авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Медицинский университет удк: 616.611–002–053.2–07–037 савош виктория викторовна патогенетическое и прогностическое значение тубулоинтерстициальных изменений в развитии первичных гломерулопатий у детей

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ

«БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

УДК: 616.611–002–053.2–07–037

САВОШ

Виктория Викторовна

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ

ЗНАЧЕНИЕ ТУБУЛОИНТЕРСТИЦИАЛЬНЫХ

ИЗМЕНЕНИЙ В РАЗВИТИИ ПЕРВИЧНЫХ

ГЛОМЕРУЛОПАТИЙ У ДЕТЕЙ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук по специальностям 14.00.15 – патологическая анатомия 14.00.48 – нефрология Минск 2010 1 Работа выполнена в УО «Белорусский государственный медицинский университет»

Научные руководители: Черствый Евгений Давыдович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки Республики Беларусь, заведующий кафедрой патологи ческой анатомии УО «Белорусский государ ственный медицинский университет»

Сукало Александр Васильевич, доктор медицинских наук, профессор, член корреспондент НАН Беларуси, заслуженный деятель науки Республики Беларусь, заве дующий 1-й кафедрой детских болезней УО «Белорусский государственный меди цинский университет»

Официальные оппоненты: Швед Иван Адамович, доктор медицинских наук, профессор, глав ный научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории ГУО «Белорусская медицинская академия после дипломного образования»

Вильчук Константин Устинович, кандидат медицинских наук, доцент дирек тор ГУ РНПЦ «Мать и дитя»

Оппонирующая организация: УО «Гродненский государственный медицинский университет»

Защита состоится 7 мая 2010 г. в 1400 часов на заседании совета по защите диссертаций Д 03.18.02 при УО «Белорусский государственный медицинский университет» по адресу: 220116, г. Минск, пр-т Дзержинско го, 83. Телефон ученого секретаря: 272-55-98.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке УО «Белорусский государственный медицинский университет».

Автореферат разослан «» апреля 2010 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций кандидат медицинских наук, доцент А. И. Герасимович ВВЕДЕНИЕ Прогрессирование хронических заболеваний почек с нарастанием хронической почечной недостаточности (ХПН), требующей заместитель ной почечной терапии, является одной из основных проблем в теоретиче ской и практической нефрологии. Несмотря на достигнутые успехи в диагностике различных нозологических форм гломерулопатий, многие патогенетические аспекты прогрессирования хронических заболеваний почек остаются неясными.

В настоящее время многочисленные экспериментальные и клиниче ские исследования показали особое значение изменений тубулоинтерсти циального компонента (ТИК) в формировании хронической почечной недостаточности [D. Goumenos и соавт., 1996;

A.A. Eddy и соавт., 2001].

Установлено, что из всего спектра клинических проявлений заболеваний почек можно выделить только два независимых фактора, играющих роль в прогрессировании ХПН: протеинурию и уровень артериального давле ния [Н.В. Мосина и соавт., 2004;

J.C. Peterson и соавт., 1995]. Несмотря на то, что получено достаточное количество экспериментальных и клиниче ских данных, подтверждающих существование связи между протеинури ей, интерстициальным фиброзом и развитием хронической почечной недостаточности, тем не менее, не выделен комплекс информативных и доступных клинико-морфологических прогностических критериев раз личных вариантов течения гломерулопатий, которые позволили бы опре делить тактику ведения этих больных и уточнить критерии выбора неф ропротекторной и патогенетической терапии.

В связи с этим, изучение патогенетических механизмов формирова ния тубулоинтерстициальных изменений является важным для понимания фундаментальных основ прогрессирования хронических заболеваний почек и прогноза течения первичных гломерулопатий. Все это определяет актуальность изучения проблемы и новизну подобных исследований.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Связь работы с крупными научными программами, темами Работа выполнена в рамках темы НИР по Государственной ком плексной программе научных исследований «Современные технологии в медицине» «Изучение молекулярных маркеров прогрессирования гломерулопатий, факторов риска, особенностей диагностики и коррекции диабетических остеопатий для оптимизации их диагностики и лечения», договор № 41-3/08 от 12.03.2008 г., темы НИР Белорусского республикан ского фонда фундаментальных исследований «Исследование роли транс формирующего фактора роста- в морфогенезе интерстициального фиброза при хронических гломерулонефритах», договор № Б08- от 01.04.2008 г.

Цель и задачи исследования Цель исследования: установить роль тубулоинтерстицальных измене ний в прогрессировании хронических заболеваний почек у детей на осно вании оценки состояния экстрацеллюлярного матрикса и канальцев при различных нозологических формах первичных гломерулопатий.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать выраженность и распространенность фиброзных и воспалительных изменений интерстициальной ткани при различных морфологических формах гломерулопатий у детей в материале нефробиоп сий, а также в зависимости от клинических проявлений заболевания.

2. Определить характер и распространенность экспрессии маркера миофибробластической дифференцировки клеток (гладкомышечного актина-) в ткани почек при различных морфологических вариантах гломерулопатий и его роль в развитии фиброзных изменений стромы.

3. Оценить с применением морфометрических методов характер и распространенность экспрессии трансформирующего фактора роста и компонентов экстрацеллюлярного матрикса (коллагена IV типа, фибро нектина) в зависимости от морфологии изменений клубочков и интерсти ция у детей.



4. Установить характер взаимосвязей между морфологическими и иммуногистохимическими изменениями интерстициального компонен та и клиническими проявлениями различных нозологических форм гломерулопатий.

5. Выявить морфологические, в том числе иммуногистохимические, факторы, определяющие прогноз течения заболевания и развития хрониче ской почечной недостаточности у детей с первичными гломерулопатиями.

Объект и предмет исследования. Объектом исследования был мате риал пункционных нефробиопсий.

Предмет исследования – тубулоинтерстицальные изменения при различных морфологических вариантах гломерулопатий.

