авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Формирование и физико-химические свойства привитых рецепторных слоев микромеханических и пьезокварцевых сенсоров

На правах рукописи

Кудринский Алексей Александрович

ФОРМИРОВАНИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

ПРИВИТЫХ РЕЦЕПТОРНЫХ СЛОЕВ МИКРОМЕХАНИЧЕСКИХ

И ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ СЕНСОРОВ

02.00.04 – физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в лаборатории органического катализа кафедры химии нефти и органического катализа Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Лисичкин Георгий Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор технических наук Зуев Борис Константинович, Институт геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН доктор химических наук, профессор Копылов Алексей Михайлович, Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН

Защита диссертации состоится «13» февраля 2009 г. в 15 час. 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д 501.001.90 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ им. М.В. Ломоносова, Химический факультет, аудитория 446.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова «25» декабря 2008 г.

Автореферат разослан «25» декабря 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 501.001.90, кандидат химических наук М.С. Бобылева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из активно развивающихся приложений метода химического модифицирования поверхности является разработка химических и биосенсоров – аналитических устройств, включающих взаимодействующий с определяемым веществом рецепторный слой, тесно связанный или интегрированный с физическим преобразователем. Каждый из известных сегодня типов сенсоров (электрохимические, полупроводниковые, оптические, масс-чувствительные и т. д.) обладает своими достоинствами и недостатками, поэтому представляет интерес не только совершенствование рецепторов известных типов, но и разработка новых селективных высокочувствительных сенсорных систем, раскрытие их потенциальных возможностей и преимуществ.

Селективность сенсора определяется наличием на поверхности преобразователя прочно зафиксированного слоя функциональных групп или молекул, способных специ фично и, желательно, обратимо взаимодействовать с определяемым веществом – анали том. Создание такого рецепторного слоя – необходимое, но не достаточное условие эффективности сенсора. Начиная с 1950-х годов практически единственными реакциями, используемыми для специфического определения концентрации биологически активных соединений, были взаимодействие антиген-антитело и гибридизация ДНК. Затем, после открытия Эллингтоном в 1990 г. "аптамеров" (короткоцепочечных однотяжевых олигонуклеотидов, способных к селективному, а в некоторых случаях и специфичному, связыванию с определенными биологически активными соединениями) появилась возможность использования альтернативных комплексообразователей в составе рецепторного слоя сенсоров. Опубликованные работы, посвященные применению аптамеров в сенсорах, носят пока преимущественно иллюстративный характер, и подробных сведений о поведении аптамеров на рабочей поверхности сенсоров получено пока немного. Вместе с тем, знание строения и свойств привитых слоев аптамеров на поверхности рецептора позволит разработать более эффективные методики экспрессного определения различных биологически активных соединений в многокомпонентных объектах. Хорошо алгоритмизированный способ получения индивидуальных аптамеров (процедура SELEX, предложенная Эллингтоном) в сочетании со сведениями о поведении иммобилизованных аптамеров в перспективе может создать предпосылки для разработки унифицированных методик экспресс-определения большого числа аналитов.

Наряду с открытием аптамеров в последние десятилетия произошел технологический прорыв в области изготовления кремниевых микроконсолей (кантилеверов) для атомно-силовой микроскопии, позволивший создать чувствительные тепловые, магнитные, масс-чувствительные сенсоры. Успешное использование кантилеверов для детектирования самых разных физических взаимодействий открывает широкие перспективы создания на их основе принципиально нового класса химических сенсоров – так называемых микро механических сенсоров, в которых регистрируется изменение поверхностного натяжения на границе рецептор – окружающая среда. Потенциальные возможности микромеханических сенсоров и области, в которых возможно их наиболее эффективное применение, еще только предстоит выяснить.

Подавляющее большинство работ в области микромеханических сенсоров посвящено определению отдельно взятого аналита с помощью соответствующего селективного комплексообразующего реагента, иммобилизованного на поверхности кантилевера. Влияние способа иммобилизации и структуры образующегося привитого слоя на величину аналитического сигнала и, как следствие, на чувствительность и другие характеристики сенсора зачастую систематически не исследуется. Также редко обсуждаются механизмы процессов, приводящих к изменению поверхностного натяжения в области привитого слоя. Лишь в самое последнее время начали появляться работы, свидетельствующие об определяющем влиянии расположения молекул реагентов в привитом слое на экспериментально определяемую величину отклика сенсора – поверхностного натяжения на границе рецепторного слоя с анализируемым раствором. Это позволяет предположить, что микромеханические устройства на основе кантилеверов могут служить не только в качестве средств инструментального экспресс анализа, но и в качестве инструментов для изучения привитых слоев и физико химических процессов в приповерхностном слое. Поэтому выявление того, какую информацию о них можно получить с помощью микромеханических устройств на основе кантилеверов, является, несомненно, интересной и актуальной в фундаментальном аспекте задачей.



Для этого необходимо на примере использования различных модификаторов поверхности и адсорбатов выявить основные закономерности возникновения аналитического сигнала в микромеханических сенсорах и установить степень влияния различных процессов, протекающих в привитых слоях, на поверхностное натяжение.

Цель и задачи работы. Основной целью работы было изучение физико химических процессов в привитых рецепторных слоях микромеханических и пьезокварцевых сенсоров.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Изучение динамики изменения поверхностного натяжения привитого слоя в процессах модифицирования кантилевера на примере иммобилизации различных белков с помощью метода химической сборки на поверхности. Выявление вклада латеральных межмолекулярных взаимодействий в привитых слоях в поверхностное натяжение. Изучение динамики изменения поверхностного натяжения в процессе структурной организации привитого слоя молекул лизоцима.

2. Разработка методов создания рецепторных слоев микромеханических сенсоров, способных к эффективному генерированию аналитического сигнала при селективной сорбции определяемого вещества. Изучение аналитических характеристик модельных микромеханических сенсоров для определения тромбина (одного из ключевых ферментов системы свертывания крови), морфина и антител к морфину.

3. Изучение комплексообразующей способности тромбин-связывающего аптамера, иммобилизованного на поверхности золота. Создание модельного пьезокарцевого сенсора для определения тромбина и оптимизация методики определения тромбина в модельных растворах, имитирующих сыворотку крови. Поиск способов увеличения чувствительности разработанного сенсора.

Научная новизна. Установлены основные закономерности изменения поверхностного натяжения на границах раздела золото/метанол, золото/вода, кремний/вода в процессах физической адсорбции и хемосорбции белков и низкомолекулярных модификаторов поверхности. Предложена модель, описывающая зависимость поверхностного натяжения от степени заполнения поверхности адсорбатом. Обнаружена агрегация лизоцима, иммобилизованного на поверхности золота, кремния и слюды, происходящая в условиях, при которых агрегация белка в растворе не наблюдается (pH 3,0, комнатная температура). Экспериментально подтверждено, что образование фибрилл лизоцима проходит через две стадии: конфор мационный переход в молекуле белка и собственно агрегация. Измерена константа связывания тромбина с аптамером 5’-HS-T(CH2CH2O)6T5CCAACGGTTGG TGTGGTTGG-3’, иммобилизованным на поверхности золота, Kb = 0,047 нМ-1.

