авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Сорбционное выделение и концентрирование метилксантинов и их определение различными методами

На правах рукописи

АНДРЕЕВА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

СОРБЦИОННОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ

МЕТИЛКСАНТИНОВ И ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМИ

02.00.02 – Аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва – 2011

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Дмитриенко Станислава Григорьевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор кафедры химии, геохимии и космохимии Международного университета природы, общества и человека «Дубна»

Басова Елена Михайловна доктор фармацевтических наук, доцент, заместитель руководителя по учебной работе Обнинского института атомной энергетики Национального исследовательского ядерного университета МИФИ Эпштейн Наталья Борисовна

Ведущая организация: Липецкий государственный технический университет

Защита состоится 26 октября 2011 года в 15 ч. 00 мин. в аудитории 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу:

119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 15 сентября 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук И.И. Торочешникова ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы. Метилксантины, важнейшими представителями которых являются кофеин, теофиллин и теобромин, широко распространены в природе и играют важную роль в биологических процессах. Интерес, проявляемый в последние пятнадцать лет к разработке методов определения метилксантинов в различных объектах, объясняется важностью этих соединений для пищевой промышленности, фармакологии, клинической и спортивной медицины, токсикологии, экологического контроля. Кофеин, теофиллин и теобромин часто определяют в продуктах питания, таких как кофе, чай, шоколад, различных тонизирующих напитках. Анализ биологических жидкостей на содержание метилксантинов проводят с целью оценки эффективности терапевтического лечения этими препаратами, поскольку диапазон между лечебной и токсической концентраций для них достаточно узок. Например, теофиллин оказывает лечебный эффект при содержании его в сыворотке крови 10 – 20 мкг/мл, а уже при его концентрации свыше 20 мкг/мл начинает оказывать токсическое действие. Международный олимпийский комитет считает, что спортсмен употребляет стимулятор, если концентрация кофеина в моче составляет более 12 мкг/мл, а его основного метаболита теофиллина – 5 мкг/мл.

Информация о концентрациях метаболитов кофеина и других метилксантинов в организме человека – важное звено в построении метаболомических профилей, позволяющих обнаружить врожденные и наследственные нарушения метаболизма и более точно диагностировать диабет, патологии печени и ряд других заболеваний. Очень важно определять низкие количества кофеина и в водах, поскольку он является своеобразным индикатором, позволяющим следить за качеством коммунально-бытовых сточных вод.

Достоверность идентификации метилксантинов и правильность полученных количественных результатов во многом зависят от выбора метода пробоподготовки и рационального сочетания его с методом последующего определения. Сложная проблема, с которой часто сталкиваются в процессе пробоподготовки объектов, содержащих метилксантины, связана с высокой гидрофильностью этих соединений (lgP = –1.1 0.3), вследствие которой эффективность концентрирования оказывается невысокой. Среди различных методов, предложенных в последнее время для выделения и концентрирования метилксантинов, наиболее перспективным является твердофазная экстракция (ТФЭ), однако большинство опубликованных работ ориентировано на решение чисто прикладных задач, а круг используемых сорбентов невелик и ограничивается в основном силикагелями, модифицированными гидрофобными алкильными группами. Для обоснованного выбора сорбентов для ТФЭ таких полярных соединений, как метилксантины, необходимы количественные данные, характеризующие сорбционный процесс, которые практически отсутствуют. В связи с этим представляется актуальным как расширение круга сорбентов, позволяющих количественно выделять и концентрировать метилксантины, так и поиск новых комбинаций сочетания сорбционного концентрирования этих соединений и их последующего определения.

Цель работы состояла в систематическом изучении сорбции метилксантинов на сорбентах различной природы и разработке методик сорбционного выделения и концентрирования этих соединений для их последующего определения в элюате методом обращенно-фазовой ВЭЖХ или спектрофотометрии.

Для достижения поставленной цели было необходимо:

систематически исследовать сорбцию метилксантинов на сверхсшитом полистироле MN-200 (ССПС), поверхностно-модифицированном сополимере стирола и дивинилбензола Strata-X, наноуглеродном материале (УНМ) Таунит и Диасорбах (100-С16, 100-С1Т, 100-С8Т, 100-С16Т) в зависимости от условий извлечения и природы сорбатов;

выявить факторы, влияющие на величину коэффициентов распределения;

сравнить сорбенты по сорбционной способности и выбрать наиболее эффективный;



выбрать условия сорбционного концентрирования метилксантинов в динамическом режиме;

оптимизировать условия разделения и определения метилксантинов методом ОФ ВЭЖХ;

изучить возможность сочетания группового сорбционного концентрирования метилксантинов с последующим определением индивидуальных соединений в элюате методом ВЭЖХ;

оптимизировать условия щелочного гидролиза метилксантинов и разработать методики их спектрофотометрического определения по реакции с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония;

разработать методики определения метилксантинов в различных объектах:

чае, напитках, лекарственных препаратах, речной воде и моче.

Научная новизна. Выявлены особенности сорбционного поведения метилксантинов на различных по природе сорбентах: ССПС, Strata-X, наноуглеродном материале Таунит и Диасорбах (100-С16, 100-С1Т, 100-С8Т, 100 С16Т). Оценено влияние pH водного раствора, природы сорбента и строения метилксантинов на их распределение. Установлены взаимосвязи между коэффициентами распределения и гидрофобностью сорбатов. Обсуждена роль различных типов межмолекулярных взаимодействий в сорбции исследованных веществ. Реализовано сочетание сорбционного концентрирования метилксантинов на ССПС с их определением в элюате методом ОФ ВЭЖХ.

Обнаружено, что продукты щелочного гидролиза метилксантинов вступают в реакцию азосочетания с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония.

Практическая значимость работы. Продемонстрированы возможности использования изученных сорбентов для сорбционного извлечения метилксантинов из водных растворов, выбраны условия концентрирования.

