авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Астрологический Прогноз на год: карьера, финансы, личная жизнь


Pages:   || 2 |

Механизмы иммуномодулирующей активности хорионического гонадотропина

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ЗАМОРИНА Светлана Анатольевна МЕХАНИЗМЫ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология (биологические наук

и)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Челябинск - 2013 2

Работа выполнена в лаборатории иммунорегуляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, г. Пермь

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий Сергей Викторович лабораторией иммунорегуляции ФГБУН Института Ширшев экологии генетики и микроорганизмов УрО РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, ГБОУ Цейликман Вадим ВПО «Челябинской государственной медицинской Эдуардович академии», кафедра биологической химии, заведующий кафедрой доктор медицинских наук, доцент, заведующий Гусев Евгений лабораторией иммунологии воспаления ФГБУН Юрьевич Института иммунологии и физиологии УрО РАН доктор биологических наук, старший научный Кудряшова Анна сотрудник, ФГБУ «Ивановский научно- Владимировна исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова», лаборатория клинической иммунологии

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Минздрава России, г. Москва

Защита состоится «27» июня 2013 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул.

Воровского,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Автореферат разослан «10» апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, доцент Шишкова Ю.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Известно, что плацентарный гормон хорионический гонадотропин (ХГ) обладает выраженными иммуномодулирующими эффектами [Magnie M. et al., 1990;

Shufer A. et al., 1992;

Ширшев С.В., 1998;

Куклина Е.М., Ширшев С.В., 2003, 2005, 2006], однако механизмы его действия изучены недостаточно. В то же время, интерес к этому гормону возрастает в плане изучения его регуляторного и терапевтического потенциала [Сole L., 2010, 2012].

Наиболее древним в филогенетическом аспекте звеном иммунной системы является врожденный иммунитет, в реализации функций которого принимают участие клетки моноцитарно-макрофагального ряда. Иммуномодулирующие эффекты ХГ реализуются в присутствии моноцитов, а также потомков моноцитов - макрофагов и дендритных клеток. Эти клетки кумулируются в децидуальной оболочке благодаря стероидному фону [Hunt J.S., 1989], принимают участие в имплантации и плацентации, участвуют в ремоделировании тканей эндометрия [Nathan C.F., 1987], а в дальнейшем определяют вид иммунного реагирования, сдвигая ответ Т-лимфоцитов в сторону Th2. Кроме того, моноциты/макрофаги осуществляют клиренсную функцию, фагоцитируя патогены, клеточный детрит и апоптотические тельца, находясь под постоянным контролем ХГ. В то же время известно, что менструальный цикл формирует условия оптимальной фертилизации гамет, оплодотворения и успешной имплантации. Так, в различные фазы менструального цикла не только меняется локальное клеточное микроокружение подслизистого слоя урогенитального тракта, но и модулируются иммунные реакции на системном уровне [Кеворков Н.Н. с соавт., 1993]. Таким образом, можно предполагать различную степень выраженности и направленности модулирующих эффектов ХГ в гестационный период в целом.

Согласно концепции Acevedo H.F [2002], ХГ не имеет своего «истинного» рецептора, реализуя эффекты через гормональный ЛГ-рецептор за счет высокой степени гомологии с ЛГ (лютеинизирующий гормон). Вследствие этого возникло предположение о взаимодействии ХГ с клетками иммунной системы через «неклассические рецепторы» - в частности, Тoll-подобные протеины (TLR) [Ширшев С.В., 2002]. Одной из экспрессируемых изоформ TLR являются TLR4, широко представленные на моноцитах и участвующие в связывании липополисахаридов (ЛПС). Известно, что введение -субъединицы ХГ (или синтетических олигопептидов, родственных по структуре) в критических состояниях, индуцированных присутствием большого количества ЛПС, способно останавливать воспалительные реакции [van den Berg et al., 2009, 2011].

Вероятнее всего, это происходит в силу способности гормона выступать как конформационный антагонист ЛПС. Таким образом, расшифровка молекулярного механизма действия ХГ, связанного с паттерн-распознающими рецепторами на уровне клеток иммунной системы, является фундаментальной задачей, связанной с изучением филогенетически древнего механизма реализации гормон-модулирующей активности.

С позиции иммунологии репродукции, беременность представляет собой физиологически обусловленное состояние толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду. Одним из наиболее значимых механизмов формирования иммунологической толерантности является смещение акцента системных иммунных реакций в сторону гуморальных (феномен Th2 девиации) за счет преимущественной секреции противовоспалительных цитокинов [Wegmann T. et al., 1993]. Кроме того, огромное значение в этот период имеет поддержание баланса между Т-регуляторными лимфоцитами (Treg) и субпопуляциями ИЛ-17-продуцирующих лимфоцитов (Th17) [Wang W.J. et al., 2010]. Для объяснения механизмов, обеспечивающих нормальное развитие беременности, предложена концепция – «Th1/Th2/Th17/Treg» [Saito S. et al., 2010], суть которой заключается в том, что в период физиологически протекающей беременности в иммунной системе матери происходят изменения, сопровождающиеся доминированием Th2 и Treg над Th1- и Th17-лимфоцитами.



Изменение соотношения этих клеточных подтипов, как правило, приводит к преждевременным родам или спонтанному аборту [Saito S. et al., 2010]. Известно, что во время беременности важную роль играют натуральные киллеры (NK клетки) и Т-клетки с функциями натуральных киллеров (NKT-клетки), которые лизируют не только клетки-мишени, инфицированные внутриклеточными патогенами и неоплазмы, но также и клетки трофобласта [Baley J.E., Schacter B.Z., 1985;

Cooper M.A. et al., 2001]. Посредством апоптоза плацента удаляет потенциально опасные клетки иммунной системы и тем самым формирует толерантность к фетальному трансплантату [Kayisli U.A. et al., 2003]. Помимо этого, формирование периферической толерантности осуществляется благодаря экспрессии антигенпрезентирующими клетками фермента индоламин-2,3 диоксигеназы (IDO), что нарушает антифетальные клеточноопосредованные иммунные реакции матери [Mellor A.L., Munn D.H., 2001]. Изучение роли ХГ в процессах регуляции данного феномена является актуальным направлением репродуктивной иммунологии.

Известно, что одновременно с ХГ, трофобласт продуцирует целый спектр цитокинов, среди которых интерлейкин-2 (ИЛ-2) наиболее важен, поскольку необходим для формирования иммунного ответа. ИЛ-2 является основным аутокринным регулятором созревания Treg [Hoyer K.K. et al., 2008] и активатором NK-клеток [King A., Loke Y.W., 2006]. В то же время, спонтанные повторяющиеся аборты сопровождаются снижением уровня Treg [Saito S. et al., 2010], повышением концентрации ИЛ-2 и NK-клеток, но при этом показана сниженная ИЛ-2-индуцируемая экспрессия STAT5 (транскрипционный фактор) в Тreg [Fainboim L., Arruvito L., 2011]. В широком смысле, взаимоотношения ИЛ- и CD25/STAT5 внутри системы определяют функциональность Treg и NK-клеток, поэтому представлялось важным оценить эффекты ХГ на фоне ИЛ-2-активации клеток.

Целью работы являлось исследование молекулярных и клеточных механизмов иммуномодулирующей активности ХГ на уровне эффекторных и регуляторных клеток врожденного и адаптивного иммунитета.

Задачи:

1. Изучение влияния ХГ на фагоцитарную, окислительную и секреторную активность моноцитов женщин в зависимости от фаз менструального цикла;

2. Исследование молекулярных механизмов, связанных с вовлечением молекул TLR4 в реализацию эффектов ХГ в отношении функциональной активности моноцитов периферической крови женщин;

3. Анализ модулирующих эффектов ХГ на фоне активации моноцитов периферической крови женщин ИЛ-2;

4. Изучение модулирующего действия ХГ на уровне NK- и NKT-клеток периферической крови женщин;

5. Комплексная оценка роли ХГ в формировании иммунологической толерантности на уровне эффекторов периферической крови женщин (соотношение Th1/Th2 и Treg/Th17, активность IDO);

6. Исследование модулирующих эффектов ХГ в отношении ключевых факторов иммунологической толерантности на фоне активации клеток периферической крови ИЛ-2.

Научная новизна работы. Новыми являются данные о регуляции ХГ широкого спектра показателей функциональной и секреторной активности моноцитов периферической крови женщин. Разносторонне изучены эффекты гормона в отношении регуляции процессов фагоцитоза разных корпускулярных объектов. Выявлена зависимость моноцит-модулирующего действия ХГ от фаз менструального цикла и степени активации клеток. Впервые показано, что ХГ участвует в регуляции синтеза моноцитами белкового компонента липопротеидов АПО-А1, ИФН- и эластазы, повышая их продукцию. Впервые исследована роль «медленных» Са2+-каналов L-типа в реализации эффектов ХГ на функциональную активность моноцитов. Установлено, что ХГ способствует фенотипическому созреванию NK- и NKT-клеток, ассоциированному с усилением их цитотоксической и цитокин-продуцирующей активности.