Положения, выносимые на защиту 1. Первичные гломерулярные заболевания почек у детей сопровож даются различными по характеру и степени выраженности изменениями интерстиция и канальцев. Выраженные интерстициальные изменения (фиброз и воспалительная инфильтрация) выступают в качестве морфоло 2. Ремоделирование интерстицального матрикса при первичных гломерулопатиях характеризуется увеличением количества клеток с мио фибробластической дифференцировкой (в результате эпителиально мезенхи-мальной трансформации канальцевых эпителиоцитов) и накоп лением в экстрацеллюлярном матриксе коллагена IV типа и фибронектина.

Степень интерстициального фиброза нарастает в динамике развития почечного заболевания преимущественно за счет увеличения количества фибронектина, усиление экспрессии которого в сочетании с увеличением показателя экспрессии гладкомышечного актина- выступают в качестве морфологических предикторов быстрого прогрессирования заболевания 3. Протеинурия является неблагоприятным фактором в развитии тубулоинтерстициальных изменений, поскольку сопровождается нараста нием степени интерстициального фиброза в результате увеличения числа миофибробластов и повышения экспрессии трансформирующего фактора роста-.

Личный вклад соискателя Постановка проблемы, формулировка целей и задач исследования, положений, выносимых на защиту проведены совместно с научными руководителями. Автором лично выполнены анализ научной литературы и медицинской документации, иммуногистохимическое исследование с предварительной отработкой методики окрашивания (подбор оптималь ного режима демаскировки антигена и разведения первичных антител) и последующей методологической разработкой оценки полученных дан ных. Проведена статистическая обработка результатов, их изложение и внедрение в практику. Пересмотр архивных гистологических препара тов осуществлялся совместно с доцентом кафедры патологической анато мии, канд. мед. наук Т.А. Летковской.

Апробация результатов диссертации Материалы диссертации доложены на XXII Европейском конгрессе патологов (Италия, Флоренция, 2009), 42-й ежегодной конференции Европейской ассоциации детских нефрологов (Франция, Лион, 2008), Республиканской научно-практической конференции «Актуальные вопросы морфологической диагностики заболеваний» (Витебск, 2008), Международном семинаре «Вопросы детской нефрологии на современ ном этапе» (Минск, 2009), заседании Минского городского общества патологоанатомов (Минск, 2009), научной сессии БГМУ (Минск, и 2009).

Опубликованность результатов По тематике исследования опубликовано 14 печатных работ. Из них 5 статей в рецензируемых научных журналах, в которых изложены глав ные результаты диссертации, 5 – в сборниках научных трудов, 3 – тезисы докладов, 1 – рационализаторское предложение. Общий объем публика ций составил 2,0 авторских листа.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, основной части, состоящей из 4 глав, включающих обзор литературы, материал и методы исследований, результаты собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, списка использован ных источников и списка публикаций соискателя, приложений. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста с таблицами и иллюст рациями, содержит 16 таблиц и 79 рисунков. Список литературы включа ет 10 русскоязычных и 169 иностранных источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проведено на архивном и текущем материале нефро биопсий, выполненных в нефрологическом отделении 2-й детской клини ческой больнице г. Минска за период с января 2000 по декабрь 2008 гг.

включительно. Из исследования исключались все варианты вторичных гломерулопатий (диабетическая нефропатия, волчаночный нефрит, пора жения почек при других заболеваниях соединительной ткани и васкули тах), а также первичные тубулоинтерстициальные поражения и нефроби опсии, выполненные у больных с интермитирующей и терминальной стадиями хронической почечной недостаточности. Также в исследование не включались случаи с недостаточным количеством в биоптате почечной паренхимы для последующего морфометрического анализа.

В результате для дальнейшего исследования было отобрано 132 неф робиопсии. Из них у 100 пациентов нефробиопсии выполнялись одно кратно для верификации диагноза, а у 16 детей через различные времен ные промежутки (от 6 месяцев до 5 лет) были выполнены повторные био псии для контроля динамики процесса или уточнения морфологического варианта гломерулопатии.

Клинические данные о пациентах были получены из сопроводитель ной документации (карт направления на патогистологическое исследова ние), историй болезни и включали возраст пациента и длительность забо левания на момент выполнения биопсии, наличие и характер мочевого синдрома (уровни протеинурии, эритроцитурии, наличие кристаллов со лей) и экстраренальных проявлений (отеки, артериальная гипертензия и т. д.), а также показатели общего и биохимического анализов крови (мочевина, креатинин, скорость клубочковой фильтрации (СКФ), рассчи танная по формуле Шварца).

Для оценки морфологических изменений в ткани почек из архивных парафиновых блоков, полученных при проведении пункционных нефро биопсий делались срезы толщиной 3–4 мкм, которые депарафинировались в ксилоле возрастающей концентрации, обезвоживались в спиртах и ок рашивались гематоксилином и эозином, по Массону, Марциус алым голубым (Martius Scarlet Blue;

MSB), реактивом Шиффа (ШИК-реакция), выполнялось серебрение по Джонсу, а также во всех случаях проводилось иммуногистохимическое (ИГХ) исследование с использованием поликло нальных антител (Ат) к иммуноглобулинам класса А (IgA). При анализе данных весь исследуемый материал был разбит на группы в соответствии с гистологическими критериями различных вариантов гломерулопатий согласно комплексной классификации Всемирной организации здраво охранения (1995 г.) (таблица 1).





Таблица 1. Распределение случаев в зависимости от морфологического варианта поражений клубочков Морфологический вариант гломерулопатии Число наблюдений Минимальные изменения клубочков (МИ) Мезангиопролиферативный гломерулонефрит (МзПГН) Болезнь Берже (ББ) Мезангиокапиллярный гломерулонефрит (МзКГН) Фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) Оценка морфологических параметров проводилась с использованием светового оптического микроскопа «Leica» при увеличении 100, 200, и 1000. При исследовании срезов, окрашенных по Массону и MSB, полу количественно в баллах оценивалась степень выраженности интерстици ального фиброза (межканальцевой, перигломерулярной и периваскуляной стромы): 0 – отсутствие изменений в почечном интерстиции, 1 балл – незначительное диффузное или очаговое умеренное расширение межка нальцевой стромы, 2 балла – умеренное диффузное или очаговое выра женное расширение межканальцевой стромы, 3 балла – наличие диффуз ного выраженного интерстициального фиброза. Оценка степени выра женности воспалительной инфильтрации стромы проводилась полуколи чественно в баллах на препаратах, окрашенных гематоксилином и эози ном: 0 – отсутствие изменений в почечном интерстиции;

1 балл – наличие отдельных очагов незначительной инфильтрации стромы;

2 балла – выяв ление слабовыраженной распространенной или очаговой умеренно выраженной инфильтрации интерстициальной ткани;

3 балла – наличие диффузной умеренно-выраженной с очаговым усилением до выраженной интерстициальной воспалительной инфильтрации.

