авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Хроматографическое разделение и определение стероидных гормонов, флавоноидов, сапонинов и аминокислот в мицеллярных и циклодекстриновых подвижных фазах

На правах рукописи

Сорокина Ольга Николаевна

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ

СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ, ФЛАВОНОИДОВ, САПОНИНОВ

И АМИНОКИСЛОТ В МИЦЕЛЛЯРНЫХ И ЦИКЛОДЕКСТРИНОВЫХ

ПОДВИЖНЫХ ФАЗАХ

02.00.02 – аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Саратов – 2013 2

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского».

Научный руководитель Сумина Елена Германовна доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты: Калач Андрей Владимирович доктор химических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Воронежский институт Государ ственной противопожарной службы Министерства Российской Федерации по делам гражданской обо роны, чрезвычайным ситуациям и ликвидации по следствий стихийных бедствий», заместитель начальника института по научной работе Неврюева Наталия Владимировна кандидат химических наук, ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный ме дицинский университет имени В.И. Разумовско го», ассистент кафедры общей и биоорганической химии

Ведущая организация ФГБОУ ВПО «Воронежский государствен ный университет»

Защита состоится “26” декабря 2013 года в 12-00 часов на заседании дис сертационного совета Д 212.243.07 по химическим наукам на базе ФГБОУ ВПО “Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского” по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, СГУ, корп. I, Институт химии.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В.А. Артисевич Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского.

Автореферат разослан “23” ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Русанова Т.Ю.

доктор химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Биологически активные вещества (БАВ) разной природы – сте роидные и тритерпеновые гормоны, полифенолы, сапонины, аминокислоты, фторхи нолоны, хинолоны и др. в последнее время вызывают возрастающий интерес в связи с участием во многих физиологических и биохимических процессах в живых организ мах и широким применением в медицине, фармацевтике, пищевой промышленности, животноводстве и других областях. Широкий ассортимент выпускаемых на их основе коммерческих продуктов, а также разнообразные источники БАВ растительного про исхождения требуют разработки простых, доступных и эффективных методов их раз деления, идентификации и количественного определения в различных сложных объ ектах. Одним из таких методов является жидкостная хроматография (ЖХ). Разнооб разие природы и свойств БАВ предполагает возможность регулирования эффективно сти и селективности их разделения с помощью комбинирования различных по приро де неподвижных (НФ) и подвижных фаз (ПФ), например, водно-органических, ми целлярных или циклодекстриновых. Несмотря на то, что разделению БАВ методом жидкостной хроматографии посвящено большое число публикаций, полной предска зуемости влияния природы различных модификаторов ПФ до настоящего времени не имеется. Развитие таких исследований позволяет оптимизировать разделение кон кретных БАВ в данном конкретном объекте, а также увеличить базу хроматографиче ских данных для лучшего понимания общих закономерностей разделения БАВ. Дан ная работа является частью плановых госбюджетных исследований кафедры аналити ческой химии и химической экологии, а также выполнялась в соответствии с проек том РФФИ № 12-03-00450а.

Цель работы состояла в оценке влияния поверхностно-активных и цикло декстриновых модификаторов водных и водно-органических подвижных фаз на хро матографическое разделение и определение стероидных гормонов, флавоноидов, са понинов и аминокислот.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

– изучить хроматографические свойства индивидуальных соединений и их сме сей методами ТСХ и ВЭЖХ в водно-органических, мицеллярных и циклодекстрино вых ПФ и выявить факторы, влияющие на селективность и эффективность разделения на конкретных НФ;

– изучить влияние природы и концентрации поверхностно-активных веществ (ПАВ) и циклодекстринов (ЦД) на подвижность и разделение исследуемых соедине ний методами ТСХ и ВЭЖХ на нормальной и обращенной фазах;

– рассчитать и сравнить количественные характеристики эффективности и се лективности разделения БАВ для исследуемых комбинаций НФ и ПФ и выявить луч шие хроматографические системы;

– рассчитать количественные характеристики, характеризующие солюбилиза цию БАВ в мицеллы ПАВ и полость циклодекстринов, и установить их взаимосвязь с гидрофобностью исследуемых веществ;

– разработать методики хроматографического разделения и определения БАВ в лекарственных препаратах синтетического и растительного происхождения, пищевых продуктах.

Научная новизна:

– установлены закономерности и выявлены факторы, влияющие на удержива ние и хроматографическое разделение исследуемых БАВ методами ТСХ и ВЭЖХ в водно-органических, мицеллярных и циклодекстриновых ПФ, позволяющие прогно зировать пути оптимизации разделения и определения компонентов сложных смесей БАВ на некоторых нормальных и обращенных неподвижных фазах;

– выявлены зависимости, характеризующие влияние концентрации и природы мицелл ПАВ в водной и водно-органической ПФ на подвижность и хроматографиче ское разделение различных классов БАВ методами ТСХ и ВЭЖХ на нормальной и обращенной фазах;



– установлены зависимости, характеризующие влияние концентрации и приро ды циклодекстринов на подвижность и хроматографическое разделение исследуемых БАВ в водной и водно-органической ПФ методом ТСХ на различных НФ;

– рассчитаны параметры, характеризующие эффективность и селективность хроматографического разделения исследуемых БАВ методами колоночной и планар ной ЖХ для исследованных комбинаций ПФ и НФ;

– рассчитаны три типа коэффициентов распределения сорбатов, характеризу ющих равновесные процессы солюбилизации в мицеллы ПАВ и полость цикло декстринов, позволяющие оценить вклад гидрофобности сорбатов и прогнозировать порядок их элюирования методом ТСХ в нормально-фазовом и обращенно-фазовом режимах хроматографирования;

– найдены оптимальные условия разделения БАВ, принадлежащих к различ ным классам.

Практическая значимость. Полученные результаты позволяют расширить возможности метода жидкостной хроматографии при разделении различных классов БАВ, используя для динамической модификации водные и водно-органические ПФ, мицеллы ПАВ и циклодекстрины. Установлено, что применение мицеллярных и цик лодекстриновых подвижных фаз приводит к значительному увеличению числа теоре тических тарелок, уменьшению высоты, эквивалентной теоретической тарелке, по вышению селективности и улучшению разрешения в хроматографических системах, повышению чувствительности определения сорбатов. На основе результатов прове денных исследований:

– разработаны методики оценки степени чистоты и разделения стероидных гормонов методами тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии с мицеллярными подвижными фазами, а также методики определения прогестерона в лекарственных препаратах “Депо-провера” и “Дюфастон”;

– разработаны методики определения кверцетина и рутина в лекарственных препаратах растительного происхождения методом нормально-фазовой ТСХ (софора японская, прополис сухое вещество и настойка), а также в лекарственных препаратах, овощах, ягодах, фруктах и растениях методами обращенно-фазовой ТСХ и ВЭЖХ (аскорутин, шелуха лука, цедра мандарина, яблоко красное, яблоко зеленое, смороди на черная, черника, петрушка, свекла, эхинацея, клевер красный);

– разработаны методики количественного определения олеаноловой и глицир ризиновой кислот в лекарственных препаратах растительного происхождения (корни солодки, настойка солодки), в пищевых продуктах (свекла столовая, слива, баклажан, картофель) методом обращенно-фазовой ТСХ;

– разработаны методики идентификации и количественного определения тиро зина, лейцина, триптофана в лекарственных препаратах “Нефрамин” и “Гидролизин” методом нормально-фазовой ТСХ в циклодекстриновых ПФ.

На защиту автор выносит:

– результаты изучения хроматографических свойств исследуемых БАВ в вод но-органических подвижных фазах;

– закономерности поведения сорбатов в водных и модифицированных мицел лярных подвижных фазах;

– закономерности поведения сорбатов в водных и модифицированных цикло декстриновых подвижных фазах;

– количественные характеристики, характеризующие солюбилизацию БАВ в мицеллы ПАВ и полость циклодекстринов и их взаимосвязь с гидрофобностью ис следуемых веществ;

– результаты применения ПФ на основе водных и модифицированных мицел лярных растворов ПАВ и циклодекстринов для оценки степени чистоты, разделения и количественного определения биологически активных веществ в лекарственных пре паратах растительного и синтетического происхождения и пищевых продуктах.