Разработана методика хроматографического разделения и определения метилксантинов, включающая их сорбционное концентрирование на микроколонке, заполненной ССПС, десорбцию метанолом и раздельное хроматографическое определение со спектрофотометрическим детектированием.

Разработаны спектрофотометрические методики определения метилксантинов в виде их окрашенных 4-нитрофенилазопроизводных. Методики апробированы при анализе модельных водных растворов, напитков, лекарственных препаратов, мочи и речной воды.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследования структурных характеристик сорбентов.

2. Результаты исследования и выявленные особенности сорбции метилксантинов на сорбентах различной природы;

интерпретация взаимосвязи коэффициентов распределения со строением и свойствами сорбента и сорбируемого соединения;

обоснование возможности использования сверхсшитого полистирола для группового сорбционного концентрирования метилксантинов.

3. Методики сорбционного концентрирования и определения метилксантинов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

4. Методики спектрофотометрического определения метилксантинов по реакции с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония.

5. Результаты определения метилксантинов в лекарственных препаратах, напитках, моче и речной воде.

Апробация работы. Основные результаты доложены на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), Всероссийской конференции «Химический анализ» (Москва-Клязьма, 2008), III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием (Краснодар, 2009), Съезде аналитиков России (Москва-Клязьма, 2010), Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010), 36th International Symposium on Environmental Analytical Chemistry (Rome, Italy, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, выводов и списка литературы (301 наименование). Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков и 34 таблицы. Во введении обосновывается актуальность темы и цель работы, ее новизна и практическая значимость. В литературном обзоре систематизированы данные, опубликованные за последние 10 лет, о методах выделения, концентрирования и определения метилксантинов в различных объектах: продуктах питания, напитках, лекарственных препаратах, биологических жидкостях и водах. Во второй главе описаны реагенты, аппаратура и методика эксперимента. В третьей главе приведены сведения о структурных характеристиках сорбентов и особенностях сорбции метилксантинов на их поверхностях в статическом и динамическом режимах. Четвертая глава посвящена оптимизации условий разделения и определения метилксантинов методом ОФ ВЭЖХ. Там же приведены примеры определения метилксантинов в различных объектах без и после сорбционного концентрирования на ССПС. В пятой главе приведены результаты оптимизации условий щелочного гидролиза метилксантинов и их спектрофотометрического определения по реакции с тетрафторборатом 4 нитрофенилдиазония.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования, аппаратура и техника эксперимента Объектами исследования служили кофеин (Roth, 99.0%), теофиллин (Acros organics, 99.0%), теобромин (Sigma-Aldrich, 99.0%), дипрофиллин (Fluka analytical, 97.0%) и пентоксифиллин (Sigma-Aldrich). Перечень и некоторые физико-химические свойства изученных веществ приведены в табл. 1. Исходные растворы метилксантинов (0.001 – 0.005 М) готовили растворением их точных навесок в воде. Рабочие растворы Таблица 1. Перечень и некоторые физико-химические свойства метилксантинов, изученных в работе Структурная Мол. рКа** Соединение lgP* рКb** формула масса OH Дипрофиллин (7- O OH (2,3-дигидрокси- H3C N 254 –1.10 – – N пропил)теофил N O N лин, Д) CH O CH Теобромин H N N (3,7-диметилксан- 180 –0.7 10.0 13. N тин, ТБ) O N CH O H Теофиллин H3C N (1,3-диметилксан- N 180 –0.2 8.8 14. тин, ТФ) N O N CH O CH Кофеин H3C N N (1,3,7-триметил 194 –0.1 14.0 14. ксантин, К) N O N CH O O CH Пентоксифиллин H H C C N (3,7-диметил-1-(5- H3C C C N H2 H 278 0.3 – – оксогексил)- N O N ксантин, П) CH *Значения параметров гидрофобности lgP рассчитаны с помощью программы lgP(@ACD, Toronto, Canada);





**Значения рКа и рКb взяты из M.C. Gennaro, C.

Abrigo, P. Biglino. // Analyst. 1992. V. 117. P. 1071–1074.

соединений готовили разбавлением исходных непосредственно перед использованием.

В качестве сорбентов использовали сверхсшитый полистирол MN-200 (ЗАО «БиоХимМак СТ», Sуд = 1020 м2/г, степень сшивки 100%, размер частиц 75 – мкм), поверхностно-модифицированный сополимер стирола и дивинилбензола Strata-X («Phenomenex», Sуд = 800 м2/г, размер частиц 33 мкм), наноуглеродный материал Таунит (ООО «НаноТехЦентр», г. Тамбов, Sуд = 120 м2/г) и модифицированные алкильными группами силикагели: Диасорб-100-С16, Диасорб-100-С1Т, Диасорб-100-С8Т, Диасорб-100-С16Т (ЗАО «БиоХимМак СТ», Sуд = 250 – 330 м2/г, размер частиц 63 – 200 мкм).

Хроматографическую часть работы выполняли на жидкостном хроматографе «Цвет-Яуза-04» со спектрофотометрическим ( = 280 нм) и амперометрическим (Е = 1.3 В) детекторами. Разделение проводили в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ. Использовали хроматографические колонки Luna 5u C18(2) (150 3.0 мм, 5 мкм) и Диасфер-110-С16 (150 4.0 мм, 6 мкм). В качестве подвижной фазы использовали водно-ацетонитрильные и водно-метанольные смеси с добавлением фосфорной кислоты. Объем пробы составлял 20 мкл, ввод пробы осуществляли с помощью петли дозатора.

Скорость потока составляла 0.5 мл/мин. Дистиллированную воду для приготовления элюента дополнительно очищали с помощью системы очистки воды Millipore. Элюент дегазировали в ультразвуковой ванне Bransonic 1510R DTH (США). Спектры поглощения и оптические плотности растворов регистрировали на спектрофотометре СФ-103 («Аквилон», Россия), значения pH контролировали на иономере «Эксперт 001» (Россия).