С целью определения изучаемых молекул миофибробластической дифференцировки, факторов роста и компонентов экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) в материале нефробиопсий, выполнено ИГХ окрашива ние с моноклональными Ат к гладкомышечному актину-альфа (a-SMA) (DAKO, 1:400), трансформирующему фактору роста- (ТФР-) (MILLIPORE S.A.S., 1:2000), коллагену IV типа (DAKO, 1:25) и поликло нальными Ат к фибронектину (DAKO, 1:1000). Система визуализации – EnVision (DAKO). Перед проведением ИГХ исследования отработана методика окрашивания с подбором оптимального режима демаскировки антигена и разведения первичных Ат. Во всех случаях использован поло жительный и отрицательный контроль ИГХ реакции. Окраска расценива лась как положительная только при отсутствии окрашивания в отрица тельном контрольном препарате.

При проведении ИГХ исследования во всех случаях обнаруживалась экспрессия ТФР- различной интенсивности в клубочках и интерстици альной ткани почки в виде цитоплазматического окрашивания миофиб робластов, эндотелиальных клеток, мезангиоцитов и клеток канальцевого эпителия. Экспрессия -SMA отмечалась в виде четкого цитоплазматиче ского окрашивания интерстициальных миофибробластов, гладкомышеч ных клеток почечных сосудов и отдельных клеток канальцевого эпителия.

Экспресия коллагена IV типа выявлялась во всех нефробиоптатах в виде четкого окрашивания базальных мембран канальцев и капилляров клу бочков, а также капсулы Шумлянского–Боуэна. Кроме того, экспрессия коллагена отмечалась при расширении межканальцевой стромы и в уча стках с наличием воспалительной инфильтрации. Фибронектин обнару живался в клубочках почки, преимущественно в участках расширенного мезангиального матрикса и гломерулосклероза, а также в интерстициаль ной ткани почек.

Для морфометрического исследования микропрепараты фотографи ровали в 5–6 полях зрения (объектив 40), а также 10 полях зрения (объек тив 100) с разрешением 1798 на 1438 пикселей при помощи микроскопа Leica c цифровой камерой Leica. Площадь исследуемых полей зрения со ставила 298.47*238.71 = 71247,77 м (увеличение х40) и 113,53*98,29 = 11158,86 м (увеличение х100) соответственно. Оценка ИГХ реакции всех вышеперечисленных маркеров проводилась с использованием про граммного обеспечения для морфометрии Aperio Image Scope, автомати чески измеряющего распространенность и интенсивность коричневой окраски (продуктов реакции диаминобензидин-хромогена). В дальнейшем рассчитывался показатель экспрессии (ПЭ), равный отношению числа позитивных пикселей к их общему числу.

Статистический анализ данных проводился с использованием про граммного обеспечения STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., 2001 г.). Получен ные результаты обработаны статистически с вычислением медианы, 25-го и 75-го перцентилей, средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m). Для оценки характера распределения полученных данных использовались критерий Колмогорова–Смирнова, а также пока затели эксцесса и асимметрии. Взаимосвязь между показателями опреде лялась при помощи непараметрического двустороннего коэффициента корреляции Спирмена (rs) и рангового коэффициента корреляции Кендалла (Kendall Tau). Для сравнительной характеристики признаков использова ны следующие непараметрические методы: сравнение двух независимых выборок – U-критерий Манна–Уитни, сравнение трех и более независимых выборок – H-критерий Крускала–Уоллиса, сравнение двух зависимых выборок – Z-критерий Уилкоксона. Оценка сроков развития почечной недостаточности включала расчеты по моментному методу Каплана– Мейера. Сравнение данных в различных группах осуществлялось с ис пользованием теста log-rank. За уровень статистической значимости принимался p0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика тубулоинтерстициальных изменений при первичных гломерулопатиях Результаты проведенного исследования свидетельствуют о наличии изменений при всех изученных вариантах поражений клубочков. Измене ния ТИК наблюдались в 79 случаях (59,85±4,3%) и были представлены интерстициальными инфильтрацией и фиброзом, а также дистрофией и атрофией канальцев, выраженность и распространенность которых варьировала в значительной степени. Канальцевые изменения были пред ставлены гиалиново-капельной дистрофией эпителиоцитов проксималь ных и дистальных канальцев, а также очаговой атрофией канальцевого эпителия (преимущественно в участках выраженного стромального фиброза).

Интерстициальная инфильтрация отмечалась в 41 случае (31,06±4,0%). Клеточный состав инфильтратов характеризовался различ ным сочетанием клеток лимфоцитарного и гистиоцитарного рядов с при месью небольшого количества нейтрофильных и эозинофильных лейко цитов, преимущественно в очагах выраженной инфильтрации. Степень выраженности воспалительной инфильтрации варьировала. В большинст ве случаев (21 наблюдение, 51,2%) она была представлена немногочис ленными очагами слабой или умеренной степени, в остальных случаях имел место очагово-диффузный характер инфильтрации умеренной (13 случаев, 31,7%) и/или выраженной (7 случаев, 17,1%) степени. Интер стициальный фиброз различной степени выраженности отмечался в большинстве случаев (79 наблюдений или 59,8%). В 73,4% исследован ных биоптатов (58 случаев) определялись очаги слабовыраженного или умеренно-выраженного склероза стромы, располагавшегося преимущест венно перигломерулярно и/или периваскулярно, а также очаговое расши рение межканальцевой стромы слабой степени. В остальных наблюдениях (26,6% случаев) можно было видеть более значительные интерстициаль ные изменения: диффузное расширение межканальцевой, перигломеру лярной и периваскулярной стромы умеренной степени с очаговым усиле нием до выраженного фиброза.

