авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Астрологический Прогноз на год: карьера, финансы, личная жизнь


Функциональный анализ днк-метилтрансфераз sssi и hhai с помощью сайт-направленного мутагенеза и модифицированных субстратов

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ДАРИЙ Мария Валерьевна ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ SssI И HhaI С ПОМОЩЬЮ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА И МОДИФИЦИРОВАННЫХ СУБСТРАТОВ 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2008

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор химических наук, профессор Громова Елизавета Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук ведущий научный сотрудник Михайлов Сергей Николаевич кандидат биологических наук ведущий научный сотрудник Прохорчук Егор Борисович

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Защита состоится 25 ноября 2008 года в 17 часов на заседании Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.

Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Институт физико химической биологии им. А.Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 24 октября 2008 г.

Учёный секретарь Совета кандидат химических наук И.Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. ДНК-метилтрансферазы присутствуют в (МТазы) различных организмах, от бактерий до растений и животных. Одним из типов МТаз являются С5-МТазы, которые переносят метильную группу на атом углерода С5 остатка цитозина, образуя 5-метилцитозин. Донором метильной группы выступает кофактор S аденозил-L-метионин (AdoMet), который в ходе реакции превращается в S-аденозил-L гомоцистеин (AdoHcy). В прокариотах МТазы функционируют, главным образом, как компоненты систем рестрикции-модификации, осуществляющих защиту клетки от проникновения чужеродной ДНК. В высших организмах метилирование ДНК играет ключевую роль в регуляции различных клеточных процессов, таких как транскрипция и импринтинг генов, эмбриональное развитие, репарация ДНК, конденсация хроматина.

Отклонения от нормального уровня метилирования в клетках млекопитающих (как гипо-, так и гиперметилирование) связаны с возникновением рака. Показано, что первичные структуры МТаз млекопитающих в С-концевой части имеют высокую степень гомологии со структурой прокариотических С5-МТаз. В связи с этим, представляется важным изучение прокариотических С5-МТаз, которые могут служить моделями для изучения механизмов метилирования у млекопитающих.

Бензо[a]пирен является одним из полициклических ароматических (B[a]P) углеводородов–загрязнителей, широко распространенных в окружающей среде. В организмах, подверженных воздействию B[a]P, отмечено образование множественных мутаций, что в конечном итоге приводит к возникновению рака. Сам B[a]P не является биологически активным, однако, при попадании в клетку он метаболизируется с образованием весьма реакционноспособных диолэпоксидов, которые могут ковалентно присоединяться к ДНК. При этом преимущественно модифицируются остатки гуанина с (+/-)-транс-анти-В[a]P-N2-dG образованием стереоизомерных и аддуктов.

(+/-)-цис Известно, что (+)- и (-)-транс-анти-В[a]P-N2-dG аддукты плохо поддаются репарации.

Вследствие этого, они могут вызывать нарушение функционирования различных ферментов, взаимодействующих с ДНК, в том числе МТаз. Однако на сегодняшний день молекулярный механизм действия В[a]Р-повреждений на С5-МТазы не изучен.

Одним из объектов настоящей работы стала прокариотическая МТаза HhaI. Она узнает в ДНК последовательность GCGC и метилирует внутренний остаток цитозина участка узнавания (подчеркнут). M.HhaI является одной из наиболее изученных С5-МТаз: для нее разрешена пространственная структура и достаточно подробно изучен механизм действия.

Это явилось предпосылкой выбора M.HhaI в качестве модельного фермента для изучения влияния B[a]P-повреждений ДНК на метилирование.

Другим объектом работы стала М.SssI – уникальная прокариотическая МТаза, которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК последовательность CG. Благодаря этой особенности, М.SssI может служить прекрасной моделью для изучения метилирования ДНК эукариотическими ферментами. Этот фермент был обнаружен еще в 1985 году, однако на сегодняшний день он практически не изучен. В частности, нет данных о пространственной структуре и практически отсутствуют данные о механизме действия M.SssI. Известна первичная структура фермента, а также методом футпринтинга определены несколько функциональных групп ДНК, образующих контакты с ферментом. В нашей лаборатории методом компьютерного моделирования по гомологии была построена модель комплекса Однако до сих пор функционального анализа M.SssI-ДНК-AdoHcy.

аминокислотных остатков M.SssI не проводилось.

Цель работы. Целью работы явилось изучение влияния (+)- и (-)-транс-анти-В[a]P N -dG аддуктов на функционирование ДНК-метилтрансферазы HhaI, а также определение функционально значимых аминокислотных остатков М.SssI.

В работе решались следующие задачи: 1) определение влияния стереоизомерии B[a]P N2-dG аддукта и его локализации в ДНК на различные стадии реакции метилирования ДНК МТазой выбор аминокислот, предположительно существенных для HhaI;



2) функционирования M.SssI и сайт-направленный мутагенез гена sssIM с целью получения мутантных форм M.SssI;

3) изучение влияния вводимых аминокислотных замен на связывание и метилирование ДНК МТазой SssI и определение участия выбранных аминокислот в основных стадиях реакции метилирования.

Научная новизна и практическая ценность. В настоящей работе впервые был изучен молекулярный механизм действия B[a]P на функционирование модельной прокариотической МТазы HhaI. Было изучено связывание и метилирование МТазой HhaI аналогов субстрата, содержащих (+)- и (-)-транс-анти-В[a]P-N2-dG-аддукты вместо остатков гуанина участка узнавания. Получены значения констант диссоциации комплексов М.HhaI с B[a]P-ДНК, на основании которых установлено, что связывание ДНК при введении модификации ухудшается в 3.5-100 раз в зависимости от локализации и стереоизомерии аддукта. На основании анализа каталитических констант показано, что метилирование ДНК, содержащей B[a]P-аддукты, затруднено или практически блокировано в зависимости от локализации аддукта в участке узнавания. Высказаны предположения о том, что в зависимости от положения B[a]P-аддукта в участке узнавания и его стереохимии могут нарушаться как контакты каталитической петли М.HhaI (в частности, остатка Ile86) с малой бороздкой ДНК, так и контакты «узнающего» домена (в частности, остатков Ser252 и с большой бороздкой ДНК. С учетом сходства первичных структур Gly256) прокариотических МТаз и каталитических доменов МТаз млекопитающих, можно предполагать, что повреждение ДНК B[a]P будет оказывать похожее действие на метилирование в случае эукариотических организмов.