Практическая значимость. В работе показано, что для микромеханических сенсоров с длительным сроком службы иммобилизация комплексообразующего реагента на кремниевой поверхности кантилевера является более предпочтительной, чем иммобилизация на отражающем слое, в то время как для одноразовых сенсоров этот фактор не является определяющим. Для эффективной работы микромеханических сенсоров при создании привитого слоя следует избегать образования полислоев модификатора. В связи с этим при проведении химической сборки рецепторного слоя на кремниевой поверхности кантилевера вместо традиционного 3-аминопропил триэтоксисилана предложено использовать 3-аминопропилсилатран.

В работе показано, что при использовании тромбин-связывающего аптамера в составе чувствительного слоя пьезокварцевого сенсора можно селективно определять содержание тромбина в модельных растворах, имитирующих сыворотку крови.

Продолжительность работы разработанного сенсора существенно больше, чем пьезокварцевых сенсоров на основе антител. Коэффициент чувствительности сенсора может быть существенно увеличен за счет предварительной иммобилизации молекул тромбина, содержащихся в анализируемом растворе, на поверхности наночастиц золота и серебра.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Малом полимерном конгрессе (Москва, 2005), International conference "Nanoscience and technology" (Switzerland, Basel, 2006), 3-ей Всероссийской конференции (с международным участием) "Химия поверхности и нанотехнология" (Санкт Петербург – Хилово, 2006), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), XIV и XV Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2007" (Москва, 2007) и "Ломоносов-2008" (Москва, 2008), Всероссийской конференции "Химический анализ" (Москва – Клязьма, 2008).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 5 статей и 10 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях, также получен патент РФ на изобретение.

Структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (174 источника). Работа изложена на 123 страницах машинописного текста и включает 7 таблиц и 70 рисунков.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность проблемы и сформулированы цели и задачи работы.

Обзор литературы разделен на две основных части, в первой из которых подробно рассмотрены принципы работы и наиболее существенные достижения в области разработки микромеханических устройств. Во второй части приведены основные сведения об аптамерах, их структуре, свойствах, а также об использовании аптамеров в сенсорах различных типов.

Экспериментальная часть содержит раздел, в котором описано использованное в работе сенсорное оборудование: установка для измерения поверхностного натяжения с детектором на основе кантилевера для атомно силовой микроскопии и проточно-инжекционная установка для пьезокварцевого микровзвешивания. В других разделах экспериментальной части приведены методики проведения измерений и приготовления образцов, а также охарактеризованы условия изучения образцов с использованием различных методов исследования: атомно-силовой микроскопии, просвечивающей электронной микроскопии, масс-спектрометрии, спектро скопии в видимой и УФ-области, лазерного светорассеяния.

Установка для измерения поверхностного натяжения Для измерения поверхностного натяже ния в работе использовали микромехани- Au ческое устройство на основе кантилевера, сконструированное на физическом факуль тете Московского Государственного Si Университета им. М.В. Ломоносова.

(Si3N4) Кантилевер представляет собой упругую кремниевую консоль, с одной стороны Рис. 1. Схематическое покрытую тонким слоем золота (рис. 1). изображение кантилевера.

Консоль способна изгибаться под действием сил межмолекулярного взаимо-действия в поверхностном слое.

Величина этого изгиба, то есть радиус кривизны консоли, определяется результирующим поверхностным натяжением (рез) – разностью поверхностного натяжения на верхней (в) и нижней (н) сторонах кантилевера:

рез = в – н Величину изгиба кантилевера измеряли с помощью лазерной детектирующей системы, изображенной на рис. 2.

На зеркальную золотую поверхность консоли под углом направляли луч лазера так, чтобы отраженный луч попал в центр позиционного фотодиода. При изгибе консоли световое пятно, образованное отраженным лучем, смещается, в результате чего возникает различие в интенсивностях фототока, генерируемого верхней и нижней долями фотодиода, при этом разность потенциалов верхней и нижней долей позиционного фотодиода пропорциональна смещению луча в вертикальной плоскости. Сигнал с фотодиода регистрировали с интервалом 20 мс. При проведении экспериментов из измеренной разности потенциалов по калибровочной зависимости определяли смещение конца консоли и рассчитывали результирующее поверхностное натяжение (рез) по формуле Стони: рез = K z, где z – смещение конца консоли, K – коэффициент пропорциональности, зависящий от геометрических размеров консоли и ее упругости. Общая схема установки для измерения поверхностного натяжения приведена на рис. 3.

1 1 – кантилевер, 2 – исходное положение консоли, 3 – изогнутая консоль, 4 – лазер, 5 – позиционный фотодиод, 6 – система обработки сигнала Рис. 2. Принцип действия оптической системы детектирования изгиба кантилевера.

1 а б Рис. 3. Схемы а) установки для измерения поверхностного натяжения и б) измерительной ячейки (1 – кантилевер, закрепленный в тефлоновом держа теле, 2 – тефлоновая измерительная ячейка, 3 –стеклянное окно, 4 – шприц для ввода жидкости, 5 – красный полупроводниковый лазер (650-670 нм), 6 – зеркало, 7 – позиционный фотодиод, 8 – система обработки сигнала).

Наибольшую погрешность в измеряемую величину разности поверхностного натяжения на границе поверхность кантилевера – жидкость вносили фоновые колебания кантилевера, возникающие из-за механических колебаний жидкости и ячейки. Величина погрешности определения поверхностного натяжения с помощью описанной установки составила в среднем 0,5 мН/м.





Основные результаты работы 1. Изучение процессов химического модифицирования поверхности кантилевера Наибольший практический интерес представляет изучение хемосорбции тех модификаторов, которые необходимы для иммобилизации на поверхности рецептора высокоселективных комплексообразующих реагентов, в частности, белков и нуклеиновых кислот. Один из широко распространенных методов ковалентного закрепления белков включает в себя предварительную функционализацию поверхности аминогруппами и последовательную обработку аминированной поверхности растворами глутарового альдегида и белка. В работе были изучены все стадии этого метода, необходимые для иммобилизации белка как на золотой, так и на кремниевой сторонах кантилевера.

Для создания слоя аминогрупп на кремниевой поверхности вначале был использован традиционный модификатор 3-аминопропилтриэтоксисилан, но из-за образования толстого и неоднородного по рельефу полисилоксанового слоя оказалось невозможным проводить корректные измерения поверхностного натяжения. Поэтому в качестве модификатора был использован недавно предложенный реагент 3-аминопропилсилатран, который, как было установлено в процессе выполнения работы, HS NH лишен упомянутых белок белок недостатков. Для созда- NH NH NH 2 2 NH NH ния аминогрупп на кантилевер Поверхность Поверхность золотой поверхности OO кантилевера использо- 1) OHC CHO N Si NH O вали 4-аминотиофенол 2) белок NH (4-АТФ). Общая схема Рис. 4. Схема иммобилизации белков на проведения ковалент поверхности кантилевера.

ного закрепления белков на кантилевере приведена на рис. 4.

Ниже будут подробно рассмотрены основные закономерности изменения результирующего поверхностного натяжения (рез) на каждой стадии иммобилизации. Под результирующим поверхностным натяжением в работе подразумевается разность величин поверхностного натяжения на золотой (Au) и кремниевой (Si) поверхностях кантилевера:

рез = Au Si Таким образом, уменьшение результирующего поверхностного натяжения в процессе протекания реакции соответствует изгибанию консоли в сторону кремниевой поверхности.

