авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 |
-- [ Страница 1 ] --

Ю.И.Посудин

Биофизик

Сергей Чахотин

Киев 1995

УДК 578.6

Посудин Ю.И. Биофизик Сергей Чахотин. Киев: Изд-во Нац. аграрного ун-та, 1995. 98 с.

Рассмотрены биографические сведения и основные этапы научной деятельности

выдающегося биофизика Сергея Чахотина, впервые использовавшего сфокусированное

ультрафиолетовое излучение для воздействия на клетку и разработавшего целую серию уникальных методов и инструментов для операций над микрообъектами. Показана перспективность идей С. Чахотина в современных научных исследованиях.

Рецензент: доктор биологических наук, профессор И.Н.Гудков Posudin Yu.I. Biophysisist Sergei Tschachotin. Kiev. Natl. Agricult. Univ. Publ., 1995.-92 P.

The biographical information and the main stages of the scientific activity of the prominent biophysisist Sergei Tschachotin who was the first to use ultraviolet micropuncture for influence upon а сell and to work out a number of unique methods and devices for operations with microobjects are considered. The development of the concepts of S.Tschachotin in modern scientific investigations are demonstrated.

Possoudine J.I. Biophysicien Serg Tchakhotine. Kiev. Nat.Univ. d'Agricult. Publ. 1995.-92 p.

On a considere des donnees biographiques et les principaux etapes de l’activite scientifique de celebre biophysicien Serg Tchakhotine qui a ete le premier qui a utilise micropuncture ultraviolette pour l'influence a la cellule et qui a elabore toute une serie des methodes unicaux et des instruments pour les operations avec les microobjets. On a montre la perspective des idees de S.Tchakhotine aux recherches scientifiques modernes.

Об авторе Юрий Иванович Посудин – профессор, доктор биологических наук, заведующий кафедрой биофизики Национального аграрного университета, Киев, Украина.

Окончил в 1969 г. радиофизический факультет Государственного университета им.

Т.Шевченко. Защитил диссертации: в 1977 г. – на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук (Институт радиотехники и электроники АН СССР, Москва), в 1992 г. – на соискание ученой степени доктора биологических наук (Агрофизический Институт, Санкт-Петербург).

Основные научные интересы автора – применение методов оптической и лазерной спектроскопии для неразрушающей оценки качества сельскохозяйственной продукции и контроля окружающей среды.

Участвовал в научных исследованиях в институтах и университетах Италии, Испании, США, Японии, Германии.

Педагогическая деятельность проф. Ю.И. Посудина связана с преподавание дисциплин „Физика с основами биофизики”, „Биофизика”, „Методы измерения параметров окружающей среды” и спецкурсов „Биофизика окружающей среды” и „Методы неразрушающей оценки качества сельськохозяйственной продукции”. В 1996 г.

читал лекции как Фулбрайтовский стипендиат в США.

Автор учебников и монографий: „Лазерная фотобиология” (1989 г.) „Біофізика”(1995 р.), „Спектроскопічний моніторинг агросфери” (1998 р.), „Lasers in Agriculture” (1998 г.), „Фізика і біофізика навколишнього середовища”(2000 р.), „Методи вимірювання параметрів навколишнього середовища” (2002 р.), „Фізика з основами біофізики” (2003 р.), „Physics with Fundamentals of Biophysics” (2004 г.), „Біофізика рослин” (2004 р.).

Электронная версия книги Ю.И.Посудина «БИОФИЗИК СЕРГЕЙ ЧАХОТИН»

подготовлена в Электронном издательстве «Аналитическая микроскопия» под редакцией проф. А.Ю.Буданцева (рег. № издательства в Министерстве РФ по делам печати, телерадиовещания и средств массовой информации Эл №6072 от 4 февраля 2002 г.) Техническая работа: редактор 1 категории Т.М.Бондарь Электронное издательство “Аналитическая микроскопия” C.С.Чахотин в последние годы жизни Портрет С.С.Чахотина (рисунок Г.Й.Ржимовского) Содержание ПРЕДИСЛОВИЕ ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ БИОГРАФИИ НАУЧНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ I. МИКРОМАНИПУЛЯЦОННАЯ ТЕХНІКА Выделение и перенос клеток Сжатие и иммобилизация Операционные камеры Прокалывание микрообъектов Послеоперационные камеры Микрофиксатор Микрокамера с циркуляцией газа Микроперфузор Микротрансплантатор Микровытягивание клеток Капиллярные камеры Камера испарения Приспособление для измерения дыхания Приспособление для заполнения капилляра Приспособление для термоэлектрических опытов Метод микрокапель П. УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЕ МИКРООБЛУЧЕНИЕ КЛЕТОК Экспериментальная техника Методика микрооблучения Результата микрооблучения клеток РЕАЛИЗАЦИЯ ИДЕЙ С.ЧАХОТИНА В НАШЕ ВРЕМЯ ЗАКЛЮЧЕНИЕ БИБЛИОГРАФИЯ ТРУДОВ С.С.ЧАХОТИНА ИМЕННОЙ УКАЗАТЕЛЬ СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ПРЕДИСЛОВИЕ Бурное развитие науки, которым ознаменовалось начало ХХ-го столетия, стимулировало появление новых экспериментальных и методических подходов к исследованию биологических объектов. Открытие явления радиоактивности, природы рентгеновского излучения, развитие квантовой теории - все это позволило подойти с новых позиций к вопросам изучения процессов жизнедеятельности живых организмов.

В свете этих преобразований в науке, в том числе и на стыке различных дисциплин, особенно яркими представляются жизнь и научная деятельность Сергея Степановича Чахотина - выдающегося биофизика, неутомимого новатора, впервые использовавшего сфокусированное ультрафиолетовое излучение для воздействия на клетку, разработавшего серию уникальных приборов для работы над микрообъектами, заложившего основы целого ряда приемов экспериментальной цитологии, эмбриологии, физиологии. С именем этого ученого связаны успехи современной биофизики, особенно таких ее направлений, как лазерная фотобиология, радиобиология, электрофизиология.

Именно о нем писал великий Альберт Эйнштейн: "Я знаю лично профессора Чахотина как очень серьезного ученого, преследовавшего свои научные цели с энергией и не падая духом, несмотря на очень большие внешние помехи».

К сожалению, деятельность С.Чахотина не получила должного отражения в нашей научной и общественной литературе. Вот почему появление исследования Ю.И.Посудина, посвященного освещению основных этапов жизненного пути и творческой деятельности Сергея Чахотина, можно только приветствовать.

Т.М.ТУРПАЕВ, член-корреспондент РАН «… Люблю я мирные ряды лабораторных ламп зеленых, и пестроту таблиц мудреных, и блеск приборов колдовской.

И углубляться день-деньской в колодец светлый микроскопа…»

(В.Набоков, ''Университетская поэма", 1927 г.) ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ БИОГРАФИИ Сергей Степанович Чахотин родился 13 сентября 1883 г. в Константинополе в семье российского консула Степана Ивановича Чахотина. В десятилетнем возрасте он вместе с родителями переезжает в Одессу, где учится в Третьей гимназии. С 1899 по 1900 год нахо дится из-за болезни в Италии. После окончания гимназии c золотой медалью в 190I г.

поступает в Московский университет на медицинский факультет. Через год за участие в студенческих выступлениях был арестован. Вот как сам С.Чахотин описывает этот период в предисловии к книге Л.В.Боброва "Тени невидимого света" (М., Атомиздат, 1964 г.):

"Исключенный из Московского университета, я выбрал по совету А.Ф.Иоффе для продолжения учебы Мюнхенский университет, в котором гремела тогда слава Рентгена прошло 6 лет со времени открытия им Х-лучей. На его лекциях громадная аудитория была всегда переполненной". И далее: "именно Рентгену я обязан тем, что исследовательский дух, царивший в его лаборатории, обострил во мне, биологе, интерес к физике и привел к открытию принципа и разработке методики микропучка ультрафиолетовых лучей как средства микроопераций над клетками".

В Германий Чахотин учится на медицинском и естественно-научном факультетах в Берлине, Мюнхене, Гейдельберге, специализируясь по физике, химии, зоологии, физиологии. Среди учителей его, кроме В.К.Рентгена, который по словам Чахотина, «...был, можно сказать, самым честным, самым безукоризненным человеком…» нужно назвать химика А.Байера, занимавшегося проблемами синтеза индиго, изучением соединений группы мочевой кислоты и ацетилена, устойчивости различных циклических соединений углерода, свойств непредельных соединений (в 1905 г. Байеру была присвоена Нобелевская премия);

биохимика А.Косселя, открывшего в 1896 г. гистидин, исследователя протаминов и гистонов, лауреата Нобелевской премии 1910 г.;

братьев Гертвигов - биолога Оскара, автора трудов по морфологии беспозвоночных, цитологии и эмбриологии, применившего новые экспериментальные методы в эмбриологии, и Рихарда, зоолога и эмбриолога, сформулировавшего закономерности объемных соотношений ядра и протоплазмы;

Т.Энгельманна, занимавшегося вопросами физиологии нервной и мышечной систем, зрения, сердца. Эти ученые, использовавшие новаторские методы в своей деятельности, несомненно влияли на формирование научного мировоззрения С.Чахотина.

В 1907 г. С.Чахотин окончил Гейдельбергский университет с высшим отличием ("summa cum lande"), защитив диссертацию "Die Statocyste der Heterepoden", посвященную исследованию структуры и физиологии органов равновесия у киленогих моллюсков. За эту работу автору присваивают ученую степень доктора философии.

После учебы а Германии С.Чахотин работает ассистентом в Мессинском университете (Италия), проводит исследования на морских биологических станциях в Виллафранке, Триесте, Неаполе, Гельголанде, Монако и др. В 1908 г., во время Мессинского землетрясения, в возрасте 25 лет, был заживо погребен под развалинами обвалившегося дома и только через 12 часов освобожден.