Используемые экспериментальные подходы позволили продемонстрировать новый механизм действия ХГ на уровне моноцитов, связанный с вовлечением молекул TLR4, принадлежащих к паттерн-распознающим рецепторам.

Существование «альтернативной» рецепции для ХГ существенно расширяет представления о фундаментальных основах взаимодействия гормон-рецептор.

Экспериментально показано, что ХГ формирует толерогенные свойства мононуклеаров человека, регулируя баланс Treg/Th17 в сторону Treg, непосредственно увеличивая количество CD4+Foxp3+ и CD4+Foxp3+CTLA-4+ клеток и снижая количество CD4+ROR-t+-, CD4+ROR-t+IL-17А+- и CD4+IL 17А+CCR6+-лимфоцитов. Помимо этого, ХГ смещает баланс ИЛ-4/ИФН-, способствуя переключению иммунного ответа по Th2-типу. Впервые исследована ХГ-зависимая экспрессия IDO в моноцитах периферической крови женщин.

Показана роль активации клеток ИЛ-2 в реализации эффектов ХГ на уровне моноцитов и лимфоцитов.

Предложен и запатентован новый метод оценки фагоцитарной активности клеток по поглощению бактерий генно-инженерного штамма E.coli lux+.

Теоретическая и практическая значимость. В теоретическом аспекте работа вносит вклад в расширение представления о взаимодействии иммунной и эндокринной систем, раскрывая новые аспекты механизмов иммуномодулирующей активности ХГ. Предложена гипотетическая схема действия гормона на моноциты человека с вовлечением «альтернативного» пути, связанного с TLR4. Управляемая модуляция TLR4-зависимого пути, в том числе при помощи ХГ и родственных гонадотропину олигопептидов имеет терапевтический потенциал. Установлена ключевая роль ХГ в формировании иммунологической толерантности в период беременности. Показаны иммуномодулирующие эффекты ХГ на фоне ИЛ-2-активации клеток. Эти данные открывают новые перспективы в исследовании нейроэндокринного контроля иммунной системы, а также послужат основой для последующих фундаментальных исследований. Результаты исследований необходимо учитывать при анализе патологических состояний, сопровождаемых эктопическим синтезом гормона при онкологических заболеваниях, а также в гормональной терапии, применяемой в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Положения, выносимые на защиту:

1. В разные фазы менструального цикла особенности рецепции гормона, связанные с уровнем половых стероидов, формируют различную чувствительность моноцитов к хорионическому гонадотропину и определяют направленность его действия. В фолликулярную фазу цикла гормон преимущественно угнетает фагоцитоз и продукцию активных форм кислорода, одновременно стимулируя секреторную активность клеток. В лютеиновую фазу цикла гормон стимулирует фагоцитоз, одновременно угнетая продукцию активных форм кислорода, практически не влияя на секреторную активность клеток.

2. На уровне моноцитов продемонстрирован новый молекулярный механизм реализации эффектов хорионического гонадотропина, вовлекающий Toll подобные рецепторы 4 типа. Показано, что гормональная регуляция фагоцитоза и продукция моноцитами интерферона- осуществляется через взаимодействие с Toll-подобными рецепторами 4 типа.

3. Хорионический гонадотропин способствует фенотипическому созреванию NK- и NKT-клеток, ассоциированному с усилением их цитотоксической и цитокинпродуцирующей активности, повышая экспрессию этими клетками CD16/CD56. Хорионический гонадотропин ослабляет интерлейкин-2 стимулирующие эффекты на уровне NK-клеток, снижая, таким образом, генерацию лимфокин-активированных клеток.

4. Хорионический гонадотропин является одним из факторов, способствующих поддержанию периферической иммунологической толерантности при беременности. Так, гормон регулирует баланс Th1/Th2 и Th17/Treg в сторону увеличения количества Treg и Th2, параллельно угнетая Th17. Одновременно хорионический гонадотропин ко-стимулирует индуцированную активность индолеамин-2,3-диоксигеназы моноцитов.

5. Активация клеток интерлейкином-2 может как усиливать, так и отменять эффект хорионического гонадотропина. Так, количество Treg, NK- NKT-клеток и активность индолеамин-2,3-диоксигеназы моноцитов увеличивается при совместном действии гормона и цитокина. Эффекты хорионического гонадотропина в отношении баланса Th1/Th2 на фоне активации клеток интерлейкином-2 меняют свою направленность, а также частично отменяются депрессивные эффекты на показатели фагоцитоза и уровень миелопероксидазы.

Внедрение результатов. Полученные данные внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Пермского государственного национального исследовательского университета» в программе спецкурсов «Общая эндокринология» и «Иммунология репродукции».

Разработанный метод оценки фагоцитоза используется в работе Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН для научных исследований.

Апробация результатов исследований. Результаты представлены на V, VIII, XIII Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001, 2005, 2009 гг.»;

II, VIII, IX конференции иммунологов Урала, 2002 г. (Пермь), 2010 г. (Cыктывкар), 2011 г. (Челябинск);

7-ой и 12-ой Международной научной конференции молодых ученых «Биология – наука 21-го века», 2003 и 2008 гг.;

Объединенном иммунологического форуме, 2004 г.

(Екатеринбург) и 2008 г. (Санкт-Петербург);

Международной научно практической конференции «Иммунологические аспекты репродукции человека», 2008 г. Новосибирск;

VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды. Адаптация. Иммунитет», 2008 г., Пермь - Н. Новгород – Пермь;

2-м Европейском конгрессе по иммунологии, 2009 г., Берлин (Германия);

VI Mеждународной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», 2009 г., Москва, ММА им. Сеченова;

Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», 2011 г., Пущино;

I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», 2011 г., Пермь;

V Всероссийской конференции «Иммунология репродукции», 2012 г., Иваново;

XII Конгрессе РААКИ, 2013 г., Москва.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав экспериментальной части, заключения и выводов. Работа содержит 45 рисунков и 24 таблицы. Список литературы содержит источника, в том числе 72 отечественных, 281 зарубежных.

Публикации. Материалы диссертации обобщены в 56 печатных работах, из них: 34 публикации (включая 22 статьи) в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, 7 статей в сборниках, 1 патент РФ на изобретение.

Работа выполнена в рамках плана НИР «Механизмы гормональной регуляции иммунной системы» № Государственной регистрации – 0120.0 809371.

Работа поддержана грантом Фонда содействия отечественной науке «Выдающиеся ученые. Кандидаты и доктора наук» (2008-2009). Часть исследований выполнена в рамках программ президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», «Изучение молекулярных механизмов иммуномодулирующего действия гормонов репродукции» (2009-2011) и «Клеточные и молекулярные механизмы гормонального контроля функциональной активности иммунной системы в период гестации» (2012).

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории иммунорегуляции ФГБУН Института экологии генетики и микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук (зав. лаб. д.м.н., профессор Ширшев С.В.). Автор благодарит за помощь в проведении исследований к.б.н., с.н.с. Орлову Е.Г., к.б.н., н.с. Некрасову И.В., к.б.н., м.н.с. Тимганову В.П. и зав.

лабораторией экологической иммунологии, к.м.н., доцента Бахметьева Б.А.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Объекты исследования. В работе использовали фракционированные моноциты и лимфоциты практически здоровых доноров, которыми являлись небеременные женщины репродуктивного возраста. Исследования проводили согласно Хельсинской Декларации ВМА 2000 г. и протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. Критериями включения явились добровольное согласие на обследование и отсутствие приема гормональных препаратов. У женщин (n=155) для верификации фазы менструального цикла оценивался гормональный статус по уровню эстрадиола, прогестерона, ЛГ и ФСГ иммуноферментным методом при помощи наборов фирм «Biomar Diagnostic» (Германия) и «Хема» (Россия).

Моноциты выделяли из гепаринизированной периферической крови по методу, скомпилированному из стандартных методик выделения адгезивных клеток [Pertof H., 1980;

Эккерт Р., 1987] в нашей модификации. Мононуклеарные клетки центрифугировали в градиенте плотности фиколл-верографина (1, г/см3) («Sigma», США;

«Спофа», Чехия, соответственно). Для работы с лимфоцитами использовали суспензию мононуклеаров или фракцию CD4+ клеток. Для выделения моноцитов полученную суспензию после двойной отмывки помещали на чашки Петри с 5% эмбриональной телячьей сывороткой («Sigma», США), инкубировали 45 мин при 370С, затем адгезировавшие моноциты снимали механическим способом, дважды отмывали и повторно инкубировали 45 мин при 40С. Жизнеспособность, определяемая по включению эозина (0,01%), была в пределах 93-98%. Чистота выделения, оцениваемая иммунофлуоресцентным методом или на проточном цитофлуориметре, составила 78-85 %.