1.1. Модифицирование кантилевера 4-аминотиофенолом В процессе протекания реакции 4-АТФ с поверхностью золота в Au HS Au S NH NH течение первого часа результирующее CH3OH, 10-3M, 12 ч Au S NH Au поверхностное натяжение оставалось на постоянном уровне, а затем начало уменьшаться рез, мН/м вплоть до установления постоянного значения - -345±5 мН/м (рис. 5). - Полностью процесс - адсорбции завершается в - течение 8 часов с момента 0 2 4 6 8 10 12 ввода 4-АТФ.

время, ч Вместе с тем, известно, что хемосорбция тиолов на Рис. 5. Зависимость результирующего поверхности золота обычно поверхностного натяжения от времени хорошо аппроксимируется при модифицировании кантилевера 4-АТФ.

кинетической моделью, в которой постулируется, что на поверхности существует фиксированное число эквивалентных адсорбционных центров. Первой стадией хемосорбции и, одновременно, лимитирующей стадией является взаимодействие молекулы адсорбата, например RSH, с вакантным адсорбционным центром:

kадс RSH + A RSH A, где kадс – константа скорости адсорбции, A – адсорбционный центр.

Далее происходит диссоциация сорбированной молекулы тиола с образованием хемосорбированных атомов водорода, которые либо в несколько этапов окисляются кислородом воздуха, либо, в инертной атмосфере, образуют молекулы водорода. Кроме того, возможна и десорбция хемосорбированной молекулы тиола:

k kдес RSH A + A 1 RS A + H A, RSH A RSH + A, где k1 – соответствующая константа скорости реакции, kдес – константа скорости десорбции. Такая модель предсказывает экспоненциальное уменьшение количества вакантных адсорбционных центров с течением времени ( – степень заполнения поверхности, kэфф – эффективная константа скорости, t – время):

k t эфф (t ) = 1 e С описанной моделью согласуются экспериментальные данные, полученные при изучении хемосорбции тиолов с помощью различных физико химических методов. Тем не менее, с ее помощью нельзя описать наблюдаемый в процессе хемосорбции 4-АТФ индукционный период.

Постоянство поверхностного натяжения на начальном этапе хемосорбции алкилтиолов неоднократно упоминалось в работах многих исследователей. Тем не менее, до настоящего времени удовлетворительного объяснения этому явлению не было предложено. По-видимому, причину его возникновения нужно искать в особенностях формирования сил поверхностного натяжения в привитом слое.

1.2. Модель изменения поверхностного натяжения на межфазной границе твердое тело – жидкость в процессе адсорбции Для объяснения наблюдаемого эффекта в работе была предложена модель расчета поверхностного натяжения, основанная на разложении сил поверхностного натяжения, действующих на произвольно выделенный на поверхности контур, на составляющие, отвечающие единичным межмолекулярным латеральным взаимодействиям.

Первым шагом на пути расчета изменения поверхностного натяжения в процессе адсорбции определенного вещества является попытка вычленить вклад этого вещества из суммарной величины поверхностного натяжения и рассматривать его независимо от вкладов других компонентов. Для этого требуется учесть межмолекулярные взаимодействия различных компонентов, присутствующих в приповерхностном слое. В случае адсорбции из раствора необходимо принять во внимание как минимум парные взаимодействия молекул адсорбат-адсорбат, адсорбат-растворитель и растворитель растворитель.

– молекула Рассмотрим адсорбата, упрощенную модель адсорбционного слоя. – молекула Предположим, что все растворителя адсорбционные центры – адсорбционный на поверхности канти- центр левера эквивалентны и Рис. 6. Схематичное изображение адсорбцион равномерно распреде лены по поверхности ного слоя с квадратной решеткой, стрелками сорбента. Тогда каж- обозначены силы поверхностного натяжения (F), адсорбционный действующие на границы выделенного контура.

дый центр может контактировать либо с молекулами адсорбата A, либо с молекулами растворителя S (рис. 6).

Выделим на поверхности кантилевера произвольный прямоугольный контур.

Рис. 7. Формирование сил Тогда, по определению поверхностного поверхностного натяжения в натяжения, на каждую из сторон этого адсорбционном слое.

контура будет действовать сила поверхност ного натяжения, равная F = l, где l – длина соответствующей стороны.

Сила F направлена внутрь контура перпендикулярно его границе. На микро скопическом уровне сила F складывается из латеральных межмолекулярных взаимодействий в адсорбционном слое (рис. 7).

Для удобства рассмотрения примем, что адсорбционные центры на поверхности кантилевера образуют квадратную квазикристаллическую решетку и проведем границу контура между адсорбционными центрами. Тогда по обе стороны от границы будут расположены центры, связанные либо с молекулами адсорбата, либо с молекулами растворителя, причем наиболее сильное взаимодействие будет наблюдаться между молекулами, адсорбированными на смежных центрах адсорбции. Затем выберем один из центров адсорбции. Тогда, сложив силы латерального взаимодействия молекул, связанных с выбранным центром, с молекулами, находящимися по другую сторону границы контура, можно найти результирующую силу, действующую на участке контура, соответствующем выбранному адсорбционному центру (рис. 7, слева). Проведя аналогичную процедуру со всеми оставшимися центрами, примыкающими к границе контура, и просуммировав силы, отвечающие отдельным участкам контура, можно найти макроскопическую силу, действующую на рассматриваемую сторону контура (рис. 7, справа). Поделив абсолютное значение этой силы на длину стороны, можно рассчитать значение поверхностного натяжения на поверхности кантилевера, покрытой адсорбционным слоем. Описанный подход аналогичен методу расчета константы Гамакера, определяющей энергию когезии двух частей одной и той же фазы.

Для расчета поверхностного натяжения в двухкомпонентном адсорбционном слое, в отличие от расчета константы Гамакера, требуются не только сведения о величине силы межмолекулярного взаимодействия, но и сведения о распределении компонентов в адсорбционном слое. Очевидно, например, что в случае островкового распределения молекул адсорбата среди различных латеральных взаимодействий будут преобладать взаимодействия адсорбат-адсорбат и растворитель-растворитель, а число взаимодействий адсорбат-растворитель будет невелико. Напротив, в случае равномерного типа распределения взаимодействия адсорбат-растворитель при средних степенях заполнения поверхности будут преобладающими. Промежуточный случай реализуется при случайном типе распределения молекул в адсорбционном слое.

В работе были последовательно рассмотрены эти три основных типа распределения и показано, что зависимость поверхностного натяжения () от степени заполнения поверхности () определяется расположением молекул адсорбата на поверхности и в общем случае является нелинейной:

= C1 + 0, 1. При островковом распределении:

= C1 2 + C 2 + 0, 2. При случайном распределении:

0,5 = C 2 + 3. При равномерном распределении: 0,5 = C + С 3 где 0 поверхностное натяжение при отсутствии адсорбата, C1, C2, C3, C4 – константы, зависящие от величины сил латерального межмолекулярного взаимодействия.

Следует отметить, что результаты рассмотрения трех основных типов распределения с точностью до числового множителя применимы и для расчета поверхностного натяжения и в адсорбционных слоях с другими типами решеток, в частности, в слое с плотнейшей гексагональной упаковкой молекул адсорбата.

