авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-hbs)

На правах рукописи

ВЯЗНИКОВА

Татьяна Владимировна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ

ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ АВИДИН-БИОТИНОВОГО

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ

(ДИФТЕРИЙНЫХ, СТОЛБНЯЧНЫХ, КОКЛЮШНЫХ, АНТИ-HBS)

14.00.36 – аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Екатеринбург - 2007 2

Работа выполнена в Филиале Федерального государственного унитарного предприятия «НПО «Микроген» Министерства здравоохранения Российской Федерации «Пермское НПО «Биомед»

Научный руководитель: доктор биологических наук Николаева Алевтина Максимовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Родионов Сергей Юрьевич кандидат биологических наук Орлова Екатерина Григорьевна

Ведущая организация: ФГУН Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора, г. Москва.

Защита состоится «» _ 2007 г. в _ часов на заседа нии диссертационного совета Д 004.027.01 при Институте иммунологии и фи зиологии УрО РАН по адресу: 620041, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 91.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г. Екатеринбург, ул. С. Ковалевской-Академическая, 22/20), с авторефератом можно ознакомиться на официальном сайте Института имму нологии и физиологии УрО РАН – http://www.iip.uran.ru.

Автореферат диссертации разослан «» _ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор И.А. Тузанкина Актуальность проблемы Вакцинопрофилактика рассматривается в настоящее время не только как эффективное, наиболее доступное и экономичное средство в борьбе с инфек циями, но и как средство достижения активного долголетия во всех социаль ных группах населения развитых и развивающихся стран (Бектимиров Т.А., 2001;

Медуницын Н.В., 2004;

Онищенко Г.Г., 2006). Успех программ вакцино профилактики во многом определяется эффективностью эпидемиологического надзора за управляемыми инфекциями, в котором важная роль принадлежит серологическому мониторингу специфического антиинфекционного иммуните та (Семенов Б.Ф., 1996;

Покровский В.И., 1999;

Фельдблюм И.В., 2005).

В соответствии с рекомендациями ВОЗ ряд стран (Финляндия, Швеция, Дания, Польша, Австралия, Япония и др.) включили серологический монито ринг в систему эпидемиологического надзора за инфекциями, управляемыми средствами специфической профилактики (Селезнева Т.С., 2004).

Современным требованиям эпидемиологической практики в значительной степени отвечает иммуноферментный анализ (ИФА), который позволяет органи зовать эффективную систему диагностики иммунитета на основе точной инст рументальной оценки уровня специфических антител (Aybay C., 2003).

В отечественных иммуноферментных тест-системах и большинстве зару бежных, рассчитанных на определение антител различной специфичности в сы воротках крови человека, используются варианты твердофазного ИФА, осно ванные на фиксации антител на нерастворимой основе (обычно полистироловых планшетах с иммобилизованным антигеном) с последующим тестированием связанных антител при помощи индикаторной системы - конъюгатов антивидо вых антител (против иммуноглобулина G человека) с ферментами-маркерами.

Однако технология приготовления антивидовых антител, связанная с использованием животных, очень сложна, длительна по времени, трудоемка и вследствие этого высокозатратна. Кроме того, к недостаткам систем с антиви довыми конъюгатами относятся и неспецифические взаимодействия, которые могут иметь место между антиглобулином, меченным ферментом, и гетероло гичным иммуноглобулином, присутствующим в клиническом образце, либо с антителом, фиксированным на твердой фазе (Yolken R.H., 1985).

В связи с этим актуален поиск новых эффективных и технологичных путей синтеза ферментных конъюгатов.

Перспективным направлением в ИФА является использование амплифи цирующей системы авидин-биотин. Исследователи отмечают, что при приме нении авидин-биотиновых конъюгатов достигается чрезвычайно высокая чув ствительность и специфичность определения, а также в значительной степени снижаются фоновые реакции (Lynn F.,1996;

Aybay C., 2003).

Цель исследования – экспериментально обосновать и сконструировать твердофазные иммуноферментные тест-системы для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) на основе амплифици рующего комплекса авидин-биотин.

Задачи исследования 1. Разработать эффективный и технологичный способ приготовления конъюгата.

2. Сконструировать оптимальные композиции иммуноферментных тест-систем на основе амплифицирующего авидин-биотинового комплекса.

3. Оценить качество разработанных тест-систем по следующим крите риям: линейность и параллелизм, чувствительность, специфичность, точ ность, сравнение с референс-методами.

4. Определить область применения разработанных иммуноферментных тест-систем.

Научная новизна 1. Впервые предложен универсальный антиглобулиновый маркер на ос нове белка А золотистого стафилококка, меченного биотином. Показана воз можность эффективного применения сконструированного конъюгата для оп ределения антител различной специфичности (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) в сыворотках крови человека и животных.



2. Экспериментально обоснована и разработана оригинальная конструк ция иммуноферментной тест-системы для выявления анти-HBs с использова нием биотинилированного конъюгата на основе рекомбинантного HВsАg (па тент № 2206095 от 10.06.03 г.).

3. Впервые разработана оригинальная конструкция иммуноферментной тест-системы для определения коклюшных антител на основе биотинилиро ванного белка А (приоритетная справка № 2006127549 от 31.07.2006 г.).