Биологически активные вещества. ХГ («Profasi», Италия) применяли в дозах 10 и 100 ME/мл, что соответствует его физиологическим концентрациям в разные сроки беременности [Wide L., 1962;

Димитров Д., 1979;

Cole L., 2012].

Рекомбинантный ИЛ-2 («Sigma», США) использовали в концентрации МЕ/мл, соответствующей его уровню при формировании иммунного ответа [Kurosaka K., 2002]. В ряде исследований применяли немеченые моноклональные антитела к TLR4 (abTLR4;





«eBioscience», Канада;

clone HTA125;

CD 286) в количестве 5 мкл на пробу, которые инкубировали с клетками перед внесением гормона. Для контроля самостоятельного эффекта антител применяли изотипический контроль («eBioscience», Канада;

Mouse IgG2a, k). Для блокады сигнала с TLR4 применяли ингибитор TRIF-комплекса (резвератрол, «Sigma», США, 50 мкмоль [Youn H.S. et al., 2005]), который вносили в культуру моноцитов за час до ХГ. Учитывая, что взаимодействие ХГ с ЛГ/ХГ-рецептором приводит к повышению внутриклеточного уровня цAMФ, активирующего протеинкиназу А (ПКА) [Rao Ch.V. et al., 2004], в исследовании применяли блокатор ПКА Н-89 («ICN Ph», США) в концентрации 10 мкМ/мл [Parvathenani L.K. et al., 1998]. Для исследования Са2+-зависимых механизмов реализации эффектов ХГ в ряд проб вносили блокатор медленных потенциалзависимых Са2+ каналов L-типа изоптин («Knoll», Германия) в дозе 0,025 мг/мл [Ширшев С.В., Кеворков Н.Н., 1993].

Оценку фагоцитарной активности моноцитов проводили методом, основанным на снижении свечения биолюминесценции E.coli lux+. Метод разработан и запатентован в Лаборатории иммунорегуляции [Ширшев С. В., Куклина Е. М., Заморина С. А. и соавт. // Патент РФ. № 2292553. 2007]. Готовую суспензию бактерий (180 мкл, 5х106 /мл) вносили в лунки 96-луночного планшета для люминоскана, инкубировали при 37°С в течение 3-5 мин и снимали фоновый уровень свечения бактерии, затем после внесения клеточной культуры (соотношение клетка/бактерия составило 1/10), измерялась степень гашения биолюминесценции в течение 30 мин, сопровождающая поглощение E.coli luх+ фагоцитирующими клетками (рис.1). Рассчитывали индекс фагоцитарной активности клеток (ИФА), отражающий процент гашения биолюминесценции по сравнению с исходным уровнем по формуле: ИФА=((X1-X2)/X1)*100, где Х1 – интенсивность биолюминесценции контрольной пробы, Х2 – интенсивность биолюминесценции опытной пробы. Измерение производилось в динамике процесса на люминоскане «Аccent» (Финляндия).

а) б) Индекс фаго ц и тар но й акти в но сти 0, И зм е не ни е и нт е нс и в но с ти б и о л ю м и не с ц е нц и и, о тн.

0, с в е то в ы е е д. (R L U ) 0, 0, (ИФ А), % 0, 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 мин 10 мин 20 мин 30 мин 0 мин 10 мин 20 мин 30 мин Инкубация моноцитов с E.coli lux Инкубация моноцитов с E. coli lux Рис.1. Изменение интенсивности биолюминесценции (а) и ИФА (б) в клеточной культуре моноцитов в результате поглощения E.coli lux+.

Оценка фагоцитарной активности моноцитов также производилась методом, основанным на поглощении корпускулярных объектов. Для дифференцировки сайтов связывания частиц, предназначенных для фагоцитоза, использовали следующие объекты: формалинизированные эритроциты барана (ФЭБ) [Каплин В.Н., 1996], ФЭБ с антигенной специфичностью к Yersinia enterocolitica (ФЭБИ) и частицы латекса (1.5 мкм, «ДиаМ», Россия).

Окислительную активность моноцитов оценивали по продукции активных форм кислорода (АФК) в реакции люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) [Dahigren C., Stendahl O., 1984]. Для этого в лунки 96-луночного плоскодонного планшета для люминоскана вносили 180 мкл раствора Хенкса без фенолового красного («Биолот», Россия), содержащего люминол (5х10-4М). После инкубации в течение 3-5 мин. при 37С и замера фонового свечения добавляли 20 мкл клеточной суспензии (5х106 кл/мл) и оценивали интенсивность спонтанной ЛЗХЛ, затем в кювету вносили 20 мкл суспензии штамма бактерии E. coli К12, и фиксировали интенсивность стимулированной ЛЗХЛ в динамике на люминоскане «Ассent» (Финляндия), результаты представлены в отн. ед. свечения (RLU).

Активность миелопероксидазы (МПО) в супернатантах культур (секреторная МПО) моноцитов определяли спектрофотометрическим методом в тесте с ортофенилендиамином [Бакуев М.М. с соавт., 1991]. Интенсивность оптической плотности фиксировалась в многоканальном спектрофотометре «Anthos HMTL III» (Австрия) при длине волны 492 нм.

Уровень эластазы и катепсина G в супернатантах кратковременных культур моноцитов определяли спектрофотометрическим методом, основанным на гидролитической активности этого фермента с использованием специфического субстрата BAEE («Sigma», США), растворенного в ацетонитриле и BТEE («Sigma», США), растворенного в метаноле, соответственно [O'Connor С.М., 1993;

Митенькина Е.В., 2004]. Оптическую плотность регистрировали при длине волны 340 нм («Anthos HMTL III», Австрия) в динамике. Уровень секреции АПО-А1 в клеточных супернатантах культур моноцитов определяли иммунотурбидиметрическим методом [Shchyogolev S.Y., 1999] при помощи коммерческих наборов «Spinreact» (Испания). Активность индоламин-2,3 диоксидазы (IDO) моноцитов определяли спектрофотометрически по изменению концентрации кинуренина, как в спонтанном, так и стимулированном ЛПС ( нг/мл)(«Sigma», США) варианте теста [Braun D., 2005].

Экспрессия CD11, CD14, CD25, TLR4 на моноцитах оценивалась при помощи моноклональных антител («eBioscience», Канада) на проточном цитофлуриметре «BD Calibur» (США) согласно методике производителя антител.

Уровень цитокинов (ФНО-, ИФН-, ИФН-, ИЛ-1, ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-17) в супернатантах культур фракционированных моноцитов, CD4+-лимфоцитов и мононуклеарных лейкоцитов оценивали иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов («Цитокин», «Протеиновый контур», «Вектор-Бест», Россия, «IBL», Германия, «eBioscience», США) согласно методике производителя. Контролем служили пробы, в которые вместо гормона вносили равное количество полной питательной среды (ППС). В ряде экспериментах на фракционированных моноцитах уровень цитокинов оценивался на пиках ЛПС-индуцированной (E.coli;

026:B6;

«Sigma», США, 100 нг/мл) секреции.

Оценка фенотипа лимфоцитов. После суточной инкубации с ХГ и/или ИЛ-2 определяли следующие субпопуляции Т-клеток: Th-лимфоциты CD3+CD4+ (CD3-FITC/CD4-PE), цитотоксические T-лимфоциты (ЦТЛ) CD3+CD8+ (CD3 FITC/CD8-PE). При изучении экспрессии CD25 на Тh-клетках оценивали CD3+CD4+CD25dim количество активированных Th-лимфоцитов (CD4 FITC/CD25-PE), и активированных цитотоксических Т-лимфоцитов + + + CD3 CD8 CD25 (CD8-FITC/CD25-PE). Экспрессию мембранного рецептора CD95 исследовали на Тh-клетках CD3+CD4+CD95+ (CD95-FITC/CD4-PE) и ЦТЛ:

CD3+CD8+CD95+ (CD95-FITC/CD8-PE). После суточной инкубации с ХГ и/или ИЛ-2 оценивали фенотип лимфоцитов, определяя содержание NK-клеток с фенотипом CD3-CD16+CD56+ и NKT-клеток с фенотипом CD3+CD16+CD56+ (CD3-FITC/CD16,56-PE), согласно методике производителя антител («Beckman Coulter», США).

Апоптоз лимфоцитов оценивали путем окрашивания аннексином-V (AnV FITC) и йодистым пропидием (PI). Данный метод позволяет идентифицировать клетки, находящиеся в ранней (AnV+/PI-) и поздней стадии (AnV+/PI+) апоптоза [Сибиряк С.В. с соавт. 2008]. Для индукции апоптоза использовали анти-CD моноклональные антитела (5 мкг/мл, «Медбиоспектр», Россия), которые вносили в культуры вместе с гормонами [Bijl M. et al., 2001]. Контролем служили пробы, в которые добавляли только индуктор апоптоза.