Итак, рассмотрев наиболее часто встречающиеся виды распределения молекул адсорбата можно перейти к первоначально поставленной задаче – описанию экспериментальных данных по изменению поверхностного натяжения с течением времени ((t)) при образовании слоя 4-АТФ. В рамках предложенной модели кривые (t) с индукционным периодом могут возникать как при случайном, так и при равномерном распределении молекул 4-АТФ в приповерхностном слое. Вместе с тем, при адсорбции достаточно гидрофобного 4-аминотиофенола из метанола, по-видимому, не следует ожидать существенного отталкивания между молекулами 4-АТФ, которое могло бы привести к равномерному распределению адсорбата. Таким образом, гипотеза о случайном распределении 4-АТФ на, мН/м поверхности кантилевера представляется более вероят - ной. Экспериментальная кри вая динамики изменения ре- - зультирующего поверхност - ного натяжения при адсорбции 4-АТФ на началь- - ном и среднем этапах хоро- 0 2 4 6 8 10 12 шо описывается уравнением, время, ч предложенным для случай Рис. 8. Аппроксимация зависимости резуль ного распределения молекул, тирующего поверхностного натяжения от включая индукционный период (рис. 8). Небольшие времени при модифицировании кантилевера наблюдаются 4-АТФ в предположении случайного типа отклонения только на финальном этапе распределения молекул в адсорбционном слое сорбции, когда монослой уже (––– экспериментальные данные, - - - - аппроксимация).

практически сформировался.

1.3. Модифицирование кантилевера 3-аминопропилсилатраном Для изучения применимости 3-аминопропилсилатрана (3-АПС) для модифицирования кремниевой поверхности свежеочищенный кантилевер был обработан водным раствором 3-АПС (167 мкМ), при этом результирующее поверхностное натяжение вначале уменьшалось, а через 20 минут после начала модифицирования стало увеличиваться (рис. 9а).

Такое изменение поверхностного натяжения с течением времени можно объяснить протеканием реакции 3-аминопропилсилатрана с силанольными группами в две стадии:

OO N N Si NH OH OH OH O O Si O OH SiO Si O Si SiO 167 мкМ, H2O (CH2)3NH OH O N(CH2CH2OH) Si O Si SiO2 (CH2)3NH Поскольку Si-ОН группы проявляют кислотные свойства, то можно ожидать, что первая стадия процесса (собственно иммобилизация 3-АПС) будет протекать быстрее, чем гидролиз оставшихся связей Si-O-C с отщеплением триэтаноламина, что рез, мН/м и наблюдалось на б опыте (рис. 9а).

Для доказатель- ства того, что увели- ввод воды 0 а чение результирую- в ячейку - щего поверхностного - натяжения связано со второй стадией 0 25 50 75 100 125 процесса, для проте время, мин кания которой не требуется Рис. 9. Зависимость результирующего поверхност присутствия молекул ного натяжения от времени а) при модифицировании 3-АПС в растворе, кремниевой поверхности кантилевера 3-аминопропил через 85 минут после триэтоксисиланом (тонкая линия) и б) после начала модифициро- промывки водой ячейки с кантилевером (жирная вания ячейка с канти- линия).

левером была промы та водой. После этого результирующее поверхностное натяжение продолжало расти в течение 30 минут, а затем перестало изменяться (рис. 9б). Таким образом, зафиксированный рост поверхностного натяжения действительно связан с протеканием реакции гидролиза молекул 3-АПС, уже находящихся на поверхности.

Следует отметить, что ранее кинетические параметры взаимодействия 3-АПС с поверхностными силанольными группами не были известны, и предположение о существенном различии скоростей двух этапов реакции не было подтверждено экспериментально.

В работе было сделано предположение о том, что используя существенное различие скоростей хемосорбции 3-АПС и его дальнейшего гидролиза можно предотвратить образование полисилоксановых структур на поверхности. Для этого нужно остановить процесс модифицирования поверхности в то время, когда силанольные группы уже прореагировали с 3-АПС, а выделение триэтаноламина в результате взаимодействия привитых молекул с водой или с частично гидролизованными молекулами 3-АПС еще только начинается. И действительно, при изучении поверхности свежесколотой слюды, обработанной водным раствором 3-АПС (167 мкМ) в течение 30 мин, с помощью атомно силовой микроскопии, оказалось, что полученный таким способом привитый слой 3-АПС является достаточно ровным, средний размер неровностей рельефа не превышал 1 нм.

1.4. Модифицирование аминированной поверхности Для иммобилизации белка на кантилеверах, несущих слой аминогрупп либо на золотой, либо на кремниевой поверхности, их обрабатывали 5%-ным водным раствором глутарового альдегида OHC(CH2)3CHO, раствором белка (0,1 мг/мл конъюгата морфина с овальбумином в фосфатном буферном растворе с pH 7,0 или 10 мг/мл лизоцима в ацетатном буферном растворе с pH 4,5) и 50 мМ раствором трис-гидроксиметиламинометана для блокировки непрореагировавших аминогрупп. Во всех случаях модифицирование проводили до прекращения изменения результирующего поверхностного натяжения, что свидетельствовало об окончании процесса. Полноту протекания модифицирования контролировали с помощью атомно-силовой микроскопии.

Основной проблемой при изучении взаимодействия реагентов с поверхностью кантилевера было параллельное протекание хемосорбции на золотой и кремниевой поверхностях кантилевера. Тем не менее, в ряде случае удалось восстановить вид зависимости поверхностного натяжения от времени на конкретной стороне кантилевера (рис. 10). Сводные данные об изменении поверхностного натяжения при протекании различных процессов приведены в таблице 1.

100 сорбция глутарового альдегида на рез, мН/м г а) кантилевере, модифицирован ном 4-АТФ (1);

а б) кантилевере, модифицирован ном 3-АПС (2);

0 в) немодифицированном кантиле вере (3);

г) восстановленная зависимость б - поверхностного натяжения на в золотой поверхности от времени -100 при сорбции глутарового альдеги 0 10 20 30 40 50 60 да на кантилевере, модифициро ванном 4-АТФ (4), 4 = 1 – 3.

время, мин Рис. 10. Зависимости результирующего поверхностного натяжения (рез) от времени.