После возвращения в Одессу О.Чахотин работает в университете, после чего опять едет в Гейдельберг, где занимается проблемами зоологии (проф. О.Бючли) и онкологии (проф.В.Черни). В 1912 г. молодого ученого приглашает И.П.Павлов - знаменитый физиолог, сочетавший в себе способности и к теоретическому анализу, и к экспериментальной деятельности. Создав из своих учеников и последователей научную школу, И.П.Павлов писал: "… Если я возбуждал, направлял и концентрировал нашу общую работу, то в свою очередь сам постоянно находился под влиянием наблюдательности и идейности моих сотрудников...». Работая в должности ассистента в Институте физиологии с I912 по год, С.Чахотин реорганизует физиологическую лабораторию. В этот же период он несколько раз посещает Виллафранку и Неаполь с целью научных исследований.

Начинается первая мировая война. С целью изучения потребностей промышленности в минеральном сырье и обнаружения месторождения запасов руды создается Комитет военно-технической помощи, в рамках которого была организована комиссия сырья и химических материалов. Руководит комитетом А.В.Ферсман, видающийся геохимик и минералог. Активное участие в работе Комитета принимает и С.Чахотин. В этот период ученый примыкает к Г.В.Плеханову, под руководством которого в 1914 т. возникает группа оборонцев "Единство". Это группа поддерживает Временное правительство с его призывами «войны до победного конца".

В 1918 г. С.Чахотин уезжает на Дон, в Добровольческую армию, где руководит отделом пропаганды "Осваг". Осенью 1919 г. он уезжает за границу. С этого момента начинается самый длительный период эмиграции ученого.

Он возвращается в научной деятельности, начав работать в Пастеровском институте (Париж), а потом Океанографическом музее Монако, на зоологической морской станции в Виллафранке. В то же время С.Чахотин пытается дать свою политическую оценку роли российской интеллигенции в происходящих событиях. В своей статье "В Каноссу" он пишет:

"Итак, мы идем в Каноссу. т.е. признаем, что проиграли игру, что шли неверным путем, что поступки и расчеты наши были ошибочны". Статья предназначалась для сборника "Смена всех", который наряду с газетой "Накануне" и другими печатными изданиями отражал взгляды, присущих части русской интеллигенции в двадцатых годах. С газетой "Накануне", выходившей с марта 1922 г. по июнь 1924 г., сотрудничали многие выдающиеся литераторы:

М.Булгаков, В.Катаев, Е.Петров, К.Федин, Вл.Лидин, О.Мандельштам. В редакционную коллегию газеты входил С.Чахотин, литературное приложение редактирует А.Толстой. В Москве в Большом Гнездиковском переулке помещается московское отделение редакции "Накануне".

В 1920 г. С.Чахотин возглавляет отдел в Институте общей патологии в Загребе, а через год становится профессором местного университета. Сложные взаимоотношения ученого с русской эмиграцией вынуждают его через год переехать в Италию. Здесь он участвует в работе Генуэзской конференции, освещая ее работу в газете "Накануне". На конференции С.Чахотин знакомится с. Г.В.Чичериным, Л.Б.Красиным, В.В.Воровским, представляющими Советское государство при обсуждении экономических и финансовых вопросов. В этот период Я.Б.Красин приглашает С.Чахотина принятъ участие в организации советского торгпредства в Берлине. В 1922 г. С.Чахотин получает советское гражданство.

Одновременно он является заграничным сотрудником Народного комиссариата Рабоче крестьянской инспекции.

Не замыкаясь в рамках сугубо научной деятельности, С.Чахотин пишет работы, посвященные научной организации труда: "Организация. Принципы и методы промышленности, торговли, общей администрации и политики" (Москва, 1923), "Европейская литература по научной организации труда" (Москва, 1924), "Рациональная организация научного исследования" (Париж, 1938) и др.

Из-за тяжелой болезни в 1927 г. С.Чахотин уезжает в Геную, где работает в Фармакологическом институте Университета, занимаясь проблемами онкологии. В году по предложению Альберта Эйнштейна ему присуждается премия Исследовательской корпорации (Research Corporation);

в этом же году он возвращается в Германию в Гейдельбергский Институт медицинских исследований. Данный период биографии ученого совпадает с приходом гитлеровской клики к власти. Не оставаясь безучастным к усилению фашизма в Германии, С.Чахотин становится участником антигитлеровского движения, возглавляя пропагандистскую работу в движении "Железного фронта". С приходом Гитлера к власти С.Чахотин вынужден переехать в Данию, где работает в Институте общей патологии. В 1934 году судьба забрасывает С.Чахотина в Париж. Там он занимается научной деятельностью в Институте эволюции в Профилактическом институте, в исследовательской лаборатории госпиталя "Леопольд Беллан", в Институте физико-химической биологии.

Основными проблемами, с которыми ученый связывает свою научную деятельность, является микрооблучение клетки, изучение условных рефлексов по И.П.Павлову у одноклеточных микроорганизмов, этиология рака.

Весомым вкладом в борьбу с фашизмом стала книга С.Чахотина «Le vio des foules per («Психическое насилие над массами путем политической пропаганды»), la politique»

которую он написал в 1939 году. (рис. I). Выход книги был вызван возрастанием опасности со стороны пришедших к власти фашистских режимов в Италии и Германии (рис. 2).

С.Чахотин, анализируя развитие человека в процессе эволюции, Рис. I. Титульный лист книги С.Чахотина "Психическое насилие над массами" (1939 г.) Р Рис.2. Предисловие к французскому изданию книги С.Чахотина "Психическое насилие над массами" пытается дать классификацию инстинктов толпы и объяснить, чем в тот или иной исторический отрезок обуславливалась поддержка диктаторов (рис. 3).

В этот период времени С.Чахотина посещают академики Л.А.Орбели (основоположник эволюционной физиологии), А.А.Богомолец (патофизиолог), М.П.Кончаловский (терапевт), проявившие живой интерес к новым методам исследований С.Чахотина. Ученый много работает, выступает на многочисленных конференциях по вопросам физиологии, цитологии, онкологии. Приглашается с научными докладами в Сорбонну (Париж), в Общество имени Фарадея (Лондон). Его научные успехи отмечаются премиями Французской Академии наук (1936 г.) и Парижской медицинской академии ( г.).

Политическая активность С.Чахотина не остается без внимания фашистов, оккупировавших Париж. В 1941 г. его как советского гражданина, арестовывают и заключают в концлагерь в Компьене, где он проводит семь месяцев. Лишь только вмешательство хорошо знавших С.Чахотина немецких ученых позволило ему приобрести Рис.3. Иллюстрация к книге С.Чахотина "Психическое насилие над массами" свободу. После освобождения Парижа в 1944 г. С.Чахотин читает лекции на курсах активистов "Советского патриота", организовывает научно-политическое общество «Science Action-Liberation» руководит проведением Конференция культурных сил. Основной задачей этих прогрессивных движений было распространение правильных, неискаженных сведений о СССР, борьба против угрозы третьей мировой войны и возрождавшегося фашизма. Во время своей работы в Институте физико-химической биологии С.Чахотин активно участвует в организации первого Международного Съезда сторонников мира в 1949 г.

В 1955 г. он переезжает в Италию, сначала в Геную (Фармакологический институт Университета), затем в Рим (Фармакологический институт, Высший институт здравоохранения, Институт общей физиологии) где С.Чахотин работает вплоть до 1958 г.

В 1958 г. С.Чахотин возвращается на родину. Передо мною копия приказа № 49 по Институту цитологии АН СССР (г. Ленинград) от 18 апреля 1958 г. : «Чахотин Сергей Степанович зачисляется на должность старшего научного сотрудника лаборатории цитологических основ воспроизведения и развития с окладом 3000 руб. в месяц с 18 апреля с.г....Основание: Распоряжение Президиума АН СССР № 2-2865 от 24 декабря 1957 г."

(И.о.директора профессор Ю.И.Полянский).

Распоряжение Президиума АН СССР подписано главным ученым секретарем, академиком А.В.Топчиевым.

В это же время встает вопрос о возможности присуждения С.Чахотину ученой степени доктора биологических наук по совокупности трудов (без защиты диссертации). В отзывах трех рецензентов – С.Романова, И.Соколова и В.Парибока дается блестящая характеристика научной деятельности ученого. Решением ВАК от 28 мая I960 г. С.Чахотину присуждается ученая степень доктора биологических наук (рис. 4). Продолжая работать в области ультрафиолетового облучения клетки, ученый выступает с докладами в Институте цитологии АН СССР, Институте микробиологии АН СССР, на VI-ом Всесоюзном съезде анатомов, гистологов и эмбриологов в Киеве (1958 г.), на Съезде физиологов в Минске (1959 г.) и Обществе физиологов в Ленинграде (1959 г.), в Институтах цитологии и зоологии (Ленинград), Морфологии животных (Москва), в МГУ, в Институте экспериментальной патологии и терапии (Сухуми). Демонстрирует свои методы и приборы на Международном симпозиуме по радиобиологии (Москва, I960 г.).

МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ СССР ВЫСШАЯ АТТЕСТАЦИОННАЯ КОМИССИЯ ДИПЛОМ ДОКТОРА НАУК МБЛ № Москва 11 июня 1960 г.

РЕШЕНИЕМ ВЫСШЕЙ АТТЕСТАЦИОННОЙ КОМИССИИ ОТ 28 мая I960 г.