Апробация результатов исследования. Основные результаты работы доло жены на X Международной конференции «Теоретические проблемы химии поверх ности, адсорбции и хроматографии» (Москва (Клязьма), 2006), International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 (Moscow, 2006), Всероссийских научно практических конференциях «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, фи зиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные технологии переработки сельскохозяйственной продукции» (Саратов 2007, 2008), 10th Analytical Russian German-Ukrainian Symposium «ARGUS’ 2007 – Nanoanalytics» (Saratov, 2007), VI – IX Всероссийских конференциях молодых ученых с международным участием «Совре менные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2007, 2010, 2011, 2013), Международной научно - практической конференции «Вавиловские чте ния – 2009» (Саратов, 2009), I Всероссийской конференции «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции» (Москва, 2009), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Со временные проблемы и перспективы развития» (Саратов, 2010), Всероссийской кон ференции «Хроматография – народному хозяйству» (Дзержинск, 2010), Всероссий ской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез»

(Краснодар, 2010), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волго град, 2011), III Всероссийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в анали тической химии и радиохимии» (Краснодар, 2011), VI Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев – 2012» (Санкт-Петербург, 2012), Всероссийской школе-конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Химия биологически активных веществ» (Саратов, 2012), Всероссийской конференции по аналитической спектро скопии с международным участием (Краснодар, 2012), Конференции профессорско преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской, учеб но-методической и воспитательной работы за 2012 год (Саратов, 2013), Международ ном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ – 2013» (Москва, 2013), Втором съезде аналитиков России (Москва, 2013).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 33 работы:

5 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 15 статей в сборниках, 13 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 171 страни це, включая введение, 6 глав, выводы, список литературы, содержащий 184 ссылки, приложение. Работа содержит 68 рисунков и 48 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи ис следования, изложены научная новизна, теоретическая и практическая значимость ре зультатов и основные результаты, выносимые на защиту.

В главе 1 представлены обобщение и систематизация литературных данных по современным методам, способам и приемам разделения и определения биологически активных веществ в лекарственных препаратах синтетического и растительного про исхождения, биологических жидкостях и пищевых продуктах. Более подробно описа ны методы жидкостной хроматографии – ТСХ и ВЭЖХ, подвижные и неподвижные фазы, применяемые при разделении БАВ, показаны преимущества и недостатки каж дого из методов.

В главе 2 описаны реактивы и оборудование, использованные в работе. Объек тами исследования явились представители БАВ следующих классов: стероидных гормонов, флавоноидов, сапонинов и аминокислот (таблица 1). Содержание основно го вещества составляло 97-99 %. Исследования проводили методом жидкостной хро матографии в вариантах восходящей ТСХ на коммерческих пластинах “Сорбфил” (ЗАО “Сорбполимер”, Россия), “Полиамид-6” (Merck, Германия), RP - 18 (Merck, Германия) с УФ-индикатором и ВЭЖХ на колонке Luna C18(2), 5 мкм (1504.6 мм) (Phenomenex, США). Детектирование и количественную обработку хроматограмм проводили на видеоденситометре “Сорбфил”, ЗАО “Сорбполимер” (Россия) в УФ (254 и 365 нм) и видимой областях, как без, так и после химической обработки хрома тограмм. Измерения рН растворов проводили на иономере И-120.2. В качестве по движных фаз использовали водно-органические смеси, водные и водно-органические растворы ПАВ трех типов (додецилсульфат натрия (ДДС), бромид цетилтриметилам мония (ЦТА), хлорид цетилпиридиния (ЦПХ), Тритон Х-100 (ТХ-100)) и цикло декстринов, отличающихся размером полости и наличием заместителя (-, -, 2-ГП -, -ЦД). Чистота коммерческих препаратов ПАВ составляла более 98 %, ЦД – более 99 % основного вещества, растворители имели квалификацию “о.с.ч.”, “х.ч.”, “ч.д.а.”, сильные электролиты (KCl, NaCl, LiCl, NH4Cl, KNO3) имели квалификацию “х.ч.”.

Для оценки эффективности и селективности процесса разделения исследуемых соединений в мицеллярных, циклодекстриновых и водно-органических ПФ использо вали следующие характеристики: число теоретических тарелок (N), высоту, эквива лентную теоретической тарелке (ВЭТТ), коэффициент селективности (), разрешение (Rs). Для выявления стадии, определяющей подвижность разделяемых соединений в мицеллярных и циклодекстриновых ПФ, рассчитывали коэффициенты распределения сорбатов в системах вода – Мц(ЦД), вода – НФ, Мц (ЦД) – НФ.

В главах 3 – 6 приведены результаты экспериментальных исследований.

Таблица 1 – Структурные формулы и величины гидрофобности БАВ Стероидные гормоны CH2OH CH CO CO H3C H3C HO OH CH3 H CH3 H H H H H O O Прогестерон (Прг), lgP = 4,6 Преднизолон (Прд), lgP = – 1, CH2OH CH2OH CO CO H3C H3C HO HO OH OH CH3 H CH3 H H H F H O O Дексаметазон (Дк), lgP = 0,47 Гидрокортизон (Гк), lgP = – 0, Флавоноиды OH OH OH OH HO O HO O CH2OH O OH O OH O H H OH OH H H OH O H OH Кверцетин (Кв), lgP = 0,35 Гиперозид (Гп), lgP = – 1, OH OH H OH H OH H OH H O OH H O OH O O CH HO O H O CH3 H H CH H H H H2C O H O OH H2C O H OH H O H H O OH H OH O OH OH H OH O H OH H OH O H OH H OH H OH OH H H OH Рутин (Рт), lgP = – 2,3 Фларонин (Фл), lgP = – 2, Сапонины H 3C H 3C CH3 CH HOOC H 3C O H 3C HO COOH COOH HO OH CH3 CH HO O CH3 CH H 3C CH3 H3C CH Сапонин (Сп), lgP = 6, Олеаноловая кислота (Ол), lgP = 7, H3C H3C COOH CH OH COOH O O OH O H3C HO C O HO O H3C HO CH3 О OH CH3 O O CH HO HO O HO O HO O CH3 HO CH3 HO CH HOOC OH O CH3 O O O HO HO O H3C CH HO HO HO OH OH Глицирризиновая кислота (Гл), lgP = 4,8 Хедеракозид (Хд), lgP = 1, Аминокислоты COOH COOH COOH H3C COOH C CH CH2 HO CH2 C CH2 C H3C C H3C NH NH NH2 NH Лейцин (Лей), Фенилаланин (Фен), Тирозин (Тир), Аланин (Aла), lgP = – 0, lgP = 1,2 lgP = 1,9 lgP = 1, COOH HOOC CH2 C HC CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 NH H 2N NH Лизин (Лиз), Триптофан (Три), lgP = – 0,67 lgP = 0, Хроматографическое поведение биологически активных веществ в водно-органических подвижных фазах Предварительные исследования показали, что при использовании водно органических ПФ эффективно применение как полярных (Сорбфил (Al)), так и непо лярных (RP-18) НФ. В связи с этим изучено хроматографическое поведение на Сорбфиле (Al) и RP-18 указанных выше исследуемых соединений в водно органических ПФ на основе протонных (этилацетата, этанола, пропанола-1, бутанола 1, пропанола-2, бутанола-2) и апротонных (ацетонитрила) растворителей, которые наиболее часто используются в жидкостной хроматографии. Установлено, что неза висимо от природы органического растворителя с увеличением его концентрации в ПФ подвижность гормонов, флавоноидов и сапонинов, как правило, возрастает.





В целом, закономерности хроматографического поведения БАВ согласуются с вытеснительным механизмом сорбции теории Хорвата и связаны с преимуществен ной адсорбцией молекул растворителя на поверхности сорбента, а также образовани ем ими водородных связей с молекулами исследуемых веществ в ПФ, что уменьшает удерживание БАВ на НФ и усиливает перенос полярной ПФ. Подтверждением этому может служить также то, что подвижность флавоноидов и сапонинов на неполярной НФ растет с увеличением количества ОН-групп и гидрофильности в рядах Кв Гп Рт Фл (Rf: 0,12 0,21 0,37 0,53) и Ол Гл (Rf: 0,15 0,79).