Характеристики пористой структуры образцов – удельную поверхность (Sуд), объем пор (Vп), средний диаметр пор (dп), а также площадь поверхности, приходящуюся на микропоры (Sуд мк), и объем микропор (Vмк) – определяли методом низкотемпературной адсорбции азота на установке ASAP 2010 N («Micromeritics», США) в лаборатории кинетики и катализа кафедры физической химии МГУ. Исследование микроструктуры образцов сорбентов проводили на сканирующем электронном микроскопе с автоэмиссионным источником LEO SUPRA 50VP («Carlо Zeiss», Германия).

Для изучения сорбции веществ в статическом режиме точные навески сорбентов (0.020 ± 0.001 г) помещали в пробирки с притертыми пробками, добавляли 5 мл раствора исследуемого вещества и встряхивали на электромеханическом вибросмесителе до установления сорбционного равновесия. После этого сорбент отделяли от раствора декантацией, фильтрованием через складчатый бумажный фильтр и определяли концентрацию исследуемого соединения в равновесной водной фазе спектрофотометрическим методом по их собственному поглощению в УФ области. Для изучения сорбции в динамическом режиме использовали концентрирующую микроколонку объемом 0.15 мл (25 2.7 мм), заполненную ССПС, и перистальтический насос ЛАБ-НП-1-20М (Россия). Перед использованием колонку промывали 10 мл дистиллированной воды. Скорость пропускания раствора через колонку составила 0.7 мл/мин. После проведения сорбции и десорбции колонку промывали 3 мл этанола и 10 мл воды. Кроме того, использовали картриджи, заполненные 30 мг сорбентов.

Структурные характеристики сорбентов и особенности сорбции метилксантинов Удельная поверхность и пористость. Методом низкотемпературной адсорбции азота при 77 К на установке ASAP 2010 N проведено исследование пористой структуры и определена удельная поверхность сорбентов (табл. 2).

Изотермы сорбции-десорбции азота для изученных сорбентов (рис. 1) существенно различаются друг от друга, на всех изотермах наблюдаются петли гистерезиса. Согласно классификации ИЮПАК по форме изотерм сорбции и петли гистерезиса ССПС (II, Н4-тип) принадлежит к микропористым сорбентам, Strata-X и Диасорб-100-С16Т (IV, Н2-тип) – к мезопористым сорбентам, в составе которых содержатся поры в форме «бутылочного горлышка», а УНМ Таунит (IV, Н3-тип) – к мезопористым сорбентам, содержащим поры по форме ближе к Таблица 2. Характеристики пористой структуры сорбентов, рассчитанные по изотермам низкотемпературной адсорбции азота Сорбент ССПС Strata-X Диасорб-100-С16Т УНМ Таунит Sуд, м /г 912 575 204 Vп, см3/г 0.53 1.06 0.49 0. dп, 23.3 73.5 95.5 56. Sуд мк, м /г 513 0 0 Vмк, см /г 0.23 0 0 0. Доля, % (Рассматриваемый диаметр пор 1.7 – 300 нм) макропоры (более 50 нм) 10 7 0.3 мезопоры (от 2 до 50 нм) 79 91 99.7 микропоры (менее 2 нм) 11 2 0 щелевидным. Как следует из табл. 2, все исследованные сорбенты заметно отличаются друг от друга и по Sуд, Vп и dп.

Анализ полученных из изотерм дифференциальных кривых распределения объема пор по диаметрам (рис. 2) показал, что в образцах Strata-X и Диасорб-100-С16Т присутствуют в основном мезопоры (на них приходится 91% и 99.7% от общего объема пор) диаметром около 15 и 7.5 нм соответственно.

В УНМ Таунит присутствуют мезопоры (78%) диаметром около 4 нм и макропоры (21%) разного диаметра. В сорбции- ССПС, помимо мезо- (79%) и макропор Изотермы Рис. 1.

десорбции азота на сорбентах (10%) диаметром около 50 нм, содержится Strata-X (1), ССПС (2), УНМ много микропор (11%) с диаметром менее Таунит (4) и Диасорб-100-С16Т (3). 2 нм.

б) в) г) а) Рис. 2. Распределение пор по размерам для сорбентов ССПС (а), Strata-X (б), Диасорб-100-С16Т (в) и УНМ Таунит (г).

Данные электронно-микроскопических исследований показали (рис. 3), что частицы ССПС и Strata-X имеют правильную сферическую форму и их диаметр составляет около 60 и 30 мкм соответственно. На микрофотографиях ССПС с большим увеличением видно, что ССПС имеет упорядоченную структуру из пористых агломератов полимерных цепей и транспортных пор диаметром 50 – 300 нм между ними. Напротив, у сорбента Strata-X макропоры а) б) в) г) Рис. 3. Электронные микрофотографии поверхности ССПС (а), Strata-X (б), Диасорб-100-С16Т (в) и УНМ Таунит (г).

отсутствуют, поверхность однородна и пронизана мезопорами размером около 15 нм. Частицы Диасорб-100-С16Т имеют вид гранул неправильной формы и разных размеров от 10 до 200 мкм. При большем увеличении видны мезопоры размером до 10 нм. Согласно данным производителя и электронной микроскопии, УНМ Таунит представляет собой одномерные наномасштабные нитевидные образования поликристаллического графита. Гранулы УНМ микрометрических размеров имеют структуру спутанных пучков многостенных трубок.