Далее, в работе с помощью метода сайт-направленного мутагенеза были получены конструкции для продукции мутантов М.SssI, содержащих единичные замены ряда аминокислот. Впервые были получены мутантные ферменты, содержащие замены остатков, предположительно участвующих в узнавании ДНК (K297A, N299A, S300G/P и S317A), стабилизации переходного комплекса с «выпетленным» остатком цитозина (S145A, Q147L, V188A, R232A и T313A/D/H) и катализе (E186A и R230A). Было изучено связывание и метилирование ими ДНК. Показано, что остатки Glu186 и Arg230 играют важнейшую роль в катализе. Обнаружено, что остатки Ser145, Gln147, Arg232 и T313 участвуют в «выпетливании» цитозина из двойной спирали и стабилизации промежуточного комплекса, а Ser317 может участвовать в узнавании ДНК-мишени. Таким образом, впервые получены результаты, позволяющие достаточно детально описать механизм реакции метилирования ДНК МТазой SssI, а также подтверждена компьютерная модель этого фермента.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано две статьи. Результаты работы были представлены на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» и «Ломоносов-2005» (Москва, 2004 и 2005 г.г.), 31-м международном конгрессе FEBS (Стамбул, 2006 г.), международной конференции «Биокатализ-2007» (Санкт-Петербург, 2007 г.) и IV-м съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы ( ссылок). Материал иллюстрирован 34 рисунками и 3 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Взаимодействие M.HhaI с ДНК, содержащей (+)- и (-)-транс-анти-В[a]P-N2-dG аддукты в участке узнавания.

Изучение механизма М.HhaI позволило выделить основные стадии реакции метилирования ДНК (рис. 1). Коротко их можно представить как (1) образование специфического комплекса МТаза-ДНК-AdoMet, (2) «выпетливание» метилируемого цитозина из двойной спирали в каталитическую полость фермента для сближения с кофактором, (3) образование ковалентного аддукта фермента с ДНК и перенос метильной группы на ДНК, (4) диссоциация комплекса и высвобождение продуктов реакции.

Рис. 1. Схематическое представление основных этапов реакции метилирования, катализируемой M.HhaI (Vilkaitis et al., 2001). Фермент выделен голубым цветом, участок узнавания МТазы в ДНК – розовым цветом, AdoMet и AdoHcy – желтым и зеленым цветами соответственно.

При этом M.HhaI может вносить метильную группу как в еще не метилированную ДНК, превращая ее в полуметилированную (как показано на рис. 1), так и в ДНК, уже содержащую метильную группу в одной из цепей, превращая ее в полностью метилированную. Для определения влияния В[a]P-аддуктов на различные стадии реакции, были изучены связывание и метилирование В[a]P-содержащих дуплексов М.HhaI.

В качестве аналогов субстрата были использованы B[a]P-содержащие производные неметилированного или полуметилированного 18-звенного (GCG/CGC) (табл. 1) (GCG/CGM) ДНК-дуплексов (табл. 1). Модифицированные ДНК содержали (+)- и (-)-транс анти-В[a]P-N2-dG аддукты (B+ и B– соответственно) вместо внешнего (примыкающего к метилируемому цитозину с 5’-стороны) или внутреннего (расположенного с 3’-стороны от метилируемого цитозина) остатков гуанина участка узнавания (табл. 1).

Таблица 1. Параметры взаимодействия МТазы HhaI с ДНК-дуплексами, содержащими остаток B[a]P.

Kdотн. б kcatотн б kcat, мин- ДНК-дуплекс а Kd, пМ Обозначение 5’-GAGCCAAGCGCACTCTGA 8.6 ± 0.5 1 3.7 ± 0.3 GCG/CGC 3’-CTCGGTTCGCGTGAGACT 5’-GAGCCAAB–CGCACTCTGA B–CG/CGC 30 ± 1 3.5 2.3 ± 0.3 0. 3’-CTCGGTTC GCGTGAGACT 5’-GAGCCAAB+CGCACTCTGA B+CG/CGC 126 ± 33 14.7 2.7 ± 0.1 0. 3’-CTCGGTTC GCGTGAGACT 5’-GAGCCAAGCB–CACTCTGA GCB–/CGC 400 ± 23 46.5 0.9 ± 0.1 0. 3’-CTCGGTTCGC GTGAGACT 5’-GAGCCAAGCB+CACTCTGA GCB+/CGC 282 ± 60 32.8 1.3 ± 0.4 0. 3’-CTCGGTTCGC GTGAGACT 5’-GAGCCAAGCGCACTCTGA 7.2 ± 1.2 1 3.7 ± 0.1 GCG/CGM 3’-CTCGGTTCGMGTGAGACT 5’-GAGCCAAB–CGCACTCTGA 1.2·10- 124 ± 13 17.2 0.0045 ± 0. B–CG/CGM 3’-CTCGGTTC GMGTGAGACT 5’-GAGCCAAВ+CGCACTCTGA 5.4·10- 746 ± 205 103.6 0.020 ± 0. B+CG/CGM 3’-CTCGGTTC GМGTGAGACT 5’-GAGCCAAGCВ–CACTCTGA 581 ± 84 80.7 0.4 ± 0.1 0. GCB–/CGM 3’-CTCGGTTCGМ GTGAGACT 5’-GAGCCAAGCВ+CACTCTGA 323 ± 139 45 1.2 ± 0.1 0. GCB+/CGM 3’-CTCGGTTCGМ GTGAGACT а Участок узнавания M.HhaI выделен жирным шрифтом, метилируемое основание подчеркнуто;

М – 5-метил-2’-дезоксицитидин;

B+ и B- – (+)- и (-)-транс-анти-B[a]P-N2-dG аддукты соответственно. б Определены относительно соответствующего параметра для дуплекса GCG/CGC (для неметилированных дуплексов) или дуплекса GCG/CGM (для полуметилированных дуплексов).

Изучение связывания фермента с ДНК-дуплексами осуществляли в присутствии аналога кофактора, AdoHcy, поскольку сродство M.HhaI к ДНК повышается в присутствии кофактора или его аналогов (Lindstrom et al., 2000). Сначала мы попытались определить константы диссоциации фермент-субстратных комплексов с помощью титрования B[a]P поврежденных неметилированных дуплексов M.HhaI («прямое» титрование). К сожалению, получаемые этим методом значения Kd (данные не приводятся) воспроизводились недостаточно хорошо (в некоторых случаях ошибка составляла более 100%), и только одна из констант (для дуплекса B+CG/CGC) была определена с относительно небольшой ошибкой (~ 20%). В связи с этим, был использован метод равновесного конкурентного связывания с МТазой B[a]P-ДНК и Р-меченного дуплекса GCG/CGM. B[a]P-содержащие дуплексы конкурировали с Р-меченным каноническим субстратом за центр связывания фермента, уменьшая тем самым количество комплекса M.HhaI-32Р-ДНК-AdoHcy. Данный метод позволяет получить отношение (r = Kdr/Kdc) констант диссоциации комплексов фермента с вытесняемым дуплексом (Kdr) и дуплексом-конкурентом (Kdc). В качестве вытесняемого был использован полуметилированный канонический дуплекс GCG/CGM. Анализ образования комплексов при постепенном увеличении концентраций ДНК-конкурентов проводили методом «торможения» в геле. Пример радиоавтографа геля, полученного в ходе подобного эксперимента, представлен на рис. 2.