Практическая значимость работы 1. Разработана технология приготовления универсальных конъюгатов на основе биотинилированных белка А и рекомбинантного HBsAg, не требую щая больших экономических затрат.

2. Разработана и утверждена нормативно-техническая документация на производство тест-системы иммуноферментной для выявления антител к по верхностному антигену вируса гепатита В (Фармакопейная статья № 42 0504656005, Производственный регламент № 04862997-79-06). Получено ре гистрационное удостоверение (ЛС-000884 от 03.11.2005 г.) и лицензия на производство (99-04-000097 от 27.10.2005 г.).

3. Использование разработанных тест-систем обеспечивает эффективный серологический мониторинг за инфекциями, управляемыми средствами иммуно профилактики, на основе количественной оценки уровня специфических антител.

4. Изданы и внедрены в работу территориальных отделов Управления Роспотребнадзора по Пермскому краю и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемио логии в Пермском крае» методические рекомендации «Эпидемиологический надзор и контроль за коклюшной инфекцией».

Положения, выносимые на защиту 1. Получены универсальные конъюгаты и сконструированы на их осно ве иммуноферментные тест-системы для индикации специфических антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs).

2. Разработанные тест-системы соответствуют критериям, предъявляе мым ВОЗ к наборам для иммунологических испытаний (линейность и парал лелизм, чувствительность, специфичность, точность, сравнение с референс методами).

3. Определена область применения разработанных иммуноферментных тест-систем.

Апробация диссертации Результаты проведенных исследований были доложены и обсуждены на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г.

Москва, 2002);

Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» (г. Пермь, 2003);

XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2004);

Научно практической конференции «Современная вакцинопрофилактика: проблемы и перспективы развития» (г. Пермь, 2005);

Международной научной конферен ции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий»

(г. Томск, 2006);

Всероссийской научно-практической конференции «Вакцино логия 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006).

Диссертация прошла экспертизу и апробирована на заседании Научно технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» в 2006 г.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК - 1, 1 методические рекомендации, получен 1 патент Российской Федерации и 1 приоритетная справка по заявке на патент.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и вклю чает введение, обзор литературы, главу материалы и методы, три главы собст венных исследований, заключение, выводы, приложение. Указатель литерату ры содержит 276 источников, из них 185 отечественных и 91 иностранных.

Текст иллюстрирован 23 рисунками и 33 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований Препараты и реагенты При конструировании иммуноферментных тест-систем были использова ны препараты производства филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Перм ское НПО «Биомед» (анатоксин дифтерийный очищенный концентрированный;

анатоксин столбнячный очищенный концентрированный;





нативная коклюш ная суспензия (взвесь убитых формалином коклюшных микробов 1 фазы);

ан тивидовой конъюгат (F(ab')2-фрагменты аффинноочищенных антител лошади против IgG человека, меченные пероксидазой хрена);

белок А золотистого ста филококка);

поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) производства ЗАО НПК «Комбиотех» (г. Москва), а также реагенты производства фирмы «Sigma», США (пероксидаза хрена высокоочищенная;

3,3',5,5' тетраметилбензидин;

авидин-пероксидаза;

диметилсульфоксид;

N гидроксисукцинимидобиотин);

полистироловые планшеты однократного применения фирмы «Costar» (США), а также конъюгат белок А, меченный пе роксидазой хрена, полученный по методу Накане (Nakane P.K., 1974).

Тест-системы сравнения Определение анти-HBs проводили с помощью тест-систем MONOLISA® anti-HBs 3.0 (Франция) и “AUSAB® EIA” (США) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к наборам.

Контрольные образцы Контрольные положительные образцы (К+) - сыворотки крови с из вестным содержанием специфических антител, установленным в прецизи онном тесте (дифтерийные и столбнячные антитела - в реакции нейтрали зации in vivo, коклюшные антитела – в реакции агглютинации, а для «ИФА анти-B» - сыворотка, откалиброванная по ОСО 42-28-320-00 «Им муноглобулин человека против вируса гепатита В»).

Контрольные отрицательные образцы (К-) - сыворотки крови, не содер жащие специфических антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, ан ти-HBs).

Образцы сывороток крови, исследованные на наличие специфических антител Группы обследованных Количе ство проб Здоровые взрослые и дети Дети и взрослые, иммунизированные комбинированными вак- цинами (АКДС, АДС-М, Бубо-М, Бубо-Кок) и вакциной гепа тита В (ВГВ) Взрослые и дети, контактные с источником возбудителя HBV- инфекции в эпидемических очагах Дети с подозрением на коклюш (группа наблюдения) и дети с заболеванием не коклюшной этиологии (группа сравнения) Больные с легким и среднетяжелым течением острой формы гепатита В Кролики, иммунизированные вакциной гепатита В (ВГВ) и иммуноглобулином человека против гепатита В (Антигеп) Морские свинки, иммунизированные комбинированными вак- цинами (АКДС, АДС-М, Бубо-М, Бубо-Кок, Инфанрикс) и вакциной гепатита В (ВГВ) и не иммунизированные морские свинки (контрольная группа) Мыши, иммунизированные комбинированными вакцинами (Бубо-М, АКДС-Геп В) и вакциной гепатита В (ВГВ) и не им мунизированные мыши (контрольная группа) В работе были использованы также иммуноглобулины (нормальный, противостафилококковый, противоэнцефалитный, противостолбнячный, про тив гепатита В (Антигеп)) производства филиала ФГУП «НПО «Микроген»

МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (г. Пермь) - 20 серий.