Хроматографическое поведение аминокислот в этаноле, пропаноле-2 и ацетони триле на полярной и слабополярной НФ имеет свои особенности. Так, независимо от природы растворителя подвижность исследуемых аминокислот уменьшается с увели чением концентрации органического растворителя. Это, вероятно, связано с образо ванием более прочных водородных связей по аминогруппе с молекулами спирта, находящимися на поверхности сорбента, и, таким образом, преобладанием процесса сорбции на поверхности сорбента над ассоциацией в растворе.

На основании проведенных исследований найдены оптимальные условия разде ления смесей БАВ: для Дк, Прд, Гк – система ацетонитрил – вода (70:30), Прг – аце тонитрил – вода (60:40) (НФ: RP-18);

флавоноидов – пропанол-2 – вода (30:70) (НФ:

RP-18), этилацетат – вода (70:30) (НФ: Сорбфил (Al);

сапонинов – пропанол-1 – вода (60:40) (НФ: RP-18);

аминокислот – ацетонитрил – вода (10:90) (НФ: Сорбфил (Al)).

Выбор подвижных фаз в ТСХ был подтвержден результатами исследования ме тодом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Время удерживания составляет для Кв – 9,55 мин, Рт – 4,45 мин, что также согласуется с закономерностями обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Однако установлено, что разделение сорбатов методами ТСХ и ВЭЖХ в водно органических ПФ протекает с низкой эффективностью, так как независимо от приро ды и концентрации органической составляющей ПФ для большинства сорбатов хро матографические зоны и пики имеют размытый вид, что затрудняет их полное разде ление. В связи с этим далее апробировали в качестве ПФ различные организованные системы.

Влияние мицелл ПАВ и циклодекстринов на хроматографическое поведение БАВ Как следует из анализа литературных данных, применение в составе ПФ мицелл ПАВ и циклодекстринов в жидкостной хроматографии придает элюентам новые свойства, влияющие на эффективность и селективность разделения широкого круга органических и неорганических молекул и ионов. Однако следует отметить, что чис ло работ, посвященных применению мицеллярных и циклодекстриновых ПФ в анали зе БАВ, невелико. В связи с этим, нами была поставлена цель оценить возможность применения мицеллярных и циклодекстриновых ПФ для разделения исследуемых нами БАВ в планарном и колоночном вариантах жидкостной хроматографии.

Хроматографическое поведение сорбатов в водных мицеллярных ПФ, модифицированных органическими растворителями и сильными электролитами Изучение влияния природы и концентрации ПАВ на хроматографическое пове дение исследуемых веществ проводили в ПФ на основе водных мицеллярных раство ров ДДС, ЦТА, ЦПХ и ТХ-100. Предварительные исследования показали, что незави симо от природы и концентрации ПАВ в водной МПФ хроматографические зоны ис следуемых флавоноидов и сапонинов в ТСХ остаются на линии старта либо движутся с фронтом элюента. Несколько иначе ведут себя представители стероидных гормонов и аминокислоты, которые образуют зоны с разными значениями Rf. Найдено, что МПФ на основе кПАВ и нПАВ непригодны для разделения гормонов и аминокислот вследствие сильного размывания хроматографических зон. Поэтому дальнейшие ис следования проводили в МПФ на основе ДДС.

Установлено, что с увеличением концентрации ДДС в ПФ значения Rf сорбатов растут (рисунок 1). Рост подвижности сорбатов в водной МПФ, по-видимому, вызван смещением равновесия солюбилизации в мицеллы ПАВ вправо: R+Мц Мц(R), где:

Мц – мицелла, Мц(R) – система мицелла – солюбилизат.

1 Rf Rf 0,9 0, 4 0, 0,6 0,4 0, 0, 1 0 3 6 C(ДДС)10-2, М 0 3 6 C(ДДС)10-2, М а б Рисунок 1 – Зависимость подвижности стероидных гормонов (а) и аминокислот (б) от концентрации ДДС в ПФ. НФ: Сорбфил (Al). а) 1 – Прг (2,5 мг/мл), 2 – Прд (3,0 мг/мл), 3 – Дк (4,0 мг/мл), 4 – Гк (2,5 мг/мл);

б) 1 – Лиз, 2 – Ала, 3 – Три, 4 – Лей, 5 – Тир;

СR = 1,010-3 М.

Важной составляющей оценки хроматографического процесса являются количе ственные величины эффективности и селективности. Сопоставление этих характери стик представлено на примере гормонов в таблице 2. Видно, что МПФ на основе ДДС обеспечивают значительно большую эффективность хроматографического разделе ния, чем водно-ацетонитрильная ПФ. Так, при замене ацетонитрила на ДДС число теоретических тарелок N для дексаметазона возрастает почти в 2 раза, для преднизо лона – в 1,5 раза, а для гидрокортизона – в 1,2 раза. Селективность разделения сорба тов возрастает в 1,3 раза.

Таблица 2 – Параметры эффективности и разрешения, рассчитанные для стероидных гор монов методом ТСХ. НФ: Сорбфил (Al). (n = 3, P = 0,95) Подвижная фаза Водный раствор ДДС (2,510-2 М) – KCl Ацетонитрил – вода Вещество - ДДС (2,510 М) (70:30) (=0,10) N10-2 Н, мм Rs* N10-2 Н, мм Rs* N10-2 Н, мм Rs* Преднизолон 1,4 0,55 43 2,1 0,48 58 2,3 0,37 Дексаметазон 1,4 0,59 - 3,1 0,20 - 9,0 0,09 Гидрокортизон 6,8 0,12 20 8,3 0,05 46 14 0,06 * Rs рассчитаны по отношению к дексаметазону.

На примере аминокислот установлено, что с возрастанием гидрофобности по движность сорбатов в МПФ уменьшается, т.е. усиливается удерживание на полярной НФ, сопровождающееся изменением порядка элюирования (таблица 3). Это, вероят но, связано с гидрофобизацией НФ при динамической адсорбции ПАВ на ее поверх ности.

Таблица 3 – Взаимосвязь параметра гидрофобности и подвижности аминокислот в водно органических и водных мицеллярных подвижных фазах в ТСХ. НФ: Сорбфил (Al). (n = 3, P = 0,95) Водно-органическая ПФ МПФ ацетонитрил – вода (10:90) водный раствор ДДС (6,010-2 М) 0,67 0,40 0,50 1, lgP 0,50 1,2 1,7 1, Три Лей Тир Лиз Ала Три Лей Тир Соединение Rf 0,77 0,78 0,85 0,77 0,73 0,64 0,41 0, Поскольку водные МПФ оказались непригодными для анализа двух других классов БАВ – флавоноидов и сапонинов – нами была предпринята попытка их мо дификации путем введения в ПФ добавок органического растворителя и сильного электролита. Этот прием известен и описан в литературе, а получаемые таким обра зом ПФ называют модифицированными или гибридными подвижными фазами.

Установлено, что введение органического растворителя в водные МПФ оказы вает положительное влияние лишь на хроматографическое поведение флавоноидов и сапонинов. При введении до 30 об.% пропанола-2 в МПФ, содержащие ДДС, на непо лярном сорбенте подвижность флавоноидов возрастала с увеличением концентрации ПАВ. Разница в подвижности Кв и Рт (Rf) в этом случае составляла 0,32, т.е. была несколько больше Rf = 0,25, чем в ПФ вода – пропанол-2. Чем гидрофобнее сорбат, тем сильнее он удерживается неполярной неподвижной фазой, что следует из полу ченного ряда элюирования флавоноидов Кв Гп Рт Фл, который согласуется с изменением их гидрофобности в системе н-октанол – вода (таблица 4).

Таблица 4 – Ряды подвижности флавоноидов в ТСХ на RP-18. (n = 3, P = 0,95) Водно-органическая ПФ МПФ пропанол-2 – ДДС (2,0·10- М) пропанол-2 – вода (30:70) (30:70) 2,9 2,3 1,4 2,9 2,3 1, lgP 0,35 0, Соединение Фл Рт Гп Кв Фл Рт Гп Кв Rf 0,53 0,37 0,21 0,12 0,71 0,62 0,44 0, Для сапонинов введение постоянной концентрации органического растворите ля также приводило к повышению подвижности сорбатов в модифицированных МПФ. Как и в случае флавоноидов, порядок элюирования сапонинов в модифициро ванной МПФ по сравнению с водно-органической оставался неизменным (таблица 5):

чем гидрофобнее сорбат, тем сильнее он удерживался неполярной неподвижной фа зой.