Для оценки уровня Treg МПК культивировали с ХГ (и/или блокатором ПКА H-89) в ППС в течение суток в условиях 5% СО2. Поскольку экспрессия транскрипционного фактора Foxp3 является основным маркером Treg, с помощью внутриклеточного окрашивания моноклональными антителами в гейте лимфоцитов определяли уровень CD4+Foxp3+ (Treg) (CD4-PE/Foxp3-FITC;

«Biolegend», США) клеток, оценивая не менее 30000 событий в пробе. Фиксацию и пермеабилизацию осуществляли при помощи буферов «Biolegend» (США) согласно методике. Количество Treg оценивали как процент CD4+CD25bright Foxp3+ клеток в гейте CD4+CD25bright лимфоцитов (CD4-P.Cy5/CD25-PE/Foxp3 Alexa Fluor®488;

«Biolegend», США). В ряде экспериментов формирование Treg оценивали в 3-х сут. культуре CD4+-позитивных лимфоцитов, выделенных на магнитных бусах («Invitrogen», США) методом негативной селекции. Для индукции формирования Тreg в культуры добавляли TGF- (5 нг/мл, «GIBCO», США), магнитные частицы с анти-CD3/CD28 моноклональными антителами ( «Invitrogen», США), и нейтрализующие анти-ИФН- и анти-ИЛ-4 антитела ( мкг/мл, «eBioscience», США). После 72 ч инкубации с гормоном удаляли магнитные частицы, и оценивали количество Treg как процент CD4+Foxp3+ клеток, параллельно исследуя экспрессию CD152 (CTLA-4) (CD4-FITC/Foxp3 P.Cy5/CD152-APC;

«eBioscience», США) и уровень ИЛ-10 в супернатантах культур («Вектор-Бест», Россия). Для индукции дифференцировки Th17 из CD4-позитивных Т-лимфоцитов в культуры вносили ИЛ-1 (10 нг/мл, «eBioscience», США) и ИЛ-6 (10 нг/мл, «eBioscience», США). Количество Th оценивали как процент CD4+-лимфоцитов, экспрессирующих ROR-t, ИЛ-17A и/или CCR6 (CD196) (CD4-FITC/ROR-t-PE/IL17A-P.Cy5;

CD196-PE;

все антитела «eBioscience», США). В супернатантах культур Th иммуноферментным методом оценивали уровень ИЛ-17A («eBioscience», США).

Для оценки внутриклеточного синтеза цитокинов в CD3+CD4+- и CD3+CD8+-лимфоцитах использовали PE-конъюгированные антитела к ИЛ-4 и ИФН- («Caltag», CША). В качестве активаторов для стимуляции внутриклеточного синтеза использовали форболмиристацетат (50 нг/мл, «Sigma», США) в комбинации с иономицином (50 мкг/мл, «Sigma», США), затем применяли брефелдин А (10 мкг/мл, «ICN Рh.», США). Фиксацию и пермеабилизацию осуществляли при помощи коммерческих буферов «Biolegend», США согласно методике. Результаты учитывались на проточном цитофлюориметре «BD facscalibur» (США).

Статистический анализ. Результаты представлены в виде средней М±m. О достоверности межгрупповых различий судили с помощью параметрического t критерия Стьюдента, или непараметрического u-критерия Манна-Уитни в зависимости от нормальности распределения данных. Проверка статистических гипотез осуществлялась при критическом уровне значимости Р0,05. В ряде случаев рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона (r).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ РОЛЬ ФАЗ МЕНСТРУАЛЬНОГО ЦИКЛА В РЕАЛИЗАЦИИ ЭФФЕКТОВ ХГ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЖЕНЩИН Влияние ХГ на фагоцитарную активность моноцитов. Установлено, что гормон угнетал фагоцитарную активность моноцитов женщин в фолликулярной фазы в отношении Е.coli lum+, причем депрессивный эффект ХГ в высокой концентрации был более выражен и затрагивал всю динамику процесса. В то же время, по отношению к моноцитам лютеиновой фазы, продемонстрирован стимулирующий эффект ХГ (100 МЕ/мл) на 15-30 минутах исследования (рис.1б). Возможно, стимуляция фагоцитарной активности моноцитов в лютеиновую (прогестерондоминантную) фазу цикла может служить необходимым фактором сохранения беременности, так как при помощи фагоцитоза утилизируются не только патогенные агенты и тканевой детрит, но и апоптотические клетки, избыточное накопление которых в фетоплацентарной зоне может иметь фатальные последствия для плода [Abrahams V.M. et al., 2004].

Показано, что внесение высокой концентрации ХГ (100 МЕ/мл) в культуры фракционированных моноцитов, полученных от женщин, находящихся в фолликулярной фазе менструального цикла, приводило к угнетению фагоцитарной активности, затрагивающей как количество фагоцитирующих клеток, так и их поглотительную способность (табл. 1). В то же время, при фагоцитозе ФЭБИ или латекса, депрессивный эффект гормона был менее выражен и затрагивал только процент фагоцитирующих клеток. В отношении моноцитов, полученных от женщин, находящихся в лютеиновой фазе цикла, эффекты гормона были противоположными. Так, ХГ в концентрации 100 МЕ/мл достоверно стимулировал фагоцитоз ФЭБ и не оказывал модулирующего эффекта на фагоцитоз латекса и ФЭБИ (табл.1). Известно, что поглощение латекса обусловлено гидрофобными взаимодействиями, фагоцитоз ФЭБ осуществляется преимущественно scavenger- и маннозными рецепторами, а взаимодействие с ФЭБИ происходит через 1-интегрины [Wiedemann A. et al., 2001]. По-видимому, в разные фазы менструального цикла специфическое соотношение половых стероидных гормонов формирует структурно функциональную основу, позволяющую ХГ в фолликулярную фазу угнетать, а в лютеиновую стимулировать силу активационных сигналов с маннозных- и scavenger- рецепторов. В то же время 1-интегриновые рецепторы и мембранные структуры, ответственные за гидрофобные взаимодействия, в меньшей степени модулируются стероидным фоном.

Влияние ХГ на фагоцитоз Е.coli lum+ моноцитами Рис. 1.

периферической крови женщин в зависимости от фазы менструального цикла (n=8).

Примечание: *, **, # - достоверные (p0,05) по t-критерию Стьюдента различия с контролем.

Ось x – время наблюдения, ось y – ИФА (индекс фагоцитарной активности), а – фолликулярная фаза, б) – лютеиновая фаза.

При оценке секреторной активности моноцитов установлено, что при внесении ХГ в ЛПС-стимулированные культуры моноцитов гормон статистически значимо повышает уровень ИЛ-6 и ИФН- только моноцитами женщин фолликулярной фазы (табл. 2). Эффекты ХГ на продукцию ИФН зависели не только от фазы менструального цикла, но и от концентрации гормона. Так, гормон (100 МЕ/мл) повышал уровень ИФН- в моноцитах фолликулярной фазы цикла, как в ранний пик секреции (1.5 ч), так и спустя сутки, когда происходит синтез de novo. В то же время, в низкой концентрации ХГ повышал уровень ИФН- (24.0 ч) в моноцитах лютеиновой фазы. Гормон не влиял на продукцию моноцитами Г-КСФ, ИЛ-1 и ФНО-, однако под влиянием низкой концентрации ХГ продукция Г-КСФ моноцитами лютеиновой фазы статистически значимо превышала таковую в фолликулярной фазе (табл. 2).

Таким образом, в фолликулярную фазу менструального цикла гонадотропин в концентрации, соответствующей его максимальному уровню в I триместре беременности (100 МЕ/мл) повышает синтез ИФН- и ИЛ-6, а в лютеиновую фазу повышает уровень только ИФН- в концентрации, экстраполированной с раннего гестационного срока и/или II – III триместров беременности (10 МЕ/мл). Продукция данных цитокинов крайне важна для благополучного развития беременности, поскольку ИЛ-6 является одним из индукторов эндокринной функции плаценты и поддерживает Th2-поляризацию иммунного ответа интраэпителиальных лейкоцитов децидуальной оболочки [Ширшев С.В., 2002]. ИФН-, в свою очередь, пролонгирует процессы имплантации и плацентации зиготы [Roberts R.M., 1989] и активирует ангиогенез и репарацию тканей матки при инвазивном росте плаценты [Strikantan L. et al., 1990].

фолл. фаза лют. фаза а) б) * 2, * * 2,5 1, мг/дл мг/дл 1, 0, 0, 0 Контроль ХГ10МЕ/мл ХГ100МЕ/мл Контроль ХГ10МЕ/мл ХГ100МЕ/мл Рис. 2. Влияние ХГ на уровень АПО-А1 в супернатантах фракционированных моноцитов в зависимости от фазы менструального цикла (n=6). Примечание: *- достоверные (p0,05) по t-критерию Стьюдента различия с контролем. Ось x – экспериментальное воздействие, ось y – концентрация АПО-А1, а) – спонтанный вариант, б) – стимулированный ЛПС вариант.

