.P.

Kozlov. Masked damage diagnostics of human erythrocyte membrane after the action of small dose gamma-radiation. 4th International Workshop on Space Radiation Research and 17th Annual NASA Space Radiation Health Investigators’ Workshop.

Moscow-St. Petersburg. 2006. Book of Abstracts. P. 68 – 69.

14. P.Yu. Alexeeva, A.P. Chernyaev, U.A. Bliznuk and A.P. Kozlov. The action of gamma-radiation in small doses on erythrocyte membrane. // 16 Meeting of the European Association for Red Cell Research. Oxford. 16 – 19 March. 2007. PC 1.

15. Алексеева П.Ю., Близнюк У.А., Елагина В. М., Казиев Г.Р., Васильев В.Ю., Козлова Е.К., Черныш А.М. Детектирование скрытых повреждений эритроцитарных мембран при фармакологических воздействиях. Общая реаниматология. 2007. Том 3, № 4. С. 18- 23.

16. В.В. Мороз, П.Ю. Алексеева, У.А. Близнюк, В.М. Елагина, Г.Р. Казиев, А.П.

Козлов, В.Ю. Васильев, Е.К. Козлова, А.М. Черныш, М.С. Богушевич.

Воздействие анестезирующих препаратов на мембрану эритроцитов в цельной крови и в суспензии. Общая реаниматология. 2007. Том 3, № 5-6. С. 28- 33.

17. А.П. Черняев, А.М.Черныш, Алексеева П.Ю., Козлов А.П., Близнюк У.А., Е.К.

Козлова. Диагностика скрытых повреждений мембран эритроцитов в результате воздействия физико-химических факторов. Технологии живых систем. 2007.Т.

4. № 1. С. 28-36.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.