(протокол № 17) ЧАХОТИНУ Сергею Степановичу ПРИСУЖДЕНА УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Печать Высшей Аттеста- П.п. Председатель ционной комиссии при Высшей Аттестационной Подпись Министерстве высш. и Комиссии среднего специального Зам. Ученого Секретаря образования СССР Высшей Аттестационной Подпись Комиссии Рис. 4. Решение ВАК СССР о присуждении С.С.Чахотину ученой степени доктора биологических наук Распоряжением по Институту цитологии АН СССР от 29 октября I960 г. С.Чахотин переводится в Москву, в Институт биофизики АН СССР, где он работает до 1967 г. Нельзя сказать, что научный путь С.Чахотина в стенах этого учреждения был усыпан розами. Когда он находился за границей, его работы привлекали внимание многих ученых, в том числе и приезжавших из Советского Союза. Здесь же, за все восемь лет пребывания ученого в институте администрация так и не удосужилась хоть раз посетить его лабораторию, поинтересоваться проведением исследований. Были и проблемы материально-технического обеспечения, и отказы в поездках на международные конференции.

Все это привело к тому, что с 16 сентября 1967 г. С.Чахотин зачисляется в порядке перевода в Институт биологии развития АН СССР, где работает в должности научного сотрудника, а с 1 июля 1970 г. - научным консультантом вплоть до самой смерти, которая настигла ученого 24 декабря 1973 г.

У Сергея Степановича от трех браков ( с Эммой Вильгельмовной Гааз, Серафимой Никитичной Омелаевой и Анной Марковной Свенчанской ) остались сыновья Сергей ( г.р.), Игорь (1911 г.р.), Вениамин (1917 г.р.), Евгений (1922 г.р.), Андрей (1939 г.р.) и Петр (1943 г.р.).

Согласно соглашению, заключенному между сыновьями, прах отца был захоронен на острове Корсика, в селении Каржез.

НАУЧНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ Любое научное исследование начинается с постановки проблемы, выбора и обоснования методов ее решения. В этом плане следует отметить, что начало научной деятельности С.Чахотина совпало с развитием представлений о биологической клетке как элементарной биологической единице, в пределах которой совершается основная ее жизнедеятельность. Нельзя не отметить при этом несомненного влияния на научное мировоззрение ученого таких новаторов, использовавших оригинальные экспериментальные приемы в своих исследованиях, как В.К.Рентген, О.Гертвиг, Т.Энгельманн, И.П.Павлов.

Представляя С.Чахотина к присвоения ученой степени доктора биологических наук, один из рецензентов С.Романов пишет: "Основные постулаты о том, что клетка является элементарной морфологической единицей живой материи и что законы физики и химии лежат в основе жизнедеятельности живой клетки, стали методологической основой научного мышления большинства биологов. Эта строго научная материалистическая методология была положена С.С.Чахотиным в основу всей его последующей деятельности. Проблему, избранную им для исследования, можно формулировать так: "Физико-химические основы поведения клеток". Выбор этой проблемы свидетельствует об эрудиции автора, о его глубоком понимании актуальных проблем современной биологии".

Свои ранние исследования С.Чахотин посвящает изучения биоэлектрических токов у позвоночных. Автор не только рассматривает природу этих токов, но и ставит вопрос о связи биоэлектрических явлений с морфологической структурой тканей.

Особое внимание уделяет ученый проблеме терапии злокачественных опухолей. Ему удается установить связь восприимчивости мышей к раку с лейкоцитарной формулой крови.

Работая в Гейдельберге (1912 г.) и в Генуе (1928-1930 гг.), он публикует работы о роли лейкоцитоза при раке лабораторных животных, вызванном канцерогенными веществами.

Нарушение гликолитического процесса части развивающегося яйца морского ежа позволило С.Чахотину инициировать явления, сходные с малигнизацией тканей. За свою работу "Клеточный микроскоп и проблема рака" ученый удостаивается в 1936 г. премии Парижской медицинской академии.

Но основной сферой научной деятельности является разработка методов и средств микроманипулирования с отдельными клетками, а также микрооблучение клеток и их органелл сфокусированным ультрафиолетовым излучением.

Говоря о необходимости развития экспериментальной цитологии, сам Чахотин признает, что и до него имели место попытки ряда ученых исследовать отдельные клетки ( Balbiani E.G.,l888;

Bataillon Е., 1910;

Chabry L.,1887;

Maupas E.,1888;

Roux W.,1895;

Verworn M., 1889 и др.). Однако данные исследователи использовали довольно крупные объекты – яйца лягушек и других амфибий. В ряде случаев господствовал подход, основанный на исследовании закономерностей, присущих однородным массам клеток с последующей экстраполяцией результатов на отдельную клетку. Можно отметить и метод дифференциального центрифугирования, при котором происходит разрушение клеток и распределение содержимого в соответствии с удельным весом по фракциям с последующим изучением свойств отдельных органелл – ядер, митохондрий, микросом и т.д.

С.Чахотин, тем не менее, приходит уже в своих ранних работах по исследованию биоэлектрических токов у беспозвоночных и по изучению физиологии органа равновесия моллюска Рterotrachea к выводу о необходимости изучения процессов жизнедеятельности живых организмов на основе экспериментальных подходов, применяемых к изолированным клеткам многоклеточного организма или к одноклеточным организмам.

Начиная с 1912 г. С.Чахотин разрабатывает целую серию микроманипуляторов, микрооператоров и других устройств для обеспечения механических приемов и операций над клеткой под микроскопом. При этом исследователем была учтена необходимость перемещения клеток, их фиксации, иммобилизации, извлечения, помещения в различные сосуды. Рассмотрим более подробно особенности предложенной С.Чахотиным микротехники.

1. МИКРОМАНИПУЛЯЦИОННАЯ ТЕХНИКА Выделение и перенос клеток При необходимости изоляции подвижных клеток (водорослей, инфузорий) предлагается использовать длинные капилляры с воронкообразным концом. Этот конец подводят к объекту и втягивают его с помощью резиновой пипетки. Другой метод предусматривает использование стеклянного мундштука, который исследователь держит во рту и который связан посредством резиновой трубки с капиллярообразным концом. При работе с неподвижными объектами (например, яйцеклетками) используют метод прецизионной микрокапиллярной пипетки (сам Чахотин дал ей название "мипетки").

Техника изготовления этой пипетки представлена на рис. 5 (в разделах 1 и 2 представлены рисунки, заимствованные из работ С.С.Чахотина). Стеклянную трубку длиной около 15 см и диаметром 5 мм вытягивают в длину над огнем так, чтобы образовался капилляр длиной см и диаметром от 0,5 до 0,7 мм (а). Обрезают капилляр и оплавляют отрезанный конец до образования шарика (b). После этого шарик выдувают до появления пузырька, предварительно одев на трубку резиновый шланг (с). Вытягивают капилляр над огнем и обламывают его (d). Пузырек нагревают (е), воздух в нем расширяется. Конец капилляра опускают в подготовленную жидкость;

воздух при охлаждении сжимается и засасывает жидкость (f ). На пипетку одевают кусок пробки для теплоизоляции (g) и удерживают ее пальцами.

Работают с пипеткой следующим образом. Пробковую пластину удерживают большим и средним пальцем (рис. 6, а), при этом касаясь стеклянного пузырька внутренними поверхностями пальцев. За счет тепла пальцев из капилляра выйдет немного жидкости.

Затем конец пипетки погружают в жидкость с исследуемыми объектами и подводят под микроскопом конец капилляра к избранному объекту. Раздвигают пальцы (рис.6, b );

воздушный пузырек охлаждается, жидкость всасывается внутрь вместе с объектом. Для извлечения объекта пипетку переносят в другой сосуд и сжимают пальцы. Вместо нагрева рукой автор предлагает использовать электроподогрев с помощью намотанной вокруг капилляра спирали.

Рис. 5. Капиллярная пипетка с воздушным пузырьком (пояснения в тексте) Рис. 6. Работа с микропипеткой: а) при удалении объектов;

b) при всасывании объектов Сжатие и иммобилизация Некоторые исследователи использовали для иммобилизации подвижных микрообъектов плотные среды, в которых скорость движения организмов существенно замедлялась, или использовали способность организмов на некоторое время оставаться неподвижными при контакте с твердыми объектами (т.н. "сигмотаксис"). С.Чахотин предложил метод иммобилизации микрообъектов с помощью небольшого сжатия.

Предложенный ученым микрокомпрессор (рис.7, а) состоит из латунной пластинки D толщиной 1 мм с отверстием посередине, под которым приклеивают небольшой кусок стеклянной или кварцевой пластины S. С обеих сторон установлены два металлических штыря (рис. 7, b). Вторая латунная пластина D снабжена отверстием большего диаметра, которое закрыто покровным стеклом dg. Пластина оборудована мягкими прокладками f для предотвращения препарата от раздавливания. Два небольших отверстия в пластине соот ветствуют штырям верхней пластины (рис. 7, с). На основание S c помощью микропипетки наносят каплю воды с клеткой и соединяют верхнюю и нижнюю пластины (рис. 7, с). Весь узел помещают на предметный столик микроскопа (рис. 8);

с помощью винтов Sr прижимает обе пластины друг к другу. При этом микроорганизм плавно сжимается и иммобилизуется, оставаясь неповрежденным.

Если вместо покровного стекла на отверстии закрепить небольшую узкую пластинку (рис. 7, d), то техника введения и извлечения клетки существенно упрощается. При этом в приспособление с помощью пипетки вносят каплю воды, располагая конец пипетки между краями отверстия и узкой пластиной. Аналогично вводят и микроорганизм, который располагается под пластиной. Излишек воды убирают. В данном варианте можно Рис. 7. Конструкция микрокомпрессора: а. приспособление с введенной пластиной;

b. верхняя, пластина;

с. нижняя пластина;

d. верхняя пластина с закрепленной узкой пластинкой Рис. 8. Размещение микрокомпрессора на предметном столике микроскопа (пояснения в тексте) совмещать механические, световые, тепловые и химические факторы воздействия на микроорганизмы. Размещая на пластинке волос или тонкую нить, можно обеспечить разре зание клетки. Располагая клетку у края пластинки, можно осуществлять различные микроманипуляции с ней – уколы, электрораздражения и т.д.