Рис. 2. Конкурентное связывание дуплекса B+CG/CGM и 32Р-меченного дуплекса GCG/CGM (2 нМ) с М.HhaI (1 нМ) в присутствии 0.1 мМ AdoHcy. Радиоавтограф 8%-ного ПААГ. СДНК (B+CG/CGM) 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.5 и 3 мкМ в дорожках 1-8 соответственно. 9 – ДНК дуплекс GCG/CGM.

Далее строили зависимости степени образования комплекса от концентрации ДНК конкурента (рис. 3) и определяли значение r. С помощью полученной методом прямого титрования величины Kd комплекса M.HhaI с дуплексом B+CG/CGC была рассчитана Kd комплекса M.HhaI с дуплексом GCG/CGM. С использованием этой константы были рассчитаны Kd комплексов фермента с B[a]P-модифицированными ДНК (табл. 1).

Рис. 3. Кривые вытеснения неметилированными (А) и полуметилированными (Б) B[a]P модифицированными ДНК-конкурентами 32Р-меченного субстрата GCG/CGM (1 нМ) из тройного комплекса M.HhaI-ДНК-AdoHcy. CAdoHcy 0.1 мМ, СМ.HhaI 2 нМ. R – относительная степень связывания, определяемая как отношение степени образования комплекса при данной концентрации ДНК-конкурента к степени образования комплекса в отсутствие ДНК конкурента. Обозначения дуплексов: (А) GCG/CGC (), B–CG/CGC (), B+CG/CGC (), GCB–/CGC (), GCB+/CGC ();

(Б) B–CG/CGM (), B+CG/CGM (),GCB–/CGM (), GCB+/CGM ().

Как видно из табл. 1, все модифицированные дуплексы связываются ферментом хуже, чем канонические. Влияние положения В[a]P-N2-dG аддуктов в участке узнавания на связывание ДНК для неметилированных и полуметилированных дуплексов различается.

Первые хуже связываются M.HhaI при модификации внешнего остатка гуанина (B+/ CG/CGC). Для вторых отсутствует четкое соответствие между локализацией аддукта и наблюдаемыми эффектами. Для полу- и неметилированных дуплексов не наблюдается четкой корреляции между стереохимией B[a]P-N2-dG аддукта и эффективностью связывания, однако можно сказать, что в случае модификации внешнего остатка гуанина (B+/-CG/CGC и B+/-CG/CGM) хуже связываются (+)-транс-изомеры, а в случае модификации внутреннего остатка гуанина (GCB+/-/CGC и GCB+/-/CGM) хуже связываются (-)-транс-изомеры.

Кинетику метилирования ДНК-дуплексов изучали в B[a]P-поврежденных стационарных условиях. Уровень метилирования определялся по включению тритиевой метки в ДНК, происходящему в процессе переноса метильной группы от [3Н-CH3]AdoMet в ходе ферментативной реакции. С помощью полученных зависимостей уровней метилирования B[a]P-содержащих ДНК-дуплексов от времени были определены величины начальных скоростей реакции (V0) (рис. 4), а затем – значения каталитических констант (kcat).

Рис. 4. Временные зависимости степени метилирования неметилированных (А) и полуметилированных (Б) B[a]P-модифицированных ДНК-дуплексов в условиях стационарной кинетики. СДНК 100 нМ, СМ.HhaI 5 нМ, CAdoMet 1.3 мкМ. Обозначения дуплексов такие же, как на рис. 3.

Как видно из табл. 1, все B[a]P-содержащие ДНК-дуплексы метилируются МТазой HhaI хуже, чем немодифицированные субстраты. В случае неметилированных B[a]P-ДНК наблюдается относительно небольшое снижение эффективности метилирования по сравнению с каноническим субстратом;

дуплексы с B[a]P-поврежденным внутренним остатком гуанина (GCB+/-/CGC) метилируются хуже, чем те, в которых поврежден внешний остаток гуанина (B+/-CG/CGC). В случае полуметилированных дуплексов эффективность метилирования снижается сильнее, причем при модификации внешнего остатка гуанина (B+/ CG/CGM) метилирование практически блокируется (kcat снижается на 2-3 порядка). Можно отметить, что (-)-транс-изомеры метилируются хуже, чем (+)-транс-изомеры.

Далее было необходимо определить, какие контакты M.HhaI с ДНК, важные для функционирования фермента, нарушались при введении B[a]P-аддуктов. Для этого использовали данные о структуре ДНК, содержащей (+)- и (-)-транс-анти-В[a]P-N2-dG аддукты (рис. 5) и данные о контактах M.HhaI с ДНК в тройном комплексе M.HhaI-ДНК AdoHcy (рис. 6). Согласно данным ЯМР, в ДНК-дуплексах, содержащих (+)- или (-)-транс анти-В[a]P-N2-dG аддукт (рис. 5А), объемный остаток B[a]P локализован в малой бороздке ДНК (Geacintov et al., 1997). В случае (+)-изомера он ориентирован в сторону 5’-конца, а в случае (-)-изомера – в сторону 3’-конца модифицированной цепи (рис. 5Б). Введение таких аддуктов в ДНК практически не нарушает комплементационные взаимодействия между основаниями и В-форму двойной спирали (Cosman et al., 1992).

А (+)-транс-анти-В[a]P-N2-dG (В+) (-)-транс-анти-В[a]P-N2-dG (В–) Б Рис. 5. (А) Структурные формулы (+)- и (-)-транс-анти-В[a]P-N2-dG аддуктов. (Б) Пространственные структуры ДНК-дуплексов, содержащих (+)- и (-)-транс-анти-В[a]P-N2 dG (вид на малую бороздку). Структуры разрешены методом ЯМР (Geacintov et al., 1997).

Методом РСА была разрешена пространственная структура комплекса M.HhaI-ДНК AdoHcy, в которой метилируемый цитозин находится в «выпетленном» положении (Klimasauskas et al., 1994). Согласно полученным данным, M.HhaI состоит из двух доменов – большого и малого, в полости между доменами связывается ДНК-субстрат. При этом каталитическая петля (остатки 80-99) из большого домена взаимодействует с малой бороздкой, а две «узнающие» петли (остатки 233-240 и 250-257) из малого домена образуют контакты с большой бороздкой ДНК (рис. 6). Таким образом, специфические контакты с основаниями ДНК образуются малым доменом со стороны большой бороздки.