Таблица 5 – Подвижность сапонинов на RP-18. (n = 3, P = 0,95) Водно-органическая ПФ МПФ бутанол-1 – ЦПХ (2,0·10- М) бутанол-1 – вода (25:75) (25:75) 4,8 7,8 4,8 7, lgP Ол Гл Ол Соединение Гл Rf 0,70 0,53 0,94 0, Установлено, что положительным результатом введения органического раство рителя в мицеллярную ПФ как в планарном, так и колоночном варианте жидкостной хроматографии (ЖХ) является существенное улучшение формы хроматографических зон и пиков сорбируемых веществ. В такой модифицированной МПФ селективность и эффективность разделения флавоноидов и сапонинов выше по сравнению с водно органической ПФ. Так, в случае ТСХ, для кверцетина на полярной НФ значения N увеличиваются в 2 раза, для рутина в 10 раз, а на неполярной НФ и для рутина, и для кверцетина N увеличивается в 2,02,5 раза (таблица 6). Результаты расчетов эффек тивности и селективности разделения смеси сапонинов показывают, что N в растворе, содержащем кПАВ, для Гл – 21103, Ол – 0,83103, что в 47 и 1,5 раза соответствен но превышает значения N в водно-бутанольной ПФ. Значение Rf при этом составляет 0,15.

Таблица 6 – Параметры эффективности и селективности, рассчитанные для различных хроматографических систем. НФ: RP-18. (n = 3, P = 0,95) N·10-3 H·103, мм *Rs Вещество Подвижная фаза Rf * Кверцетин пропанол-2 – вода 0,47 0,25 9,8 3, (30:70) Рутин 0,96 Кверцетин пропанол-2 – ДДС 0,81 0,32 22 4, (2,0·10-2 М) (30:70) Рутин 2,6 * Rs и рассчитаны по отношению к кверцетину.

Исследование этих систем методом ВЭЖХ подтвердило результаты, полученные методом ТСХ: хроматографические пики в присутствии органического растворителя стали более узкими и симметричными (рисунок 2), что соответствует общей тенден ции в мицеллярной жидкостной хроматографии.

Рисунок 2 – Хроматограммы ру тина (а) и кверцетина (б). НФ:

С18. ПФ: 1 – пропанол-2 – вода (30:70), 2 – пропанол-2 – ДДС (2,010-2 М) (30:70) а б Порядок удерживания флавоноидов при использовании модифицированных МПФ в ВЭЖХ, как и в ТСХ, также не изменился по сравнению с хроматографирова нием в ПФ вода – пропанол-2. Кв, как более гидрофобный компонент, также сильнее удерживался неполярным сорбентом (tR = 9,97 мин, Rf = 0,30), чем Рт (tR = 4,77 мин, Rf = 0,62).

Ионная сила раствора, создаваемая добавлением хлорида калия, выбранного на основании предварительных исследований, как и органический растворитель, оказы вает существенное влияние на хроматографическое поведение некоторых БАВ. Так, добавление в МПФ на основе ДДС хлорида калия ( = 0,01 – 1,0) улучшало четкость и компактность хроматографических зон ТСХ стероидных гормонов (таблица 2) и аминокислот (рисунок 3). Подвижность аминокислот при увеличении концентрации электролита в МПФ незначительно возрастала, что, вероятно, связано с их “высали ванием” из водной среды в менее полярное мицеллярное окружение. Введение хлори да калия в водную МПФ не повлияло на хроматографические свойства флавоноидов и сапонинов, зоны которых, независимо от природы НФ и от величины ионной силы раствора, оставались на стартовой линии.

Рисунок 3 – Хроматограммы аминокис лот. НФ: Сорбфил (Аl). ПФ: а) ДДС (6,010-2 М) – ацетонитрил (90:10);

б) ДДС (6,010-2 М) – KCl (=0,15).

СR = 1,010-3 М. 1 – Три, 2 – Лей, 3 – Ала, 4 – Тир, 5 – Лиз, 6 – смесь аминокислот.

а б Проведенные исследования позволили найти оптимальные условия разделения смесей БАВ в модифицированных МПФ: для стероидных гормонов – ДДС(2,510-2 М) – КCl ( = 0,10) для Сорбфила (Al) и колонки с сорбентом С18;

для флавоноидов – этилацетат – ДДС (2,010-2 М) (30:70) на НФ: Сорбфил (Al) и пропанол-2 – ДДС (2,010-2 М) (30:70) на RP-18 и С18;

для сапонинов – бутанол-1 – ЦПХ (2,010-2 М) (25:75) на RP-18 и С18;

для аминокислот – ДДС (6,010-2 М) – KCl ( = 0,15) на Сорбфиле (Аl).

Обобщение и анализ экспериментальных данных в целом позволили установить следующие закономерности, присущие хроматографическому разделению исследуе мых веществ в водных и модифицированных МПФ:

1. Рост подвижности сорбатов с увеличением мицеллярной концентрации ДДС.

2. Увеличение эффективности и селективности разделения сорбатов.

3. Рост удерживания с увеличением гидрофобности сорбатов.

4. Изменение порядка элюирования в водно-мицеллярных ПФ и неизменность порядка элюирования в модифицированных МПФ по сравнению с водно органическими ПФ.

Хроматографическое поведение сорбатов в водных циклодекстриновых ПФ, модифицированных органическими растворителями и сильными электролитами На примере гормонов, флавоноидов и аминокислот изучено влияние других представителей организованных систем – циклодекстринов. Результаты исследований показали, что независимо от природы ЦД повышение его концентрации в ПФ увели чивает подвижность всех сорбатов (рисунок 4). Установлено, что на хроматографиче ское поведение БАВ оказывает существенное влияние природа циклодекстринов. На примере аминокислот показано, что наиболее полное разделение веществ наблюда лось в - и 2-ГП--ЦД ПФ. Это, вероятно, связано с соответствием размеров гидро фобной полости -ЦД и молекул аминокислот, а также с более эффективным вклю чением аминокислот в полость 2-ГП--ЦД в связи с присутствием в его молекуле за местителей, изменяющих условия включения молекул аминокислот в полость по сравнению с -ЦД.

0, 0,9 Rf Rf 0, 0, 0, 0, 0, 0,6 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 2 4 6 8 С(2-ГП--ЦД)10-2, М C(-ЦД)10-2, М а б Rf 1 Rf 0,8 0, 0,6 0, 0,4 0, 0,2 0, 0 0 1 2 3 0 1 2 3 C(2-ГП--ЦД)10-2, М C(-ЦД)10-2, М в г Рисунок 4 – Зависимость подвижности сорбатов от концентрации ЦД.

а) НФ: RP-18. ПФ: водный раствор -ЦД. 1 – Прд (СR = 3,0 мг/мл), 2 – Дк (СR = 4,0 мг/мл);

б) НФ: Полиамид-6. ПФ: водный раствор 2-ГП--ЦД. 1 – Рт, 2 – Гп, 3 – Фл. CR = 1,0 мг/мл;

в) НФ: Сорбфил (Al). ПФ: водный раствор 2-ГП--ЦД. 1 – Три, 2 – Лей, 3 – Тир.

CR = 1,010-3 М;

г) НФ: Полиамид-6. ПФ: водный раствор -ЦД. 1 – Ала, 2 – Три, 3 – Фен.

CR = 1,010-3 М.

Таблица 7 – Параметры эффективности и селективности разделения стероидных гормонов и флавоноидов. (n = 3, P = 0,95) Подвижная фаза Сорбат Н, мм N10- Rf *Rs Стероидные гормоны. НФ: RP- Преднизолон 0,57 0,14 0, CH3CN – H2O (70:30) Дексаметазон 0,63 0,14 0, -ЦД (0,610-2 М) – KCl Преднизолон 0,35 0,18 0, Дексаметазон 0,50 0,17 0, (=0,10) (95:5) Флавоноиды. НФ: Полиамид- кверцетин 0,85 2,4 0, Этилацетат –H2O (70:30) 6, рутин 0,17 0,023 0, кверцетин 2-ГП--ЦД (4,510-2М) – 0,13 0,014 0, бутанол-1 (50:50) рутин 0,80 1,4 0, * Rs рассчитаны для стероидных гормонов по отношению к дексаметазону, для флавоноидов – к кверцетину.