Операционные камеры При работе с неподвижными микрообъектами (яйцами, амебами) не всегда возникает необходимость прижимать исследуемые объекты. В этом случае используют операционные камеры более простой конструкции. Одна из таких камер изображена на рис. 9.

Представляет она собой предметное стекло, на котором расположены четыре широких пластины b и четыре более узкие пластины s;

в образованные пустые полости вкладывает две пластины р, создающие при этом прямоугольные камеры. Над обеими камерами располагают длинную пластину q которая прижимается пружиной f. Эти камеры запол няется с помощью пипетки - одна раствором флуоресцеина, другая -жидкостью, в которую попадает объект. Сам объект вводят с помощью микропипетки, свободный конец которой подводят под покровное стекло операционной камеры, а затем приближением ладони к стеклянномy пузырьку обеспечивает ввод клетки а камеру (рис. 10). После манипуляций с клеткой вывод ее из камеры осуществляется в обратной последовательности. Сам манипулятор с микропипеткой изображен на рис. 11. Нa трехгранном основании перемещается рейтер, на котором расположены перпендикулярно направленные салазки S1.

Нa них размещена трубчатая колонка S со штангой St. На штанге закреплена пластина Р1 с гильзой u и патрубком R, который может выдвигаться и поворачиваться вокруг своей оси. В патрубок вставляется пробка к с манипулятором, состоящим из зажима V, иглой со стеклянной головкой N и пипеткой Ml. Данная система позволяет реализовать любые перемещения пипетки относительно операционной камеры.

Рис. 9. Операционная канальная камера (пояснения в тексте) Рис.10. Введение клетки в канал с помощью микропипетки Рис.11. Микроманипулятор с микропипеткой (пояснения в тексте) Один из вариантов камер представляет собой вырезанное из бумаги кольцо с внешним диаметром 6 мм и внутренним - 4 мм. Кольцо r погружает в расплавленный парафин, охлаждают и располагают на предметном стекле, слегка подогрев последнее (рис.

12).

Рис. 12. Операционная камера (пояснения в тексте) При этом кольцо приклеивается к стеклу. Вводят каплю парафинового масла (о) внутрь кольца. С помощью микропипетки с резиновой трубкой просверливают в слое парафинового масла отверстие, и на дно углубления помещают каплю воды w. В каплю переносят клетку. С помощью второй пипетки вносят каплю флуоресцеина f для удобства ориентации. Преимущество метода заключается в том, что препарат не надо закрывать покровным стеклом - слой парафинового масла и защищает объект от высыхания, и обеспечивает возможность наблюдения за ним.

Прокалывание микрообъектов Конструкция микрооператора, предназначенного для хирургических действий над клетками, изображена на рис. 13. Предварительно, с помощью зубчатой передачи, производится грубая установка инструмента, а затем, вращая головку d и зажимное кольцо Kr, осуществляют точное подведение держателя инструмента ih к объекту, после чего производят операцию.

Рис.13. Конструкция микрооператора, предназначенного для хирургических действий над клетками (пояснения в тексте) Послеоперационные камеры В качестве послеоперационных камер С.Чахотин предлагает использовать несколько (8-10) колец r из парафинированной бумаги, наклеенных на предметное стекло (рис.14,а).

На дно таких камер с помощью капиллярных трубок можно помещать парафиновое масло р, в которое вносится капля жидкости f с исследуемой клеткой. Если капля слишком велика и ее поверхность выступает из парафинового масла, прибегают к многократному касания этой капли тонким капилляром К (рис. 14, b).

Рис.14. Камера с парафинированными кольцами: а. вид сверху;

b. вид сбоку (пояснения в тексте) Eще один вид послеоперационной камеры изображен на рис. 15. На покровное стекло р наклеивают парафинированное кольцо r;

в углубление вводят каплю воды T с исследуемой клеткой. Затем покровное стекло переворачивают и устанавливают его углублением с каплей вниз на предметное стекло ot со сферическим углублением d. Для предотвращения испарения капли кольцо приклеивают с помощью парафина g. Вокруг исследуемой капли можно нанести капли K с контрольными клетками.

Рис. 15. Камepa с подвешенной каплей: а.

вид сверху;

b. вид сбоку (пояснения в тексте) Рис. 16..Капиллярная послеоперационная камера ( К- капилляры;

W - парафиновые барьеры) Рис. 17. Послеоперационная камера с обновлением потока среда (пояснения в тексте) В ряде случаев в такую камеру можно расположить ряд тонких капилляров с клетками (рис. 16).

При необходимости сообщения клетке непрерывной аэрации или обновления воды используется камера следующей конструкции (рис. 17). Две чашки Петри вставляются одна в другую. Во внешней чашке aS находится вода;

в середине внутренней чашки iS располо жено основание So, на котором покоятся радиально расположенные заостренные стеклянные трубки o. Торцы этих трубок закрыты заглушками р, через которые с помощью капилляров h и притока H жидкости создается разность уровней жидкости во внешней и внутренней чашках. Исследуемый объект подводят к заостренному концу трубки;

за счет разности давлений он всасывается и располагается на дне трубки, где его можно наблюдать.

Среда при этом непрерывно обновляется.

Микрофиксатор Данное устройство, представляющее собой комбинацию камеры с углублением в перевернутом виде и микропипетки, предназначено для быстрого закрепления клетки.

Конструкция микрофиксатора изображена на рис. 18. Две латунные пластины R размерами 4х8 см располагают одну над другой на расстоянии 5 мм;

толщина каждой пластины 1 мм. В нижней пластине имеется отверстие диаметром 20 мм;

в верхней выполнено отверстие диаметром 10 им с прорезью S1 шириной 4 мм, которая тянется до края пластины. Слева расположена гильза h со штифтом St, который поддерживает пружинящую трубку t. В последней зафиксированы более тонкая трубка r, которую можно перемещать перпендикулярно штифту. В ней же расположена микропипетка Mi. На верхнюю пластину приклеивают покровное стекло. На нижнюю Рис. 18. Микрофиксатор с микропипеткой (пояснения в тексте) поверхность покровного стекла наносят каплю парафинового масла р, в которую, в свою очередь, помещают каплю воды w с исследуемой клеткой (для этого устройство переворачивают). Пипетка может содержать любой реактив - краситель, яд, среду, электролит и т.д. Для целей калибровки системы в парафиновое масло вводят каплю флуоресцеина f.

Микрокамера с циркуляцией газа Это устройство предназначено для исследования реакций клеток на внешние физические факторы при различных условиях аэро- и анаэробиоза, при изучении влияния газовой среды. Конструкция устройства (рис. 19) состоит из латунной пластины р толщиной 1 мм с отверстием диаметром 15 мм, снабженной двумя планками l высотой 5 мм. Нa пластине расположен блок b размерами 30х25х5 мм с отверстием диаметром 10 мм. С этим отверстием связаны трубки r со шлангами g.

Трубки проходят через пазы e в планках l.

Рис. 19. Микрокамера с циркуляцией газа (пояснения в тексте) На верхнюю поверхность блока прикрепляют парафином покровное стекло d. Блок переворачивают, нанося на внутреннюю поверхность покровного стекла каплю парафинового масла, в которую помещают каплю воды с исследуемым объектом. После этого блок вновь переворачивает, закрыв при этом отверстие кварцевой пластиной. По шлан гам в собранное и подготовленное устройство подают газ (светильный или, при необходимости изменения рН среды, аммиак или хлористый водород).

Микроперфузор Это устройство позволяет обеспечивать потоки жидкости вокруг исследуемого объекта с целью исследования одновременного воздействия физических и химических факторов. Конструкция устройства (рис. 20) состоит из четырех частей (а-d). Самая нижняя пластина выполнена из латуни (размеры ее 45х90х2 мм (рис. 20, а). Внутри имеется четырехугольное углубление размерами 27х50х1 мм с отверстием диаметром 15 мм. Справа и слева расположены два резьбовых штифта St с резиновыми трубками g. Пластина оборудована шарнирами Sr со штифтами S, гильзой h и стержнями gs, между которыми располагает полоски фильтровальной бумаги fp предназначенные для транспортировки жидкости. Вторая часть устройства состоит из пластины размерами 27х50х1 мм (рис. 20, b ), которая входит в углубление первой пластины. В центре второй пластины имеется прямоугольный вырез 5х7 мм, по периметру которого приклеены два стеклянных цоколя So.

В пластине имеются два отверстия lo, соответствующие штифтам первой пластины. Третья пластина (рис. 20, с ) имеет размеры 27х50х1 мм;

в центре ее выполнен прямоугольный продольный вырез 7х13 мм. Вдоль длинных краев щели располагает планки lе, на которые помещают кварцевую пластину q размерами 5х10 мм.

Рис. 20. Компрессионнный микроперфузор (пояснения в тексте) Наконец, четвертый элемент конструкции (рис, 20, d ) представляет собой пластину размерами 20х80х1 мм. Она оборудована планками высотой 1 мм вдоль прямоугольного выреза 14х13 мм, над которым располагают покровное стекло dg.

Нa кварцевую пластину третьего элемента конструкции поступает жидкость с исследуемым объектом. "Сэндвич" из четырех элементов собирают, фиксируют с помощь гаек sm, соблюдая меры предосторожности с тем, чтобы не раздавить объект.

Подавая капли воды или перфузионной жидкости на конец одной из полосок фильтро вальной бумаги и используя с другой стороны сухие полоски, обеспечивают поток жидкости вокруг объекта.

Микротрансплантатор Устройство предназначено для трансплантации клеток, фрагментов яиц и т.д.