Сорбция в статических условиях. На выбранных сорбентах изучена сорбция метилксантинов в зависимости от времени контакта фаз, рН раствора и концентрации извлекаемых соединений. В качестве примера на рис. 4 приведены экспериментальные зависимости для кофеина. Для остальных метилксантинов они носят аналогичный характер. Установлено, что природа сорбента оказывает существенное влияние как на время установления сорбционного равновесия, так и на эффективность сорбции. Быстрее всего сорбционное равновесие устанавливается на сорбентах, в структуре которых содержатся макропоры:

УНМ Таунит (10 мин) и ССПС (30 мин). Для сорбентов Strata-X и Диасорб-100 а) б) в) Рис. 4. Зависимости степеней извлечения кофеина на ССПС (1), УНМ Таунит (2), Strata-X (3) и Диасорб-100-С16Т (4) от времени контакта фаз (а), рН раствора (б) и концентрации кофеина (в). c = 1 10-4 М, V = 5 мл, mсорб = 0.020 ± 0.001 г, pH 6 (а, в).

С16Т, в структуре которых макропоры отсутствуют, время установления сорбционного равновесия увеличивается до 60 мин. Характер зависимостей степеней извлечения от pH свидетельствует о том, что метилксантины сорбируются на всех изученных сорбентах в молекулярной форме;

максимальная сорбция наблюдается в широком интервале рН 2 – 8. Начальные участки изотерм сорбции линейны до равновесных концентраций метилксантинов 0.3 мМ;

в диапазоне 0.1 – 15 мМ равновесных концентраций изотермы описываются уравнением Ленгмюра.

Сопоставление степеней извлечения и коэффициентов распределения (табл. 3, рис. 5) показывает, что в целом сорбция метилксантинов растет по мере увеличения гидрофобности соединений в рядах: дипрофиллин, теобромин теофиллин кофеин пентоксифиллин (ССПС и УНМ Таунит) и теобромин дипрофиллин, теофиллин кофеин пентоксифиллин (Strata-X и Диасорб 100 С16Т).

Таблица 3. Степени извлечения (R, %) и коэффициенты распределения (lgD) метилксантинов на изученных сорбентах в статических условиях (c = 110-4 М, V = 5 мл, mсорб = 0.020 г, t = 60 мин, n = 3, Р = 0.95) Соединение ССПС Strata-X Диасорб-100- УНМ С16Т R, % lgD R, % lgD R, % lgD R, % lgD Пентоксифиллин 97 ± 2 3.9 95 ± 6 3.7 80 ± 4 3.0 90 ± 3 3. Кофеин 94 ± 3 3.6 70 ± 2 2.8 36 ± 3 2.1 81 ± 6 3. Теофиллин 91 ± 3 3.4 55 ± 6 2.5 27 ± 2 2.0 78 ± 5 2. Теобромин 84 ± 2 3.1 20 ± 2 1.8 10 ± 1 1.4 66 ± 6 2. Дипрофиллин 84 ± 3 3.1 40 ± 4 2.2 27 ± 1 2.0 61 ± 5 2. Для всех метилксантинов, за исключением дипрофиллина, наблюдается линейная зависимость lgD – lgP (в скобках указаны значения коэффициентов корреляции, R2):

ССПС: lgD = 0.8 lgP + 3.6 (0.9723);

Strata-X: lgD = 1.9 lgP + 3.0 (0.9746);

УНМ Таунит: lgD = 0.7 lgP + + 3.1 (0.9811);

Диасорб-100-С16Т: lgD = 1.5 lgP + + 2.4 (0.9530).

Расположение и разный наклон этих зависимостей (рис. 6) указывают на то, что наряду с гидрофобными Значения степеней Рис. 5.

взаимодействиями, которые сильнее всего извлечения пентоксифиллина (1), проявляются на сорбентах Strata-X и кофеина (2), теофиллина (3), Диасорб-100-С16Т, при сорбции теобромина (4) и дипрофиллина (5) метилксантинов реализуются и на сорбентах: ССПС, УНМ Таунит, специфические взаимодействия.

Strata-X и Диасорб-100-С16Т.

Уменьшение наклона линейных V = 5 мл, pH 6, mсорб = 0.020 ± зависимостей в ряду Strata-X Диасорб 0.001 г, t = 60 мин.

100-С16Т ССПС УНМ Таунит косвенно указывает на то, что в этой последовательности вклад гидрофобных взаимодействий нивелируется на фоне lgD 4, более сильных специфических:

- 1 взаимодействий между сорбируемым 3, соединением и матрицей сорбента и донорно-акцепторных взаимодействий 2, между атомами кислорода и азота в составе метилксантинов и акцепторными 1, фрагментами сорбентов.

Для подтверждения вклада 0, -0,8 -0,3 0,2 0,7lgP специфических взаимодействий в сорбцию Рис. 6. Зависимости логарифмов метилксантинов была изучена сорбция распределения кофеина и пентоксифиллина на этих коэффициентов метилксантинов (lgD) на ССПС сорбентах из гексана, в котором (1), УНМ Таунит (2), Strata-X (3) гидрофобные взаимодействия отсутствуют (табл. 4).

и Диасорб-100-С16Т (4) от lgP.

Таблица 4. Степени извлечения (R, %) пентоксифиллина и кофеина из гексана и воды в статических условиях (c = 110-4 М, V = 5 мл, m сорб = 0.020 г, t = 120мин) Сорбент R, % Пентоксифиллин Кофеин Гексан Вода Гексан Вода ССПС 92 97 96 Strata-X 57 95 31 Диасорб-100-С16Т 97 80 86 УНМ Таунит 96 90 94 Полученные результаты подтвердили, что гидрофобные взаимодействия сильнее всего проявляются при сорбции метилксантинов на Strata-X: из гексана пентоксифиллин и кофеин сорбируются заметно хуже, чем из воды. Значения степеней извлечения пентоксифиллина и кофеина на ССПС оказались примерно одинаковыми и высокими, что, по-видимому, связано с уникальной способностью жесткой ажурной полимерной сетки сверхсшитого полистирола практически одинаково набухать как в воде, так и в неполярных органических растворителях. В случае Диасорба-100-С16Т и УНМ Таунит оба метилксантина лучше сорбируются из гексана, чем из воды, что, вероятно, связано с активацией поверхности этих сорбентов выбранным растворителем.