Рис. 6. Схематическое изображение контактов M.HhaI с ДНК в тройном комплексе M.HhaI ДНК-AdoHcy согласно Klimasauskas et al., 1994. Структура тройного комплекса разрешена методом РСА.

Рассмотрим влияние положения транс-анти-В[a]P-N2-dG аддуктов в участке узнавания на формирование контактов M.HhaI с ДНК на примере полуметилированных дуплексов. В комплексах M.HhaI с полуметилированными ДНК-дуплексами возможна только одна ориентация фермента относительно ДНК – когда в активный центр попадает еще не метилированный остаток цитозина. В данном случае можно однозначно судить о том, какие контакты образуются с метилируемой и неметилируемой цепями ДНК.

При модификации внешнего остатка гуанина (дуплексы B+/-CG/CGM) наблюдается резкое снижение эффективности метилирования ДНК (табл. 1). Это может быть обусловлено, во-первых, тем, что расположенный в малой бороздке остаток В[a]P мешает «выпетливанию» цитозина и, таким образом, препятствует образованию каталитически компетентного комплекса. Кроме того, могут быть нарушены контакты каталитической петли с малой бороздкой ДНК, необходимые для ее стабилизации, что приводит к нарушению метилирования. В частности, может пропадать контакт Ile86 с аминогруппой внешнего остатка гуанина (рис. 6). Ухудшение связывания фермента с дуплексами B+/ CG/CGM также может быть обусловлено нарушением «выпетливания» метилируемого цитозина из двойной спирали, поскольку в случае M.HhaI наблюдается корреляция между эффективностью «выпетливания» цитозина-мишени и прочностью фермент-субстратного комплекса (Estabrook et al., 2004). Моделирование комплекса M.HhaI с B-CG/CGM и AdoHcy (здесь и далее моделирование проводилось Е.В. Кудан) показало, что, помимо отсутствия контакта Ile86 с внешним остатком гуанина, также нарушаются контакты Gln237 (малый домен), с неспаренным остатком гуанина (рис. 6). В нашем случае это согласуется с ухудшением связывания дуплекса B–CG/CGM МТазой HhaI. Известно, что при замене Gln237 на другие аминокислоты связывание фермента с ДНК ухудшается (Mi et al., 1995).

При модификации внутреннего остатка гуанина метилирование сохраняется, пусть и на невысоком уровне. Можно сделать вывод, что в этом случае наиболее важные контакты каталитической петли M.HhaI с малой бороздкой ДНК не нарушены. Вместе с тем, наличие В[a]P-повреждения приводит к увеличению значений Kd комплексов M.HhaI с GCB+/-/CGM и AdoHcy. В случае (+)-изомера моделирование показало, что нарушаются водородные связи Gln237 с ДНК. Ухудшение связывания в случае (-)-изомера может объясняться тем, что локальное нарушение структуры ДНК, вызываемое введением аддукта, приводит к смещению модифицированного остатка гуанина относительно его положения в немодифицированном субстрате. При этом исчезают водородные связи, образованные остатками Ser252 и Gly256 с ДНК со стороны большой бороздки.

Эффективность метилирования дуплексов, поврежденных B[a]P, зависела не только от положения, но и от стереоизомерии аддукта: (+)-изомеры метилировались более эффективно, чем (-)-изомеры (табл. 1). Известно, что (+)-транс-анти-В[a]P-N2-dG аддукты вызывают несколько большую локальную дестабилизацию двойной спирали ДНК, чем (-) изомеры;

при этом происходит большее расширение малой бороздки и наблюдается больший изгиб ДНК в месте повреждения. Такие локальные нарушения могут облегчать конформационные перестройки в ДНК, приводящие к «выпетливанию» цитозина-мишени, и, таким образом, способствовать более эффективному метилированию ДНК.

Поскольку в целом механизмы катализа эукариотических и прокариотических МТаз схожи, можно предположить, что B[a]P-повреждения будут оказывать похожее действие на МТазы млекопитающих. С помощью полуметилированных дуплексов показано, что локализация объемного остатка B[a]P в малой бороздке ДНК может препятствовать образованию контактов каталитической петли фермента с ДНК, модифицированной B[a]P.

На основании выявленного снижения эффективности метилирования неметилированных дуплексов, поврежденных B[a]P, можно предположить, что наличие B[a]P-аддуктов способно нарушать de novo метилирование ДНК в клетках млекопитающих.

Вероятность влияния B[a]P-повреждений на метилирование ДНК у высших эукариот высока, поскольку наиболее часто B[a]P-поврежденные остатки гуанина встречаются в CG последовательностях, узнаваемых эукариотическими МТазами. Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о том, что повреждения бензо[a]пиреном остатков гуанина в CG участках (и примыкающих к ним с 5’-стороны) могут приводить к локальному гипометилированию ДНК. Ранее уже было показано, что при обработке эукариотических клеток B[a]Р происходит снижение количества метилированных остатков цитозина в геномной ДНК (Wilson et al., 1987). Таким образом, помимо известного мутагенного действия бензо[a]пирена, проявляется и его влияние на метилирование, что может вносить дополнительный вклад в канцерогенное действие этого загрязнителя.

2. Мутационный анализ ДНК-метилтрансферазы SssI.

Вторая часть работы посвящена изучению уникальной прокариотической МТазы SssI, которая узнает короткую последовательность CG, и, таким образом, проявляет такую же специфичность, как МТазы млекопитающих. На сегодняшний день этот фермент практически не изучен. В частности, отсутствуют данные о пространственной структуре и крайне мало данных о механизме действия M.SssI. Данные футпринтинга свидетельствуют о том, что M.SssI взаимодействует преимущественно с остатками гуанина участка узнавания в большой бороздке ДНК (Renbaum et al., 1995). Также выявлены многочисленные контакты M.SssI с межнуклеотидными фосфатами, расположенными преимущественно с 5’-стороны от CG-участка. Предполагается, что именно эти контакты могут способствовать узнаванию короткой CG-последовательности.

2.1. Выбор аминокислотных остатков – объектов мутационного анализа.

Нас интересовало, какие аминокислотные остатки участвуют в ключевых стадиях реакции метилирования, катализируемой M.SssI. Мы предполагали, что основные этапы реакции будут такими же, как в случае M.HhaI (рис. 1). Для выбора остатков – объектов мутационного анализа мы воспользовались данными выполненного в нашей лаборатории компьютерного моделирования по гомологии комплекса M.SssI-ДНК-AdoHcy, предсказывающего контакты фермента с гетероциклическими основаниями участка узнавания, а также с углеводофосфатным остовом ДНК (рис. 7).

Рис. 7. Схема контактов с ДНК согласно M.SssI компьютерной модели комплекса M.SssI-ДНК AdoHcy (Koudan et al., 2004).