Состоит из алюминиевого объектодержателя, в середине которого с помощью скоб К закреплена кварцевая пластина q (рис. 21, а). К ней приклеены три стеклянные пластины: одна из них (а) образует канал с подвижной пластиной d, а две другие служат в качестве направляющих при перемещении пластины d, на которой приклеена еще одна стеклянная пластина, закрывающая канал. Пластина d перемещается с помощью штифта s и рычага l на шарнире Sr. Система оборудована стеклянными трубками r в каждую из которых вставлена тонкая стеклонить g со сферическими утолщениями на конце (рис. 21,b ). Другие концы стеклонити механически связаны с рычагами sl. Перемещая их, можно добиться прижатия друг к другу двух яйцеклеток Z. Место контакта sb облучается ультрафиолетовым светом, после чего клетки склеиваются.

Еще один вариант микротрансплантатора изображен на рис. 22. На латунную пластину Р размерами 60х75х1 мм с отверстием lc укладывают вторую пластину р размерами 25х75х3 мм так, чтобы обе пластины плотно прилегали друг к другу.

Рис. 21. Прибор для трансплантации клеток (a - общий вид сверху);

b - две яйцеклетки, прижатые в канале перед микрооблучением (пояснения в тексте) Рис. 22. Вариант, микротрансплантато ра (пояснения в тексте).

В верхней пластине имеется отверстие диаметром 10 мм, на которое укладывают кварцевую пластину q с тонким каналом, образованным приклеенными стеклянными планками. По бокам от канала приклеены короткие стеклянные трубки r, служащие направляющими для штифтов g. Кроме того, на верхней пластине установлен блок b с винтом sr, сопряженным со штифтом в направляющей f, крючком h и резиновым кольцом gr. Нa основной пластине смонтированы направляющие s, пластина bl с покровным стеклом d, выполняющим функции крышки канала. В правом углу установлена компрессионная пипетка pi, состоящая из латунной трубки ro c отверстием 1, резиновой трубки gk и стеклянного капилляра Kp. Латунная трубка соединена с резиновым шлангом gu, зажимами pl и пробкой gs. Конец капилляра входит в канал, ширина которого регулируется таким образом, чтобы соединить исследуемые клетки перед облучением.

Микровытягивание клеток В ряде случае клетки, обладавшие определенной пластичностью, можно деформировать, придавая им цилиндрическую форму, удобную для извлечения ядер или микрооблучения. Процедура связана с всасыванием яйца в капиллярную трубку с помощью шприца. Внутренний диаметр трубки несколько меньший диаметра яйца. Поворотом головки шприца добиваются всасывания яйца;

противоположным поворотом обеспечивают выталкивание яйца из капилляра (рис. 23, a,b). Клетку после этой операции можно разрезать (рис. 23, c ) с помощью бритвенного лезвия r, элемент которого вставляется в валик (рис. 23, d).

Рис. 23. Микровытяжной прибор (пояснения в тексте) Капиллярные камеры Эти приспособления позволяют вводить клетки в капилляры и выводить их оттуда.

Конструкция капиллярной камеры изображена на рис. 24, a. На предметном стекле расположены две пластины l и r, между которыми с помощью капель жидкости f устанавливают капилляр k. Клетку вводят в левую каплю;

поворотом пластины r добиваются понижения правого конца капилляра относительно левого. Клетка при этом втягивается в капилляр. Когда она доходит до середины капилляра, осуществляют отрыв капилляра от обеих капель путем подъема его с помощью рычага h с вилкой g (рис. 24, b).

После этого капилляры размещают в одну из послеоперационных камер (типа той, которая изображена на рис.16) для исследования клеток и манипуляций с ними.

Рис. 24. Капиллярная камера: а - вид сверху;

b -вид сбоку (пояснения в тексте) Камера испарения Данное устройство позволяет иммобилизовать подвижные клетки, исследовать воздействие на них различных газов. Конструкция, изображенная на рис. 25, состоит из металлической рамы r размерами 110х60х16 мм, закрытой сверху и снизу стеклянными пластинами, причем верхняя пластина - съемная. Камера снабжена двумя планками и объектодержателем ot с отверстием в центре, направляющими sl и кварцевым покровным стеклом q. Образованное отверстием пространство в объектодержателе может быть герметично закрыто с помощью парафинового масла. Сверху располагают обычное покровное стекло dg, которое также смазано парафиновым маслом и на которое переносят каплю с клеткой. У передней стороны камеры припаяна латунная трубка со штифтом st. Для подвода и отвода, газов используются трубки gr. На дне камеры имеется сосуд с концентрированной серной кислотой, необходимой для осуществления процесса испарения Рис. 25. Испарительная камера (пояснения в тексте) жидкости капли. Испарение контролируется через микроскоп;

при иммобилизации клетки с помощью штифта камера закрывается и испарение прекращается.

Приспособление для измерения дыхания Зачастую представляет интерес исследование процесса обмена веществ в отдельной клетке и установление роли клеточных органелл в этих процессах. Например, можно проводить микрооблучение отдельных органелл (таких как ядра) с одновременным измерением дыхания клеток. Для этой цели С.Чахотин предлагает следующее приспособление (рис. 26), состоящее из тонкого кварцевого капилляра длиной 10 мм и внутренним диаметром 0,2 мм. В капилляре последовательно располагают: каплю парафинового масла p1 в качестве заглушки, каплю жидкости W с исследуемой клеткой Z, газовый пузырек g, каплю едкого калия К и еще одну каплю парафинового масла p2.

Капилляр устанавливает на предметном стекле рядом с еще одним капилляром с раствором флуоресцеина, необходимого для фокусировки ультрафиолетового излучения. Процесс измерений сводится к определению объема газового пузырька с помощью окулярометра. В процессе дыхания кислород уходит из газовой смеси, а образующийся углекислый газ поглощается едким кали, объем газового пузырька при этом уменьшается.

Рис. 26. Приспособление для измерения дыхания (пояснение в тексте) Приспособление для заполнения капилляра Процесс заполнения капилляров связан с такими технологическими операциями, как насечка, ломка капилляров и их заполнение. Для первых двух операций используются следующие конструкции. Одна из них, изображенная на рис. 27, состоит из латунной пластины с планкой l, к которой подводят капилляр К, фиксируемый пластинами pl с помощью винтов Sr. В центре пластины имеется отверстие lo диаметром 5 мм, над которым расположен алмазный резец d в оправе b. Поворот резца осуществляют с помощью держателя h. Резцом надсекают капилляр в нужном месте. Ломают надсеченный капилляр с помощью другого приспособления (рис. 28), представляющего собой латунную пластину W с прямоугольным углублением f в центре, закрытым покровным стеклом. К упорной планке а подводят капилляр K, который фиксируется с помощью пластины S. Насечку располагают над отверстием;

используя латунный блок b с трубкой, штифтом st и пружиной sf путем нажатия штифта производят ломку капилляра K.

Рис. 27. Микронадсекатель (пояснения в тексте) Рис. 28. Микроломатель надсеченного капилляра (пояснения в тексте) Процесс заполнения капилляра производят с помощью устройства, изображенного на рис.29. На латунном основании р размером 40х90 мм с отверстием lo в центре располагают каретку с пластиной pl, перемещающейся вдоль основания. На пластине имеется еще одна каретка с узкой пластиной el, перемещающейся поперек основания. В центре этой пластины крепится с помощью прижимных винтов pr планка m, которая прижимает четыре стеклянных капилляра gk и пипетку d с клеткой. Один из капилляров (b) заполнен парафиновым маслом, второй (c) - жидкостью с исследуемой клеткой, третий (d) – 5%-ным раствором едкого кали, четвертый (e) - газом. Устройство состоит из всасывающей и компрессорной полоски st, латунной трубки r, шланга gu, стеклянной трубки g колпачка K. Для сжатия используется латунная коробка mk, одна из стенок lw которой может выдвигаться с помощью винта ds. Кварцевый капилляр qk последовательно, путем перемещения каретки с капиллярами b-e, заполняется содержимым этих капилляров, после чего проводят эксперименты с дыханием.

Рис.29. Приспособление для заполнения капилляра (пояснения в тексте) Приспособление для термоэлектрических опытов Вставляемый в держатель микроманипулятора инструмент состоит из цапфы Z к которой прикреплено плоское асбестовое кольцо А (рис. 30). К его нижней стороне прикреплена проволочная спираль S, свободные концы которой входят и зажимы на эбонитовой пластине E. К этим зажимам подводится напряжение 4 В. Контроль температуры производится с помощью капелек окрашенного в различной степени парафина, которые плавятся при различных температурах.

Для термоакустических опытов в держатель вставляется двойная микроигла M (рис. 31), обе части которой изолированы друг от друга и соединены с источником напряжения.

С.Чахотин предусмотрел и комбинацию микропипетки с электрическим нагревателем. При прохождении электрического тока через спираль стеклянный баллончик пипетки нагревается и пипетка действует как компрессор;

удаление спирали вызывает охлаждение воздуха в пипетке, которая при этом всасывает объект.

Рис. 30. Приспособление для термоэлектрических опытов (пояснения в тексте) Рис. 31. Приспособление для термоакустических опытов (пояснениия в тексте) Метод микрокапель Предложенная С.Чахотиным методика позволяет использовать микрокапли для хранения в них клеток, наблюдения за клетками в течение нескольких недель, извлечения клеток, воздействия на них различных физических и химических факторов и т.д. С этой целью используют предметное стекло с лункой, которая продувается для удаления пара и заливается чистым и прозрачным парафиновым или вазелиновым маслом (рис. 32). С помощью микропипетки диаметром 10 мкм и горелки Бунзена прокалывают слой масла и осаждают каплю воды. Эту операцию повторяют несколько раз, получая несколько рядов капель. В эти капли помещают исследуемые клетки. Для предотвращения испарения капли покрывают тонким слоем масла. Набор таких пластинок с лунками, содержащими ряды капель С.Чахотин назвал "микроклиникой".