Максимальная выраженность интерстициальных изменений (как склеротических, так и воспалительных) отмечалась в группах МзКГН и ФСГС (критерий Крускала–Уоллиса Н=23,7 и 37,9 соответственно при р0,01). В обеих группах интерстициальный фиброз и воспалительная инфильтрация наблюдались в большинстве случаев (64,3% и 82,8% соот ветственно). Они носили преимущественно очагово-диффузный характер, имели слабую или умеренную степени выраженности. Однако в части на блюдений имели место распространенные (до 50–60% площади биоптата) участки диффузного умеренного с очаговым усилением до выраженного межканальцевого фиброза и выраженная лимфогистиоцитарная инфильт рация. При минимальных изменениях клубочков соответствующими были и интерстициальные изменения – сочетание скудной очаговой лимфоги стиоцитарной инфильтрации с минимальным расширением межканальце вой, периваскулярной либо перигломерулярной стромы.

Как стало известно в последние годы, морфологический тип гломе рулярных поражений не в полной мере определяет течение и прогноз по чечного заболевания. Хотя в результате многолетних наблюдений и были выделены варианты гломерулопатий, чаще всего сопровождающиеся быстрым развитием ХПН (такие как ФСГС, МзКГН, быстропрогресси рующий гломерулонефрит, волчаночный нефрит IV и V класса). В то же время многочисленными исследованиями показано, что преимущественно интерстициальные изменения определяют прогноз заболевания и скорость развития почечной недостаточности при гломерулярных заболеваниях почек [R.A. Risdon и соавт., 1968;

L.I. Schainuck и соавт., 1970;

A. Bohle и соавт., 1977]. Таким образом, полученные нами результаты позволяют объяснить быстрое прогрессирование и плохой прогноз этих так называе мых «неблагоприятных» форм гломерулопатий с точки зрения современ ных представлений о патогенезе развития хронической почечной недоста точности.

В результате проведенного исследования было установлено, что ПЭ a-SMA в почечном интерстиции значительно варьирует в зависимости от характера изменений клубочков и выраженности интерстициального фиб роза. Наиболее выраженная его экспрессия была выявлена у больных с неблагоприятными морфологическими вариантами гломерулопатий (ФСГС и МзКГН) (критерий Крускала–Уоллиса Н=24,3 при р0,01), а также в участках склеротических изменений стромы (критерий Круска ла–Уоллиса Н=29,3 при р0,01). Также была установлена прямая досто верная корреляционная взаимосвязь средней силы между уровнем экс прессии a-SMA и выраженностью как интерстициального фиброза (r=0,43, р=0,0001), так и воспалительной инфильтрации стромы (r=0,46, р=0,0000). Фиброзные изменения интерстиция на фоне увеличения числа миофибробластов обусловлены их синтетической активностью – в усло виях фиброгенеза эти клетки продуцируют большое количество матрикс ных белков, что подтверждает наличие прямой корреляционной зависи мости между экспрессией a-SMA и количеством в почечном интерстиции молекул экстрацеллюлярного матрикса (фибронектин и коллаген IV типа) (rs=0,54, р=0,021 и rs=0,36, р=0,045 соответственно).

Помимо интерстициальной экспрессии a-SMA в отдельных случаях также отмечалось слабое и/или умеренное окрашивание эпителия почеч ных канальцев, что указывает на возможность происхождения интерсти циальных миофибробластов в результате процесса эпителиально-мезен химальной трансформации (ЭМТ) канальцевых клеток. Значение ЭМТ в развитии фиброзных изменений почечного интерстиция достаточно широко освещены в имеющейся литературе, однако, большинство иссле дований проведены на экспериментальных моделях нефритов, либо отдельных нозологических формах гломерулопатий у взрослых [Y. Liu и соавт., 2004;

G. D'Amico и соавт., 1992].

В ходе проведенного исследования было установлено, что формиро вание интерстициального фиброза характеризуется появлением и накоп лением в строме почки вне базальной мембраны коллагена IV типа. Также отмечалось более выраженная экспрессия фибронектина в зонах интер стициального фиброза и воспалительной инфильтрации стромы (rs=0,31, р=0,0004 и rs=0,27, р=0,0017 соответственно). Данная закономерность была также подтверждена в результате сравнения групп с различной степенью интестициального фиброза с использованием непараметриче ского критерия Крускала–Уоллиса (таблица 2). Было обнаружено досто верное увеличение выраженности экспрессии коллагена IV типа и фибро нектина при нарастании степени как фиброзных, так и воспалительных изменений в строме почки при различных морфологических вариантах гломерулопатий.

Таблица 2. Результаты статистического анализа (Крускала–Уоллиса) выраженности экспрессии молекул ЭЦМ в зависимости от степени интер стициальной инфильтрации и фиброза Зависимость от степени Зависимость от степени интерстициального фиброза воспалительной инфильтрации Н р Н р Коллаген IV типа 37,1 0,017 34,2 0, Фибронектин 19,5 0,002 23,1 0, Полученные данные подтверждают важную роль фибронектина в формировании интерстициальных изменений. Этот адгезивный глико протеин формирует основу для накопления других белков, а также, выступая в роли хемоаттрактанта для фибробластов, способствует при влечению в очаг формирующегося фиброза еще большего количество профиброгенных клеток [M. Zeisberg и соавт., 2001]. Кроме того, фибро нектин является лигандом для адгезивных молекул – интегринов, прини мающих участие в процессах миграции клеток моноцитарного ряда, их локального взаимодействия друг с другом и окружающим матриксом, тем самым способствует формированию и поддержанию интерстициального воспалительного инфильтрата [F.P. Schena и соавт., 1988]. Косвенным подтверждением его хемотаксического действия является выявленная прямая корреляционная связь между воспалительной инфильтрацией и количеством фибронектина в почечном интерстиции (rs=0,27, р=0,0017).