Учитывая, что продукция моноцитами структурного компонента липопротеинов высокой плотности - АПО-А1 ведет к аутокринной блокаде синтеза провоспалительных цитокинов, в частности ФНО- [Hyka N. et al., 2001], важно было оценить влияние ХГ на синтез этого фактора. Установлено, что вне зависимости от фаз цикла ХГ (100 МЕ/мл) стимулирует секрецию АПО А1 интактными моноцитами. Однако, в условиях суточной активации моноцитов ЛПС, ХГ оказывает стимулирующий эффект на секрецию АПО-А1 только моноцитами лютеиновой фазы цикла (рис. 2). Таким образом, ХГ обладает самостоятельным, не зависимым от фаз цикла АПО-А1-стимулирующим действием на уровне интактных моноцитов, а у ЛПС-активированных моноцитов его эффект протектируется прогестероном.

Известно, что уровень моноцитарного АПО-А1 прямо регулируется МПО, трансформирующей его в неактивный продукт [Zheng L. et. al., 2004], поэтому следующим этапом исследования явилось изучение влияния ХГ на уровень секреторной МПО моноцитов. Показано, что ХГ снижал уровень спонтанной МПО в культуре моноцитов фолликулярной фазы цикла, в то время как зимозан индуцированная МПО достоверно усиливалась высокой концентрацией ХГ (рис.3а). В моноцитах лютеиновой фазы ХГ, напротив, снижал уровень МПО в спонтанном варианте теста и не влиял на зимозан-индуцированную продукцию фермента (рис.3б). По-видимому, депрессивный эффект ХГ на уровень МПО в лютеиновую фазу цикла обусловлен действием прогестерона, который доминирует на протяжении всей беременности.

фолл. фаза лют. фаза a) б) 3, 0, * 0, * 2, ** * Е, опт. ед Е, опт.ед 0, 0, 1, 0, 0 0, Контроль ХГ10МЕ/мл ХГ100МЕ/мл Контроль ХГ10МЕ/мл ХГ100МЕ/мл Рис. 3. Влияние ХГ на уровень секреторной МПО в супернатантах фракционированных моноцитов в зависимости от фазы менструального цикла (n=6). Примечание: *- достоверные (p0,05) по t-критерию Стьюдента различия с контролем. Ось x – экспериментальное воздействие, ось y – уровень МПО, а) – спонтанный вариант, б) – стимулированный зимозаном вариант.

Установлено, что по отношению к моноцитам фолликулярной фазы, ХГ оказывал депрессивные эффекты на продукцию АФК, фиксируемую в спонтанном варианте ЛЗХЛ (100 МЕ/мл) (рис.4а). Интересно, что ХГ параллельно угнетал секрецию МПО, однако корреляционный анализ не выявил достоверных связей. В тоже время, в латекс-индуцированном варианте ЛЗХЛ гормон ( МЕ/мл) оказывал выраженное стимулирующее действие на окислительную активность моноцитов, которое сохранялось в динамике всего эксперимента (5- мин).

Эффекты, оказываемые ХГ на спонтанную окислительную активность моноцитов, полученных от женщин в лютеиновой фазе, были во многом аналогичны. Так, гормон (10 и 100 МЕ/мл) угнетал как ЛЗХЛ, так и активность МПО. Однако корреляционный анализ показал, что под действием гормона, в отличие от фолликулярной фазы, возникает достоверная обратная корреляционная зависимость между активностью МПО и спонтанной ЛЗХЛ: для ХГ (10 МЕ/мл) r=-0,7;

для ХГ (100 МЕ/мл) r=-0,8. По-видимому, это связано с реципрокными механизмами регулирования НАДФ-оксидазного комплекса и МПО в условиях ХГ-зависимой депрессии окислительного потенциала моноцитов лютеиновой фазы. В отношении индуцированного варианта ЛЗХЛ показано, что ХГ в высокой концентрации снижал окислительную активность латекс-стимулированных моноцитов только в ранний период инкубации (5 мин), в то время как в низкой - оказывал аналогичный эффект на протяжении всего периода наблюдения (рис.4б).

б) к ХГ10 ХГ а) 12 * * * * * имп/сек/кл * имп/сек/кл * * ** * * спонт 5 10 15 20 спонт 5 10 15 мин мин Рис. 4. Влияние ХГ на показатели ЛЗХЛ моноцитов женщин в зависимости от фазы менструального цикла (n=7). Примечание: *- достоверные (p0,05) по t критерию Стьюдента различия с контролем. Ось x – время наблюдения, ось y – уровень АФК, а) – фолликулярная фаза, б) – лютеиновая фаза.

Известно, что CD11 входит в состав рецептора для компонента комплемента 3 (CR3 (CD18/CD11)), и опосредует фагоцитоз частиц, опсонизированных iC3b, и является молекулой межклеточной адгезии. Показано, что ХГ снижает экспрессию CD11 на моноцитах женщин, находящихся в фолликулярной фазе цикла (данные не приводятся), и не влияет на этот показатель, если фаза была лютеиновой. Известно, что продуктами секреции моноцитов являются сериновые протеиназы эластаза и катепсин G [Nathan N., 1987], которые участвуют в ремоделировании тканей в период инвазивного роста плаценты, а также в процессах воспаления. Установлено, что ХГ достоверно повышал активность эластазы в супернатантах культур моноцитов женщин только фолликулярной фазы цикла (табл. 8, стр. 29). Помимо этого, эластаза, наряду с катепсинами, необходима для миграции клеток и преодоления преград в виде базальных мембран. Однако, уровень катепсина G – катионного белка, родственный эластазе, не изменялся под действием гормона (данные не приводятся).

В заключение можно сказать, что ХГ разнонаправлено модулирует функциональную активность моноцитов женщин в зависимости от того, в какую фазу цикла были получены клетки. В разные фазы менструального цикла соотношение половых стероидных гормонов и/или уровень гипофизарных гормонов (ЛГ, ФСГ, пролактин) формируют разную чувствительность моноцитов к ХГ и определяют направленность его действия. В лютеиновую фазу, когда доминирует прогестерон (8,03±2,86 мкг/л, n=51), ХГ стимулирует фагоцитарную активность моноцитов, угнетая базальную активность секреторной МПО и повышая продукцию АПО-А1 и ИФН- (рис. 5). В фолликулярную фазу, когда относительно высок уровень эстрадиола (70,54±15,98 пг/мл, n=68), ХГ угнетает фагоцитоз, секрецию спонтанной секреторной МПО, экспрессию CD11 и спонтанную продукцию АФК. Одновременно ХГ стимулирует индуцированную продукцию секреторной МПО, ИЛ-6, ИФН-, АФК и спонтанную продукцию АПО-А1 и эластазы (рис. 5). Очевидно, что в фолликулярную фазу моноциты более чувствительны к действию ХГ, поэтому в дальнейшей работе исследовали клетки, полученные в эту фазу.

Таким образом, выявленные нами механизмы моноцит-регулирующего действия ХГ ставят данный гормон не только в ряд чрезвычайно важных регуляторов эндокринного зеркала беременной женщины, но и особо выделяют его как эффективного иммунного фетопротектора.

Фагоцитоз Фагоцитоз Е.coli lux+ Е.coli lux+ ФЭБ ФЭБ ФЭБИ моноцит м моноцит АФК, МПО латекс ИЛ-6, ИФН-, АПО-А1, АПО-А АПО-А1 стим.

стим.

Эластаза, АФК стим., МПО стим.

Заморина С.А© Рис. 5. Роль фаз менструального цикла в реализации модулирующего эффекта ХГ на функции моноцитов Таблица Влияние ХГ на дифференцированную фагоцитарную активность фракционированных моноцитов периферической крови женщин в зависимости от фазы менструального цикла Экспериментальное n Процент ФЧ, ФИ, Процент ФЧ, ФИ, Процент ФЧ, ФИ, № воздействие фагоцитоза, ФЭБ ФЭБ фагоцитоза, ФЭБИ ФЭБИ фагоцитоза, латекс латекс ФЭБ ФЭБИ латекс Фолликулярная фаза 42.37±4.85 0.806±0.137 1.820±0.144 54.66±3.77 2.49±0.34 0.58±0.11 68.27±3.70 4.67±1.16 1.63±0. 1 Контроль 38.46±3.70 0.654±0.075 1.695±0.100 57.73±6.81 2.34±0.23 0.69±0.22 69.88±3.50 5.51±1.01 1.94±0. 2 ХГ (10 МЕ/мл) 29.96±2.4* 0.434±0.028 1.462±0.047 47.11±3.61* 7.35±1.03 0.46±0.09 49.89±6.77* 7.35±1.03 1.64±0. 3 ХГ (100 МЕ/мл) * * Лютеиновая фаза 33.33±2.22 0.636±0.018 1.935±0.084 49.54±5.62 2.79±0.21 0.61±0.11 69.36±3.53 5.94±1.18 1.97±0. 4 Контроль 33.20±4.17 0.629±0.092 1.907±0.178 52.86±5.76 2.48±0.17 0.60±0.10 55.57±6.33 7.19±0.91 1.94±0. 5 ХГ (10 МЕ/мл) 47.99±2.82* 0.867±0.067 1.813±0.106 52.56±6.64 2.63±0.20 0.65±0.15 49.05±9.25 5.56±1.27 1.39±0. 6 ХГ (100 МЕ/мл) * Примечание: здесь и далее * - достоверные (0,05) по t-критерию Стьюдента различия с контролем.