Рис. Рис. 32. Метод микрокапель ( 1 -заполнение лунки в предметном стекле парафиновым маслом;

2 - нанесение ряда капель с исследуемой культурой в подготовленную лунку) II. УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЕ МИКРООБЛУЧЕНИЕ КЛЕТОК Экспериментальная техника Одним из самых новаторских приемов, которые использовал С. Чахотин в своей деятельности, является воздействие сфокусированного ультрафиолетового излучения на отдельную клетку или е органеллы. Задача представляется далеко не простой даже в наше время;

именно поэтому интересно проследить, каким образом решал ученый вставшие перед ним методические и экспериментальные проблемы.

Механическое вмешательство в клетку – иглой, микропипеткой – является возмущающим и поражающим воздействием, которое, к тому же, не может быть строго регламентировано в количественном отношении. Кроме того, механические действия над клеточными органеллами немыслимы без механического повреждения наружной оболочки клетки. Все эти соображения заставили С.Чахотина прийти к необходимости замены механического манипулятора на сфокусированное ультрафиолетовое излучение. В 1912 году уже было известно бактерицидное действие коротковолнового ультрафиолетового излучения, которое использовали для стерилизации питьевой воды.

При разработке метода, который сам автор называл "ультрафиолетовым микроуколом", пришлось решать ряд конструктивных и методических задач. Необходимо было превратить микроскоп из инструмента наблюдения в операционный аппарат;

обеспечить фокусировку коротковолнового ультрафиолетового излучения до размеров, соизмеримых с размерами клеточных компонентов (напомним читателю, что обычные стеклянные элементы оптики не пропускает ультрафиолетовое излучение;

для работы с ним требуется кварцевые оптические детали). Немаловажной представлялась задача управления, манипулирования сфокусированным лучом и определения его местоположения.

Оригинально был решен вопрос с источником ультрафиолетового излучения (нельзя забывать, что ученый работал в начале столетия). В качестве источника ультрафиолетового излучения С.Чахотиным была использована искра, возникающая между магниевыми электродами. В спектре излучения этой искры наблюдалось много плотно расположенных линий в области 280 нм. Схематическое изображение оптической части опыта представлено на рис. 33.

Рис. 33. Схематическое изображение оптико-спектральной части ультрафиолетового микрооблучателя С.Чахотина (пояснения в тексте) Излучение фокусировали кварцевой линзой Q1 после чего направляли на две кварцевые призмы Qp, на которых излучение раскладывалось на отдельные спектральные линии rB, из которых в микроскоп направляли только те, которые находились в области нм. Выделение этих линий осуществляли с помощью прецизионной щели Sp;

ею же регулировали величину ультрафиолетового луча. После щели излучение проходило через отверстие в зеркале Ls. Само зеркало необходимо для отражения света лампы L, и освещения поля наблюдения. С помощью отражательной кварцевой призмы tp излучение направляли через монохроматический объектив Mo, выполненный также из кварца, на объект pr, расположенный на предметном столике микроскопа Bo. Система позволяла фокусировать излучение размером от 5 до 2 мкм в плоскости препарата. Для определения месторасположения микролуча относительно клетки о использовали раствор флуоресцеина s в сочетании с подвижной механической стрелкой Z (рис. 34, а-d).

Рис.34.Определение месторасположения микролуча с помощью капли флуоресцеина (а - нанесение флуоресцеина;

b подведение механического указателя к капле;

c - замена флуоресцеина исследуемой клеткой;

d подведение клетки к острие указателя).

Помимо аппаратурных вадач С.Чахотину пришлось столкнуться с проблемами фотохимического характера. Для того, чтобы предотвратить повреждение поверхности клетки при микрооблучении ядра, исследователь размещает клетки в смеси растворов, богатых ионами кальция, которые обладает вяжущими или отвердительными свойствами.

Для исключения воздействий ультрафиолетового излучения на цитоплазму С.Чахотин использовал центрифугирование клеток, в результате которого ядро смещалось к периферии клетки и слой цитоплазмы между ядром и поверхностью клетки уменьшался) а затем сплющивал клетку (рис. 35, a - c).

Рис. 35.

Центрифугирование исследуемой клетки с целью смещения ядра к периферии ( а - клетка до центрифугирования, b клетка со смещенным ядром;

c - сплюснутая клетка в процессе облучения ядра) Техника микроманипулирования, операционные и послеоперационные камеры описаны в предыдущих разделах.

В целом, экспериментальная установка, предназначенная для микрооблучения клеток, представляет собой сочетание микроскопа, источника ультрафиолетового излучений и оптических элементов (рис. 36). Вариант установки с элементами, расположенными на оп тической скамье, представлен на рис. 37.

Для получения искры как источника ультрафиолетового излучения был использован индуктор, состоящий из искрового промежутка, образуемого электродами bF, конденсаторов К и катушки индуктивности S, предохранителя Fs, трансформатора T, амперметра A, реостата W, включателя Sch (рис. 38).

Рис. 36. Экспериментальная установка С.Чахотина, предназначенная для микрооблучения клеток Рис. 37. Вариант установки для микрооблучения с расположением на оптической скамье (справа налево):

индуктора с источником питания, диафрагм, оптических элементов, микроскопа, фотоаппарата) Рис. 38. Схема электропитания дуги, используемой как источник ультрафиолетового излучения (пояснения в тексте) При необходимости использования ультрафиолетового излучения сравнительно невысокой интенсивности использовали вариант оптической схемы, изображенный на рис. 39, а. Здесь f - дуга, lk и Kk - кварцевые линзы, Р - призменный столик, T - тубус, Kh - конденсор, Sp - щель;

Sf - штатив микроскопа, tr -призма, Ls - зеркало. На рисунке проставлены и paccтояния в миллиметрах между элементами схемы.

В случае использования высоких интенсивностей ультрафиолетового излучения применяется вариант схемы, изображенный на рис. 39,б. В данном варианте в кварцевой объектив попадает больше света. С этой целью используют сочетание призмы Qp, объектива Рис.39. Схема установки для микрооблучения с использованием высоких интенсивностей ультрафиолетового излучения (пояснения в тексте) M, диафрагм O и Sp, кварцевого окуляра l и призмы tr;

ультрафиолетовый луч, имевший диаметр 6 мм, после прохождения такой оптической системы сужается до 3 мм, за счет чего и увеличивается интенсивность.

Методика микрооблучения Первым этапом в процессе микрооблучения является наведение сфокусированного излучения на объект. С этой целью на предметном столике микроскопа устанавливают препарат с каплей флуоресцеина и наводят на него резкость в светлом поле. Затем свет отключают. Устанавливают расстояние между электродами равным I мм и включают электрический ток. С помощью флуоресцирующего экрана (уранилового стекла) настраивают оптическую систему так, чтобы в щель попадала группа линий при 280 нм.

Перемещая кварцевый объектив, добиваются четкого изображения светящейся зеленой точки в препарате. Затем, убрав ураниловое стекло, получают изображение щели. К этому изображению подводят указатель, совмещая его конец с изображением укола. Дугу перекрывают. Поле зрения опять делают светлым и размещают исследуемую клетку на предметном столике, совмещая ее с концом указателя, и подают ультрафиолетовое излучение на объект.

Для дозировки и количественных оценок интенсивности излучения С.Чахотин использовал кадмиевый фотоэлемент Z,сопряженный с источником питания E, тубусом ro и призмой gp (рис. 40);

юстировку излучения, попадающего на фотоэлемент, он осуществлял с помощью уранилового стекла.

Рис. 40. Схема регистрации и дозировки ультрафиолетового излучения ( Z кадмиевый фотоэлемент, E - источник питания;

gp - призма, ro - тубус) Результаты микрооблучения клеток В своих ранних работах, опубликованных в 1912 году, С.Чахотин сообщает о результатах применения сфокусированного ультрафиолетового излучения для терапии злокачественных опухолей. К тому времени уже проводились эксперименты по использованию рентгеновского излучения и радиоактивных изотопов радия для лучевой терапии в сочетании с введенными в организм химическими препаратами (в частности, холином). Было обнаружено, что ионизирующие излучения и растворы холина вызывали избирательное поражение отдельных тканей, особенно богатых лецитином. В пользу того свидетельствовали опыты, проведенные С.Чахотиным с расщеплением лецитина на компоненты при облучении его оптическим и ионизирующим излучениями. Для объяснения подобного поражающего действия излучений был выдвинут ряд гипотез, предполагающих разрушение ферментов, изменение проницаемости протоплазматической оболочки.

Сам С.Чахотин для выяснения возможных механизмов действия излучений на клетки сформулировал цель исследования следующим образом - если при облучении лецитин расщепляется, то образуемый при этом холин как липоидорастворимый компонент должен удерживаться дольше, чем другие продукты распада лецитина, липоидонерастворимые.

Обнаружить холин себя может щелочной реакцией. Индикатором этой реакции С.Чахотин избрал липоидорастворимый краситель (нейтральный красный), приобретающий при кислой реакции красно-фиолетовый цвет, при щелочной - соломенно-желтый. При воздействии ультрафиолетового излучения краситель не изменял своей окраски.

Объектами исследований были выбраны яйца морских ежей, клетки крови лягушек, птиц и раковые клетки мышей. Все эти виды клеток богаты лецитином. Было обнаружено, что предварительно окрашенные с помощью красителя в ярко-красный цвет клетки после облучения приобретает желтый цвет и распадаются. Добавляя липоидорастворимые кислоты для нейтрализации предположительно образовавшихся оснований, С.Чахотин наблюдал красную окраску. Этот факт подтверждал гипотезу о том, что сам краситель не выщелачивается из клеток при их распаде или изменении проницаемости протоплазматической оболочки. Добавление холина в клетки вызывало изменение окраски из красной в желтую.