В нашем исследовании анализ взаимосвязи экспрессии a-SMA, ТФР-, фибронектина и клинических данных выявил статистически достоверную корреляционную взаимосвязь между уровнем суточной протеинурии и позитивностью экспрессии вышеуказанных молекул. При сравнении выраженности экспрессии a-SMA и ТФР- с использованием непарамет рического критерия Манна–Уитни были выявлены более высокие значе ния ПЭ этих маркеров у больных с нефротическим уровнем суточной протеинурии (40 мг/кг/сут) вне зависимости от морфологии гломеруляр ных изменений. Также была выявлена зависимость выраженности интер стициального фиброза и воспалительной инфильтрацией стромы от уровня суточной протеинурии (rs=0,27, р=0,0043 и rs=0,28, р=0,0036 соответст венно). Использование непараметрического теста Манна–Уитни позволи ло выявить достоверное увеличение степени и распространенности скле ротических и воспалительных изменений стромы в группе пациентов с уровнем суточной протеинурии 40 мг/кг (U=234,1, p=0,019 и U=137,2, p=0,036 соответственно). Подобные изменения могут быть следствием сочетанного действия двух факторов – увеличением числа миофибробла стов, усилением их синтетической активности под влиянием выраженной экспрессии ТФР- при нарастании уровня суточной проеинурии (установ лено пороговое значение неблагоприятного уровня суточной экскреции белка равное 40 мг/кг/сут). Результирующим эффектом влияния обоих показателей является накопление большого количества белков ЭЦМ и на растание степени интерстициального фиброза, что позволяет рассматри вать протеинурию в качестве неблагоприятного прогностического факто ра в прогрессировании хронических болезней почек Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика тубулоинтерстициальных изменений при первичных гломерулопатиях в материале повторных пункционных нефробиопсий Повторная нефробиопсия была выполнена у 14 пациентов для кор рекции лечения или уточнения морфологического диагноза. Спектр мор фологических вариантов гломерулопатий в этой группе представлен в таблице 3. Между группами с различными вариантами гломерулопатий не было достоверных различий по возрасту.

Таблица 3. Спектр морфологических вариантов гломерулопатий, возрас тной и половой состав в группе повторных нефробиопсий Морфологический Число случаев Средний возраст, диагноз лет мальчики девочки всего МзПГН – 3 Б. Берже 2 2 10,7±3, МзКГН - 3 ФСГС 3 1 Длительность заболевания на момент выполнения первой биопсии составила 22,4 ± 3,8 мес. Интервал между первой и повторной биопсиями колебался от 8 до 55 месяцев, в среднем составил 25,4±9,1 мес. Группы с различными морфологическими вариантами гломерулопатий не отлича лись между собой как по длительности заболевания на момент выполне ния первой биопсии, так и по промежутку времени до повторной биопсии.

В динамике в 7 случаях (с морфологическими вариантами ФСГС и ББ) отмечалось усиление выраженности интерстициальных изменений, как фиброза стромы, так и ее инфильтрации воспалительными клетками.

Увеличение выраженности интерстициального фиброза носило статисти чески достоверный характер (критерий Уилкоксона Z=2,9, р=0,023). В из менении степени инфильтрации стромы не было выявлено статистически значимых закономерностей (Z=0,36, р=0,67). Отмечалась прямая корреля ционная связь между выраженностью воспалительной инфильтрации в первой биопсии и степенью интерстициального фиброза во второй био псии (rs=0,42, р=0,035). В четырех наблюдениях в первой биопсии отме чалась незначительная или умеренная инфильтрация стромы и в трех из них в динамике отмечалось нарастание степени интерстициального фиб роза (в одном случае – с умеренного до выраженного, в двух остальных – от слабовыраженного до умеренного).

Данные, полученные в процессе анализа материала первичных и по вторных нефробиопсий, о том, что степень выраженности стромального фиброза увеличивается в динамике развития заболевания, также подтвер ждают большое значение интерстициальных изменений в прогрессирова нии гломерулярных заболеваний. Наряду с этим, отсутствие подобных закономерностей для воспалительной инфильтрации стромы в сочетании с выявленной достоверной корреляцией между ее выраженностью в пер вой биопсии и степенью интерстициального фиброза во второй биопсии свидетельствуют о преимущественной роли клеток инфильтрата в качест ве триггерного фактора на начальных этапах фиброгенеза.

Проведенный статистический анализ выраженности экспрессии мар керов миофибробластической дифференцировки, молекул ЭЦМ (фибро нектин, коллаген IV типа) и ТФР- с использованием попарного сравне ния с помощью критерия Уилкоксона позволил выявить следующие зако номерности. Отмечается достоверное увеличение в материале повторной нефробиопсии ПЭ ТФР- и фибронектина (Z=2,13, р=0,032 и Z=2,43, р=0,015 соответственно). Полученные данные носят оригинальный харак тер и свидетельствуют о важной роли фибронектина в процессе формиро вания и прогрессирования интерстициальных изменений.

Прогностическое значение тубулоинтерстициальных изменений и иммуногистохимических маркеров в развитии нарушений функции почек при первичных гломерулопатий у детей У 65 пациентов имелись данные об изменении клинико-биохими ческих показателей в течение от 10 до 85 месяцев с момента выполнения нефробиопсии. В 9 случаях в течение этого срока развилась хроническая почечная недостаточность 1–2 степени, в одном случае у ребенка с ФСГС – терминальная стадия ХПН. Кроме того, еще у 9 пациентов отмечались парциальные нарушения канальцевых функций.

Оценка влияния морфологических и иммуногистохимических изме нений ТИК на развитие нарушений почечных функции у пациентов с раз личными морфологическими вариантами гломерулопатий была проведена с помощью непараметрического теста Каплан–Майера, где в качестве конечной точки использовалось развитие хронической почечной недоста точности как минимум 1-й степени. Выраженные склеротические и вос палительные изменения интерстициальной ткани в дебюте заболевания и/или на момент проведения нефробиопсии имели статистически значи мый неблагоприятный эффект для развития ХПН у больных с различны ми морфологическими формами гломерулопатий (рисунок 1).