Таблица Влияние ХГ на продукцию цитокинов моноцитами периферической крови женщин в зависимости от фазы менструального цикла n № Экспериментальное ИЛ-6 Г-КСФ ИЛ-1 ИФН- ФНО- ИФН нг/мл мкг/мл пг/мл ед/мл пг/мл ед/мл Воздействие 1.5 ч 1.5 ч 6.0 ч 24.0 ч 24.0 ч 24.0 ч Фолликулярная фаза 18.13±2. Контроль 1 502.20±49.93 447.04±47.95 29.17±5.69 69.95±14.30 23.84±4. 19.30±4. Контроль гормона 693.10±85.43 1178.4±66.55 280.19±54.44 1256.3±127.4 69.98±22. # # # # # + ЛПС (100 нг/мл) 802.40±55.08 24.97±9.03 874.35±158.74 392.99±78.69* 1510.2±391.1 76.69±16. ХГ (10 МЕ/мл) + ЛПС (100 нг/мл) 685.60±73.51 81.36±3.97* 966.25±130.86 432.53±89.19* 1587.8±401.9 94.29±22. ХГ (100 МЕ/мл) 6 * + ЛПС (100 нг/мл) Лютеиновая фаза Контроль 5 446.60±53.75 13.63±0.39 598.93±47.23 29.61±6.99 138.86±16.04 37.68±9. Контроль гормона 630.10±86.03# 31.62±9.38 1258.2±160.18# 314.94±76.95# 1897.8±298.4 # 65.45±16.69# + ЛПС (100 нг/мл) ХГ (10 МЕ/мл) 720.80±51.16 38.52±12.95 1029.0±62.58 330.22±67.25 2558.9±173.4* 120.7±28.48* + ЛПС (100 нг/мл) ХГ (100 МЕ/мл) 535.60±68.12 67.22±12.21 1618.7±126.31 310.59±86.66 1283.0±163.2 58.68±13. + ЛПС (100 нг/мл) Примечание: здесь и далее * - достоверные (0,05) по t-критерию Стьюдента различия с контролем гормона;

# - с контролем ЛПС.

МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ МОНОЦИТ-МОДУЛИРУЮЩИХ ЭФФЕКТОВ ХГ 1. ХГ как эндогенный лиганд для TLR4 моноцитов.

Роль TRIF-комплекса и ПКА Согласно концепции Acevedo H.F. (2002), ХГ не имеет своего «истинного» рецептора, реализуя эффекты через гормональный ЛГ-рецептор за счет высокой степени гомологии с ЛГ. Поэтому возникло предположение о взаимодействии ХГ с клетками иммунной системы через мембранные молекулы, которые не являются его «классическими рецепторами» - в частности, с рецепторами TLR [Ширшев С.В., 2002]. Известно, что внеклеточные домены как TLR [Hashimoto C.

et al., 1988], так и ЛГ/ХГ-рецептора [Rosemblit N. et al.;

1988;

Bhowmick N. et al., 1996] содержат лейцин-богатые (leucin-rich) LRR-участки, что может служить структурной основой взаимодействия ХГ с TLR.

Одной из экспрессируемых изоформ TLR является TLR4, широко представленная на моноцитах и участвующая в связывании ЛПС. Помимо ЛПС, TLR могут распознавать ряд эндогенных продуктов, появление которых не связано с инфицированием (белки теплового шока, мочевая кислота, а также продукты некроза и апоптоза) [Tsan M.F. & Gao B., 2004]. Таким образом, ХГ может быть кандидатом на роль эндогенного лиганда для TLR.

Учитывая, что TLR4 рецептирует молекулы ЛПС в комплексе с CD14, ранее было исследовано влияние ХГ на детекцию этой молекулы. Часовая инкубация ХГ (10, 100 МЕ/мл) с фракционированными моноцитами практически вдвое снижает уровень детекции молекул CD14, что является доказательством лигирования CD14 гормоном беременности [Ширшев С.В., Заморина С.А., 2004].

Как видно из рис. 6а, в присутствии высокой дозы ХГ снижался и уровень CD14 TLR4+-позитивных клеток. Мы предполагаем, что в данном случае речь + идет не о регуляции экспрессии, а об детекции этих молекул, так как ХГ, взаимодействуя с молекулами TLR4, экранирует их от антител. Помимо этого, нашими исследованиями установлено, что наиболее активно ХГ (100, МЕ/мл) взаимодействует с молекулами TLR4 в ранние сроки инкубации (1, 5, мин;

370С) (рис. 6 б). Таким образом, ХГ связывается с поверхностью моноцитов, взаимодействуя с молекулами TLR4.

Для изучения роли молекул TLR4 в реализации модулирующей активности ХГ применяли ингибиторный анализ: 1) TLR4 блокировали моноклональными антителами;

2) TRIF-комплекс, участвующий в каскадной передаче сигнала с TLR по MyD88-независимому пути, блокировали препаратом резвератрол;

3) для «выключения» ЛГ/ХГ рецептора в исследовании применяли блокатор ПКА Н-89.

Так как нами установлено, что ХГ регулирует фагоцитоз, ЛЗХЛ, секрецию МПО, АПО-А1, ИЛ-6 и ИФН-, изучали роль молекул TLR4 в реализации эффектов ХГ именно на эти показатели. Полученные нами результаты разделились на три группы: так, эффекты ХГ на процессы фагоцитоза и секреции ИФН- зависели от блокады TLR4;

эффекты ХГ в отношении секреции АПО-А и МПО зависели от активности ПКА. В то же время, большая часть исследуемых показателей зависела и от TLR4, и от ПКА.

а) 38,3% 24,7% 19,4% TLR ХГ 1000 МЕ/мл Контроль ХГ1000 МЕ/мл 1 мин 5 мин CD б) CD14+TLR4+, % ** * * * * контроль 1 мин 5 мин 10 мин 15 мин ХГ 100 МЕ/мл ХГ1000 МЕ/мл Рис. 6. Влияние ХГ на детекцию CD14+TLR4+-клеток в системе in vitro.

а) Гистограммы, отражающие влияние ХГ на количество CD14+TLR4+-клеток в культуре на примере одного эксперимента. В правом верхнем квадранте указан процент дубльпозитивных клеток в гейте моноцитов (гейтировано по FSS/SS). По оси x - интенсивность флуоресценции по каналу FL1, FITC;

по оси y - по каналу FL2, PE;

.б) влияние ХГ на детекцию CD14+TLR4+-клеток в динамике (n=4);

* - достоверные (p0,05) по u-критерию Манна-Уитни различия с контролем.

TLR4-зависимые эффекты ХГ. Внесение гормона в культуры моноцитов приводило к угнетению их фагоцитарной активности в отношении E.coli lum+ (табл. 3). На фоне блокады TLR4 антителами эффекты высокой концентрации гормона не воспроизводились, что свидетельствует о вовлечении этих рецепторов в реализацию эффектов ХГ. Блокада TRIF-комплекса резвератролом отменяла гормональный эффект, а «выключение» ЛГ/ХГ-рецептора при помощи блокады ПКА не влияло на эффекты ХГ (табл. 3). Эти результаты воспроизводились также при оценке фагоцитоза методом, основанным на поглощении ФЭБ [Ширшев С.В., Заморина С.А., 2006]. Таким образом, филогенетически древняя функция, какой является фагоцитоз, регулируется гормоном с вовлечением Toll-подобных рецепторов через MyD88-независимый трансдукционный путь.

Показано, что ХГ в высокой концентрации (100 МЕ/мл) достоверно повышает продукцию моноцитами ИФН-, однако на фоне блокады TLR4 этот эффект полностью отменялся. На фоне «выключения» трансдукции с ЛГ/ХГ рецептора гормон оказывал стимулирующий эффект на синтез ИФН- (табл. 4).

По-видимому, ХГ связывается на поверхности моноцитов с молекулами TLR и активирует TRIF-зависимый путь запуска синтеза ИФН-.

ПКА-зависимые эффекты ХГ. Установлено, что ХГ угнетает уровень секреторной МПО. На фоне блокады TLR4 и/или TRIF-комплекса депрессивный эффект ХГ на продукцию секреторной МПО моноцитами полностью воспроизводился, что свидетельствует о вовлечении не связанных с TLR механизмов в реализацию гормонального эффекта. На фоне блокады ПКА депрессивный эффект гормона полностью отменялся (табл. 3), что подтверждает вовлечение ЛГ/ХГ-рецептора. Аналогичные результаты продемонстрированы в отношении секреции АПО-А1 моноцитами женщин. Применение антител к TLR не влияло на стимулирующий эффект гормона (100 МЕ/мл), однако на фоне «выключения» ЛГ/ХГ-рецептора этот эффект полностью отменялся.