Таблица 1. Характеристические параметры взаимодействия модифи каторов с поверхностью кантилевера;

р,max – максимальное изменение результирующего поверхностного натяжения в процессе взаимодействия;

ГА – глутаровый альдегид, 3-АПС – 3-аминопропилсилатран, 4-АТФ – 4-амино тиофенол, ЗП – золотая поверхность, КП – кремниевая поверхность р,max, Процесс мН/м Сорбция 4-АТФ -345± Сорбция 3-АПС 145± Сорбция ГА на немодифицированном кантилевере -80± Сорбция ГА на кантилевере, модифицированном 3-АПС -80± Сорбция ГА на кантилевере, модифицированном 4-АТФ 21± Сорбция ГА на золотой поверхности, модифицированной 100± 4-АТФ, восстановленная зависимость Сорбция конъюгата морфина с овальбумином на кантилевере с 9± модифицированной ЗП Сорбция лизоцима на кантилевере с модифицированной ЗП 24± Сорбция лизоцима на кантилевере с модифицированной КП -80± 1.5. Агрегация лизоцима на поверхности кантилевера В предыдущем разделе было показано, что микромеханические устройства могут быть успешно применены для изучения кинетики сорбции различных веществ на границе раздела твердое тело – жидкость. Получаемые при этом экспериментальные данные дополняют известные сведения о кинетике адсорбции, полученные с помощью традиционных методов, например, весового. Следует отметить, что существенным ограничением весового метода в исследовании процессов, протекающих на поверхности, является невозможность изучения процессов, протекающих без изменения массы сорбента, то есть протекающих только с участием молекул, находящихся в приповерхностном слое. Напротив, при изучении процессов на границе раздела твердое тело – жидкость с помощью микромеханических устройств такое ограничение должно отсутствовать. Вместе с тем, остаются пока открытыми вопросы о том, насколько существенно влияние процессов, протекающих внутри приповерхностного слоя, на поверхностное натяжение и достаточно ли чувствительности микромеханических измерителей поверхностного натяжения для получения достоверной информации о таких процессах. Для получения предварительных ответов на эти вопросы требуется исследование подходящих модельных реакций. В работе в качестве такого модельного процесса была выбрана агрегация белка лизоцима, протекающая при повышенной температуре и в слабокислой среде с образованием характерных фибрилл, которые носят название амилоидных.

Aгрегация лизоцима изучалась в нескольких исследовательских группах.

Было показано, что в растворе лизоцим начинает агрегировать при pH 3,8 и температуре t 57oC. В то же время, in vivo фибриллы образуются не в растворе, а на поверхности клеток, причем в более мягких условиях.

В связи с этим представляет интерес изучение конформационных переходов в молекулах белка, находящихся вблизи поверхности твердого тела.

В работе исследовалась агрегация лизоцима, иммобилизованного на золотой и на кремниевой поверхностях кантилевера через 4-аминотиофенол и 3-аминопропилсилатран соответственно.

Кантилевер с иммобилизованным на золотой поверхности лизоцимом был помещен в ацетатный буфер рез, мН/м ный раствор с pH 4,5, при а этом в течение 8 часов поверхностное натяжение не изменялось. Затем ячейку с - кантилевером заполнили б - глициновым буферным - раствором (pH 3,0), при этом уже при комнатной температуре результирующее время, ч поверхностное натяжение начало изменяться: сначала Рис. 11. Изменение результирующего уменьшалось, а затем, пройдя поверхностного натяжения в процессе через минимум, начало агрегации лизоцима, иммобилизованного на увеличиваться (рис. 11а). а) золотой и б) кремниевой поверхностях Процесс реструктуризации кантилевера.

привитого слоя продолжался в течение нескольких часов. Постоянство рез при pH 4,5 и деформирование консоли при pH 3,0 согласуются с литературными данными о том, что конформационный переход из нативного состояния в состояние с неправильной укладкой происходит только при понижении кислотности среды до pH 3,8.

Для получения дополнительной информации о состоянии привитого слоя был исследован рельеф модельных образцов позолоченной слюды с иммобилизованным на поверхности лизоцимом. На образцах, находившихся в буферном растворе с pH 3,0 в течение 4,5 и 12 ч, были обнаружены фибриллы длиной до 10 мкм и высотой 2-10 нм с поверхностной плотностью 0,1 и 1 шт./мкм2 соответственно. В связи с этим, увеличение результирующего поверхностного натяжения на второй стадии процесса, соответствующее изгибанию консоли в сторону золотой поверхности, может быть объяснено возникновением значительных "стягивающих" напряжений в привитом слое в результате агрегации молекул лизоцима. На первой стадии процесса, напротив, в привитом слое преобладают силы отталкивания. Они, по-видимому, возникают вследствие того, что площадь, занимаемая на поверхности молекулами лизоцима, находящимися в конформации с неправильной укладкой, в которой вместо компактных -спиралей присутствуют -листы, больше площади, занимаемой нативными молекулами белка.

Полностью аналогичные исследования были проведены и в отношении лизоцима, иммобилизованного на кремниевой поверхности кантилевера. При этом, как и следовало ожидать исходя из результатов, полученных при изучении реакций химического модифицирования кантилевера (раздел 1.4), ход зависимости результирующего поверхностного натяжения был полностью противоположным (рис. 11б), при этом кинетические характеристики обеих стадий процесса фибриллообразования оказались достаточно близкими. Тем не менее, можно отметить, что процесс агрегации лизоцима, закрепленного на кремниевой поверхности кантилевера, проходит немного медленнее. Этот факт согласуется с результатами, полученными при исследовании поверхности модельных образцов слюды с иммобилизованным лизоцимом: поверхностная плотность фибрилл 0,1 шт./мкм2 достигается только по истечении 9 ч.

Таким образом, лизоцим, иммобилизованный как на золотой, так и на кремниевой поверхностях, агрегирует при комнатной температуре при pH 3,0, причем процесс агрегации сопровождается увеличением сил межмолекулярного притяжения в слое белка. Вместе с тем, в ряде работ отмечается, что ковалентное закрепление молекул белка на поверхности предотвращает их агрегацию. Это утверждение может быть справедливо для поверхности с расстоянием между соседними белковыми молекулами 10-30 нм (плотность прививки 0,001-0,01 молекул на нм2), которая получается при обработке слюды 3-аминопропилтриэтоксисиланом из газовой фазы. При иммобилизации лизоцима на кантилевере через глутаровый альдегид по описанным выше методикам плотность прививки белка, определенная с помощью атомно-силовой микроскопии, гораздо выше и составляет 0,04-0,1 мол./нм2. При таком плотном расположении молекул ковалентное закрепление лизоцима на поверхности золота не препятствует его агрегации, а, напротив, на поверхности кантилевера этот процесс протекает быстрее и в более мягких условиях (~12 часов при комнатной температуре), чем в растворе, где процесс образования фибрилл возможен только при повышенной температуре (57°С) и его длительность составляет несколько суток.

Возможной причиной агрегации иммобилизованного лизоцима может быть переход белка при иммобилизации на поверхности из нативной конформации в состояние с неправильной укладкой. Это состояние, при комнатной температуре неустойчивое в растворе, может стабилизироваться вблизи поверхности.

2. Сенсоры на основе микромеханических устройств 2.1. Микромеханический сенсор для определения морфина и обнаружения антител к морфину На основе кантилевера с иммобилизованным на золотой поверхности конъюгатом морфина с овальбумином (условия иммобилизации описаны в разделе 1.4) в работе была показана принципиальная возможность реализации иммунохимического микромеханического сенсора для обнаружения поликлональных антител к опиатам в сыворотке крови человека, которое необходимо осуществлять для ранней диагностики наркомании, и для определения концентрации морфина.

Для изучения сенсорных характеристик модифицированного кантилевера в работе использовалась антителосодержащая сыворотка крови двух видов:

полученная при иммунизации кроликов конъюгатом овальбумина с морфином и сыворотка крови человека, больного опиатной наркоманией.

При обработке кантилевера, модифицированного конъюгатом морфина с овальбумином, антителосодержащими сыворотками крови человека и кролика, в обоих случаях наблюдалось увеличение результирующего поверхностного натяжения (табл. 2). Таким образом, кантилевер с иммобилизованным на поверхности конъюгатом морфина с овальбумином, по-видимому, может быть использован в качестве сенсора для обнаружения поликлональных антител к морфину.