С целью повышения эффективности и селективности разделения сорбатов, улучшения формы хроматографических зон и пиков циклодекстриновую ПФ моди фицировали органическим растворителем и сильным электролитом. Установлено, что увеличение ионной силы, так же как и введение органического растворителя в ПФ, уменьшает подвижность всех сорбатов. Возможно, это происходит из-за протекания конкурирующих реакций комплексообразования между ЦД и электролитом, концен трация ионов которого на несколько порядков больше концентрации сорбатов. Уста новлено также, что использование циклодекстриновых ПФ, модифицированных орга ническим растворителем, изменяет порядок элюирования флавоноидов на Полиами де-6 (таблица 7).

Анализ полученных результатов позволил установить следующие закономерно сти, присущие хроматографическому разделению БАВ в водных и модифицирован ных ЦД ПФ:

1. Рост подвижности сорбатов с увеличением концентрации ЦД в водной ПФ.

2. Уменьшение подвижности сорбатов в ЦД ПФ при модификации органическим растворителем и сильным электролитом.

3. Повышение селективности и эффективности разделения некоторых сорбатов в модифицированных ЦД ПФ.

4. Зависимость подвижности сорбатов от их гидрофобности: чем гидрофобнее сор бат, тем выше его подвижность в ЦД ПФ независимо от природы НФ.

Количественные характеристики разделения биологически активных веществ в мицеллярных и циклодекстриновых подвижных фазах В отличие от классического варианта ТСХ, селективность разделения веществ с использованием циклодекстриновых и мицеллярных ПФ зависит от специфики их распределения между неподвижной фазой и водой (KSW), НФ и молекулами ЦД или мицеллами (KS(CD/М)), а также распределения внутри самой ПФ, т.е. в системе вода – ЦД(мицелла) (K(CD/М)W). Количественная оценка распределения в такой трехфазной системе позволяет выявить процесс, оказывающий основное влияние на разделение в ЖХ. Для выявления вклада каждого процесса в методе ТСХ использованы уравнения Армстронга и Стайна. Результаты проведенного расчета представлены в таблицах 8,9.

Сравнение величин констант, представленных в таблицах 8, 9 показывает, что в исследуемых мицеллярных и циклодекстриновых ПФ процесс переноса сорбатов в мицеллы ПАВ или полость ЦД в ПФ преобладает над их сорбцией на НФ, а значения коэффициентов распределения, как в МПФ, так и в ЦД ПФ, зависят от гидрофобности сорбата, природы НФ и наличия модификаторов (органического растворителя и силь ного электролита).

Так, из таблицы 8 видно, что на пластинах RP-18 с увеличением числа гликозид ных остатков в молекуле флавоноидов (от гидрофобного кверцетина к более гидро фильному фларонину) значения KMW в мицеллы ПАВ уменьшаются. В случае цикло декстринов (таблица 9) присутствие в молекуле БАВ гидрофобных атомов, например, атома фтора в молекуле дексаметазона, способствует увеличению величины K CDW в ЦД ПФ. Видно, что коэффициент распределения KCDW в полость ЦД самого гидро фобного из гормонов дексаметазона более чем в 4 раза превышает KCDW более гидро фильного преднизолона. KCDW для аминокислот в -ЦД ПФ также превышает KCDW для 2-ГП--ЦД, что, вероятно, связано с большим соответствием размеров молекул аминокислот и полости -ЦД.

Таблица 8 – Коэффициенты распределения KМW, KSW, энергия переноса Gпер. веществ из воды в мицеллы ДДС в модифицированных МПФ и энергия адсорбции Gадс. веществ на НФ при 298 К (кДж/моль). (n = 3, P = 0,95) KМW 10- Вещество lgP KSW -Gпер. -Gадс Флавоноиды НФ: Сорбфил (Al). ПФ: этилацетат – ДДС Фларонин – 2,9 5,8 1,3 16 4, Рутин – 2,3 2,6 2,3 14 3, Гиперозид – 1,4 0,68 5,1 10 1, Кверцетин – 0, 0,35 0,67 8,8 НФ: RP-18. ПФ: пропанол-2 – ДДС Фларонин – 2,9 2,2 20 7,7 6, Рутин – 2,3 3,1 26 8,6 Гиперозид – 1,4 3,3 31 14 Кверцетин - 0,35 5,0 15 1, Сапонины НФ: RP-18. ПФ: бутанол-1 – ЦПХ Хедеракозид 1,3 0,57 0,25 9,9 4, Глицирризиновая кислота 4,8 0,49 0,23 9,6 4, Сапонин 6,2 0,31 0,19 8,5 4, Олеаноловая кислота 7,8 0,059 0,12 4,4 3, Таблица 9 – Коэффициенты распределения KCDW, KSW, энергия переноса Gпер. веществ из воды в полость ЦД и энергия адсорбции Gадс. веществ на НФ при 298 К (кДж/моль). (n =3, P = 0,95) Gадс KCDW 10- Вещество lgP KSW -Gпер.

Стероидные гормоны НФ: RP-18. ПФ: водный раствор -ЦД Преднизолон – 1,1 – 1, 0,46 0,30 9, Дексаметазон 0,47 1,9 0,45 13 1, Флавоноиды НФ: Полиамид-6. ПФ: водный раствор 2-ГП--ЦД Фларонин – 2,9 0,68 19 11 0, Рутин – 2,3 0,63 21 10 0, Гиперозид – 1,4 0,66 20 10 0, Аминокислоты НФ: Полиамид-6. ПФ: водный раствор 2-ГП--ЦД Аланин – 0,40 – 4, 0,047 1,5 3, Триптофан – 3, 0,50 0,080 2,3 5, Фенилаланин – 2, 1,9 0,18 0,31 7, НФ: Полиамид-6. ПФ: водный раствор -ЦД Аланин – 0,40 – 1, 0,28 3,2 8, Триптофан 0,50 0,62 1,8 10 0, Фенилаланин 1,9 0,74 0,20 12 0, НФ: Сорбфил (Al). ПФ: водный раствор 2-ГП--ЦД Триптофан 0,50 0,012 0,39 0,23 0, Лейцин – 0, 1,2 0,022 0,37 0, Тирозин – 0, 1,7 0,45 0,15 9, На примере флавоноидов показано влияние природы НФ на процессы распреде ления сорбатов в мицеллярных ПФ. Так, коэффициенты переноса флавоноидов в ми целлы на неполярной НФ превышают коэффициенты переноса флавоноидов на по лярной НФ, что, возможно, связано с динамической модификацией (гидрофилизаци ей) неполярной неподвижной фазы ионами ПАВ и переносом сорбатов в мицеллы ПАВ.

Установлено, что введение в мицеллярную или циклодекстриновую ПФ органи ческого растворителя или сильного электролита приводит к понижению коэффициен та распределения в системе вода – мицелла (ЦД), что, вероятно связано с протекани ем конкурирующих реакций включения модификаторов в полость ЦД или мицеллу ПАВ.

Практическое применение методов ТСХ и ВЭЖХ с модифицированными подвижными фазами на основе ПАВ и циклодекстринов Практическое применение результатов работы состояло в разработке методик оценки степени чистоты биологически активных веществ и их определении в лекар ственных препаратах синтетического и растительного происхождения, в ряде пище вых продуктов.

Оценка степени чистоты коммерческих препаратов стероидных гормонов.

Мицеллярные ПФ на основе ДДС позволили оценить степень чистоты коммерческих препаратов стероидных гормонов. Проанализированы препараты “Преднизолон”, рас твор для внутривенного и внутримышечного введения (Индия), “Дексаметазон”, рас твор для инъекций 0,4 % (Индия), “Гидрокортизона ацетат”, суспензия для инъекций 2,5 % (ОАО “Фармак”, Украина). В таблице 10 приведены результаты сравнения хро матографического поведения гормонов в водно-органической и модифицированной мицеллярной ПФ. Видно, что в МПФ значения Rf между зонами основного вещества и примесей в препаратах больше в 2 – 3 раза, чем в водно-органической ПФ. Установ лено, что количество хроматографических зон в препаратах, полученное методами мицеллярной ТСХ и ВЭЖХ, а также порядок их элюирования одинаковы. Следует отметить, что в МПФ хроматографические зоны (ТСХ) и пики (ВЭЖХ) веществ более компактны и симметричны (рисунок 5).