А Б Рисунок 1 – Развитие ХПН у больных с первичными гломерулопатиями в зависимости от степени интерстициального фиброза (А) и инфильтрации (Б) Для оценки влияния на скорость развития ХПН выраженности экс прессии изученных иммуногистохимических маркеров (a-SMA, ТФР-, коллаген IV типа, фибронектин) все случаи были разделены на три группы по 33-му и 66-му перцентилям ПЭ. Так проведенный анализ продемонст рировал существенное неблагоприятное влияние на развитие нарушения функции почек увеличения выраженности экспрессии фибронектина и a-SMA (рисунок 2), тогда как количество коллагена IV типа и ТФР в почечном интерстиции не имели отрицательного значение для прогноза в развитии ХПН (р=0,27 и р=0,56 соответственно).

А Б Рисунок 2 – Развитие ХПН у больных с первичными гломерулопатиями в зависимости от значения ПЭ a-SMA (А) и фибронектина (Б) ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основные научные результаты диссертации 1. Наиболее выраженные тубулоинтерстициальные изменения отме чаются у больных с фокально-сегментарным гломерулосклерозом и ме зангиокапиллярным гломерулонефритом (Н=24,35, р=0,0001), тогда как остальные рассмотренные морфологические варианты поражений клу бочков сопровождаются незначительными изменениями стромы. Это позволяет объяснить быстрое прогрессирование и плохой прогноз этих «неблагоприятных» форм гломерулопатий с точки зрения современных представлений о патогенезе развития хронической почечной недостаточ ности [2–4].

2. Увеличение степени фиброза стромы, прослеженное в динамике на материале повторных нефробиопсий свидетельствует о важной роли тубулоинтерстициальных изменений в прогрессировании гломерулярных заболеваний (Z=2,9, р=0,023). Отсутствие подобных закономерностей для воспалительной инфильтрации в сочетании с выявленной прямой корре ляционной связью между ее выраженностью в первой биопсии и степе нью интерстициального фиброза во второй биопсии (rs=0,42, р=0,035) свидетельствуют о преимущественном значении клеток инфильтрата на начальных этапах фиброгенеза [4].

3. Степень экспрессии гладкомышечного актина- в интерстициаль ной ткани почек значительно варьирует в зависимости от характера изме нений клубочков и степени интерстициального фиброза. Наиболее выра женная его экспрессия отмечается у больных с неблагоприятными морфологическими вариантами гломерулопатий (фокально-сегментарный гломерулосклероз и мезангиокапиллярный гломерулонефрит) (показатели экспрессии равны 0,095 и 0,116 соответственно, р=0,0001), а также в слу чаях с выраженными склеротическими стромальными изменениями (Н=29,3;

р=0,0000). Фиброзные изменения интерстиция на фоне увеличе ния числа миофибробластов обусловлены их синтетической активностью – в условиях фиброгенеза эти клетки продуцируют большое количество матриксных белков, на что указывает корреляционная связь между экс прессией гладкомышечного актина- и количеством коллагена IV типа и фибронектина в почечном интерстиции (rs=0,54, р=0,021 и rs=0,36, р=0,045 соответственно). Выявленная экспрессия гладкомышечного акти на- в эпителиоцитах почечных канальцев указывает на возможность происхождения интерстициальных миофибробластов в результате про цесса эпителиально-мезенхимальной трансформации канальцевых клеток [2, 4, 6, 7, 9–11].

4. Развитие интерстициального фиброза характеризуется появлением в строме почки вне базальной мембраны коллагена IV типа и увеличением его количества по мере нарастания степени фиброзных изменений (Н=12,3, р=0,0054). Также выявлено достоверное увеличение выраженно сти экспрессии фибронектина по мере нарастания степени стромального фиброза (Н=11,6, р=0,0087). Обнаруженная прямая корреляционная связь между воспалительной инфильтрацией и количеством фибронектина в почечном интерстиции (rs=0,27, р=0,0017), а также статистически зна чимое увеличение его экспрессии у пациентов с выраженным стромаль ным воспалением (Н=17,6, р=0,0005) являются косвенным подтверждени ем его хемотаксического действия. Статистически значимое увеличение количества фибронектина в материале повторных нефробиопсий отмеча ется одновременно с увеличением степени фиброзных изменений соеди нительной ткани почек (Z=2,43, р=0,015) и свидетельствует о важной роли этого маркера в процессе развития тубулоинтерстициальных изме нений [2, 4, 9, 10].

5. Продемонстрировано влияние уровня суточной протеинурии на выраженность интерстициальных изменений при первичных гломеруло патиях в виде значительного увеличения усиления экспрессии гладкомы шечного актина- и трансформирующего фактора роста- в почечном интерстиции у пациентов с нефротическим уровнем протеинурии (более 40 мг/кг/сут) (U=125,0, р=0,0011 и U=636,0, р=0,046 соответственно) [2, 4, 8, 9–12].

6. Выраженные интерстициальный фиброз и инфильтрация стромы являются прогностически неблагоприятными факторами в развитии хро нической почечной недостаточности у пациентов с первичными гломеру лярными заболеваниями (Chi2=35,6 и Chi2=33,7 при р0,0001). Неблаго приятными факторами прогноза течения заболевания являются также увеличение показателя экспрессии гладкомышечного актина- и фибро нектина в почечном интерстиции (Chi2=8,1;

р=0,017 и Chi2=6,7;

р=0, соответственно) [3, 4].

Рекомендации по практическому использованию результатов 1. Использование предложенной методики оценки степени интер стициальных фиброза и воспалительной инфильтрации в материале неф робиопсий позволяет исключить фактор субъективности, что является важным звеном, как постановки правильного морфологического диагноза, так и необходимым условием проведения научных исследований [14].