Далее изучалась возможность использования модифицированного кантилевера для определения морфина: после завершения адсорбции антител из сыворотки крови и отмывки несвязавшихся антител кантилевер был инкубирован в растворах морфина с различной концентрацией.

При этом было уста новлено, что в растворах с Таблица 2. Десорбция антител с концентрацией морфина более поверхности модифицированного кантилевера 50 мкг/мл происходит полная под действием растворов морфина с различ десорбция антител с по- ной концентрацией;

рез, max – максималь верхности, сопровождающая- ное изменение результирующего поверхност ся уменьшением результи- ного натяжения в процессе взаимодействия, рующего поверхностного c – концентрация морфина, tдес – время модулю морф натяжения, по равным наблюдавшемуся при завершения десорбции антител рез,max, адсорбции антител. Поэтому в cморф, мкг/мл tдес, мин.

мН/м дальнейшем для регенерации Антитела кролика, поверхности кантилевер обра- -120± разведение 1: батывали последовательно 3 – – раствором морфина с 10 80 5,0±0, концентрацией 100 мкг/мл и фосфатным буферным раство- 50 50 110± ром. Сводные данные по Антитела человека, -80± десорбции антител с разведения 1:50 и 1: поверхности кантилевера под 3 70 13± действием растворов морфина 10 60 30± приведены в таблице 2. 50 20 50± Из табл. 2 видно, что антитела человека и кролика десорбировались с поверхности при добавлении растворов морфина. Об этом свидетельствует изгибание кантилевера в противоположную сторону по сравнению с наблюдавшимся при адсорбции антител. Увеличение концентрации морфина в растворе ведет к увеличению аналитического сигнала сенсора (по модулю).

Таким образом, установлено, что отклик сенсора зависит от концентрации морфина в растворе. Это позволяет заключить, что модифицированный кантилевер может использоваться в качестве иммуносенсора для определения морфина. Эксперименты проводились на протяжении 3-4 недель, за это время кантилевер с иммобилизованным морфином не потерял способности к воспроизводимой сорбции и десорбции антител.

Для изучения влияния процессов химического модифицирования на морфологию отражающего слоя с помощью растрового электронного микроскопа были получены изображения поверхности кантилевера после проведения нескольких циклов определения морфина и антител к морфину. На изображении верхней (позолоченной) части модифицированного кантилевера отчетливо видна область, отличная по рельефу от основной поверхности (рис. 12). Микроструктура Рис. 12. Микрофотографии этого участка состоит из выпуклостей с мкм. модифицированного кантиле диаметром основания 0,3-0, Появление неровностей рельефа вызвано, вера, вид сверху, увеличение в по-видимому, воздействием лазерного луча 500 раз, квадратом выделена на отражающую поверхность. Поскольку область падения лазерного при иммобилизации реагентов на золотой луча.

поверхности отражающий слой кантилевера является чувствительным элементом сенсора, химическая и морфологическая неоднородность этой поверхности может приводить к искажению результатов анализа и снижению чувствительности. Избежать этого можно, проводя иммобилизацию реагентов на нижней стороне кантилевера, например, с помощью предложенной в работе методике – через 3-аминопропилсилатран.

2.2. Микромеханический сенсор для определения тромбина Для выявления возможности использования аптамеров в составе рецепторного слоя сенсоров в работе была предпринята попытка реализовать микромеханический сенсор с рецепторным слоем на основе аптамеров, а именно, сенсор для определения тромбина (одного из ключевых ферментов системы свертывания крови).

При изучении сорбции тромбина на поверхности кантилевера с иммобилизованным аптамером 5’-HS-T(CH2CH2O)6TTTTTCCAACGGTTGGT GTGGTTGG-3’ было обнаружено, что зависимость результирующего поверхностного натяжения от времени также имеет индукционный период, в связи с чем экспресс-определение тромбина с помощью такого микромеханического сенсора произвести невозможно. Как и в случае с хемосорбцией 4-аминотиофенола, сорбция тромбина хорошо описывается в рамках предложенной в работе модели за исключением финального этапа.

3. Пьезокварцевый проточно-инжекционный сенсор для определения тромбина Поскольку микромеханический сенсор на основе аптамеров оказался непригоден для практического применения, для выявления особенностей использования аптамеров в сенсорах в работе был реализован пьезокварцевый сенсор для определения тромбина. Пьезокварцевые сенсоры относятся к классу масс-чувствительных. Их применение основано на линейной зависимости частоты собственных колебаний тонкого диска от его массы. Частоту собственных колебаний кварцевого диска можно легко измерить с помощью явления пьезоэффекта. Для этого на противоположные стороны кристалла напыляют металлические электроды, к которым подключают соответствующую аппаратуру: генератор колебаний и частотомер.

Исследования взаимодействия тромбина с рецепторным слоем, состоящим из молекул аптамера, проводились в проточно-инжекционном режиме с помощью установки (рис. 13), включающей измерительную ячейку объемом 100 мкл, в которую был помещен пьезокварцевый кристалл (с золотыми электродами) с начальной собственной частотой колебаний 10МГц таким образом, что с поверхностью жидкости контактировала только одна сторона кристалла.

2 1 – насос, 2 – инжектор, 3 – измерительная ячейка с f(t) пьезокварцевым кристаллом, 4 – генератор колебаний и частотомер, 5 – система обработки сигнала Рис. 13. Схема проточно-инжекционной установки для пьезокварцевого микровзвешивания.

На поверхности электрода, предварительно очищенного в горячей азотной кислоте, был хемосорбирован тромбин-связывающий аптамер (5’)HS-T(CH2CH2O)6TTTTTCCAACGGTTGGTGTGGTTGG(3’), имеющий на 5'-конце SH-группу (10 мМ, дист. вода, 2 ч). Далее через проточную ячейку, в которую был помещен кристалл, пропускали поток буферного раствора (10 мМ HEPES-NaOH, 40 мМ NaCl, 10 мМ NaN3, pH 7,4, HEPES – N-гидрокси этилпиперазин-N’-2-этансульфоновая кислота) со скоростью 100 мкл/мин, в который через инжектор вводили растворы тромбина различной концентрации (10-500 нМ) порциями по 1 мл.

На графиках зависимости изменения частоты колебаний кристалла (f) от времени, прошедшего после ввода тромбина в инжектор, присутствуют пики (рис. 14), которые соответствуют адсорбции тромбина на поверхности сенсора.

Из рис. 14 видно, что f, Гц ввод раствора частота колебаний тромбина кристалла после выхода -1 концентрация зоны тромбина из ячейки тромбина в растворе начинает плавно прибли- - 500 нМ жаться к исходному 100 нМ - значению. Это свиде- 250 нМ тельствует о том, что -4 50 нМ вслед за адсорбцией тром- 0 5 10 15 бина проходит его час- время, мин тичная десорбция с поверхности электрода Рис. 14. Графики зависимостей изменения пьезокварцевого резонато- частоты колебаний пьезокварцевого кристалла ра. Исходя из этого, было от времени при адсорбции растворов тромбина сделано предположение о различных концентраций, f – изменение часто том, что для регенерации ты колебаний кристалла.