С.Чахотин пришел к выводу, что при облучении клеток в них появляются ионы OH, обусловившие изменение цвета красителя. При этом возникал вопрос о происхождении этих ионов - является ли они результатом распада какой-либо субстанции, или же проникают в клетку в результате изменения ее проницаемости из окружающей среды. Для решения этой проблемы С.Чахотин помещает клетки крови, ядра которых были окрашены и красный цвет, в изотонический раствор (0,6%-ный раствор NaCl ), в котором не было ионов OH. При этом он отмечает изменение цвета клеток. Разрушение оболочки яиц морских ежей, окрашенных в красный цвет, не привело к изменению окраски. Все эти факторы свидетельствуют о том, чтo при облучении клеток возможен процесс образования холина из составных частей лецитина клеток. Наличие в холине ионов OH обуславливает разрушающее действие на клетку.

Вполне очевидно и влияние разрушения клеточной оболочки под воздействием облучения и изменения проницаемости для ионов, поступающих и клетку из окружающей среды. Решаю щим фактором, по мнению С.Чахотина, в выяснении механизма избирательного действия облучения на клетки злокачественных новообразований, является распад лецитина и цитолиз вследствие воздействия продуктов деления. Ученый приходит к выводу о перспективности исследования совместного действия облучений и химических препаратов (хемотерапии) при разрушении труднодоступных для хирургического вмешательства опухолей.

Серия экспериментов была посвящена исследованию возможности микрооблучения ядра яйца морского ежа. Предварительные опыты показали, что во избежании поражения слоя цитоплазмы необходимо производить облучение в течение короткого промежутка времени - ядерное вещество поглощает излучение более интенсивно, чем цитоплазма. Кроме того, были учтены имевшиеся к тому времени сведения (J.Loeb, R.Lillie и др.) о влиянии различных ионов на проницаемость плазматической мембраны - в то время как ионы K и Na увеличивают проницаемость, ионы Ca оказывают противоположное действие. Воздействие сфокусированного (до 5 мкм и менее) ультрафиолетового излучения на яйцо морского ежа позволяет разрушить его в процессе деления, причем процесс деления тотчас же прекращается. Для исключения возможности разрушения плазматической мембраны необходимо производить микрооблучение в среде, содержащей избыток кальция.

Подвергая яйца морского ежа микрооблучению, С.Чахотин установил, что местная проницаемость плазматической мембраны увеличивается при воздействии излучения, что позволяет ионам окружающей среды проникать в клетку и вызывать в ней характерную реакцию. Об этом свидетельствуют и опыты с помещением клетки, окрашенной в красный цвет красителем, в раствор, содержащий ионы OH. После микрооблучения происходит окрашивание яйца в желтый цвет. Во время активации и деления яйца увеличивается проницаемость поверхностного плазматического слоя;

у оплодотворенного делящегося яйца местная проницаемость имеет различные значения. Микрооблучение, по мнению С.Чахотина, по своему характеру напоминает естественные стимулы оплодотворения, вызывающие определенные этапы активации яйца, т.е. образование мембраны, деление яйца, сегментацию цитоплазмы. Процесс стимулирования клетки микрооблучением проходит нас только, медленно, что становится возможным анализировать автономные деления цитоплазмы.

Сферой научных интересов С.Чахотина были исследования функций стигмы у эвгленофитовой водоросли Euglena gracilis. Известно, что ряд водорослей проявляет специфические реакции на свет, изменяя при этом свои двигательные характеристики скорость, направление движения, траекторию и т.д. У некоторых водорослей, в частности, Euglena gracilis, имеет место т.н. модуляционный механизм ориентации клеток на свет:

если клетка движется к источнику света, то при вращении ее вокруг продольной оси происходит освещение паражгутикового тела, находящегося у основания жгутика и выполняющего функции фоторецептора, непрерывным светом. Сбоку, у края вакуоли, находится стигма - специфическая органелла, выполняющая роль модулятора света для фоторецептора (рис. 41). При отклонении движущейся клетки от направления распространения света происходят периодические затенения стигмой света, попадающего на фоторецептор;

клетка производит корректирующие биения жгутиком, возвращаясь к той траектории, при которой модуляции света нет. Эффект усиливается за счет дихроичной природы фоторецептора.

Рис. 4I. Схематическое изображение одноклеточной водоросли Euglena gracilis (1 – жгутик, 2 - стигма. 3 - паражгутиковое тело) Первые попытки выяснения функций фотоориентационного аппарата Euglena gracilis были проведены С.Чахотиным с помощью техники ультрафиолетового микрооблучения.

Исследования показали, что при воздействии излучения с длиной волны 280 нм клетки отбрасывали жгутики, резко сокращались, принимая сферическую форму и раздуваясь. Была отмечена различная степень чувствительности переднего и заднего концов клетки к облучению - сокращение было более внезапным и более существенным при воздействии на переднюю часть клетки. Но самым интересным был опыт исследования фототаксиса Euglena gracilis, который ученый провел с присущей ему филигранностью. Два параллельно распо ложенных кварцевых капилляра, пропускающих ультрафиолетовое излучение, размещались на предметном столике микроскопа. В одном был раствор флуоресцеина, в другом - клетка Euglena gracilis. Вначале сфокусированное ультрафиолетовое излучение фокусировали на капилляре с флуоресцеином и фиксировали место фокусировки механическим указателем.

Затем на место первого капилляра помещали второй, с клеткой;

ограниченный участок этого капилляра освещался белым светом конденсора микроскопа. Клетка двигалась до границы "свет-тень", возвращалась ко второй границе и, таким образом, совершала реверсивные дви жения, определяемые пространственными градиентами света. С помощью микрооблучения стигмы Euglena gracilis, С.Чахотин нарушал работу фотоориентационного механизма клетки, что и проявлялось в виде пересечения ею границы освещенного участка. Мало того, возбуждение стигмы монохроматическим светом различной длины волны показало, что красная, желтая и зеленая области спектра не вызывают фотодвижения клетки, чего нельзя сказать о синей и фиолетовой области. На основе проведенных исследований С.Чахотин установил, что стигма действительно является примитивным органом зрения клетки, который yправляет ее фотодвижением;

ультрафиолетовое (280 нм) облучение стигмы "ослепляет" клетку;

в видимой области спектра стигма реагирует на сине-фиолетовый свет;

локальное микрооблучение клетки вызывает ее сокращения, причем передняя часть клетки представляется более чувствительной к облучению.

Следует отметить, что представления С.Чахотина о функциональных и спектральных свойствах стигмы Euglena gracilis мало изменились и в наше время.

Совместно с французским естествоиспытателем из Сорбонны П.Гаваданом (P.Gavaudan) ученый проводит исследование влияния микрооблучения на гриб Ascoidea rubescens. Предварительные эксперименты показали, что при обработке гриба витальными красителями происходят определенные структурные модификации - вакуолярная система сокращается до нескольких сферических вакуолей, расположенных вдоль клетки. Это состояние, продолжающееся несколько минут, обратимо. Облучение клеток по методу С.Чахотина привело к упомянутой выше вакуолярной реакции после 10–15 с воздействия ультрафиолетового излучения;

при облучении части клетки реакция происходит через 15–30 с. Реакция имеет место лишь при помещении клеток в питьевую воду с рН 7,2.

Время облучения, необходимое для реализации, зависит от значений рН среды: от 11 с при рН 7,2 до 105 с при рН 4,2. Показано, что возмущающее действие ультрафиолетового облучения Ascoidea rubescens является эффективным в присутствии ионов OH. Совместное действие кислот и оснований с одной стороны, и ультрафиолетового излучения - с другой, показало, что вакуолярная реакция происходит при использовании щелочи и не имеет место при добавлении кислоты. Авторы приходят к выводу, что следует отличать реакцию проницаемости поверхностного слоя цитоплазмы от вакуолярной реакции, которая связана с внутренним изменением цитоплазмы. Микрооблучение увеличивает проницаемость клетки для компонентов окружающей среды, что приводит к вакуолярной реакции.

Очень важным представляется исследование О.Чахотина, проведенное с парамециями. Воздействие на клетки ультрафиолетового излучения с длиной волны 310 нм не приводило к каким-либо нарушениям или изменениям процессов жизнедеятельности клеток. Однако, добавление раствора эозина в сочетании с микрооблучением приводило к сократительным реакциям клеток. Краситель в данной ситуации выступает в качестве фотосенсибилизатора, повышающего чувствительность организма к излучению.

Еще один опыт с парамециями был посвящен проблеме изучения условных реакций рефлекторного типа. Если на пути следования клетки поместить тонкий ультрафиолетовый луч, то при соприкосновении с ним клетка отскакивает и обходит луч. После многократных столкновений клетка продолжает огибать луч, даже если убрать последний: у нее сформировалась условная реакция, подобная таковой у высших организмов.

Продолжая серию экспериментов с парамециями, С.Чахотин облучает одну из сократительных вакуолей, а затем и вторую. Клетки перестают пульсировать и выделять воду. Нo если подвергнуть микрооблучению цитостом, вода выделяется за счет диффузии через поверхность клетки и парамеция вновь "оживает". С.Чахотин сравнивает данное явление с отеком при уремическом кризисе у высших животных и человека.

Итак, основные результаты, к которым пришел С.Чахотин при использовании техники ультрафиолетового микрооблучения ("микроукола", "лучевой микропункции", "микрофотохирургии"), можно сформулировать следующим образом:

1. В действии облучения на живую субстанцию необходимо различать как модификацию проницаемости поверхностного слоя клетки, как и коагуляцию белков и других компонентов цитоплазмы. При этом изменение проницаемости клеточной оболочки вызывает поступление в клетку ионов из окружающей среды.

2. Установлен механизм избирательного действия облучения на клетки злокачественных опухолей, определяемый распадом лецитина и цитолизом вследствие воздействия продуктов деления. Опыты по совместному действию облучения и химических препаратов (фотосенсибилизаторов) свидетельствуют о перспективности фотосенсибилизации для диагностики и терапии злокачественных образований.

3. Воздействие сфокусированного ультрафиолетового излучения (275-280 нм) на яйца морского ежа стимулирует партеногенез яиц, что позволяет изучать процессы оплодотворения.