Для выяснения вклада в сорбцию остаточных силанольных групп поверхности химически модифицированных кремнеземов (ХМК) проведено сопоставление сорбционного поведения метилксантинов на Диасорбе 100-С16Т, дополнительно силанизированном триметилхлорсиланом, и Диасорбе 100-С16, содержащем остаточные силанольные группы. Из данных, приведенных в табл. 5, видно, что все метилксантины из водных растворов сорбируются на этих двух сорбентах одинаково. На примере Диасорбов серии Т с привитыми гексадецильными (100-С16Т), октильными (100-С8Т) и метильными (100-С1Т) группами изучено влияние на сорбцию длины алкильного радикала. Характер зависимостей сорбции от длины алкильного радикала ХМК, с одной стороны, и от гидрофобности молекул метилксантинов, с другой (табл. 5), указывает на то, что основной вклад при сорбции метилксантинов из воды на ХМК вносят гидрофобные взаимодействия. Сорбция метилксантинов возрастает по мере увеличения длины алкильного радикала, а максимальным сродством ко всем изученным ХМК среди метилксантинов обладает наиболее гидрофобный пентоксифиллин.

Таблица 5. Степени извлечения (R, %) и коэффициенты распределения (lgD) метилксантинов на ХМК в статических условиях (c = 1 10-4 М, pH 6, V = мл, m сорб = 0.020 ± 0.001 г, t = 60 мин, n = 3, Р = 0.95) Соединение 100-С16 100-С16Т 100-С8Т 100-С1Т R, % lgD R, % lgD R, % lgD R, % lgD Пентокси- 83 ± 2 3.1 80 ± 4 3.0 79 ± 3 3.0 46 ± 2 2. филлин Кофеин 32 ± 2 2.1 36 ± 3 2.1 22 ± 1 1.8 5±1 1. Теофиллин 25 ± 1 1.9 27 ± 2 2.0 11 ± 1 1.5 2±1 0. Теобромин 17 ± 1 1.7 10 ± 1 1.4 7±1 1.3 3±1 0. Сорбция в динамических условиях. На картриджах, заполненных 30 мг сорбентов, изучена сорбция метилксантинов в динамическом режиме (табл. 6).

Из сравнения данных видно, что на ССПС и Strata-X все метилксантины сорбируются и десорбируются метанолом (одним из лучшим из изученных Таблица 6. Степени извлечения метилксантинов (Rсорб, %) на картриджах, заполненных 30 мг сорбентов, и степени их десорбции (Rдес, %) 0.5 и 1 мл метанола (c = 1 10-4 М, V = 5 мл, U = 2 мл/мин, n = 3, Р = 0.95) Сорбент Rсорб и Пентокси- Кофеин Теофиллин Теобромин Дипро Rдес филлин филлин Rсорб, % ССПС 100 ± 1 100 ± 1 100 ± 1 100 ± 1 100 ± Rдес0.5, % 62 ± 5 71 ± 5 96 ± 4 95 ± 5 96 ± Rдес1, % 92 ± 6 95 ± 4 100 ± 4 100 ± 5 100 ± Rсорб, % Strata-X 100 ± 1 100 ± 1 100 ± 1 100 ± 1 100 ± Rдес0.5, % 96 ± 6 97 ± 3 94 ± 3 93 ± 5 98 ± Rдес1, % 98 ± 4 100 ± 3 97 ± 4 96 ± 5 100 ± Диасорб- Rсорб, % 92 ± 5 95 ± 6 66 ± 6 47 ± 5 78 ± 100-С16Т R дес0.5, % 95 ± 5 91 ± 4 92 ± 6 91 ± 4 95 ± Rдес1, % 97 ± 4 95 ± 5 97 ± 3 95 ± 5 99 ± УНМ Rсорб, % 82 ± 95 ± 4 86 ± 2 84 ± 2 79 ± Таунит Rдес0.5, % 11 ± 3 30 ± 5 22 ± 4 19 ± 3 36 ± Rдес1, % 18 ± 4 44 ± 5 31 ± 5 27 ± 4 48 ± элюентов) количественно. Степени извлечения метилксантинов на УНМ Таунит высоки, но с этого сорбента метилксантины десорбируются 1 мл метанола всего на 18 – 48 %. При увеличении объема элюента до 5 мл десорбция возрастает до 75 – 89 %. На Диасорбе 100-С16Т количественно сорбируются лишь кофеин и пентоксифиллин, тогда как другие метилксантины извлекаются в значительно меньшей степени.

Установлено, что на микроколонке, заполненной 0.055 г ССПС, все метилксантины сорбируются на 97 – 100% (V = 25 мл, U = 0.7 мл/мин). На примере кофеина показано, что степень извлечения изменяется незначительно и составляет 95 ± 4% при увеличении объема анализируемой пробы до 100 мл.

При осуществлении десорбции в противотоке метилксантины количественно элюируются с микроколонки 1 мл метанола, 1 мл смеси этанол-вода (1:1), 1.5 мл смеси метанол-вода (1:1) или 5 мл смеси ацетонитрил-вода (1:1).

Определение метилксантинов методом обращено-фазовой ВЭЖХ Оптимизированы условия хроматографического определения и разделения метилксантинов: неподвижная фаза – Luna 5u C18, подвижная фаза – ацетонитрил – вода – H3PO4 (табл. 7), скорость потока подвижной фазы – 0.5 мл/мин, = 280 нм.