поверхности сенсора может быть достаточно промывания ячейки рабочим буферным раствором. Для проверки этой гипотезы через разные промежутки времени после проведения первого адсорбционного измерения в ячейку повторно вводили пробу тромбина до тех пор, пока величина изменения частоты колебаний кристалла не сравнивалась с соответствующей величиной для первого адсорбционного измерения. В результате было установлено, что для полной десорбции тромбина с поверхности сенсора требуется промывка буферным раствором на основе HEPES в течение 2 часов. Такая длительная регенерация совершенно недопустима для экспрессных методов анализа. В связи с этим, регенерацию сенсора проводили пропусканием через ячейку глицинового буферного раствора (10 мM глицин- 3. NaOH, pH 8,7), в котором -f, Гц 3. комплексы аптамер-тромбин 2. разрушаются.

2. Было показано, что изме нение частоты кристалла (f) 1. в диапазоне концентраций 1. тромбина от 25 до 500 нМ 0. можно с хорошей точностью 0. описать линейной функцией (рис. 15). При этом добавле- 0 100 200 300 400 ние вплоть до 40-кратного концентрация тромбина, нМ количества сывороточного Рис. 15. Концентрационная зависимость альбумина в изучаемые изменения частоты колебаний пьезо растворы тромбина не приво кварцевого кристалла с иммобилизованным дит к изменению отклика сен на поверхности аптамером при адсорбции сора. Время работы сенсора тромбина, f – изменение частоты без замены кристалла соста колебаний кристалла.

вило около двух месяцев.

Это намного дольше, чем время работы аналогичных сенсоров на основе антител и является существенным достоинством сенсора на основе аптамера.

Погрешность определения тромбина с помощью предложенного сенсора не превышает 10%.

0, При линеаризации получен f/c, Гц/нМ ных экспериментальных данных в 0, координатах, аналогичных коор динатам Скэтчарда (f/c – f), 0, была оценена величина константы связывания аптамера с тром бином – Kb = 0,047 нМ-1. Оказалось, 0 1 2 3 что на поверхности сенсора на f, Гц блюдается также и неспецифичес кая сорбция тромбина (рис. 16). Рис. 16. Определение константы Тем не менее, чувствитель- связывания комплекса «аптамер-тром бин» в координатах f/c – f, аналогич ности разработанного сенсора может быть недостаточно, так как ных координатам Скэтчарда, c – кон центрация тромбина, f – изменение для решения некоторых задач медицинской диагностики необхо- частоты колебаний кристалла.

димо определять тромбин в концентрациях 1 нМ и ниже. В связи с этим возникает задача уменьшения предела обнаружения сенсора.

Одним из широко распространенных приемов увеличения чувствительности сенсоров на основе пьезокварцевых резонаторов с прямым способом детектирования является комбинация "утяжеления" молекул определяемого вещества с использованием конкурентного способа детектирования. Наилучшим образом для этого подходят наночастицы благородных металлов: золота и серебра.

В работе были получены конъюгаты тромбина с наночастицами золота и серебра различных размеров и, следовательно, массы. Сначала были синтезированы наночастицы (НЧ) серебра и золота, стабилизированные олигосахаридом хитозаном, и НЧ серебра, стабилизированные меркапто янтарной кислотой. Синтез наночастиц осуществляли в водной среде путем восстановления раствора нитрата серебра AgNO3 или золотохлороводородной кислоты HAuCl4 боргидридом натрия NaBH4 в присутствии стабилизатора.

Конъюгат тромбина с НЧ серебра, стабилизированными меркаптоянтарной кислотой, был получен с помощью стандартного карбодиимидного метода, включающего активацию карбоксильных групп поверхности при взаимодействии НЧ с растворимым производным карбодиимида и последующую реакцию активированных карбоксильных групп с аминогруппами тромбина. По данным электронной микроскопии распределение частиц по размерам после иммобилизации тромбина на поверхности НЧ существенно не изменилось. Полноту протекания реакции ( 95%) контролировали путем спектрофотометрического определения концентрации непрореагировавшего тромбина по методу Брэдфорд после отделения наночастиц центрифугированием (при проведении контрольных опытов было подтверждено, что тромбин при этом остается в растворе).

На наночастицах золота и серебра, стабилизированных хитозаном, тромбин был иммобилизован за счет нековалентных взаимодействий, тем не менее, тромбин прочно удерживался на поверхности таких НЧ. По данным электронной микроскопии изменения распределения частиц серебра и золота, стабилизированных хитозаном, по размерам после иммобилизации тромбина также не наблюдалось. Полнота протекания адсорбции тромбина на поверхности НЧ, стабилизированных хитозаном, определенная по методу Брэдфорд после отделения НЧ, также составила не менее 96-98%.

Характеристики полученных конъюгатов тромбина с наночастицами приведены в табл. 3.

Изучение адсорбции конъюгатов тромбина с наночастицами серебра и золота проводили по той же методике, что и изучение адсорбции тромбина. Так же, как и при адсорбции тромбина, на графике зависимости частоты колебаний кристалла от времени, прошедшего после ввода раствора конъюгата тромбина с НЧ в инжектор, присутствует пик, соответствующий адсорбции и последующей десорбции конъюгатов.

Вместе с тем, максимальная величина изменения частоты колебаний кристалла (глубина пика) при адсорбции конъюгатов тромбина с наночастицами существенно больше, чем при адсорбции тромбина из раствора с той же концентрацией (табл. 3). При этом адсорбция наночастиц, не несущих на поверхности тромбин, минимальна – величина изменения частоты колебаний не превышает 15-30% от изменения частоты при адсорбции конъюгатов тромбина с соответствующими наночастицами.

Поскольку концентрации растворов наночастиц в проведенных адсорбционных экспериментах были различны, то для корректного сравнения полученных результатов необходимо использовать коэффициенты отклика сенсора (КО) – значения величины отклика сенсора (f), приведенные к одной и той же концентрации f/cНЧ, Гц/нМ наночастиц (cНЧ) или тромбина:

f КО = cНЧ 0,1 Тромбин Коэффициенты отклика сен 0, сора увеличиваются симбатно с уве 0 20 40 личением размера частиц (рис. 17), D, нм при этом для всех наночастиц значение КО больше, чем Рис. 17. Влияние размера конъюгатов соответствующее значение для тромбина с наночастицами золота и тромбина (КО = 0,01-0,03 Гц/нМ).

серебра на отклик сенсора для Отклик сенсора при адсорбции определения тромбина (D – средний тромбина, связанного с наночасти диаметр конъюгатов, f/cНЧ – коэффи цами, в расчете на единицу концен циент отклика сенсора, КО).

трации на 2-3 порядка выше, чем при адсорбции свободного тромбина, таким образом, полученные наночастицы могут быть использованы для увеличения чувствительности сенсора.

Таблица 3. Адсорбция наночастиц золота и серебра и конъюгатов тромбина с наночастицами на поверхности сенсора* Наличие Средний Отклик Материал Стабилизатор cНЧ, КО, тромбина на диаметр час- сенсора наночастиц наночастиц нМ Гц/нМ поверхности тиц (D), нм (f), Гц Серебро МЯК есть 2-3 50 3,8 0, Серебро МЯК нет 2-3 50 1,1 0, Серебро хитозан есть 15 0,6 7,2 Серебро хитозан нет 15 0,6 1,4 2, Золото хитозан есть 55 0,03 15,4 Золото хитозан нет 55 0,03 1,6 * Случайная ошибка измерений отклика сенсора 10%. МЯК – меркапто янтарная кислота;

КО – коэффициент отклика сенсора, отношение отклика сенсора к концентрации определяемого вещества в исследуемом растворе;

cНЧ – концентрация наночастиц в пересчете на НЧ среднего диаметра.