Методы Реакция нейтрализации (РН). Определение титра дифтерийных и столбнячных антител в сыворотках крови людей и животных проводили с по мощью биологического теста – реакции нейтрализации дифтерийного токсина на морских свинках, столбнячного токсина - на белых мышах (Методическое руководство по лабораторной оценке качества бактерийных и вирусных пре паратов, 1972).

Реакция агглютинации (РА). Проводили по общепринятой методике с помощью диагностикума коклюшного жидкого для реакции агглютинации производства АООТ «Биомед» им. И.И. Мечникова (Моск. обл., Петрово Дальнее).

Учет результатов реакции иммуноферментного анализа (ИФА). Ре зультаты ИФА регистрировали на спектрофотометре PR 2100 производства фирмы “Sanofi Diagnostics Pasteur” (Франция) при двух длинах волн 450/620 нм.

Определение концентрации специфических антител проводили по градуировочному графику, построенному в координатах: y – lg оптической плотности положительного контрольного образца, х – log2 кратности его разве дения (рис. 1).

Y 0. -0. -0. -0. -0. -0. -0. -0. 1 2 3 4 5 6 X Рис. 1. Градуировочный график Далее находили концентрацию антител в исследуемом образце по следующей формуле:

Т1 х В Т = _, где А х Т – концентрация антител в исследуемом образце, МЕ/мл;

Т1 – концентрация антител в положительном контрольном образце;

А – кратность разведения по ложительного контрольного образца;

Ах100 – разведение положительного кон трольного образца;

В – разведение исследуемого образца, в котором определя лась оптическая плотность.

Кроме того, была использована компьютерная программа количествен ного определения специфических антител, созданная на основании разрабо танного алгоритма обработки результатов ИФА (Николаева А.М., 2003).

Следует отметить, что учет результатов иммуноферментной реакции стандартизован таким образом, что позволяет оценить содержание дифтерий ных и столбнячных антител в исследуемых образцах в МЕ/мл, анти-HBs – в мМЕ/мл, коклюшных антител – в ИЕ/мл (иммуноферментные единицы).

Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики. В работе использовали электронные таб лицы Excel для Windows (Microsoft), пакет статистических программ “DIASTA” (МГУ, Россия), являющегося версией пакета "STADIA", програм му статистической обработки результатов ИФА методом параллельных линий (ГИСК им. Л.А. Тарасевича), программу БИОСТАТ для Windows (Microsoft), версия 4.03 (Гланц С., 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Одним из важнейших моментов в программе конкретных инженерных разработок иммуноферментного метода определения специфических антител является выбор оптимальных реагентов для основных составляющих тест систем – конъюгатов.

В своих исследованиях мы пошли по пути создания конъюгата на осно ве белка А, обладающего уникальной способностью образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека и различных млекопи тающих (Акатов А.К., 1983;

Азаренок К.С., 1987). Выбор этого реагента в зна чительной степени был обусловлен тем, что в Пермском НПО «Биомед» разра ботана оригинальная промышленная технология получения белка А, не усту пающего по своим качественным характеристикам препаратам зарубежных фирм (Sigma, Pharmacia).

Известно, что один из наиболее эффективных методов введения фер ментной метки основан на использовании авидина и биотина, образующих между собой комплекс, характеризующийся константой связывания 1015 М-1, что в десятки тысяч раз превышает характеристики связи антиген-антитело (Bayer A., 1980).

В связи с этим были проведены эксперименты по отработке оптималь ной методики биотинилирования белка А, в результате которых была обосно вана технология приготовления стандартных препаратов белка А, меченных биотином.

Основные физико-химические параметры ИФА, а именно чувствитель ность, точность и воспроизводимость, могут существенно изменяться при варьировании условий проведения эксперимента, что обусловливает необхо димость оптимизации каждой стадии анализа.

Для определения оптимальных условий проведения иммуноферментной ре акции были исследованы варианты возможных реагентов и параметры их приме нения: выбор антигенов, блокирующего агента, системы детекции, субстрата;

оп ределены оптимальные концентрации реагентов, состав, рН буферных растворов, а также оптимальная температура и время проведения отдельных этапов реакции.

На первом этапе работы были определены условия иммобилизации каж дого из исследованных антигенов на твердую фазу (табл. 1).