Таблица 7. Выбор подвижной фазы для разделения смесей метилксантинов № Смесь метилксанинов Элюент Время анализа 1 Теобромин, теофиллин, Ацетонитрил – 0.1%-ный водный 10 мин кофеин раствор H3PO4 (10 : 90, pH 3.5) 2 Теобромин, дипрофиллин, Ацетонитрил – 0.1%-ный водный 10 мин кофеин раствор H3PO4 (10 : 90, pH 3.5) 3 Теобромин, теофиллин, Ацетонитрил – 0.1%-ный водный 55 мин кофеин, пентоксифиллин раствор H3PO4 (10 : 90, pH 3.5) 4 Теобромин, теофиллин, Ацетонитрил – 0.1%-ный водный 25 мин дипрофиллин, кофеин раствор H3PO4 (5 : 95, pH 3.5) 5 Пентоксифиллин Ацетонитрил – 0.1%-ный водный 5 мин раствор H3PO4 (30 : 70, pH 3.5) На рис. 7 приведены хроматограммы разделения модельных смесей метилксантинов. Характеристики методик определения соединений приведены в табл. 8. Методика применена для анализа различных образцов чая (табл. 9).

С применением ССПС разработана методика группового сорбционного концентрирования метилксантинов из водных растворов и их последующего хроматографического определения. Концентрирование метилксантинов проводили в динамическом режиме на микроколонке (252.7 мм), заполненной 0.055 г ССПС. Скорость пропускания раствора через колонку поддерживали постоянной и равной 0.7 мл/мин. Объем анализируемой пробы варьировали от 25 до 100 мл. Элюирование проводили метанолом в противоточном режиме.

Перед элюированием, колонку промывали 1 мл дистиллированной воды.

Установлено, что при пропускании через колонку 0.5 мл метанола метилксантины десорбируются на 85 – 90%, а увеличение объема элюента до а) б) mAU mAU 60 теобром и н 40 тео ф и л л и н 1 к о ф еи н 20 255нм 0280нм 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 мин 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 мин Рис. 7. Хроматограммы разделения модельных смесей метилксантинов на колонке Luna 5u C18. Элюент: а) ацетонитрил – 0.1%-ный водный раствор H3PO (10 : 90;

pH 3.5), с = 0.01мМ, б) ацетонитрил – 0.1%-ный водный раствор H3PO (5 : 95;

pH 3.5), с = 0.1мМ. Скорость потока 0.5 мл/мин. 1 – теобромин, 2 – теофиллин, 3 – дипрофиллин, 4 – кофеин.

Таблица 8. Характеристика методик определения метилксантинов методом ВЭЖХ без (I) и после концентрирования (II) из 25 мл на микроколонке, заполненной ССПС (pH 6, U = 0.7 мл/мин, m ССПС = 0.055 г) Определяемый Диапазон определяемых cmin, компонент содержаний, мкг/мл мкг/мл I II I II Дипрофиллин 0.2 – 50 0.005 – 1 0.06 0. Теобромин 0.09 – 50 0.003 – 1 0.03 0. Теофиллин 0.1 – 50 0.004 – 1 0.04 0. Кофеин 0.2 – 50 0.006 – 1 0.07 0. Пентоксифиллин 0.4 – 50 0.03 – 1 0.1 0. Таблица 9. Результаты определения кофеина и теобромина в различных образцах чая (n = 3, Р = 0.95) Образец чая Содержание sr Содержание sr кофеина, г/100г теобромина, г/100г Чай черный крупно- 4.48 ± 0.08 0.02 0.406 ± 0.009 0. листовой «Riston»

Чай зеленый цейлонский 3.0 ± 0.1 0.04 0.25 ± 0.02 0. «Хэйлис»

Чай черный «Золотые 4.01 ± 0.08 0.02 0.227 ± 0.006 0. реснички»

Чай зеленый китайский 2.45 ± 0.07 0.03 0.039 ± 0.001 0. Оолонг Чай черный «Lipton» в 2.7 ± 0.1 0.04 0.16 ± 0.01 0. пакетиках Чай черный Greenfield 3.5 ± 0.1 0.03 0.26 ± 0.01 0. «Golden Ceylon» в пакетиках Холодный чай «Nestea» 67 ± 2 мг/л 0.04 6.0 ± 0.7 мг/л 0. 1 мл позволяет десорбировать эти соединения количественно. Характеристики методик определения соединений с предварительным сорбционным концентрированием приведены в табл. 8. Методика применена для анализа модельного раствора, приготовленного на основе мочи (табл. 10).

Хроматограмма модельной смеси метилксантинов после концентрирования из 25 мл раствора мочи приведена на рис.8.

На примере модельной смеси, приготовленной на основе речной воды (р.

Москва), показана принципиальная возможность определения кофеина в природных водах методом ВЭЖХ после его динамического сорбционного концентрирования на микроколонке, заполненной 0.055 г ССПС. Правильность определения кофеина подтверждена методом «введено – найдено». При определении 2.0 мкг/л кофеина найдено 2.1 ± 0.4 мкг/л кофеина (V = 250 мл, sr = 0.07, n = 3, P = 0.95).

Таблица 10. Результаты определения метилксантинов в модельных растворах, приготовленных на основе мочи (pH 6, U = 0.7 мл/мин, V = 25 мл, m ССПС = 0.055 г, n = 3, Р = 0.95) Соединение Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл sr Теобромин 0 0.7 ± 0.2 0. 3.60 4.3 ± 0.3 0. Теофиллин 0 0 – 3.60 3.8 ± 0.6 0. Кофеин 0 0 – 3.90 4.1 ± 0.4 0. Дипрофиллин 0 0 – 5.10 5.3 ± 0.8 0. Пентоксифиллин 0 0 – 5.60 5.6 ± 0.7 0. mAU тео и л н фли оф н к еи 280нм 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 мин Рис. 8. Хроматограмма разделения модельной смеси, полученной после концентрирования соединений на ССПС из 25 мл раствора мочи. 1 – теобромин;

2 – теофиллин;

3 – кофеин. Концентрация каждого компонента в моче составляла 0.02 мМ. Элюент ацетонитрил – 0.1%-ный водный раствор H3PO (7 : 93;

pH 3.5).