Выводы 1. Установлены закономерности изменения поверхностного натяжения на границах раздела золото/метанол, золото/вода, кремний/вода в процессах физической адсорбции и хемосорбции некоторых белков и низкомолекулярных модификаторов поверхности, определены характерные времена протекания этих процессов. Предложена модель, описывающая зависимость поверхностного натяжения от степени заполнения поверхности адсорбатом при различных способах распределения молекул в приповерхностном слое.

2. Показано, что хемосорбция 3-аминопропилсилатрана на окисленной кремниевой поверхности протекает последовательно в две стадии: быстрое взаимодействие 3-аминопропилсилатрана с поверхностными силанольными группами и последующий медленный гидролиз с выделением триэтаноламина.

Основываясь на различии скоростей стадий была предложена методика модифицирования поверхности кремния 3-аминопропилсилатраном, позволяющая избежать образования полисилоксановых слоев.

3. Обнаружена агрегация лизоцима, иммобилизованного на поверхности золота, кремния и слюды, происходящая в условиях, при которых агрегация белка в растворе не наблюдается – pH 3,0, комнатная температура. Показано, что при высокой плотности прививки ковалентное закрепление молекул лизоцима не препятствует агрегации. Агрегация иммобилизованного лизоцима протекает в две стадии: конформационный переход в молекуле белка и собственно образование агрегатов.

4. Показана возможность создания микромеханических иммуносенсоров для обнаружения антител к морфину в сыворотке крови. Разработан сенсор для определения концентрации морфина в водных растворах в диапазоне концентраций 3-50 мкг/мл.

5. Показано, что в точке падения лазерного луча в процессе модифицирования возможно протекание побочных реакций, приводящих к образованию полимолекулярных слоев на поверхности кантилевера.

6. Определена константа связывания тромбина с иммобилизованным тромбин-связывающим аптамером 5’-HS-T(CH2CH2O)6T5CCAACGGTTGGTGT GGTTGG-3’, Kb = 0,047 нМ-1.

7. Разработан сенсор для проточно-инжекционного определения тромбина в модельных растворах в диапазоне концентраций 10-500 нМ с относительной погрешностью, не превышающей 10%. Установлено, что продолжительность стабильной работы сенсора составляет 60 суток (200 измерений). Показано, что присутствие 40-кратного избытка сывороточного альбумина не мешает определению тромбина.

8. Установлено, что тромбин может быть иммобилизован на наночастицах серебра, стабилизированных меркаптоянтарной кислотой, а также на наночастицах серебра и золота, стабилизированных хитозаном. Полученные конъюгаты обладают способностью к связыванию с аптамером и могут быть использованы для увеличения чувствительности сенсора для определения тромбина.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселёв, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В.

Яминский. Формирование фибрилл лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых они не образуются в растворе. // Высокомолекулярные соединения. Серия Б. 2007. Т. 49. № 1. С. 125-129.

2. Г.В. Лисичкин, А.А. Кудринский. Привитые поверхностные соединения в химических и биосенсорах. // ЖОХ. 2007. Т. 77. № 3. С. 355-366.

3. А.Ю. Оленин, Ю.А. Крутяков, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин.

Формирование поверхностного слоя наночастиц серебра в водных и водно органических средах. // Коллоидный журнал. 2008. Т. 70. № 1. С. 78-84.

4. Ю.А. Крутяков, А.А. Кудринский, А.Ю. Оленин, Г.В. Лисичкин. Синтез и свойства наночастиц серебра: достижения и перспективы. // Успехи химии.

2008. Т. 77. № 3. С. 242-269.

5. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселёв, Д.В. Багров, П.В. Горелкин, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский. Атомные весы: новые возможности исследования взаимодействия молекул. // Датчики и системы.

2007. № 1. С. 18-21.

6. Г.А. Киселёв, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский, М.А.

Мягкова, Г.К. Вертелов. Устройство и способ для качественного и количественного определения химических соединений и биологических объектов. Патент РФ № 2327140.

7. Г.А. Киселёв, П.В. Горелкин, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В.

Яминский. Универсальный сенсор на основе атомно-силового микроскопа.

// Материалы Малого Полимерного Конгресса, Москва, Россия, 29 ноября – – 1 декабря 2005. С. 94.

8. G. Kiselev, A. Kudrinskii, E. Ukraintsev, I. Yaminsky, G. Lisichkin. Atomic balance observation of protein aggregation on a cantilever surface. // Proc.

International conf. on nanoscience and technology. Basel, Switzerland, July 30 – – August 4, 2006. P. 209-210.

9. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселёв, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В.

Яминский. Изучение агрегации лизоцима, иммобилизованного на поверхности золота и слюды, с помощью кантилевера для атомно-силовой микроскопии.

// Материалы 3-ей Всероссийской конференции (с международным участием) "Химия поверхности и нанотехнология", Санкт-Петербург – Хилово, Россия, 24 сентября – 1 октября 2006. С. 189-190.

10. А.А. Кудринский, Г.А. Киселёв, Г.К. Вертелов, М.А. Мягкова, И.В.

Яминский, Г.В. Лисичкин. Разработка микромеханического сенсора для определения морфина. // Материалы 3-ей Всероссийской конференции (с международным участием) "Химия поверхности и нанотехнология", Санкт Петербург – Хилово, Россия, 24 сентября – 1 октября 2006. С. 260.

11. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселёв, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В.

Яминский. Агрегация лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых лизоцим не агрегирует в растворе. // Материалы XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2007", секция "Химия", Москва, 11-14 апреля 2007. С. 410.

12. А.А. Кудринский, Г.А. Киселёв, Г.К. Вертелов, М.А. Мягкова, И.В.

Яминский, Г.В. Лисичкин. Микромеханический сенсор для определения морфина. // Материалы XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2007", секция "Химия", Москва, 11-14 апреля 2007. С. 411.

13. А.А. Кудринский, Г.А. Киселёв, Г.К. Вертелов, М.А. Мягкова, И.В.

Яминский, Г.В. Лисичкин. Определение морфина с помощью микромеханического сенсора. // Материалы XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, Москва, 23-28 сентября 2007. Т. 4. С. 170.

14. А.А. Кудринский, Ю.А. Крутяков. Модель изгиба кантилевера в процессах адсорбции. // Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2008", секция "Химия", Москва, 8-11 апреля 2008. С. 629.

15. А.В. Яковлев, А.А. Кудринский. Иммобилизованные аптамеры – новые модификаторы поверхности в биосенсорике. // Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2008", секция "Химия", Москва, 8-11 апреля 2008. С. 630.

16. А.В. Яковлев, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин. Проточно инжекционное определение тромбина с помощью пьезокварцевого микровзвешивания. // Материалы Всероссийской конференции "Химический анализ", Москва – Клязьма, 21-25 апреля 2008. С. 101.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.