Кроме того, предположения о роли отдельных аминокислот в функционировании M.SssI базировались на анализе первичных структур M.SssI и ряда прокариотических и эукариотических С5-МТаз (рис. 8). Как известно, С5-МТазы имеют очень высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей (Posfai et al., 1989). В первичной структуре M.SssI содержатся 10 консервативных для семейства С5-МТаз аминокислотных мотивов, между мотивами VIII и IX расположен вариабельный участок – TRD (target recognition domain), предположительно отвечающий за узнавание в ДНК последовательности-мишени.

Можно предположить, что остатки, занимающие в ферментах одну и ту же консервативную позицию, выполняют одну и ту же функцию. Некоторые предположения относительно роли аминокислотных остатков M.SssI в реакции метилирования были сделаны с учетом литературных данных по мутационному анализу М.HhaI.

Прежде всего, нас интересовал вопрос о том, какие остатки могут отвечать за узнавание короткой последовательности CG (этап 1 на рис. 1). Согласно модели, важную роль в этом играют Ser300 и Ser317 из TRD (рис. 7 и 8). Атомы кислорода и азота основной цепи фермента в районе Ser300 образуют водородные связи с аминогруппой цитозина и карбонильным кислородом гуанина неметилируемой цепи ДНК соответственно. Для проверки роли Ser300 мы заменяли его на Gly и Pro. Боковая цепь Ser317 взаимодействует с атомом азота N7 гуанина метилируемой цепи, что хорошо согласуется с результатами футпринтинга комплекса М.SssI с ДНК (Renbaum et al, 1995). Этот остаток Ser был заменен на Кроме того, мы приняли во внимание важность контактов M.SssI с Ala.

межнуклеотидными фосфатами (Renbaum et al., 1995), и в качестве объектов мутационного анализа выбрали остатки K297 и N299 из TRD (рис. 7 и 8), заменив их на Ala.

Рис. 8. Выравнивание аминокислотных последовательностей прокариотических С5-МТаз (M.SssI, M.HhaI, M.HaeIII и M.EcoRII) и МТаз млекопитающих (Dnmt2, Dnmt3a и Dnmt3b).

Консервативные остатки выделены черным фоном, остатки с одинаковой химической природой выделены серым фоном. Консервативные мотивы выделены рамками и пронумерованы согласно (Posfai et al., 1989), после мотива VIII показана N-концевая часть последовательности TRD. Над аминокислотной последовательностью M.SssI отмечены остатки, выбранные для мутационного анализа.

Далее был выбран ряд остатков из мотивов IV, VI и VIII и из TRD, предположительно участвующих в «выпетливании» и стабилизации метилируемого цитозина (этап 2 на рис. 1).

Одним из таких остатков является консервативный Ser145 (мотив IV) (рис. 8). Согласно модели, он взаимодействует с фосфатом, примыкающим к цитозину-мишени с 5’-стороны (Е. Кудан, личное сообщение). Роль этого остатка проверяли, заменяя его на Ala.

Следующим остатком, для которого мы предположили участие в «выпетливании» цитозина из ДНК, был неконсервативный остаток Gln147 (рис. 8). Согласно построенной модели, Gln147 в M.SssI взаимодействует с неспаренным остатком гуанина со стороны малой бороздки ДНК (рис. 7). Его заменяли на Leu. Еще одна аминокислота, предположительно поддерживающая остаток цитозина в положении это «выпетленном» – высококонсервативный Val188 из мотива VI (рис. 8). В M.HhaI соответствующий остаток необходим для «выпетливания» цитозина из ДНК и, как следствие, для катализа (Estabrook et al., 2004). Val188 заменяли на Ala. Другим остатком, для которого мы предполагали участие в закреплении правильного положения «выпетленного» цитозина, был консервативный остаток Arg232 из мотива VIII (рис. 8). Согласно компьютерной модели, Arg232 образует водородные связи с атомом О2 метилируемого цитозина и с фосфатной группой, примыкающей к нему с 5’-стороны (рис. 7). Его важность проверяли заменой остатка на Ala.

Наконец, была проверена роль Thr313 в «выпетливании» метилируемого цитозина из ДНК.

Этот остаток, являющийся частью консервативного дипептида TL в TRD (рис. 8), согласно модели, взаимодействует с углеводофосфатным остовом (рис. 7). Мы заменяли Thr313 на Ala, Asp и His.

Наконец, нас интересовал вопрос о том, какие аминокислоты принимают участие в каталитическом акте (этап 3 на рис. 1). На рис. 9 показан механизм реакции метилирования, предложенный для С5-МТаз (Chen et. al., 1993). Он включает протонирование N3 положения метилируемого цитозина остатком Glu из мотива ENV, что вызывает активацию С положения для нуклеофильной атаки остатка Cys из мотива PCQ и образование ковалентного аддукта фермента с ДНК. В свою очередь, образование ковалентной связи по С6 вызывает активацию атома углерода С5 остатка цитозина для присоединения метильной группы.

Рис. 9. Механизм реакции метилирования цитозина по положению С5 (Chen et. al., 1993).

Для проверки справедливости этой схемы в случае M.SssI проводили замены аминокислот, предположительно участвующих в катализе. Первым таким остатком стал инвариантный остаток Cys141 из мотива IV (рис. 8), предположительно образующий ковалентную связь с цитозином (рис. 9). Он был заменен на Ser. Ранее было показано, что каталитическая активность мутантного фермента C141S в 100 раз меньше таковой для фермента дикого типа (Rathert et al., 2007). Однако не было изучено, как такая замена влияет на эффективность связывания с ДНК. Вторым был выбран консервативный остаток Glu186 из мотива VI (рис.

8), предположительно протонирующий положение N3 цитозина (рис. 9), и заменен на Ala.

Наконец, третьим заменяемым остатком стал консервативный остаток Arg230 из мотива VIII (рис. 8). Мы предположили, что этот остаток участвует в катализе, поскольку для М.HhaI методом компьютерной симуляции динамики активного центра была показана возможность соответствующего остатка аргинина протонировать положение N3 метилируемого цитозина через молекулу воды совместно с остатком глутаминовой кислоты из мотива VI. Arg230 был заменен на Ala.

2.2. Конструирование плазмид с мутациями в гене sssIM и выделение мутантных ферментов.

Конструкции для продукции мутантных ферментов V188A, S300P и S300G были получены с помощью сайт-направленного мутагенеза плазмиды pCAL/nH, кодирующей М.SssI с кластером из шести гистидинов на N-конце (рис. 10). Общая схема конструирования плазмид, несущих гены мутантных белков, была следующей: из плазмиды pCAL/nH вырезали ген белка M.SssI (или его часть) и выделяли большой фрагмент без гена. Затем с помощью ПЦР копировали ген с внесением в него мутаций, в результате чего получали два фрагмента, которые обрабатывали эндонуклеазами рестрикции и соединяли с большим фрагментом ДНК-лигазой.