4. Изучены функции стигмы при воздействии на нее ультрафиолетового (280 нм) и монохроматического излучения в видимой части спектра. Отмечены: участие стигмы в фотодвижении Euglena gracilis, чувствительность стигмы в сине-фиолетовой области спектра, влияние локальных микрооблучений на сократительные реакции клетки.

5. Исследованы вакуолярные реакции клеток гриба Ascoidea rubescens (из гемиаскомицетов) в зависимости от продолжительности облучения, рН среды, присутствия ионов ОН.

6. Обнаружены эффекты микрооблучения парамеций: локальное выпадение ресничек, деформация поверхности, изменение выделений воды, реакции рефлекторного типа, фотосенсибилизирующее действие облучения (310 нм) и эозина на сократительные реакции клеток.

7. Изучена роль ядра в дыхании клетки;

проведены фотометрические измерения в области ядра и цитоплазмы.

Наряду с разработанной С.Чахотиным техникой микроманипулирования и серией проведенных им физиологических и эмбриологических исследований эти результаты представляют неоспоримую ценность и в наше время.

Дальнейший прогресс в своей научной деятельности С.Чахотин видит в реализации следующего плана (1935 г.):

1. Продолжение изучения роли клеточного ядра в развитии клеточных процессов;

воздействие микрооблучения клетки на ход ее развития, движения, секреции и т.д.

2. Искусственное инициирование развития яйца посредством периферического микрооблучения - метода, по своей сущности являющегося промежуточным между химическим вмешательством и нормальным оплодотворением.

3. Решение проблемы детерминирования в развитии путем микрооблучения отдельных бластомер оплодотворенного яйца и анализа последующих результатов.

4. Разрушение, повреждение или раздражение клеточных органелл с целью выяснения их функций и участия в жизнедеятельности клетки.

5. Искусственное слияние яйцеклеток, фрагментов яйца и бластомеров;

проведение опытов по трансплантации и вегетативной гибридизации.

6. Удаление ядер из клеток после микрооблучения;

перенос их в другие клетки.

7. Разделение клеток на части с помощью сфокусированного излучения.

8. Дальнейшее исследование проницаемости поверхности клетки, ее изменений во время сегментации и локальных микрооблучений.

9. Изучение влияния различных ионов и токсических веществ на проницаемость клетки.

10. Определение рН среды внутри клетки по изменению ее окраски после облучения.

11. Селективное воздействие сфокусированного ультрафиолетового излучения на отдельные клетки зародыша, находящегося в слабом токсическом растворе, с последующим контролем хода развития организма.

12. Комбинация микрооблучения и ультрамикроскопии с целью изучения локальных изменений коллоидов в клетке после облучения.

13. Проведение исследований с монохроматическим сфокусированным излучением и выявление зависимости эффектов облучения от длины волны.

14. Фотометрия клетки, связанная с определением как поглощенной, так и прошедшей через различные участки клетки энергией.

15. Рассмотрение возможности использования ионизирующих излучений для локальных воздействий на клетку.

РЕАЛИЗАЦИЯ ИДЕЙ С.ЧАХОТИНА В НАШЕ ВРЕМЯ Экспериментальные методы по ультрафиолетовому микрооблучению клетки, разработанные С.Чахотиным, получили самое широкое приложение к различным областям биологии и биофизики. Рассмотрим некоторые из них.

Так, в экспериментальной протозоологии, метод был использован для изучения ряда проблем клеточного морфогенеза инфузорий, в частности, Paramecium aurelia, Urostyla weissei, Stentor coerulus и др. Ленинградские ученые С.И.Фокин и Д.В.Осипов поставили своей целью использовать ультрафиолетовое облучение инфузорий для исследования ядерного дуализма. Дело в том, что у таких микроорганизмов как инфузории вегетативная клетка содержит ядра двух различных типов: соматическое, высокополиплоидное макронуклеус (МА) и генеративное - микронуклеус (МИ). Селективное облучение этих органелл позволило бы получить информацию о функциональных особенностях отдельных элементов ядерного аппарата.

Обездвиженные клетки Paramecium caudatum были подвергнуты воздействию сфокусированного до 70 мкм2 (луч имел квадратную форму), а в ряде случаев - до 23 мкм ультрафиолетового излучения с длиной волны около 260 нм. Исследования проводили с двумя клонами – M-3I с нормальной организацией ядерного аппарата и M-3I-20-омега, содержащим внутриядерные симбионты (в данном случае - грам-отрицательные бактерии).

В процессе опытов были подвергнуты облучению чистый МИ в клетках клона M-3I (рис.42, 1), зараженный МИ клеток субклона М-31-20-омега (рис. 42, 2а), зараженный МИ с последующей реактивацией видимым светом (рис. 42, 2б), участок МА клеток М-31-20 омега (рис. 42, 3), участок цитоплазмы клеток M-3I-20-омега (рис.42, 4), и, наконец, делящиеся клетки субклона М-31-20-омега (рис.42, 5). Авторы установили, что элементы ядерного аппарата инфузорий характеризуются неодинаковой чувствительностью к Рис. 42. Серии опытов, проведенных С.И.Фокиным и Д.В.Осиповны, по ультрафиолетовому облучению парамеций (I - клон M-3I;

2а -5-субклон М-31-20-омега;

ми -микронуклеус;

ми+ -мпкронуклеус, инфицированный омега-частицами;

ма - макронуклеус;

гл - глотка;

от - остаточное тело веретена деления зараженного микронуклеуса;

заштрихованные квадраты - зона микрооблучения (дана не в масштабе) ультрафиолетовому облучению. Были произведены количественные оценки чувстви тельности цитоплазмы, макро- и микронуклеуса и симбиотических бактерий МИ. В результате микрооблучения могут иметь место снижение эффективности клонирования, утрата, микронуклеусом бактерий, появление клеток с несколькими МИ и амикронуклеарных клеток. Отмечена возможность восстановления повреждений, вызванных ультрафиолетовым облучением, при освещении клетки видимым светом.

Разнообразные возможности применения ультрафиолетового микрооблучения к исследованию свойств, структуры и функций отдельных, клеточных органелл. Объем данной работы не позволяет детально осветить все аспекты этого направления. Вот только краткий перечень результатов работ по микрооблучению клеток: исследование процесса "побледнения" хромосом при их локальном облучении;

инициирование распада и роста зрелых интерфазных ядрышек;

избирательное повреждение митохондрий, пластид и плазматической мембраны, изучение механизмов митоза путем селективного воздействия ультрафиолетового излучения на отдельные элементы митотического аппарата;

выяснение разнообразных аспектов индуцированной микрооблучением пролиферации клеток;

нарушение синтеза РНК, ДНК и белка и т.д. (советуем читателю за более подробными сведениями обратиться к работам В.Н.Сахарова).

Со времени разработки и создания С.Чахотиным первого прибора, предназначенного для ультрафиолетового микрооблучения клеток, экспериментальная техника совершенствовалась и развивалась, претерпевая существенные изменения. К последний можно отнести использование отражательных объективов, позволяющих с их помощью объединить процесс облучения и наблюдения клеток, а также избежать применения флуоресцирующих экранов;

применение монохроматоров для спектральных исследований на клеточном уровне;

усиление контраста биологических объектов;

ограничение линзовых аберраций;

использование отражательных конденсоров;

сопряжение микроскопической техники с телевизионной регистрацией (подробно эти методические приемы изложены в об зоре А.П.Дуброва).

Но подлинный расцвет техника микрооблучения получила после появления уникального прибора - лазера. С созданием этого устройства были сразу же проведены попытки использовать лазерное излучение для воздействия на клетку и ее органеллы.

Пионерской здесь можно считать работу Бессиса ( Bessis M.) с соавторами, связанную с лазерным микрооблучением клеток крови. Можно отметить также целенаправленные исследования структурно-функциональных особенностей клеток, проводимые Бернсом (Berns M.W.).

В своих работах Бернс с соавторами производил селективнуо инактивацию ядрышкового организатора и удаление целой хромосомы с последующим клонированием облученной клетки. Такое избирательное повреждение хромосом позволило изучить функции этих генетически важных структур. Разработана методика получения клонов клеток с удаленными участками хромосом или всей хромосомы. Кроме того, были проведены исследования по установление точного месторасположения ядрышкового организатора путем микрооблучения перетяжки и участков, удаленных от нее.

В настоящее время спектр возможных применений лазерного микрооблучения клетки довольно широк и вряд ли возможно осветить результаты всех исследований.

Остановимся лишь на некоторых, наиболее характерных.

Лазерное микрооблучение нервных клеток рака позволило А.В.Узденскому исследовать ультраструктурные и цитохимические изменения митохондрий облученного нейрона. Автор наблюдал группировку митохондрий в околоядерной зоне, неравномерные изменения профиля ядерной мембраны и локализацию ядерного хроматина. Все это свидетельствует о различной метаболической активности отдельных областей сомы нейрона при лазерном микрооблучении.

Киевские ученые (Н.Ф.Гамалея. Е.Д.Шишко) использовали излучение ксенонового (495;

533 и 595 нм и азотного (337 нм) лазеров для воздействия на опухолевые и нормальные клетки в культуре ткани. Диаметр луча составлял 0,6-0,8 мкм. Целью исследований было выяснение возможности селективной фотосенсибилизации облучаемого участка клетки при совместном действии лазерного излучения и ряда красителей (в частности, акридинового оранжевого, эритрозина, родамина 6G). Кроме того, облучение клеточных органелл излучением азотного лазера (ближняя ультрафиолетовая область) позволило оценить чувствительность клеточных органелл. Введение химических соединений (красителей, витаминов, коферментов, антибиотиков) позволяет управлять чувствительностью органелл к облучению. Практическая целесообразность этих исследований связана с возможностью реализации диагностики злокачественных опухолей на ранних стадиях и терапии.



Pages:   || 2 |
 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.