Таблица Оптимальные условия приготовления иммуносорбента Определяемые антитела анти-НВs дифтерийные столбнячные коклюшные Твердая фаза 96-луночные полистироловые планшеты Иммобилизирую- фосфатно- карбонатно-бикарбонатный, щий буферный солевой, рН 9, раствор рН 7,2-7, Антиген рекомби- дифтерий- столбнячный взвесь убитых нантный ный анатоксин формалином HBsAg анатоксин коклюшных микробов 1 фазы Концентрация белка 1 мкг/мл 10 мкг/мл 10 мкг/мл 5 млрд. кл./мл о Условия сорбции 2 суток при температуре 2-8 С 12 месяцев при температуре 2-8 оС Срок хранения В следующей серии модельных экспериментов была проведена сравни тельная оценка полученного конъюгата на основе биотинилированного белка А и конъюгатов, меченных пероксидазой хрена (антивидовой и белок А пероксидаза).

При оценке различных конъюгатов использовали коэффициент пози тивности (КП) - отношение средней оптической плотности положительных контрольных образцов к средней оптической плотности отрицательных кон трольных образцов (ОП К+ / ОП К-). Оптимальным считали конъюгат, при использовании которого КП составлял не менее 10,0;

а оптическая плотность К- была не более 0,150 (табл. 2).

Таблица Сравнительная оценка конъюгатов Опре- Конъюгат деляе- антивидовой белок А-биотин белок А-пероксидаза мые ан- КП ОП К- чувст- КП ОП К- чувст- КП ОП К- чувст титела витель- ви- витель ность* тельно ность* сть* дифте- 27,3 0,053 0,2-0,5 18,8 0,045 0,3-0,5 15,5 0,084 0,3-0, рийные ±2,4 ±0,005 мМЕ/мл ±1,4 ±0,003 мМЕ/мл ±1,8 ±0,009 мМЕ/мл столб- 30,2 0,054 0,2-0,5 28,4 0,055 0,2-0,5 30,7 0,062 0,2-0, нячные ±3,0 ±0,006 мМЕ/мл ±2,1 ±0,004 мМЕ/мл ±3,0 ±0,006 мМЕ/мл коклюш 19,0 0,061 0,01-0,05 19,8 0,061 0,01-0,05 7,6 0,211 0,1-0, ±0,002 ИЕ/мл ные ±0,7 ±1,1 ±0,003 ИЕ/мл ±0,3 ±0,009 ИЕ/мл анти- 5,1 0,265 25,0-50,0 6,5 0,275 25,0-50,0 4,9 0,325 25,0-50, мМЕ/мл ±0,3 ±0,013 мМЕ/мл ±0,3 ±0,019 мМЕ/мл HBs ±0,2 ±0, * Примечание: минимальный защитный уровень дифтерийных антител составляет 30 мМЕ/мл, столбнячных и анти-HBs – 10 мМЕ/мл.

Из представленных данных видно, что все исследованные конъюгаты обеспечивали достаточную чувствительность анализа при определении диф терийных и столбнячных антител. При использовании конъюгата белок А пероксидаза при определении коклюшных антител наблюдался высокий уро вень фоновых реакций (ОП К- более 0,150), тогда как при применении конъю гатов белок А-биотин и антивидового уровень фоновых реакций был низким (ОП К- менее 0,150).

Кроме того, было установлено, что все исследованные конъюгаты не обеспечивали необходимой чувствительности анализа при определении анти HBs в сыворотках крови человека.

В связи с этим были проведены эксперименты по созданию конъюгата для определения анти-HBs на основе биотинилированного рекомбинантного HBsAg. Результаты оценки полученного конъюгата представлены в таблице 3.

Таблица Оптимизация параметров проведения ИФА с помощью тест-системы на основе конъюгата HBsAg-биотин Раствор для разведения сывороток и Оптическая Чувствитель конъюгата плотность ность*, мМЕ\мл К+ К Фосфатно-солевой буферный раствор, 1,057 0,311 25,0-50, рН 7,2-7, Раствор отрицательной сыворотки в 1,024 0,055 3,1-5, фосфатно-солевом буфере, рН 7,2-7, * Примечание: оценку чувствительности проводили с помощью ОСО 42-28-320- «Иммуноглобулин человека против вируса гепатита В».

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана конструкция ИФТС, основанная на взаимодействии антигена (дифтерийного, столбнячного, коклюшного или HBsAg), иммобилизованного на полистироло вом планшете с антителами, содержащимися в сыворотке крови человека или животных. После фиксации на твердой фазе специфических реагирующих ан тител не прореагировавшие компоненты системы удаляют из сферы реакции путем последовательных промывок белково-солевым раствором с детерген том. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляют с помощью ам плифицирующей авидин-биотиновой системы, состоящей из белка А или HBsAg, меченных биотином и авидина, меченного пероксидазой хрена, кото рая обусловливает гидролиз перекиси водорода, регистрируемой по измене нию окраски индикатора (ТМБ) (рис. 2).

инкубация отмывка инкубация определение ферментативной отмывка активности Рис.2. Схема проведения твердофазного авидин-биотинового ИФА Условные обозначения:

- АГ – антиген;

- АТ – антитело;

- биотин;

- авидин;

- конъюгат (белок А (или HBsAg), меченный биотином + авидин, меченный пе роксидазой).

Важно отметить, что все разработанные ИФТС содержат универсальные реагенты (табл. 4), а методика постановки ИФА основана на одинаковом на боре манипуляций, что существенно упрощает их применение.