Рис. 10. Схематическое изображение этапов получения мутантных плазмид. 1 – плазмида, продуцирующая M.SssI дикого типа, 2-4 – плазмиды, продуцирующие мутантные ферменты S300P, S300G и V188A соответственно. Темно-серым цветом показана последовательность His6, светло-серым – ген sssIM.

Конструкции, несущие гены других мутантных белков, были получены в лаборатории А. Киша (Венгрия). Все эти мутантные ферменты были производными M.SssI, содержащей дополнительную последовательность Ser-His6 на С-конце. Ген такого варианта M.SssI дикого типа кодировался плазмидой pBHNS-MSssI.

В качестве штамма-реципиента для плазмид pCAL7/nH, pBHNS-MSssI и мутантных плазмид использовали штамм Е. со1i ER1821. Ферменты выделяли с помощью Co2+ содержащей смолы TALON, используя ступенчатый градиент концентрации имидазола.

Выход ферментных препаратов составлял около 0.8 мг белка на 1 л клеточной культуры.

Ферменты имели степень чистоты около 90%.

2.3. Подходы к изучению свойств мутантов M.SssI.

Определение концентраций мутантов M.SssI. Для большинства мутантных белков определяли общую концентрацию белка по методу Брэдфорд. В случае мутантных ферментов и методом поляризации флуоресценции определяли V188A S300G/P концентрацию молекул, способных связываться с ДНК («активных» молекул). Проводили прямое титрование меченного 6-карбокси-флуоресцеином (FAM) дуплекса 5’-FAM рGAGCCAAGCGCACTCTGA/5’-TCAGAGTGCGCTTGGCTC (FAM-GCG/CGC) ферментами в условиях стехиометрического связывания (СДНКKd) и определяли концентрации активных молекул V188A и S300G/P.

Метилирование ДНК. Были определены начальные скорости реакции метилирования ДНК дуплекса 5’-GAGCCAAGCGCACTCTGA/5’-TCAGAGTGCGCTTGGCTC (GCG/CGC) МТазой SssI и мутантными ферментами в стационарных условиях (СДНК 1 мкМ, СМТазы нМ) (табл. 2). Как и в случае M.HhaI, использовали меченный тритием кофактор AdoMet (CAdoMet 1.3 мкМ). Для трех мутантных ферментов V188A, S300G и S300P измеряли V0 за первые три минуты реакции. Для остальных ферментов, многие из которых имели очень низкие активности, временной интервал для определения начальных скоростей реакции был увеличен до 25 мин, чтобы получить достаточно высокие счета радиоактивности продукта.

При этом линейность зависимости выхода продукта от времени сохранялась. На рис. показан пример определения V0 для ряда мутантных ферментов.

Рис. Зависимости уровней 11.

метилирования ДНК-дуплекса GCG/CGC дикого типа и мутантными M.SssI ферментами S145A, Q147L, R232A и T313A/D/H от времени при СДНК 1 мкМ, CAdoMet 1.3 мкМ, СМТазы 50 нМ.

Таблица 2. Параметры взаимодействия M.SssI дикого типа и мутантных ферментов с ДНК.

Положение а Kdмут/KdWT V0, нМ/мин в V0мут/V0WT МТаза заменяемого Kd, нM остатка 42.4 ± 9.2 2.62 ± 0. 1 M.SssI WT б 72.1 ± 1.9 г 11.1 ± 2. Мотив IV 40 ± 8.35 0.94 - C141S Мотив IV 31.3 ± 5.3 0.74 0.221 ± 0.003 0. S145A Мотив IV 532.4 ± 97.6 12.6 0.199 ± 0.001 0. Q147L Мотив VI 10.5 ± 1.6 0.25 0 E186A 2.03 ± 0.46 б 34.2 ± 0.9 г Мотив VI 0.18 0. V188A Мотив VIII 51.3 ± 8.3 1.21 0 R230A Мотив VIII 11.8 ± 2.1 0.28 0.059 ± 0.019 0. R232A TRD 55.9 ± 10.8 1.32 2.03 ± 0.09 0. K297A TRD 39.7 ± 11.4 0.94 2.66 ± 0.02 1. N299A 9.6 ± 2.1 б 87.8 ± 5.2 г TRD 0.86 1. S300G 32.7 ± 4.4 б 58.8 ± 3.4 г TRD 2.95 0. S300P TRD 26.8 ± 6.4 0.63 2.56 ± 0.23 0. T313A TRD 420.7 ± 113.6 9.92 0 T313D TRD 1111.4 ± 186.0 26.2 0 T313H TRD 132.7 ± 20 3.13 1.421 ± 0.004 0. S317A – определены методом «торможения» в геле с учетом общих концентраций ферментов. б – a определены методом поляризации флуоресценции с учетом концентраций активных молекул ферментов.

в – определены за 25 мин реакции с учетом общих концентраций ферментов. г – определены за 3 мин реакции с учетом концентраций активных молекул ферментов.

Связывание ДНК. Для изучения стабильности фермент-субстратных комплексов проводили прямое титрование ДНК ферментами в присутствии AdoHcy. Для мутантных ферментов V188A, S300G и S300P использовали метод поляризации флуоресценции, для остальных – метод «торможения» в геле. В обоих случаях в качестве субстрата использовали дуплекс FAM-GCG/CGC (с концентрацией 10 или 15 нМ соответственно);

концентрация AdoHcy составляла 0.1 мМ. На рис. 12 показаны изотермы связывания ряда мутантных ферментов с ДНК.

Рис.12. Титрование дуплекса FAM GCG/CGC M.SssI дикого типа и мутантными ферментами S145A, Q147L, R232A и T313A/D/H (по данным, полученным с помощью метода «торможения» в геле). СДНК нМ, CAdoHcy 0.1 мМ, СМТазы 0-600 нМ.

Определение Kd проводилось методом регрессионного анализа, в качестве параметров которого использовали экспериментальные зависимости степени образования комплекса от общей концентрации фермента. Полученные значения Kd для мутантных ферментов приведены в табл. 2.

2.4. Функциональный анализ мутантных ферментов.

Как уже было сказано, мы выделили ряд аминокислотных остатков M.SssI, которые могут участвовать в основных этапах реакции метилирования. В данном разделе все заменяемые остатки поделены на три группы согласно предполагаемым функциям.

Узнавание последовательности CG в ДНК.

Lys297 и Asn299. Результаты связывания и метилирования ДНК мутантными ферментами K297A и N299A показали, что замена этих аминокислот не влияет на активность фермента (табл. 2). Таким образом, аминокислотные остатки в положениях 297 и 299 не важны для узнавания ДНК.