2. Выявление в ткани почек выраженной экспрессии гладкомышеч ного актина- и фибронектина может служить морфологическим марке ром неблагоприятного прогноза. Использование комплексной оценки из менений интерстиция с применением иммуногистохимического метода позволяет определить вероятный прогноз дальнейшего развития заболе вания на начальных этапах диагностики и выделить среди детей с пер вичными гломерулопатиями группу пациентов с высоким риском быстро го развития хронической почечной недостаточности. Выявление предик торов раннего прогрессирования хронических болезней почек позволит своевременно назначить необходимую нефропротекторную терапию и решить вопрос о выборе протокола патогенетической терапии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ СОИСКАТЕЛЯ Статьи в научных журналах 1. Клинико-морфологическая характеристика IgA нефропатии у де тей и подростков / А.В. Сукало, А.В. Крылова-Олефиренко, Е.Д. Черст вый, Т.А. Летковская, Н.И. Тур, В.В. Савош // Педиатрия. – 2009. – № 3. – С. 28–32.

2. Савош, В.В. Морфологическая и иммуногистохимическая харак теристика интерстициальной ткани почек при первичных гломерулопати ях / В.В. Савош, Т.А. Летковская, Е.Д. Черствый // Проблемы здоровья и экологии. – 2009. – № 2. – С. 26–30.

3. Патогенетическое и прогностическое значение тубулоинтерстици альных изменений в прогрессировании некоторых морфологических вариантов гломерулопатий у детей / В.В. Савош, Т.А. Летковская, Е.Д. Черствый, А.В. Сукало, Н.И. Тур // Рецепт. – 2009. – № 4. – С. 105–112.

4. Савош, В.В. Морфологическая и иммуногистохимическая харак теристика тубулоинтерстициального компонента при первичных гломе рулопатиях в материале пункционных нефробиопсий / В.В. Савош // Ме дицинская панорама. – 2009. – № 10. – С. 66–68.

5. Клеточные механизмы формирования тубулоинтерстициальных изменений при первичных гломерулопатиях / В.В. Савош, Т.А. Летков ская, Е.Д. Черствый, А.В. Сукало // Медицинский журнал. – 2007. – № 4. – С. 98–100.

Статьи в сборниках научных трудов 6. Савош, В.В. Определение экспрессии гладкомышечного актина-а в интерстициальной ткани почек при различных морфологических типах нефропатий / В.В. Савош // Труды молодых ученых–2007: сборник науч ных работ. – Минск, 2007. – С. 123–126.

7. Савош, В.В. Изучение молекулярных механизмов развития тубу лоинтерстициальных повреждений при гломерулопатиях / / В.В. Савош // Труды молодых ученых–2008: сборник научных работ. Минск, 2008.

С. 148–152.

Тезисы докладов и конферений 8. Immunohistochemical Characteristic of Tubulointerstitial Changes in Patients With Primary Glomerulopathies / V.V. Savosh, T.A. Letkouskaya, E.D. Cherstvoy, A.V. Sukalo, N.I. Tur // Virchows Arch. – 2009. – Vol. 455. – P. S405.

9. Савош, В.В. Некоторые патогенетические механизмы формирова ния интерстициальных изменений при первичных гломерулопатиях / В.В. Савош, Т.А. Летковская, Е.Д. Черствый // Сборник тезисов III съезда Российского общества патологоанатомов. – 2009. – Т. II. – С. 442–444.

10. Савош, В.В. Характеристика тубулоинтерстициальных измене ний при первичных гломерулопатиях у детей / В.В. Савош, Т.А. Летков ская, Е.Д. Черствый // Актуальные вопросы экспериментальной и клини ческой морфологии: сборник работ науч.-практ. конф. – 2009. – С. 57–59.

11. Expression of myofibroblasts markers in the renal interstitial tissue in patients with proteinuria / I.A. Kazyra, V.V. Savosh, N.I. Tur, T.A. Let kovskaya, E.D. Cherstviy, A.V. Sukalo // Pediatric Nephrology. – 2008. – Vol. 23. – P. 1642.

12. Савош, В.В. Экспрессия трансформирующего фактора роста в интерстициальной ткани почек при первичных нефропатиях у детей. / В.В. Савош, Т.А. Летковская, Е.Д. Черствый // Актуальные вопросы мор фологической диагностики заболеваний: материалы Республ. науч.-практ.

конф. – Витебск: ВГМУ, 2008. – С. 215–218.

13. Савош, В. В. Структура нефробиопсий у детей / В.В. Савош // Достижения фундаментальной, клинической медицины и фармации:

материалы 62-й науч. сессии университета. – Витебск, 2007. – С. 419–423.

Рационализаторское предложение 14. Методики оценки фиброзных и воспалительных изменений в ин терстициальной ткани почек в материале нефробиопсий: рационализатор ское предложение № 1682 от 09.11.2009 г. / В.В. Савош, Т.А. Летковская, Е.Д. Черствый, С.К. Клецкий.

РЭЗЮМЭ Савош Вiкторыя Вiктараўна Патагенетычнае i практычные значэнне тубулаiнтэрстыцыяльных змяненняў пры развiццi першасных гламерулапатый у дзяцей Ключавыя словы: першасныя гламерулапатыi, iнтэрстыцыяльныя змяненнi, фiброз, мiяфiбрабласты, фiбранэкцiн, калаген IV тыпу.

Мэта даследавання: вызначыць ролю тубулаiнтэрстыцыяльных змяненняў пры прагрэсіраваннi хранічных захворванняў нырак ў дзяцей на аснове ацэнкi стану экстрацэлюлярнага матрыкса i канальцаў пры розных назалагiчных формах першасных гламерулапатый.

Метады даследавання: светавая мікраскапія, iмунагiстахiмiчнае афарбаванне, статыстычны аналiз.