Таблица Состав разработанных иммуноферментных тест-систем Компонент ИФТС ИФА ИФА ИФА ИФА анти-К анти-В* анти-Д анти-С Иммуносорбент рекомби- дифтерий- столбняч- взвесь убитых нантный ный анаток- ный анаток- формалином дрожжевой син син коклюшных HBsAg микробов 1 фазы Раствор для промывания Фосфатно-солевой буферный раствор с твином- планшетов, разведения рН 7,0-7, сывороток и конъюгата Блокатор Белково-солевой раствор на основе казеина Положительный кон- Сыворотка крови, содержащая специфические антитела трольный образец Отрицательный кон- Сыворотка крови, не содержащая специфических антител трольный образец Конъюгат Белок А, меченный биотином, и авидин-пероксидаза Субстратный буферный Цитратно-фосфатный буферный раствор с перекисью водо раствор рода Хромоген 3,3',5,5'-тетраметилбензидин Стоп-реагент Серная кислота Примечания: * используется также конструкция ИФТС, содержащая в качестве конъюгата биотинилированный рекомбинантный HBsAg.

При создании любой ИФТС необходимо быть уверенным в том, что ее характеристики позволяют использовать ее для решения конкретных задач.

Подобная оценка должна быть проведена в форме валидации, которая являет ся важной частью системы обеспечения и контроля качества тест-систем (Давлетбаева Л.Р., 2006).

Валидационные исследования были проведены в соответствии с требо ваниями ВОЗ, предъявляемыми к наборам для иммунологических испытаний.

Дисперсионный анализ показал наличие линейности и параллелизма ре зультатов измерения анализируемого вещества и положительного контрольно го образца (калибрователя) (табл. 5, рис. 3).

Таблица Результаты сравнения положительного и исследуемого образцов, содержащих анти-HBs, с ОСО 42-28-320- Д И С П Е Р С И О Н Н ЫЙ А Н А Л И З Источник вариации Степень Сумма Средний F-теор. F- Вывод свободы квадра- квадрат экспер.

тов Измерения (дозы) 24 7,3102 0,3046 2,0825 297,7154 Значимо Препараты 4 0,0985 0,0246 2,8661 24,0637 Значимо Линейная регрессия 1 7,1770 7,1770 4,3513 7014,997 Значимо ПАРАЛЛЕЛИЗМ 4 0,0065 0,0016 2,8661 1,5874 ДА ЛИНЕЙНОСТЬ 15 0,0282 0,0019 2,2033 1,8379 ДА Остаточная ошибка 20 0,0205 0, Total 44 7, 0 0,5 1 1,5 2 2, Логарифм оптической плотности -0, -0, -0, -0, - -1, -1, О С О 42-28-320-00д о зы Л о гар и ф м К о н тр о л ь н ы й п о л о ж и тел ь н ы й о б р азец И ссл ед уем ы й о б р азец Рис. 3. Сравнение контрольного положительного и исследуемого образцов с ОСО 42-28-320- Полученные нами данные указывают, что все исследованные образцы обладают общепринятыми критериями стандартов антител – линейным участ ком кривой «доза-ответ» (прямая линия) в пяти точках и параллелизмом кри вых при смещении разведения при тестировании в ИФА. Аналогичные ре зультаты были получены для всех разработанных ИФТС.

Специфичность разработанных тест-систем была подтверждена в тесте блокирования. Предварительная инкубация положительных контрольных об разцов с различными антигенами приводила к существенному блокированию их активности в ИФА только при использовании антигена, специфичного для тестируемых антител (табл. 6).

Таблица Оценка специфичности тест-систем в тесте блокирования Блокатор Определяемые антитела реакции Дифтерийные Столбнячные Коклюшные анти-HBs ОПК ОПК ОПК ОПК ОПК ОПК ОПК+ ОПК+ + + + + + + опыт кон- опыт кон- опыт кон- опыт кон троль троль троль троль Дифтерий- 0,062 0,954 0,975 0,931 0,870 0,905 1,009 1, ный анаток син Столбняч- 0,921 0,943 0,072 0,986 0,904 0,947 0,963 0, ный анаток син Коклюш- 0,941 0,912 0,904 0,914 0,087 0,923 1,079 1, ная суспен зия HBsAg 0,944 0,932 0,992 0,934 0,951 0,969 0,086 1, Точность результатов измерений в пределах одной серии испытаний (внутрипостановочный коэффициент вариации - ВКВ) и разных серий испы таний (межпостановочный коэффициент вариации - МКВ) для разработанных тест-систем была весьма высокой – коэффициенты вариации не превышали 10 %. Была установлена также высокая степень корреляции результатов парал лельного исследования сывороток с помощью разработанных ИФТС и регла ментированных методов (реакцией нейтрализации при определении дифте рийных и столбнячных антител, реакции агглютинации при определении кок люшных антител, а также с импортными тест-системами при определении анти-HBs) (табл. 7).