б а Рисунок 5 – Хроматограммы препарата дексаметазона, полученные методом ВЭЖХ (СR=2,5 мкг/мл) и ТСХ (СR =2,5 мг/мл) соответственно. НФ: С18, Сорбфил (Al).

ПФ: а) CH3CN – H2O (70:30), б) ДДС (2,510-2 М) – КCl (=0,10) (90:10) Таблица 10 – Подвижность отдельных компонентов препаратов гормонов в ПФ:

ДДС (2,510-2 М) – КCl (=0,10). (n = 3, P = 0,95) Препарат, Rf* Подвижная фаза преднизолон дексаметазон гидрокортизон CH3CN – H2O (70:30) 0,30;

0,40 0,20;

0,46;

0,66;

0,83 0,60;

0,73;

0, ДДС – KCl (90:10) 0,29;

0,55 0,16;

0,37;

0,63;

0,83 0,26;

0,47;

0, * Значения Rf зоны основного вещества выделены.

Количественное определение биологически активных веществ в лекарственных препаратах синтетического, растительного происхождения и пищевых продуктах В выбранных оптимальных условиях проведены идентификация и количествен ное определение биологически активных веществ в реальных объектах. Основой пра вильности при всех определениях являлось совпадение подвижности и времени удерживания аналитов в искусственных смесях и анализируемых объектах.

Стероидные гормоны. Методами ТСХ и ВЭЖХ проведено количественное хроматографическое определение прогестерона в лекарственных препаратах “Депо провера” и “Дюфастон”, где он является основным компонентом. Результаты иденти фикации и определения приведены в таблице 11.

Флавоноиды. В вариантах нормально-фазовой и обращенно-фазовой ТСХ и ВЭЖХ в МПФ проведено определение некоторых флавоноидов в пищевых продуктах (шелуха лука, цедра мандарина, яблоко красное, яблоко зеленое, смородина, свекла, петрушка, черника), лекарственных препаратах растительного происхождения (со фора японская, прополис (сухое вещество), настойка прополиса, эхинацея, клевер красный) и синтетическом лекарственном препарате (аскорутине).

Таблица 11 – Результаты определения прогестерона в лекарственных препаратах (n = 3, P = 0,95) Содержание Найдено Найдено Объект ис- основного методом методом Fэксп Fтабл tэксп tтабл следования вещества по МТСХ МВЭЖХ паспорту (Sr) (Sr) “Депо- 148 ± 9 149 ± 150 мг/мл 3,29 0, провера” (0,024) (0,013) 19,0 2, 9,3 ± 0,8 9,7 ± 0, “Дюфастон” 10 мг/ табл. 1,26 1, (0,035) (0,030) Установлено, что в МПФ на Сорбфиле (Аl) и RP-18 подвижности кверцетина и рутина в индивидуальных препаратах, искусственной смеси и объектах совпадают, что свидетельствует о правильной идентификации определяемых веществ. Результа ты определения флавоноидов методом градуировочного графика представлены в таб лицах 12, 13. Правильность контролировали методом добавок.

Таблица 12 – Результаты определения кверцетина и рутина в анализируемых объектах ме тодом мицеллярной нормально-фазовой ТСХ. НФ: Сорбфил (Al). ПФ: этилацетат – ДДС (2,010-2 М) (30:70). (n = 3, P = 0,95) Найдено рутина (Рт) Найдено кверцетина (Кв) Анализируемый Xср X, X/Xср Xср X, X/Xср образец Sr Sr мг/мл мг/мл % % 0,95 0,10 0,036 0,25 0,02 0, Софора японская 11 0,27 0,04 0,051 0,9 0, Шелуха лука 15 0,048 0,71 0, Прополис (сухое вещество) – – – 0,039 0,39 0,04 0, Прополис настойка – – – Таблица 13 – Результаты определения кверцетина и рутина в объектах методами мицел лярной ОФ ТСХ и ОФ ВЭЖХ. ПФ: пропанол-2 – ДДС (2,010-2 М) (30:70). (n = 3, P = 0,95) Кверцетин Рутин Объект Хср ± Х, мг/г Хср ± Х, мг/г Sr Sr Цедра мандарина 0,48 ± 0,01 0,24 ± 0, 0,02 0, *0,50 ± 0,01 *0,26 ± 0, 0,005 0, Яблоко красное 0,62 ± 0,07 0,31 ± 0, 0,04 0, *0,64 ± 0,02 *0,32 ± 0, 0,001 0, Яблоко зеленое 0,37 ± 0,05 0,15 ± 0, 0,03 0, *0,40 ± 0,02 *0,20 ± 0, 0,004 0, Смородина черная 0,74 ± 0,02 0,35 ± 0, 0,04 0, *0,76 ± 0,03 *0,32 ± 0, 0,006 0, Черника 0,68 ± 0,06 0,32 ± 0, 0,06 0, *0,70 ± 0,05 *0,35 ± 0, 0,002 0, Петрушка 0,86 ± 0,07 0,45 ± 0, 0,02 0, *0,87 ± 0,04 *0,42 ± 0, 0,003 0, Свекла 0,47 ± 0,01 0,27 ± 0, 0,04 0, *0,52 ± 0,01 *0,28 ± 0, 0,008 0, Эхинацея 0,24 ± 0,03 0,17 ± 0, 0,06 0, *0,27 ± 0,03 *0,18 ± 0, 0,005 0, Клевер красный 0,32 ± 0,05 0,23 ± 0, 0,07 0, *0,35 ± 0,01 *0,16 ± 0, 0,009 0, Аскорутин 0,63 ± 0,02 0, – – *0,65 ± 0,01 0, во второй строке каждой графы приведены данные ВЭЖХ Сапонины. Разработана методика хроматографического определения сапони нов в лекарственных растениях и пищевых продуктах. Полученные результаты пред ставлены в таблице 14. Правильность идентифицируемых веществ подтверждена с использованием свидетелей. Видно, что оба метода дают близкие результаты.

Таблица 14 – Результаты определения олеаноловой и глицирризиновой кислот в объектах методами мицеллярной ОФ ТСХ и ОФ ВЭЖХ*. ПФ: бутанол-1 – ЦПХ (2,010-2 М) (25:75).

(n = 3, P = 0,95) Содержание Содержание Объект исследо- x/x, x/x, Гл, Хср ± Х, Ол, Хср ± Х, Sr Sr вания % % мг/г мг/г Корни солодки 2,4 ± 0,2 – – – 0,06 6, Настойка корней 2,3 ± 0,2 0,7 ± 0, 0,08 8,9 0,08 солодки Свекла столовая 3,1 ± 0,3 – – – 0,12 9, Слива 1,3 ± 0,2 – – – 0,08 * * * 1,33 ± 0,08 0,005 6, Баклажан 0,9 ± 0,3 – – – 0,11 * * * 0,92 ± 0,09 0,008 7, Картофель 0,6 ± 0,2 – – – 0,09 * * * 0,64 ± 0,08 0,009 9, во второй строке приведены данные ВЭЖХ Аминокислоты. В выбранных оптимальных условиях проведено разделение аминокислот в лекарственном препарате “Гидролизин” (рисунок 6). Установлено, что хроматографические зоны аминокислот в растворах свидетелей и в лекарственном препарате соответствуют друг другу. Таким образом, циклодекстриновые ПФ могут быть использованы для идентификации аминокислот в фармацевтических препаратах.

Результаты количественного определения аминокислот представлены в таблице 15.

Правильность определения подтверждали спектрофотометрическим методом. Обра ботка результатов двух методов по F- и t-критериям показала отсутствие систематиче ской погрешности.

Рисунок 6 – Хроматограммы амино кислот в отсутствие глюкозы в цикло декстриновой ПФ (а), в присутствии глюкозы в циклодекстриновой ПФ (б), в препарате «Гидролизин» (в).

НФ: Сорбфил (Al).

C (2-ГП--ЦД) = 0,0810-2 М.

CR = 5,010-2 М. (С6Н12О6) = 2,0 %.

1 – Тир, 2 – Лей, 3 – Три, 4 – смесь аминокислот.

а б в Таблица 15 Определение триптофана в препарате «Гидролизин». НФ: Сорбфил (Al).