Установлено, что ХГ угнетал продукцию АФК в спонтанном варианте ЛЗХЛ, этот эффект воспроизводился на фоне блокады TLR4 и TRIF-комплекса (табл. 3).

На фоне блокады ПКА гормон не влиял на продукцию АФК моноцитами.

TLR4 и ПКА-зависимые эффекты ХГ. В отношении регуляции окислительной активности в стимулированной ЛЗХЛ показано, что ХГ вовлекает в реализацию своих эффектов как MyD88-зависимый, так и цАМФ-зависимый путь трансдукции (табл.3). Таким образом, гормональная модуляция стимулированной ЛЗХЛ в большей степени связана с TLR4 и TRIF-комплексом.

Известно, что TLR4/CD14/MD2 после активации непосредственно взаимодействует с дрейфующей в липидном рафте НАДФ-оксидазой, участвующей в синтезе АФК [McGettrick A.F., 2010].

Как видно из табл. 3, ХГ повышал уровень эластазы в супернатантах кратковременных культур моноцитов. Однако, стимулирующий эффект ХГ ( МЕ/мл) на фоне блокады TLR4 был достоверно выше самостоятельных эффектов abTLR4 и ХГ 100 МЕ/мл. Таким образом, блокада TLR4 способствовала реализации стимулирующего эффекта ХГ на продукцию эластазы, что связано, вероятно, с суммированием эффектов на уровне трансдукции гормонального сигнала. Однако, в случае «выключения» трансдукции с ЛГ/ХГ-рецептора, депрессивный эффект гормона отменялся, что свидетельствует о частичном вовлечении этого рецептора в реализацию сигнала.

Установлено, что гормон стимулирует ЛПС-индуцированный синтез моноцитами женщин ИЛ-6. На фоне блокады TLR4 антителами, а также на фоне блокады ЛГ/ХГ-рецептора, стимулирующий эффект гормона (100 МЕ/мл) полностью воспроизводился. Более того, на фоне «двойной блокады», ХГ реализовывал стимулирующий эффект. Важно отметить, что в условиях «выключенного» ЛГ/ХГ-рецептора гормон стимулировал продукцию ИЛ-6, которая была достоверно выше таковой в случае блокады TLR4 (табл.4).

Вероятно, ХГ связывается и с ЛГ/ХГ-рецептором, и с TLR4, в зависимости от доступности рецепторов.

Таблица Влияние ХГ на функциональную активность моноцитов. Роль TLR4, TRIF-комплекса и ПКA (n=10) ХГ (100 МЕ/мл) ХГ (100 МЕ/мл) ХГ (100 ME/мл) ХГ (100 МЕ/мл) ХГ (100 МЕ/vk) +резвератрол +резвератрол Резвератрол (50 мкмоль) (50 мкмоль) Показатель +abiTLR контроль +abTLR abTLR +H- H- Фагоцитоз E.coli 70,99± 63,77± 81,90± 77,22± 76,99± 79,70± 76,81± 79,27± 61,44± lum+, ИФА, 2,29 2,44* 1,45* 0,86 1,47* 3,05 1,18 0,36 1,53* 20 мин.

0,072± 0,042± 0,063± 0,045± 0,066± 0,043± 0,050± 0,071± 0,072± Спонтанная 0,005 0,005* 0,004 0,003* 0,003 0,004* 0,008* 0,005 0, ЛЗХЛ (RLU) Стим.

0,442± 0,215± 0,380± 0,280± 0,412± 0,334± 0,360± 0,411± 0,253± ЛЗХЛ, E.coli K 0,038 0,040* 0,041 0,042* 0,132 0,071 0,076 0,042 0,023* (RLU), 20 мин МПО, 0,382± 0,316± 0,327± 0,306± 0,439± 0,311± 0,324± 0,410± 0,439± секреторная 0,016 0,025* 0,016* 0,006* 0,022* 0,015* 0,014* 0,017 0, (опт.ед) 1,148± 2,088± 1,151± 1,885± 1,145± 2,101± 1,975± 1,188± 1,144± АПО-А1, мг/дл 0,372 0,243* 0,251 0,267* 0,298 0,239* 0,284* 0,245 0, 0,490± 0,830± Н.д. Н.д. 0,799± 1,086± Н.д. 0,678± 0,944± Эластаза, 0,051 0,081* 0,067* 0,108* 0,065* 0,078* нМ/млн.кл/мин 63,33± 79,48± Н.д. Н.д. 65,70± 69,25± Н.д. 78,96± 81,15± ИФН-, ед/мл 4,39 5,01* 5,91 4,54 4,99* 5,08* 512,25 643,29 Н.д. Н.д. 610,56 748,86 Н.д. 549,23 1190, ИЛ-6, нг/мл ±52,52 ±20,84 ±17,16 ±29,69 ±28,09 9±137, 9* * * Примечание: * - достоверные (p0,05) различия с контролем по t-критерию Стьюдента.

* * * ИЛ пг/мл -8, 1 2 3 4 5 6 7 экспериментальное воздействие Рис. 7. Влияние ХГ на продукцию ИЛ-8 интактными моноцитами женщин.

Роль TLR4 и ПКA (n=12).

Примечание: 1 – контроль;

2 – ХГ 100 МЕ/мл;

3 – H-89;

4 – H-89+ХГ 100 МЕ/мл;

5 – контроль изотипа;

6 - аbTLR4;

7 – ХГ 100 МЕ/мл+abTLR4;

8- ХГ 100 МЕ/мл+abTLR4+Н-89;

* достоверные (p0,05) различия с контролем по t-критерию Стьюдента.

В 2002 г. Kosakа K. с коллегами показали, что ХГ усиливает продукцию ИЛ-8 моноцитами небеременных женщин, при этом авторы обнаружили лишь следовые количества ДНК ЛГ/ХГ-рецептора в этих клетках. Авторы предполагают, что ХГ на поверхности моноцитов связывается с маннозными рецепторами (C-lectin). Предварительный контакт моноцитов с D-маннозой ослаблял стимулирующий эффект ХГ в отношении синтеза ИЛ-8, однако блокада ПКА не влияла на реализацию гормонального эффекта.

Мы в аналогичных условиях подтвердили, что стимулирующий эффект ХГ на уровень ИЛ-8 (в интактных 2 сут. культурах) воспроизводился на фоне блокады ПКА. Однако, принципиально важным моментом является то, что ИЛ-8 cтимулирующий эффект ХГ воспроизводился и на фоне заблокированных антителами TLR4 (рис.7). В условиях двойной блокады, когда были «выключены» как ПКА, так и TLR4, стимулирующий эффект гормона полностью отменялся (рис.7). Таким образом, можно сделать вывод о том, что в зависимости от доступности рецепторов гормон может связываться и «работать» как через ЛГ/ХГ-рецептор, так и через молекулы TLR4, не исключая взаимодействия с маннозными рецепторами.

Известно, что процессы секреции и фагоцитоза тесно связаны с функционированием Са2+-каналов, преимущественно L-типа [Striessnig J. et al.

1998]. Показано, что депрессивные эффекты ХГ на фагоцитарную активность моноцитов отменялись в присутствии ингибитора Са2+-каналов L-типа, что вполне закономерно в силу зависимости процессов фагоцитоза от уровня Са2+.

Стимулирующие эффекты ХГ в отношении продукции ИФН-, АПО-А1 и эластазы, как и депрессивные эффекты в отношении секреторной МПО отменялись на фоне блокады Са2+-каналов (данные не приводятся). Вероятно, стимулирующие эффекты ХГ ассоциированы с увеличением концентрации кальция в клетке, посредством как высвобождения из эндоплазматического ретикулума, так и поступления через мембранные потенциалзависимые Са2+ каналов L-типа [Korbonits M. et al., 2004;

Anderson L. et al., 2005]. Блокада Са2+ каналов L-типа, таким образом, принимает участие в регулировании как TLR4-, так и ПКА-зависимых эффектов ХГ.

Анализируя результаты по ИФН- хочется отметить, что ХГ повышал продукцию этого цитокина, вовлекая TLR4, однако на фоне блокады Са2+-каналов изоптином этот эффект инвертировался, приобретая депрессивную направленность. В 2012 г. Сhiang c коллегами показал, что каскад PLC2–IP3– Ca2+ инфлюкс необходим для эндоцитоза TLR4 и активации IRF3. В контексте этих сведений объяснимо, почему блокада Са2+-каналов отменяет эффект ХГ.

Довольно интересен тот факт, что АПО-А1, продукция которого стимулируется гормоном, ослабляет пальмитат-опосредованную активацию TLR4 в эндотелиальных клетках, блокируя сигнал на уровне NF-kB, что предполагает дальнейшее его изучение в качестве противовоспалительного агента [Cheng A.W.

et al., 2012].