Ser300. Мутантный белок S300G связывал и метилировал ДНК так же эффективно, как и фермент дикого типа (табл. 2). Введение в M.SssI вместо Ser300 остатка пролина (более «жесткая» замена) привело к росту Kd примерно в 3 раза (табл. 2), что свидетельствует о некотором снижении устойчивости комплекса мутантного фермента S300P с ДНК. Величина начальной скорости метилирования при такой замене практически не менялась (табл. 2).

Поскольку даже замена Ser300 на пролин в M.SssI не привела к значительному ухудшению связывания и метилирования ДНК, можно предположить, что Ser300 не играет важной роли в связывании с участком узнавания.

Ser317. При замене Ser317 на аланин эффективности связывания и метилирования ДНК снизились в 3 и 2 раза соответственно (табл. 2). Хотя эффект этой замены и не очень велик, мы предполагаем, что Ser317 участвует в узнавании ДНК. Известно, что замены отдельных остатков из TRD, которые, согласно данным компьютерного моделирования, важны для связывания С5-МТаз с ДНК, обычно незначительно влияют на активность ферментов (Radlinska et al., 2004).

«Выпетливание» метилируемого цитозина из двойной спирали ДНК.

Ser145. Мутантный фермент S145A показал практически такую же эффективность связывания ДНК, как и фермент дикого типа, но начальная скорость метилирования была снижена в 12 раз (табл. 2). Эти результаты свидетельствовали о важности остатка Ser145 для ферментативной активности. Однако это не было прямым подтверждением того, что этот остаток играет роль именно на стадии «выпетливания». Для изучения возможности выведения основания-мишени из состава двойной спирали был использован ДНК-дуплекс, содержащий в положении цитозина-мишени флуоресцентный аналог аденина, 2 аминопурин. Флуоресценция 2-аминопурина потушена, когда основание находится в составе ДНК, и разгорается при его выведении из двойной спирали (Holz et al., 1998). Был проведен анализ разгорания флуоресценции при взаимодействии мутантного фермента S145A с ДНК дуплексом, содержащим остаток 2-аминопурина (здесь и далее анализ флуоресценции проводился Н.А. Черепановой). Было показано, что флуоресценция в случае мутантного фермента практически не разгоралась (интенсивность флуоресценции была в 7 раз ниже, чем для фермента дикого типа). Таким образом, полученные данные подтвердили участие Ser в «выпетливании» цитозина-мишени. Можно предположить, что этот остаток стабилизирует «выпетленный» цитозин. По данным РСА структур M.HhaI и M.HaeIII, соответствующий остаток серина в этих ферментах образует водородную связь с фосфатной группой, расположенной с 5’-стороны от метилируемого цитозина (Klimasauskas et al., 1994;

Reinisch et al., 1995).

Gln147. При замене этого остатка на лейцин связывание и метилирование ДНК ухудшились примерно в 12 раз (табл. 2). Такое резкое снижение активности фермента свидетельствует о том, что остаток Gln147 необходим для функционирования M.SssI. Кроме того, в случае мутантного фермента Q147L практически не наблюдалось разгорания флуоресценции 2 аминопурина (интенсивность флуоресценции была в 20 раз ниже, чем в случае M.SssI дикого типа), что свидетельствует о необходимости Gln147 для «выпетливания» цитозина.

Сравнение данных РСА комплекса M.HhaI-ДНК-AdoHcy (Klimasauskas et al., 1994) с моделью комплекса M.SssI-ДНК-AdoHcy (рис. 7) показало, что Gln147 в паре с Ser300 в M.SssI, подобно паре Ser87 с Gln237 в M.HhaI занимают пространство, освободившееся после «выпетливания» метилируемого цитозина и стабилизируют неспаренный остаток гуанина.

Val188. Замена Val188 на аланин привела к некоторому улучшению связывания мутантного фермента V188A с ДНК (Kd снижается примерно в 5 раз, табл. 2). Начальная скорость метилирования ДНК при введении мутации снизилась примерно в 2 раза (табл. 2). Исходя из полученных данных, можно было бы предположить, что остаток Val188 не является важным для стабилизации «выпетленного» цитозина. Однако, учитывая, что остаток Val188 является высококонсервативным, а также тот факт, что его замена на аланин в случае M.HhaI приводит к полной потере ферментативной активности, мы не можем исключить его взаимодействия с метилируемым цитозином. Val188, скорее всего, образует контакт с «выпетленным» цитозином. По всей вероятности, в случае мутантного белка V188A этот контакт может быть образован с Ala188, поскольку у M.SssI в соседней позиции (189) присутствует остаток глицина (рис. 8), дающий ферменту возможность «подстроиться» под мутацию и не потерять активность.

Arg232. При замене этого остатка на Ala наблюдался рост сродства фермента к ДНК в 3. раза, а каталитическая активность снизилась в 45 раз (табл. 2). Кроме того, было показано, что разгорание флуоресценции 2-аминопурина было совсем незначительным (в 11 раз ниже, чем для фермента дикого типа). Эти результаты свидетельствуют об участии Arg232 в «выпетливании» цитозина-мишени и/или в поддержании его конформации, необходимой для катализа. Для М.HhaI было продемонстрировано участие соответствующего остатка аргинина в «выпетливании» цитозина-мишени и стабилизации его внеспирального положения (Shieh et al., 2006).

Thr313. В M.HhaI, с помощью замены соответствующего остатка треонина на аминокислоты с различным размером боковых цепей и с использованием анализа флуоресценции 2 аминопурина было показано, что этот остаток участвует в конформационных перестройках во время «выпетливания» цитозина и поддерживает правильную конформацию остова ДНК и метилируемого цитозина (Vilkaitis et al., 2000). В нашем случае, замена Thr313 на Asp и His привела к значительному снижению устойчивости комплексов фермента с ДНК (в 10 и раз соответственно) и к потере ферментативной активности (табл. 2). Также было показано снижение интенсивности флуоресценции 2-аминопурина в случае мутанта T313D в 5 раз по сравнению с ферментом дикого типа. Для мутантного белка T313A, напротив, не наблюдалось снижения эффективности связывания или метилирования ДНК (табл. 2), и интенсивность флуоресценции 2-аминопурина была снижена всего в два раза. Эти данные согласуются с полученными для M.HhaI, поэтому можно предположить, что Thr313 в M.SssI выполняет такую же функцию, т.е. поддерживает нужную конформацию углеводофосфатного остова и метилируемого цитозина во время «выпетливания».

Катализ переноса метильной группы на ДНК.

Cys141. Полученные для мутантного фермента C141S данные (табл. 2) свидетельствуют о том, что связывание им ДНК не меняется по сравнению с ферментом дикого типа. При этом каталитическая активность C141S в 100 раз меньше таковой для M.SssI дикого типа (Rathert et al., 2007). Эти данные свидетельствуют о том, что Cys141 необходим именно для катализа и не существенен для прочного связывания M.SssI с ДНК.