ПФ: 2-ГП--ЦД (0,610-2 М) – КСl (=0,10). (n = 3, P = 0,95;

Fтабл = 19, tтабл = 2,78) Содержа Содержание, ние по Вещество Метод Sr Fэксп tэксп Хср ±Х, мг/100мл паспорту, мг/100 мл ТСХ 17 ± 1 0, Триптофан Спектрофото- 4,21 2, 17,9 ± 0,7 0, метрия ТСХ 20 ± 3 0, Лейцин Спектрофото- 3,76 1,97 20,3 ± 0,9 0, метрия Выводы 1. На основании систематического исследования влияния природы и концен трации ПАВ и циклодекстринов в подвижной фазе на хроматографическое поведение биологически активных веществ различных классов (стероидных гормонов, флавоно идов, сапонинов, аминокислот) показана возможность применения методов мицел лярной тонкослойной (на нормальной и обращенной фазах) и высокоэффективной жидкостной (на обращенной фазе) хроматографии для разделения их смесей, оценки степени чистоты соединений и количественного определения в лекарственных и рас тительных препаратах.

2. Изучено совместное влияние природы и концентрации органического рас творителя, ПАВ и циклодекстринов на хроматографическое поведение представите лей четырех классов биологически активных веществ. Показано, что действие каждо го фактора индивидуально и определяется природой разделяемых веществ. Показано, что особенностью мицеллярной и циклодекстриновой ТСХ на нормальной фазе явля ется динамическая модификация неподвижной фазы, что приводит к обращению ряда элюирования веществ (флавоноидов, аминокислот) и его соответствию ТСХ с обра щенными фазами. Выявлена связь удерживания и гидрофобности сорбатов в мицел лярной жидкостной хроматографии. Установлено, что в водных и модифицированных мицеллярных и циклодекстриновых подвижных фазах эффективность и селектив ность разделения биологически активных веществ выше, чем в традиционных по движных фазах на основе водно-органических растворителей.

3. Рассчитаны коэффициенты распределения исследуемых веществ в системах вода – мицеллы ПАВ (циклодекстрины), вода – неподвижная фаза в нормально фазовой и обращенно-фазовой ТСХ. Показано, что определяющее влияние на по движность биологически активных веществ оказывает процесс солюбилизации в ми целлы ПАВ или включения сорбатов в полость циклодекстринов. Установлено, что коэффициенты распределения в системе вода – мицеллы ПАВ (циклодекстрины) воз растают с увеличением гидрофобности соединений. Показано, что закономерности и особенности хроматографического поведения биологически активных веществ в по движных фазах на основе мицеллярных растворов ПАВ и циклодекстринов в методе ТСХ характерны и для метода ВЭЖХ.

4. Разработаны методики оценки степени чистоты препаратов стероидных гормонов, а также методики количественного определения биологически активных флавоноидов, сапонинов и аминокислот в лекарственных препаратах синтетического и растительного происхождения, а также в пищевых продуктах, отличающиеся боль шей экспрессностью, эффективностью и селективностью по сравнению с известными.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ 1. Сорокина О.Н., Сумина Е.Г., Петракова А.В., Угланова В.З. Применение цик лодекстринов в тонкослойной хроматографии некоторых антиоксидантов полифе нольной природы // Изв. Саратовск. ун-та. Новая серия. Серия Химия. Биология. Эко логия. 2013. Т. 13, вып. 2. С. 23-29.

2. Сорокина О.Н., Сумина Е.Г., Петракова А.В., Барышева С.В. Спектрофото метрическое определение суммарного содержания флавоноидов в лекарственных препаратах растительного происхождения // Изв. Саратовск. ун-та. Новая серия. Се рия Химия. Биология. Экология. 2013. Т.13, вып. 3. С. 8-11.

3. Сумина Е.Г., Угланова В.З., Белая Е.В., Сорокина О.Н. Определение прогесте рона в некоторых лекарственных препаратах методом жидкостной хроматографии в мицеллярных подвижных фазах // Сорбц. и хроматогр. процессы. 2011. Т.11, вып. 5.

С. 654-662.

4. Сумина Е.Г., Угланова В.З., Сорокина О.Н., Афонина Д.О. Определение сте пени чистоты препаратов кортикостероидных гормонов методом тонкослойной хро матографии в подвижных фазах на основе циклодекстринов и ПАВ // Изв. Саратовск.

ун-та. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. 2011. Т.11, вып. 2. С. 48-53.

5. Сорокина О.Н., Сумина Е.Г., Штыков С.Н., Атаян В.З., Барышева С.В. Разде ление D- и L-изомеров аминокислот методом тонкослойной хроматографии в водной подвижной фазе на основе 2-гидроксипропил--циклодекстрина // Сорбц. и хрома тогр. процессы. 2010. Т.10, вып. 1. С. 135-141.

Статьи в сборниках научных трудов 6. Сорокина О.Н., Цымбал О.А., Сумина Е.Г., Угланова В.З. Хроматографиче ское поведение олеаноловой и глицирризиновой кислот в водно-органических ПФ методом тонкослойной хроматографии // IX Всерос. конф. молодых ученых с между нар. участием «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии»:

Межвуз. сб. науч. трудов. Саратов: ООО Изд-во «КУБиК». 2013. С.128-130.

7. Сорокина О.Н., Цымбал О.А., Сумина Е.Г., Угланова В.З. Применение мицел лярных подвижных фаз в тонкослойной хроматографии некоторых сапонинов // IX Всерос. конф. молодых ученых с междунар. участием «Современные проблемы тео ретической и экспериментальной химии»: Межвуз. сб. науч. трудов. Саратов: ООО Изд-во «КУБиК». 2013. С.131-133.

8. Сумина Е.Г., Барышева С.В., Сорокина О.Н. Мицеллярная жидкостная хрома тография в анализе биологически-активных веществ // Всерос. школа-конф. молодых ученых, аспирантов и студентов с междунар. участием «Химия биологически актив ных веществ»: Межвуз. сб. науч. трудов. Саратов: Изд-во «КУБиК». 2012. С.201-202.

9. Штыков С.Н., Сумина Е.Г., Угланова В.З., Загниборода Д.А., Сорокина О.Н.

Тонкослойная хроматография с дифференцирующей газовой фазой для улучшения эффекта разделения биологически активных веществ // Всерос. школа-конф. молодых ученых, аспирантов и студентов с междунар. участием «Химия биологически актив ных веществ»: Межвуз. сб. науч. трудов. Саратов: Изд-во «КУБиК». 2012. С.203-205.

10. Барышева С.В., Сорокина О.Н., Прозапас О.Н., Сумина Е.Г. Хроматографи ческие свойства некоторых полифенольных соединений в мицеллярных подвижных фазах // VIII Всерос. конф. молодых ученых с междунар. участием «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии»: Межвуз. сб. науч. трудов. Са ратов: ООО Изд-во «КУБиК». 2011. С.102-104.

11. Сорокина О.Н., Прозапас О.Н., Барышева С.В., Сумина Е.Г. Идентификация и определение кверцетина и рутина методом тонкослойной хроматографии // VIII Всерос. конф. молодых ученых с междунар. участием «Современные проблемы тео ретической и экспериментальной химии»: Межвуз. сб. науч. трудов. Саратов: ООО Изд-во «КУБиК». 2011. С.116-117.

12. Сорокина О.Н., Сумина Е.Г., Барышева С.В. Влияние хлорида калия на раз деление D- и L-изомеров аминокислот в циклодекстриновой подвижной фазе // Меж дунар. науч.-практ. конф. «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и пер спективы развития»: Материалы конф. Саратов: ИЦ «Наука». 2010. С.387-391.

13. Сорокина О.Н., Атаян В.З., Белая Е.В., Сумина Е.Г. Определение прогесте рона методом жидкостной хроматографии в мицеллярных подвижных фазах // VII Всерос. конф. молодых ученых с междунар. участием «Современные проблемы тео ретической и экспериментальной химии»: Межвуз. сб. науч. трудов. Саратов: ООО Изд-во «КУБиК». 2010. С.173-175.

14. Сорокина О.Н., Сумина Е.Г., Атаян В.З., Афонина Д.О. Определение корти костероидов методами ТСХ и ВЭЖХ в подвижных фазах на основе додецилсульфата натрия // VII Всерос. конф. молодых ученых с междунар. участием «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии»: Межвуз. сб. науч. трудов. Са ратов: ООО Изд-во «КУБиК». 2010. С.396-398.