Таблица Характеристика разработанных тест-систем ИФТС Точность (коэффициент вариации), % Коэф фициент Образец 1 Образец 2 Образец корре ВКВ МКВ ВКВ МКВ ВКВ МКВ ляции ИФА анти-В 3,3 4,3 5,0 7,6 5,7 9,5 0, ИФА анти-Д 7,0 7,5 5,5 7,8 3,8 5,9 0, ИФА анти-С 6,2 6,7 6,1 5,4 8,7 8,2 0, ИФА анти-К 9,3 9,5 7,5 8,1 7,1 8,7 0, Таким образом, проведенные исследования показали, что разработан ные ИФТС для выявления дифтерийных, столбнячных, коклюшных антител и анти-HBs обеспечивают достаточно высокую степень достоверности резуль татов иммуноферментного анализа.

Экспериментальные разработки позволили провести исследования в на правлении решения ряда практических задач использования предлагаемых ИФТС.

В частности, была проведена оценка возможности использования разра ботанных тест-систем для контроля иммуногенности комбинированных вак цин по содержанию соответствующих антител в сыворотках крови иммунизи рованных морских свинок (табл. 8).

Таблица Сравнительная оценка эффективности вакцин в опытах на морских свинках Вакцина* Определяемые антитела (средняя геометрическая титра) столбнячные, дифтерийные, анти-HBs, коклюшные, МЕ/мл МЕ/мл мМЕ/мл ИЕ/мл Бубо-М 7,1 7,3 5769,1 отр.

[5,1-9,9] [5,7-9,2] [1801,1-18479,4] АДС-М 3,5 4,8 отр. отр.

[1,7-7,2] [3,0-7,6] АКДС 7,9 11,7 отр. 104, [5,3-11,6] [6,2-22,4] [73,2-148,9] Бубо-Кок 14,0 12,9 2661,5 73, [10,6-18,3] [6,4-25,7] [813,0-8712,3] [54,8-97,7] ВГВ отр. отр. 112,4 отр.

5 мкг [50,6-249,6] ВГВ отр. отр. 343,3 отр.

10 мкг [231,0-510,2] * Примечание: Бубо-М – вакцина для профилактики дифтерии, столбняка и гепатита В АДС-М – вакцина для профилактики дифтерии и столбняка АКДС – вакцина для профилактики коклюша, дифтерии и столбняка Бубо-Кок – вакцина для профилактики коклюша, дифтерии, столбняка и гепатита В ВГВ – вакцина гепатита В Как видно из представленных данных, в случае использования вакцин Бу бо-М и Бубо-Кок по сравнению с АДС-М и АКДС наблюдался более высокий уровень дифтерийных и столбнячных антител. При этом выявлен выраженный потенцирующий эффект как анатоксинов, так и коклюшного компонента на фор мирование иммунного ответа против HBsAg.

В наблюдениях на детях подтвердился потенцирующий эффект со вместного введения антигенов, обнаруженный ранее в опытах на живот ных (табл. 9).

Таблица Сравнительная оценка эффективности вакцин в наблюдениях на детях Вакцина* Определяемые антитела (средняя геометрическая титра) столбнячные, дифтерийные, анти-HBs, коклюшные, МЕ/мл МЕ/мл мМЕ/мл ИЕ/мл Бубо-М 39,1 19,6 12557 отр.

[31,5-48,4] [15,3-25,1] [6298-25035] АДС-М 14,3 13,5 отр. отр.

[11,3-18,0] [10,4-17,5] АКДС 3,4 1,8 отр. 66, [2,5-4,5] [1,3-2,4] [44,9-97,7] Бубо-Кок 3,7 2,5 453,7 64, [2,8-4,7] [1,8-3,4] [268,3-766,9] [31,5-133,6] * Примечание: вакцинами Бубо-М и АДС-М привиты дети 6 лет;

вакцинами АКДС и Бубо-Кок привиты дети первого года жизни Таким образом, в экспериментах на животных и наблюдениях на людях была обоснована возможность использования разработанных ИФТС для кон троля эффективности иммунизации, при этом тест-системы дают возможность выявлять уровень специфических антител на любой стадии цикла вакцинации, что может служить основанием для определения дальнейшей тактики имму низации.

Тест-система для определения анти-HBs была успешно применена для обоснования тактики экстренной специфической профилактики гепатита В в эксперименте и наблюдениях на людях (табл.10, 11). При этом было показано, что оптимальной схемой экстренной специфической профилактики является одномоментное введение препарата Антигеп (иммуноглобулин человека про тив гепатита В) и вакцины гепатита В, обеспечивающее быстрое появление антител в концентрации, значительно превышающей протективную с после дующим развитием иммунного ответа на HBsAg.