Спектрофотометрическое определение метилксантинов В качестве реагента для спектрофотометрического определения метилксантинов предложено использовать тетрафторборат 4 нитрофенилдиазония (4-НФД). Установлено, что продукты щелочного гидролиза метилксантинов вступают во взаимодействие с 4-НФД с образованием интенсивно окрашенных соединений в соответствии со схемой, приведенной ниже для теофиллина:

O O O H H H CH CH 4-НФД CH N N N N N KOH, 50% N N H H N N CH3 N N O N CH3 N N H NO H CH При оптимизации условий щелочного гидролиза и проведения спектрофотометрической реакции варьировали температуру, время, концентрации 4-НФД и уксусной кислоты (табл. 11). Установлено, что легче всего гидролиз протекает в случае кофеина и дипрофиллина (30 мин при комнатной температуре). Щелочной гидролиз пентоксифиллина частично протекает при комнатной температуре, однако нагревание на водяной бане в 1.5 раза повышает выход его азопроизводного. Напротив, щелочной гидролиз теофиллина протекает только при нагревании на водяной бане. Для интенсификации щелочного гидролиза теофиллина предложено использовать нагревание в УЗ-ванне при 60 С, при котором в 2 раза повышается выход азопроизводного теофиллина по сравнению с нагреванием при 60 С на водяной бане. Теобромин не вступает в реакцию щелочного гидролиза вследствие депротонирования в щелочной среде имидного атома азота. Для перевода азопроизводных метилксантинов в таутомерные формы, максимум поглощения которых находится в видимой области спектра, предложено после проведения реакции азосочетания вводить в систему уксусную кислоту (рис. 9).

А А а) 0, б) 1, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,, нм 200 300 400 500, нм 200 300 400 500 Рис. 9. Спектры поглощения азопроизводных теофиллина (а) и кофеина (б) без (1) и после добавления (2) уксусной кислоты. 1 – cKOH = 1.27 М;

2 – рН ~ (введено 5.2 М СН3СООН ), cТФ = cК = 1.0 10-4 М, С4-НФД = 3.75 10-5 М.

Таблица 11. Оптимальные условия проведения щелочного гидролиза и реакции азосочетания метилксантинов с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония Соединение Оптимальные условия Оптимальные условия max, щелочного гидролиза азосочетания нм УЗ Т, С t, мин cCH3COOH, М c4-НФД, М 2.0 10- Пентоксифиллин есть 60 30 5.2 1.5 10- Кофеин нет 25 30 5.2 - Теофиллин есть 60 30 5.2 3.75 10 - Теофиллин нет 60 30 5.2 3.75 10 - Дипрофиллин нет 25 30 5.2 2.0 10 Различие в условиях проведения щелочного гидролиза и спектральных характеристиках образующихся азосоединений, а также тот факт, что в реакцию щелочного гидролиза не вступает теобромин, позволяют предложить несколько схем спектрофотометрического определения этих соединений. Прежде всего, очевидно, что с помощью 4-НФД можно проводить спектрофотометрическое определение пентоксифиллина, кофеина, теофиллина и дипрофиллина в присутствии теобромина. Во-вторых, поскольку в отличие от теофиллина щелочной гидролиз кофеина и дипрофиллина в заметной степени протекает при комнатной температуре, возможно определение этих метилксантинов в присутствии теофиллина. И, наконец, различия в спектрах поглощения азопроизводных теофиллина, кофеина, дипрофиллина и пентоксифиллина ( ~ 125 нм) указывают на возможность определения теофиллина в присутствии этих метилксантинов.

Проведенные исследования послужили основой разработки методик спектрофотометрического определения метилксантинов без и с сорбционным концентрированием на ССПС. Спектрофотометрическая методика определения включала проведение щелочного гидролиза метилксантинов, реакцию азосочетания продуктов щелочного гидролиза с 4-НФД и измерение оптической плотности растворов в максимумах поглощения азопроизводных.

Сорбционно-спектрофотометрическая методика с сорбционным концентрированием на ССПС или Strata-X включала сорбцию исследуемых веществ на микроколонке, заполненной ССПС, или картридже Strata-X, десорбцию их смесью этанол-вода (метанол), проведение щелочного гидролиза и реакции азосочетания продуктов щелочного гидролиза с 4-НФД и измерение оптической плотности в максимумах поглощения. Характеристики спектрофотометрической методики определения метилксантинов без и с предварительным сорбционным концентрированием на ССПС приведены в табл. 12.

Для оценки возможности практического применения методики проведено определение пентоксифиллина, кофеина и теофиллина в лекарственных препаратах «Пентоксифиллин», «Кофеин-бензоат натрия» и «Эуфиллин»

соответственно (табл. 13). Полученные результаты согласуются с данными, заявленными производителями.

Спектрофотометрическая методика определения кофеина в сочетании с сорбционным выделением этого соединения на картирдже Strata-X применена для анализа напитка «Кока-кола» (The Coca-Cola Company). Применение картриджа, заполненного 30 мг сорбента Strata-X, позволило выделить кофеин и удалить мешающие компоненты напитка. Найденное содержание кофеина в напитке (0.55 ± 0.09 мМ, sr = 0.07, n = 3, P = 0.95) согласуется с результатами хроматографического определения (0.51 ± 0.05 мМ, sr = 0.02) и данными производителя (среднее содержание кофеина – 0.493 мМ).