Атрыманыя вынiкi i iх навiзна. Найбольш значныя змяненнi iнтэрстыцыя i канальцаў адзначаюцца ў хворых з факальна-сегментарным гламеруласклерозам i мезангiякапiлярным гламеруланефрытам i выступа юць ў якасцi марфалагiчных прэдыктараў хуткага прагрэсіравання хваробы. Рэмадэлiраванне iнтэрстыцыяльнага матрыкса пры першасных гламерулапатыях характарызуецца павелiчэннем колькасцi клетак з мiя фiбрабластычнай дыферэнцыроўкай (у выніку эпiтэлiяльна-мезенхiмаль най трансфармацыi эпiтэлiяцытаў) i накапленнем у экстрацэлюлярным матрыксе калагену IV тыпу i фiбранэкцiну. Ступень iнтэрстыцыяльнага фiброзу нарастае ў дынаміцы развiцця ныркавай хваробы пераважна за кошт павелiчэння колькасцi фiбранэкцiну, узмацненне экспрэсii якога ў спалучэннi са значнай экспрэсiяй гладкамышачнага акцiну- з’яўляюцца iмунагiстахiмiчным маркёрам неспрыяльнага прагнозу развiцця хваробы ў пацыентаў з першаснымi гламерулапатыямi. Вызначана павелiчэнне экспрэсii гладкамышачнага акцiну- i трансфармiруючага фактару росту у ныркавам iнтэрстыцыi ў пацыентаў з нефратычным узроўнем пратэiнурыi (больш за 40 мг/кг/сут).

Ступень выкарыстання атрыманых вынiкаў. Вызначэнне паказчыка экспрэсii гладкамышачнага акцiну- i фiбранэкцiну можа служыць дадатковым марфалагiчным маркёрам неспрыяльнага прагнозу i дазволiць вылучыць сярод дзяцей з першаснымi гламерулапатыямi групу пацыентаў з высокай рызыкай хуткага развiцця хранiчнай ныркавай недастатковасцi, удакладніць крытэрыi выбару патагенетычнай i ныркава пратэктарнай тэрапii, а таксама тактыкі вядзення гэтых хворых.

Галiна выкарыстання: паталагiчная анатомiя, нефралогiя.

РЕЗЮМЕ Савош Виктория Викторовна Патогенетическое и прогностическое значение тубулоинтерстициальных изменений в развитии первичных гломерулопатий у детей Ключевые слова: первичные гломерулопатии, интерстициальные изменения, фиброз, миофибробласты, фибронектин, коллаген IV типа.

Цель исследования: установить роль тубулоинтерстицальных изме нений в прогрессировании хронических заболеваний почек у детей на ос новании оценки состояния экстрацеллюлярного матрикса и канальцев при различных нозологических формах первичных гломерулопатий.

Методы исследования: световая микроскопия, иммуногистохими ческое окрашивание, статистический анализ.

Полученные результаты и их новизна. Наиболее выраженные из менения интерстиция и канальцев отмечаются у больных с фокально сегментарным гломерулосклерозом и мезангиокапиллярным гломеруло нефритом и выступают в качестве морфологических предикторов быстро го прогрессирования заболевания. Ремоделирование интерстициального матрикса при первичных гломерулопатиях характеризуется увеличением количества клеток с миофибробластической дифференцировкой (в ре зультате эпителиально-мезенхимальной трансформации эпителиоцитов) и накоплением в экстрацеллюлярном матриксе коллагена IV типа и фиб ронектина. Степень интерстициального фиброза нарастает в динамике развития почечного заболевания преимущественно за счет увеличения количества фибронектина, усиление экспрессии которого в сочетании с выраженной экспрессией гладкомышечного актина- являются иммуно гистохимическими маркерами неблагоприятного прогноза развития забо левания у пациентов с первичными гломерулопатиями. Отмечено усиле ние экспрессии гладкомышечного актина- и трансформирующего фактора роста- в почечном интерстиции у пациентов с нефротическим уровнем протеинурии (более 40 мг/кг/сут).

Степень использования полученных результатов. Определение показателя экспрессии гладкомышечного актина- и фибронектина может служить дополнительным морфологическим маркером неблагоприятного прогноза и позволит выделить среди детей с первичными гломерулопа тиями группу пациентов с высоким риском быстрого развития хрониче ской почечной недостаточности, уточнить критерии выбора патогенети ческой и нефропротекторной терапии, а также тактики ведения этих больных.

Область применения: патологическая анатомия, нефрология.

SUMMАRY Savosh Viktoriya Pathogenetic and prognostic meaning of tubulointerstitial changes in the development of the primary glomerulopathies in children Key words: glomerulopathy, tubulointerstitial changes, fibrosis, myofibroblasts, fibronectin, collagen IV type.

Purpose of the study: to reveal possible relationships between tubulointerstitial changes and progression of the primary glomerulopathies in children using characteristic of extracellular matrix and renal tubular.

Methods: Light microscopy, immunohistochemical staining, stastistic analysis.

Results and the main findigs. We have found that focal segmental glomerulosclerosis and membranoproliferative glomerulonephritis were accompanied by the increases of the degree of the tubulointerstitial changes and characterized by poor prognosis. There was an increase in myofibroflasts through epithelial-mesenchymal transition of tubular cells and overexpression of extracellular matrix proteins (collagen type IV and fibronectin) during formation of the interstitial fibrosis. During progression of renal disease the degree of interstitial fibrosis increased due to fibronectin accumulation, we considered high expression of smooth muscle actin and fibronectin to be a marker of unfavorable prognosis for the primary glomerulopathies. Expression of smooth muscle actin and transforming growth factors- was significantly higher in patients with the nephritic level of proteinuria (more than 40 mg/kg per 24 hours).

Recommendations for usage. The quantative assessment of fibronectin and smooth muscle actin expression may be useful for prognosis of primary glomerulopathies in children. It can also help to define patiens with high risk of rapid chronic renal failure development and specify selection criteria of the choice of pathogenetic treatment.

Area of application: pathology, nephrology.

Подписано в печать 30.03.10. Формат 6084/16. Бумага писчая «КюмЛюкс».

Печать офсетная. Гарнитура «Times».

Усл. печ. л. 1,16. Уч.-изд. л. 1,22. Тираж 60 экз. Заказ 164.

Издатель и полиграфическое исполнение:

учреждение образования «Белорусский государственный медицинский университет».

ЛИ № 02330/0494330 от 16.03.2009.

ЛП № 02330/0150484 от 25.02.2009.

Ул. Ленинградская, 6, 220006, Минск.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.