Таблица Определение концентрации анти-HBs в сыворотках крови иммунизированных кроликов Груп- Средняя геометрическая титра анти-HBs, мМЕ/мл пы * 1-3ч 24 ч 72 ч 7 сут 14 сут 21 сут 4 6 нед 8 нед 10 нед нед I гр. 40,0 340,0 450,0 160,0 30,0 8,5 0 0 0 [20,0- [230,0- [350,0- [100,0- [10,0- [2,0 80,0] 510,0] 570,0] 250,0] 80,0] 33,0] II гр. 0 0 5,7 220,0 780,0 180,0 190,0 9750,0 5490,0 120620, [20,0- [80,0- [3130,0- [3210,0- [51870,0 [3,0- [10,0- [160,0 370,0] 3830,0] 1430,0] 420,0] 30300,0] 9380,0] 280490,0] 10,0] III гр. 25,0 240,0 240,0 650,0 1120,0 470,0 330,0 12010,0 5060,0 75800, [16,0- [180,0- [190,0- [130,0- [450,0- [180,0- [50,0- [6490,0- [3100,0- [33300,0 37,0] 320,0] 310,0] 3320,0] 2780,0] 1220,0] 2030,0] 22230,0] 8200,0] 172500,0] IV гр. 20,0 330,0 300,0 70,0 13,0 5,6 0 490,0 330,0 4130, [11,0- [50,0- [290,0- [60,0- [0,5- [2,0- [240,0- [270,0- [2950,0 1010,0] 3990,0] 5770,0] 35,0] 990,0] 780,0] 80,0] 18,0] 7,0] * Примечание: схема иммунизации: I - Антигеп 100 МЕ, II - ВГВ по схеме 0-1-2, III - ВГВ (I доза) + Антигеп, IV - «Антигеп», через месяц ВГВ.

Таблица Иммунологическая эффективность разных схем иммунизации детей закрытых организованных коллективов Группы* Средняя геометрическая титра анти-HBs, мМЕ/мл Через 1 месяц Через 1 месяц Через 1 год после Через 1 месяц по после введения 1 после введения 3 введения 1 дозы сле введения 4 до дозы препаратов дозы вакцины препаратов зы вакцины I 14,3 422,7 421,6 5446, [11,7-17,6] [169,4-1054,5] [55,0-3230,9] [1086,3-27309,8] II 7,05 1063,4 584,2 5451, [2,2-22,6] [511,7-2209,9] [166,8-2045,4] [1451,2-20476,1] III 1,69 1586,5 280,7 Не вводилась [0,92-3,06] [871,8-2887,1] [145,8-540,5] * Примечание: схема иммунизации: I – 0 – Антигеп + ВГВ, 1-2-12 мес. – ВГВ;

II – 0- Антигеп, 1-2-3-12 мес. – ВГВ;

III – 0-1-6 мес. – ВГВ.

Далее была исследована возможность применения разработанных ИФТС для определения концентрации специфических антител в препаратах иммуноглобулинов (табл. 12) Таблица Определение концентрации специфических антител в препаратах иммуноглобулинов Иммуногло- Определяемые антитела (СГТ) булины столбнячные, дифтерий- коклюшные, анти-HBs, МЕ/мл ные, МЕ/мл ИЕ/мл МЕ/мл Противостафи- 13,6 7,3 405,0 1, лококковый [10,3-17,9] [4,9-11,0] [199,1-824,0] [1,3-1,8] Противоэнце- 10,8 6,2 335,1 1, фалитный [9,5-12,3] [4,9-7,9] [291,7-384,9] [1,4-2,0] Противо- 63,8 12,3 380,4 1, столбнячный [53,5-75,8] [11,5-13,1] [340,2-425,4] [1,1-2,0] Нормальный 12,0 7,0 350,1 1, [8,8-16,4] [4,8-10,2] [259,4-471,8] [1,4-2,0] Антигеп 12,2 6,7 354,1 72, [8,8-17,9] [6,1-7,2] [300,2-417,6] [65,2-89,4] Разработанные ИФТС били успешно использованы также для определе ния концентрации анти-HBs в сыворотках крови людей, больных гепатитом В при клинических испытаниях препарата Антигеп (ИФА анти-В);

диагностики коклюшной инфекции (ИФА анти-К);

оценки популяционного иммунитета.

При этом основными преимуществами разработанных ИФТС являются авто матизация анализа, стандартизация результатов, исключение субъективизма в интерпретации, и, самое главное, возможность количественной оценки.

В заключение следует отметить, что разработанные ИФТС открывают широкие возможности для проведения массовых эпидемиологических обсле дований с целью объективной оценки эффективности вакцинации и ревакци нации против дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В, характеристики иммунной структуры населения и групп повышенного риска, а также оценки качества иммунобиологических препаратов.

Выводы 1. Разработан эффективный и технологичный способ получения конъю гатов на основе белка А и HВsAg, меченных биотином.

2. Впервые с применением амплифицирующей системы авидин-биотин разработаны конструкции иммуноферментных тест-систем для определения специфических антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) в сыворотках крови, как людей, так и животных.

3. Качество разработанных тест-систем соответствует требованиям ВОЗ, предъявляемым к наборам для иммунологических испытаний, по следующим критериям: линейность и параллелизм, специфичность, чувствительность, точность, сравнение с референс-методами.

4. Научно обоснована возможность использования разработанных им муноферментных тест-систем в реальной практике для серологического мони торинга за инфекциями, управляемыми средствами иммунопрофилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В), а также для оценки качества про филактических препаратов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Казьянин А.В. Симультанная экстренная специфическая профилакти ка в очагах HBV-инфекции / А.В. Казьянин, С.В. Пленкина, Т.В. Вязникова, В.Н. Борисова, Н.С. Гурьянова // Материалы VIII Всероссийского съезда эпи демиологов, микробиологов и паразитологов. – М., 2002. - Т.2. - С. 180-181.