Таблица 12. Характеристики спектрофотометрических методик определения метилксантинов без (I) и с концентрированием (II) из 25 мл на колонке, заполненной ССПС (pH 6, U = 0.7 мл/мин, m ССПС = 0.055 г) Определяемый Диапазон определяемых содержаний, cmin, компонент М (мкг/мл) М (мкг/мл) I II I II -5 -4 - Дипрофиллин 0.3 10 – 0.7 10 0.9 – – (0.7 – 19) (0.2) 5.4 10-6 – 1.2 10-4 2.2 10-6 – 5.1 10-5 1.8 10-6 6 10- Теофиллин (1 – 22) (0.4 – 9.2) (0.30) (0.1) -5 -4 -5 -4 - 3 10- Кофеин 1.8 10 – 2.5 10 0.9 10 – 1.0 10 0.6 (3.6 – 48) (1.8 – 19.5) (1.20) (0.6) -5 -4 - Пентоксифил- 1.2 10 – 2.5 10 0.4 – – лин (3.3 – 70) (1) Таблица 13. Результаты определения пентоксифиллина, кофеина и теофиллина в лекарственных препаратах «Пентоксифиллин», «Кофеин-бензоат натрия» и «Эуфиллин» (n = 3, P = 0.95) Содержание в ампуле, мг/мл Лекарственный Определяемое По данным препарат соединение Найдено производителя «Пентоксифиллин» Пентоксифиллин 20 21 «Кофеин-бензоат Кофеин 76 – 80 76 ± натрия»

«Эуфиллин» Теофиллин 179.35 180 ± ВЫВОДЫ 1. С целью расширения ассортимента сорбентов, пригодных для сорбционного концентрирования метилксантинов, в статическом и динамическом режимах систематически изучена их сорбция на разных по природе сорбентах: сверхсшитом полистироле MN-200, поверхностно модифицированном сополимере стирола и дивинилбензола Strata-X, углеродном наноматериале Таунит и Диасорбах (100-С16, 100-С1Т, 100-С8Т, 100-С16Т).

2. Изучены структурные характеристики и морфология поверхности сорбентов. Показано, что в образцах Strata-X и Диасорб-100-С16Т присутствуют в основном мезопоры диаметром около 15 и 7.5 нм соответственно. В УНМ Таунит присутствуют мезопоры диаметром около 4 нм и макропоры разного диаметра. В ССПС, помимо мезо- и макропор диаметром около 50 нм, содержится много микропор с диаметром меньше 2 нм.

3. Даны объяснения особенностей сорбции метилксантинов в зависимости от кислотности раствора, природы и концентрации соединений, природы растворителя и структурных характеристик сорбентов. Высказаны предположения о характере межмолекулярных взаимодействий сорбент сорбат.

4. Предложены способы динамического сорбционного концентрирования метилксантинов. Показано, что сверхсшитый полистирол можно использовать для группового концентрирования этих соединений.

5. Выбраны условия разделения и определения метилксантинов методом ОФ ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором. Разработана методика динамического концентрирования метилксантинов на микроколонке, заполненной сверхсшитым полистиролом, с последующим определением соединений в элюате методом ВЭЖХ. Проведено определение метилксантинов в различных образцах чая, моче и речной воде.

6. В качестве реагента для спектрофотометрического определения метилксантинов предложен тетрафторборат 4-нитрофенилдиазония.

Показано, что продукты щелочного гидролиза метилксантинов вступают в реакцию азосочетания с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония.

Оптимизированы условия проведения щелочного гидролиза и спектрофотометрической реакции. Проведено определение пентоксифиллина, кофеина и теофиллина в лекарственных препаратах «Пентоксифиллин», «Кофеин-бензоат натрия» и «Эуфиллин». Показана возможность спектрофотометрического определения кофеина в напитках после удаления мешающих компонентов с помощью картриджа, заполненного сорбентом Strata-X.

Автор выражает благодарность акад. Ю.А. Золотову за постоянное внимание к работе;

к.х.н., доц. Е.Н. Шаповаловой и к.х.н. В.В. Апяри за помощь в работе.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Андреева Е.Ю., Дмитриенко С.Г., Золотов Ю.А.

Спектрофотометрическое определение кофеина и теофиллина по реакции азосочетания с тетрафторборатом 4-нитрофенилдиазония. // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2010. Т. 76. № 2. С. 21 – 23.

2. Андреева Е.Ю., Дмитриенко С.Г., Золотов Ю.А. Сорбция кофеина и теофиллина на сверхсшитом полистироле. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2.

Химия. 2010.Т.51. № 1. С. 48 – 52.

3. Андреева Е.Ю., Тан Цзянань, Дмитриенко С.Г., Золотов Ю.А.

Определение кофеина, теобромина и теофиллина в чае методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2010. Т. 10. № 6. С. 805 – 812.

4. Андреева Е.Ю. Спектрофотометрическое определение кофеина и теофиллина с предварительным концентрированием на сверхсшитом полистироле. / Материалы XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», секция «Химия», Москва, 8 – 11 апреля 2008. С. 10.

5. Андреева Е.Ю., Перистый А.А., Дмитриенко С.Г. Концентрирование кофеина на сверхсшитом полистироле и его спектрофотометрическое определение. / Тез. докладов Всероссийской конференции «Химический анализ», Москва – Клязьма, 21 – 25 апреля 2008. С. 37.

6. Андреева Е.Ю., Дмитриенко С.Г. Применение сверхсшитого полистирола для сорбционного концентрирования метилксантинов. / Материалы III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием, Краснодар, 27 сентября – 3 октября 2009.

С. 160.

7. Андреева Е.Ю., Тан Цзянань, Шаповалова Е.Н., Дмитриенко С.Г.

Разделение и определение метилксантинов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. / Тез. докладов Съезда аналитиков России, Москва – Клязьма, 26 – 30 апреля 2010. С. 25.

8. Андреева Е.Ю., Тан Цзянань, Дмитриенко С.Г. Сорбционное концентрирвание метилксантинов на сверхсшитом полистироле и их последующее хроматографическое определение. / Тез. докладов Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез», Краснодар, 26 сентября – 1 октября 2010.

С. 70.

9. Andreeva E.Yu., Jianan Tang, Dmitrienko S.G. Application of solid-phase extraction on hypercrosslinked polystyrene to determination of methylxanthines in urine by HPLC. / 36th International Symposium on Environmental Analytical Chemistry, Rome, Italy, 5 – 9 October 2010. P. 96.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.