Glu186. Мутантный фермент E186А образовывал в 4 раза более прочные комплексы с ДНК, чем фермент дикого типа, но при этом терял каталитическую активность (табл. 2). Это подтвердило необходимость Glu186 для катализа. Однако мутантный белок E186А не утратил способности образовывать ковалентный аддукт с ДНК (здесь и далее показано Н.А.

Черепановой). Это позволило сделать предположение, что в протонировании положения N цитозина, необходимом для образования ковалентного аддукта, может участвовать и другой аминокислотный остаток M.SssI. Интересно, что в случае M.HhaI замена соответствующего остатка глутаминовой кислоты на аланин приводила к падению каталитической активности в 500 раз и к отсутствию ковалентного аддукта с ДНК (Shieh et al., 2007).

Arg230. Замена Arg230 на Ala почти не оказала влияния на связывание фермента с ДНК, но каталитическая активность мутантного фермента R230A была полностью потеряна (табл. 2).

Кроме того, не наблюдалось образования ковалентного аддукта R230A с ДНК. Эти результаты свидетельствуют об исключительной важности Arg230 для образования ковалентной связи фермента с ДНК и катализа. Кроме того, если предположить, что этот остаток участвует в протонировании положения N3 цитозина, становится понятным, почему наблюдалось образование ковалентного аддукта мутантного фермента E186A с ДНК. Мы предполагаем, что Arg230 непосредственно участвует в катализе.

Таким образом, с помощью мутационного анализа M.SssI удалось выявить остатки, участвующие в узнавании последовательности CG (Ser317), «выпетливании» метилируемого цитозина (Ser145, Gln147, Arg232 и Thr313) и катализе (Cys141, Glu186 и Arg230). Впервые на примере M.SssI была продемонстрирована важность консервативных остатков Ser (мотив VI) и Arg230 (мотив VIII) для функционирования С5-МТаз. Важным моментом явилось то, что была показана значимость неконсервативного остатка Gln147, роль которого была предсказана по данным компьютерного моделирования.

ВЫВОДЫ 1. Введение (+)- и (-)-транс-анти-B[a]P-N2-dG-аддуктов в участок узнавания M.HhaI приводит к увеличению констант диссоциации комплексов M.HhaI-ДНК-AdoHcy на 1- порядка и к снижению эффективности метилирования ДНК M.HhaI. При расположении B[a]P-аддукта с 5’-стороны от цитозина-мишени в случае полуметилированных ДНК метилирование практически блокируется. Высказаны предположения о том, что локализация объемного остатка B[a]P в малой бороздке ДНК препятствует контактам каталитической петли фермента с ДНК, модифицированной B[a]P.

2. Получено 15 мутантных форм M.SssI, содержащих единичные замены ряда аминокислот в функционально значимых участках фермента.

3. Показано, что замены остатков, предположительно участвующих в узнавании ДНК (Lys297, Asn299, Ser300 и Ser317), практически не влияют на активность M.SssI. Замены остатков, которые могут участвовать в стабилизации переходного комплекса с «выпетленным» остатком цитозина (Ser145, Gln147, Val188, Arg232A и Thr313) и активации метилируемого цитозина в процессе катализа (Glu186 и Arg230) приводят, за исключением замены Val188, к значительному снижению эффективности метилирования ДНК, а в случае мутантных ферментов Q147L и T313D/H – еще и к заметному ухудшению связывания субстрата. Эти данные указывают на участие остатков Ser145, Gln147, Arg и Thr313 в стабилизации промежуточного комплекса и на участие остатков Glu186 и Arg230 в каталитическом акте.

4. На примере M.SssI показана важность консервативных остатков серина из мотива IV (Ser145 в M.SssI) и аргинина из мотива VIII (Arg230 в M.SssI) для функционирования С5 МТаз. Выявлен неконсервативный остаток Gln147, играющий важную роль в процессе метилирования, осуществляемого M.SssI.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. O.M. Subach, V.B. Baskunov, M.V. Darii, D.V. Maltseva, D.A. Alexandrov, O.V.

Kirsanova, А. Kolbanovskiy, M. Kolbanovskiy, F. Johnson, R. Bonala, N.E. Geacintov, E.S.

Gromova (2006) Impact of benzo[a]pyrene-2'-deoxyguanosine lesions on methylation of DNA by SssI and HhaI DNA methyltransferases. Biochemistry, 45, 6142-6159.

М.В. Дарий, О.В. Кирсанова, В.Л. Друца, С.Н. Кочетков, Е.С. Громова (2007) 2.

Выделение и сайт-направленный мутагенез ДНК-метилтрансферазы SssI. Молекуляр.

биология, 41, 121-129.

Дарий М.В., Субач О.М. (2004) Влияние модификации ДНК бензо[a]пиреном на ее 3.

взаимодействие с ДНК-метилтрансферазой HhaI. Материалы международной конференции Ломоносов-2004, Москва;

т. 1, стр. 90.

4. Darii M.V., Subach O.M. (2005) Interactions between benzo[a]pyrene-modified DNA molecules and HhaI DNA methyltransferase. Материалы международной конференции Ломоносов-2005, Москва;

т. 1, стр. 199.

5. E. Gromova, O. Subach, V. Baskunov, M. Darii, D. Maltseva, A. Jeltsch, A. Kolbanovskiy, M. Kolbanovskiy and N. Geacintov (2006) Impact of benzo[a]pyrene diol epoxide-DNA adducts on DNA methylation. FEBS Journal, v.273, Supplement 1, p.187-188.

6. M. Darii, O. Kirsanova, V. Drutsa, A. Kiss and E. Gromova (2007) Functional analysis of mutants of DNA methyltransferase SssI. International conference Biocatalysis-2007: fundamentals and applications, St. Petersburg, Russia;

р.85.

7. E.S. Gromova, M.V. Darii, N.A. Cherepanova, O.M. Subach, O.V. Kirsanova, T. Rask, K.

Slaska-Kiss and A. Kiss. (2007) Study of the catalytic mechanism and DNA recognition of the CpG methyltransferase M.SssI by site-directed mutagenesis and with modified substrates. FEBS-CNRS Workshop. DNA and RNA Modification Enzymes: Comparative Structure, Mechanism, Function and Evolution. Aussois, France;

p.16.

Дарий М.В., Черепанова Н.А., Субач О.М., Кирсанова О.В., Раско Т., Сласка-Киш К., 8.

Киш А., Громова Е.С. (2008) Мутационный анализ и механизм-зависимое ингибирование CpG-узнающей ДНК метилтрансферазы M.SssI как инструмент изучения ДНК-белковых взаимодействий. IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск;

стр. 75.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.