2. Исаева Н.В. Распространенность и эффективность специфической иммунопрофилактики гепатита В среди медицинских работников / Н.В. Исае ва, И.В. Фельдблюм, Т.В. Вязникова и др. // Актуальные вопросы вакцинно сывороточного дела в XXI веке: матер. Всерос. науч. конф. – Пермь, 2003. – С.

40-43.

3. Казьянин А.В. Изучение фармакодинамики анти-HBs при разных схемах введения препарата «Антигеп®» и вакцины против гепатита В в экспе рименте / А.В. Казьянин, Н.В. Ведерникова, Т.В. Вязникова, С.В. Пленкина // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в ХХ1 веке: матер. Все рос. науч. конф. - Пермь, 2003. - C. 86-89.

4. Николаева А.М. Сравнительная оценка отечественной ИФТС и зару бежных тест-систем для выявления антител к HBsAg / А.М. Николаева, В.Н.

Борисова, Т.В. Вязникова // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке: матер. Всерос. науч. конф. – Пермь, 2003. – С. 157-159.

5. Вязникова Т.В. Оценка валидности рабочих характеристик иммуно ферментной тест-системы для выявления анти-HBs / Т.В. Вязникова, А.М.

Николаева // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке:

матер. Всерос. науч. конф. – Пермь, 2003. – С. 159-161.

6. Казьянин А.В. Экстренная специфическая профилактика в очагах гепа тита В с использованием различных медицинских иммунобиологических препа ратов / А.В. Казьянин, С.В. Пленкина, Т.В. Вязникова // Человек и лекарство: сб.

тез. докл. XI Рос. национал. конгресса. – М., 2004. - С. 441.

7. Вязникова Т.В. Опыт использования иммуноферментного анализа для оценки противококлюшного иммунитета / Т.В. Вязникова, Е.В. Гореликова // Современная вакцинопрофилактика: проблемы и перспективы развития: ма тер. науч.-практ. конф. – Пермь, 2005. – С. 18-23.

8. Казьянин А.В. Результаты динамического наблюдения за состоянием поствакцинального иммунитета взрослых и детей, привитых вакциной «Бубо М» / А.В. Казьянин, А.М. Николаева, Т.В. Вязникова и др. // Современная вакцинопрофилактика: проблемы и перспективы развития: матер. науч.-практ.

конф. – Пермь, 2005. – С. 51-57.

9. Вязникова Т.В. Конструирование иммуноферментных тест-систем для определения дифтерийных, столбнячных, коклюшных и анти-HBs антител / Т.В. Вязникова, А.М. Николаева // Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфек ционных болезней: матер. Всерос. науч.- практ. конф. – М., 2006. - С.32.

10. Фельдблюм И.В. Оптимизация эпидемиологического надзора и кон троля за коклюшной инфекцией / И.В. Фельдблюм, А.М. Николаева, В.Н.

Сперанская, Т.В. Вязникова // Вакцинология 2006. Совершенствование имму нобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекцион ных болезней: матер. Всерос. науч.- практ. конф. – М., 2006. - С.97-98.

11. Николаева А.М. Использование тест-системы «ИФА анти-В» для определения антител к HBsAg / А.М. Николаева, Т.В. Вязникова, Н.Б. Казья нина // Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячеле тий: матер. междунар. науч. конф. – Томск, 2006. – Т.2. - С. 409-410.

12. Фельдблюм И.В. Эпидемиологический надзор и контроль за коклюш ной инфекцией / И.В. Фельдблюм, Е.В. Гореликова, Т.В. Вязникова и др. // Ме тодические рекомендации. – Пермь, 2006. – 28 с.

13. Вязникова Т.В. Изучение возможности использования иммунофер ментного анализа в системе эпиднадзора за инфекциями, управляемыми вак цинопрофилактикой // Пермский медицинский журнал. – 2006. – Т.23, № 5. – С. 78-81.

14. Николаева А.М. Тест-система для определения антител к HBs антигену и блокатор в тест-системе / А.М. Николаева, A.В. Казьянин, Т.В.

Вязникова, В.Н. Борисова, М.В. Буданов, И.А. Яковлева, В.А. Мельников // Патент на изобретение № 2206095 РФ от 10.06.2003 г.

15. Николаева А.М. Тест-система для определения противококлюшных антител в сыворотке крови человека и животных и универсальный конъюгат в тест-системе / А.М. Николаева, Т.В. Вязникова, А.В. Казьянин, В.Н. Сперан ская // Приоритетная справка № 2006127549 от 31.07.2006 г.

ВЯЗНИКОВА Татьяна Владимировна КОНСТРУИРОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ АВИДИН-БИОТИНОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ (ДИФТЕРИЙНЫХ, СТОЛБНЯЧНЫХ, КОКЛЮШНЫХ, АНТИ-HBS) 14.00.36 – аллергология и иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать _.04.2007 г. Формат 60 х 84 х Усл. печ. л. 1, Тираж 100 экз. Заказ № Отпечатана в типографии, г. Пермь, ул.

 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.