15. Барышева С.В., Сорокина О.Н., Прозапас О.Н., Сумина Е.Г. Идентификация и определение кверцетина и рутина методом тонкослойной хроматографии в мицел лярных растворах поверхностно-активных веществ // VII Всерос. конф. молодых уче ных с междунар. участием «Современные проблемы теоретической и эксперимен тальной химии»: Межвуз. сб. науч. трудов. Саратов: ООО Изд-во «КУБиК». 2010.

С.223-226.

16. Барышева С.В., Сорокина О.Н., Петракова А.Н., Сумина Е.Г. Изучение хро матографических параметров аминокислот в водно-органических и мицеллярных по движных фазах методом тонкослойной хроматографии // Междунар. науч.-практ.

конф. «Вавиловские чтения»: Материалы межд. науч.-практ. конф. Саратов: ООО Изд-во «КУБиК». 2009. С.259-262.

17. Сумина Е.Г., Штыков С.Н., Атаян В.З., Сорокина О.Н. Исследование влияния концентрации сильного электролита на хроматографическое поведение D- и L изомеров аминокислот // Всерос. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы ветери нарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные технологии переработки сельскохозяйственной продукции»: Материалы конф. Сара тов. 2008. С.153-156.

18. Atayan V.Z., Sumina E.G., Shtykov S.N., Sorokina O.N., Zagniboroda D.A.

Chromatographic separation of optical isomers of amino acids in the mobile phases contain ing receptor molecules // Proc. 10th Anal. Russian-German-Ukrainian Symp. (ARGUS’ - Nanoanalytics) / Ed. by S.N. Shtykov. Nauchnaya Kniga. 2007. P.76-78.

19. Сумина Е.Г., Штыков С.Н., Атаян В.З., Сорокина О.Н. Исследование условий разделения D- и L-изомеров аминокислот методом тонкослойной хроматографии в водной подвижной фазе на основе 2-гидроксипропил--циклодекстрина // Всерос.

науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные технологии переработки сельско хозяйственной продукции»: Материалы конф. Саратов. 2007. С.166-171.

20. Атаян В.З., Сумина Е.Г., Штыков С.Н., Сорокина О.Н. Хроматографическое разделение оптических изомеров аминокислот в подвижных фазах, содержащих мо лекулы – рецепторы // VI Всерос. конф. молодых ученых с междунар. участием «Со временные проблемы теоретической и экспериментальной химии»: Межвуз. сб. науч.

трудов. Саратов: Изд-во «Научная книга». 2007. С. 166-169.

Статьи в сборниках тезисов докладов 21. Сумина Е.Г., Сорокина О.Н., Угланова В.З. Применение мицеллярных по движных фаз в жидкостной хроматографии флавоноидов и сапонинов // Второй съезд аналитиков России: Тез. докл. Москва, 23-27 сентября, 2013. С. 199.

22. Сорокина О.Н., Барышева С.В., Сумина Е.Г. Идентификация и определение сапонинов методом тонкослойной хроматографии // VI Всерос. конф. молодых уче ных, аспирантов и студентов с междунар. участием «Менделеев – 2012»: Тез. докл.

Санкт-Петербург, 3-6 апреля, 2012. С.109-111.

23. Барышева С.В., Сорокина О.Н., Цымбал О.А., Сумина Е.Г. Спектрофотомет рическое определение суммарного содержания флавоноидов в растительном сырье // Всерос. конф. по аналит. спектроскопии с междунар. участием: Материалы конф.

Краснодар, 23-29 сентября, 2012. С.215.

24. Сумина Е.Г., Сорокина О.Н., Угланова В.З., Барышева С.В., Прозапас О.Н.

Определение некоторых биологически активных веществ методом жидкостной хро матографии в мицеллярных и циклодекстриновых подвижных фазах // XIX Менделе евский съезд по общей и прикладной химии: Тез. докл. Волгоград. ИУНЛ ВолгГТУ, 2011. Т.4. С.416.

25. Барышева С.В., Сорокина О.Н., Прозапас О.Н., Сумина Е.Г. Хроматографи ческое определение кверцетина и рутина методом жидкостной хроматографии в ми целлярных подвижных фазах // III Всерос. симп. «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии»: Материалы симп. Краснодар, 2-8 октября, 2011. С.223.

26. Сумина Е.Г., Сорокина О.Н., Белая Е.В., Атаян В.З. Хроматографическое определение прогестерона в подвижных фазах на основе организованных наносистем // Всерос. конф. «Хроматография – народному хозяйству»: Сб. тез. Дзержинск, 19- апреля, 2010. С.109.

27. Сумина Е.Г., Сорокина О.Н., Афонина Д.О., Атаян В.З. Применение мицел лярных подвижных фаз для определения степени чистоты кортикостероидных гормо нов методами жидкостной хроматографии // Всерос. конф. «Хроматография – народ ному хозяйству»: Сб. тез. Дзержинск, 19-23 апреля, 2010. С.110.

28. Барышева С.В., Сорокина О.Н., Сумина Е.Г., Петракова А.Н., Прозапас О.Н.

Раздельное определение некоторых антиоксидантов полифенольной природы мето дом тонкослойной хроматографии // Всерос. конф. «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез»: Материалы конф. Краснодар, 26 сентября – 01 октября, 2010. Краснодар: Изд-во Куб. ун-та, 2010. С.137.

29. Сумина Е.Г., Сорокина О.Н., Атаян В.З., Афонина Д.О., Белая Е.В. Примене ние организованных наносистем для оценки степени чистоты и определения некото рых кортикостероидных гормонов методом жидкостной хроматографии // Всерос.

конф. «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез»: Материалы конф. Краснодар, 26 сентября – 01 октября, 2010. Краснодар: Изд-во Куб. ун-та, 2010.

С.142.

30. Барышева С.В., Петракова А.Н., Сорокина О.Н., Сумина Е.Г. Спектрофото метрическое определение флавоноидов в фармацевтических препаратах растительно го происхождения // I Всерос. конф. «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции»: Сб. тез. Москва, 1-4 декабря, 2009. С.17-18.

31. Барышева С.В., Петракова А.Н., Сорокина О.Н., Сумина Е.Г. Идентификация и определение содержания флавоноидов в фармацевтических растительных препара тах методом тонкослойной хроматографии // I Всерос. конф. «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции»: Сб. тез. Москва, 1 4 декабря, 2009. С.19-20.

32. Сумина Е.Г., Штыков С.Н., Атаян В.З., Сорокина О.Н. Разделение оптиче ских изомеров аминокислот методом ТСХ в подвижных фазах, содержащих цикло декстрины // X Междунар. конф. «Теоретические проблемы химии поверхности, ад сорбции и хроматографии»: Тез. докл. Москва, 24-28 апреля, 2006. С.125.

33. Sumina E.G., Shtykov S.N., Atayan V.Z., Sorokina O.N. Separation of optical isomers of some aminoacids by thin-layer chromatography in mobile phases modified by cyclodextrins // Intern. Congress on Analyt. Sci. «ICAS-2006»: Book of Abstr. Moscow, Russia, 25-30 June, 2006. Vol.1. P.195-196.

Автор выражает глубокую благодарность и признательность научному руко водителю, д.х.н., профессору Е.Г. Суминой;

д.х.н., профессору С.Н. Штыкову за не оценимую помощь в обсуждении ключевых моментов настоящей работы;

д.х.н., профессору А.Н. Панкратову и аспиранту О.А. Цымбалу за консультирование по мо лекулярному моделированию и расчёту индекса липофильности lgP по атомно связево-аддитивной схеме;

заслуженному деятелю науки РФ, д.х.н., профессору Р.К.

Черновой, д.х.н., зав. кафедрой аналитической химии и химической экологии Т.Ю. Ру сановой, д.х.н., профессору Е.Г. Кулапиной, д.х.н., профессору С.Ю. Доронину, д.х.н., профессору Т.Д. Смирновой за всестороннюю поддержку и помощь в обсуждении ре зультатов работы.

_ Подписано в печать 22.11. Формат 60х84 1/16. Объем 1,5 усл. печ. л. Тираж 120 экз. Заказ № 281-Т _ Типография СГУ 410012, г. Саратов, ул. Большая Казачья,112а.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.