ХГ О Н2O2 HOCL ХГ АФК CD Антитела к ‘O2 Cl H* О2* TLR TLR ЛГ/ХГ-рецептор MD- НАДФ- IL-1R Gq/ оксидаза АЦ АТФ TIRAP TRAM [MПO]ex - MyD резве TRIF цАМФ ратрол - ПКА Н- ПКС MAPK NF-kB Полимеризация F-актина IRF Снижение фагоцитарной + активности AПO-A + ИФН Sp1 гены IFN I типа ИЛ- Заморина С.А© NF-IL Ядро ФНО-, ИЛ-1, Гены провоспалительных цитокинов ИЛ- Рис. 8. Гипотетический механизм действия высокой дозы ХГ (100 МЕ/мл) на моноциты, связанный с вовлечением молекул TLR4.

Примечание: Aц – аденилатциклаза;

АТФ– аденозинтрифосфат;

цАМФ – циклический аденозинмонофосфат;

ПKA – протеинкиназа А;

ПKC – протеинкиназа С;

IL-1R – рецептор для ИЛ-1, ассоциированный с TLR4 и CD14;

MAPK – митоген-активированные киназы;

NF-IL – ядерный фактор;

MyD88 – адаптерный белок, коактиватор сигнала с TLR;

NFkB – ядерный фактор kB ;

TRIF - адаптерный белок, участвующий в индукции IRF3;

IRF-3 – транскрипционный фактор;

TIRAP, TRAM, MD2 – белки, участвующие в трансдукции с TLR4, H-89 – ингибитор PKA;

Sp1 – ядерный фактор.

Таким образом, используемые экспериментальные подходы позволили установить, что на уровне моноцитов существует новый механизм действия ХГ, связанный с вовлечением молекул TLR4. Как видно из рисунка 8, гормон регулирует фагоцитарную активность моноцитов и секрецию ИФН-, вовлекая молекулы TLR4, реализуя MyD88-независимый трансдукционный путь.

Гормональная модуляция секреции МПО и АПО-А1 не связана с TLR4 и TRIF комплексом и реализуется через ПКА-зависимый путь (ЛГ/ХГ-рецептор). В отношении окислительной активности в стимулированной ЛЗХЛ, а также синтеза эластазы, ИЛ-6 и ИЛ-8 показано, что ХГ вовлекает в реализацию своих эффектов и TLR4-зависимый путь трансдукции и ЛГ/ХГ-рецептор. Ранее показано [Ширшев С.В. и соавт., 2000], что ХГ индуцирует повышение цАМФ в моноцитах небеременных женщин. Однако, повышение цАМФ может быть обусловлено также и сигналом с TLR4 [Song J. et al., 2007]. Для объяснения взаимодействия между Gs-рецептором и TLR4 предложена парадигма кооперации [Rallabhandi P. et al., 2008]. Так, показана конкурентная активация Gs- рецептора и TLR, приводящая в результате к повышению NF-kB опосредованной экспрессии генов, которую связывают с дрейфом TRIF комплекса и его связыванием с G-рецептором. [Nhu Q.M. et al., 2012]. В контексте наших исследований это может объяснять факт ПКА-зависимой секреции провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8.

Можно предположить, что связывание ХГ c TLR4 является одним из фетопротективных механизмов в период беременности, поскольку теоретически способно ограничивать ЛПС-индуцированные патологические реакции, приводящие к самопроизвольным абортам. В пользу этого предположения служит тот факт, что введение -субъединицы ХГ (или родственных олигопептидов) в критических состояниях, индуцированных присутствием большого количества ЛПС, способно останавливать воспалительные реакции [van den Berg J.W. et al., 2009, 2011]. Показано, что ХГ-зависимые олигопептиды имеют терапевтический потенциал для ослабления угрожающего жизни воспаления и повреждения органов, ассоциированного с травмой и геморрагическим шоком и in vivo на мышиной модели супрессирует TLR-4 опосредованное воспаление [van den Berg J.W., Dik W.A., 2011]. Вероятно, возможность подобного взаимодействия могла сложиться в процессе эволюции, так как ХГ и Toll-подобные белки являются филогенетически древними молекулами [Acevedo H., 2002].

Суммируя информацию по рецепции ХГ, хочется отметить, что для гормона существует 4 варианта взаимодействия с клеткой–мишенью: это классический гормональный ЛГ/ХГ-рецептор, молекулы TLR4, маннозные рецепторы и рецептор TGF- (рис. 9). Так, в 2009 г. показано, что на уровне децидуальных NK-клеток гормон регулирует их функции через маннозные рецепторы CD209 [Kane K. et al., 2009]. Аналогично, регуляция гормоном продукции ИЛ-8 моноцитами периферической крови, как уже было сказано выше, осуществляется с вовлечением маннозных рецепторов, относящимся к C лектинам [Kosaka K. et al., 2008]. Что касается рецептора TGF-, то некоторые варианты молекулы ХГ могут выступать антагонистами этого рецептора [Cole L., 2012]. В отношении взаимодействия цельной молекулы ХГ с TLR4 хотелось бы добавить, что активация этих рецепторов также ведет к повышению уровня цАМФ внутри клетки, что снимает существующие противоречия [Song J. et al., 2007]. Данные, полученные в 2012 г Feng C. c коллегами, показывают, что сиаловые остатки (а молекула ХГ является высокосиализированной) модулируют ЛПС-сигналинг через TLR4.

Таким образом, предложенная нами концепция «альтернативной» рецепции ХГ находит все больше экспериментальных подтверждений. Феноменология наличия множественной рецепции для ключевого гормона беременности значительно расширяет существующие представления о фундаментальных основах взаимодействия гормон-рецептор.

C-лектины ХГ ХГ ХГ TGFbR CD ЛГ/ХГ-рецептор Маннозный рецептор TLR4 (CD284) CD Gq/ мембрана MD- АЦ Syk АТФ TIRAP TRAM цАМФ Smad MyD CARD ПКА TRIF Smad Заморина С.А© Эффекты эффекты эффекты эффекты Schumacher A. et al., 2009 Kosaka K. et al., 2002 Shirshev S., Cole L., Kane K. et al., 2009 Zamorina S., Рис. 9. Возможные варианты взаимодействия ХГ с клетками иммунной системы.

Примечание: Aц – аденилатциклаза;

цАМФ – циклический аденозинмонофосфат;

ПKA – протеинкиназа А;

MyD88 – адаптерный белок, коактиватор сигнала с TLR;

TRIF адаптерный белок, участвующий в индукции IRF3;

TIRAP, TRAM, MD2 – белки, участвующие в трансдукции с TLR4, TGFbR – рецептор для TGFb;

smad3, smad2 – транскрипционные факторы;

Syk, CARD9- белки, участвующие в трансдукции с CD209.

2. Эффекты, оказываемые ХГ на функциональную активность моноцитов на фоне активации клеток ИЛ- Одновременно с ХГ, трофобласт начинает продуцировать целый спектр цитокинов, среди которых ИЛ-2 наиболее важен, поскольку необходим для формирования иммунного ответа. Известно, что присутствие ИЛ-2 определяет направленность эффекта ХГ на функциональную активность спленоцитов мыши в системе сингенного переноса [Ширшев С.В., 1994]. Таким образом, изучали эффекты ХГ на функциональную активность ИЛ-2-активированных моноцитов женщин.

Установлено, что гормон в исследуемых концентрациях угнетал фагоцитарную активность моноцитов в отношении Е.coli lum+ (рис. 10а). Важно отметить, что депрессивный эффект высокой концентрации ХГ (100 МЕ/мл) был более выражен и затрагивал всю динамику процесса, в то время как низкая концентрация гормона угнетала только ранние этапы фагоцитоза.

Самостоятельный эффект ИЛ-2 заключался в подавлении фагоцитарной активности моноцитов на раннем этапе фагоцитарного процесса (рис. 10б). При совместном внесении высокой концентрации гормона и ИЛ-2 угнетение фагоцитоза выявлено на ранних этапах – с 5-й по 15-ю мин. В то же время, низкая концентрация ХГ в присутствии ИЛ-2 оказывала угнетающее действие на поглотительную активность моноцитов лишь на 5 мин (рис. 10в). Таким образом, ХГ и ИЛ-2 оказывали однонаправленное действие на фагоцитарную активность моноцитов женщин. Однако, при совместном внесении ИЛ-2 и ХГ, по-видимому, запускают разные каскады внутриклеточных мессенджеров, что в итоге приводит к конкурентному нивелированию эффектов друг друга.

в б а контроль ИЛ-2 (100 МЕ/мл) контроль ХГ 10МЕ/мл +ИЛ- контроль ХГ10 МЕ/мл ХГ100 МЕ/мл ХГ 100МЕ/мл +ИЛ- 95 95 90 90 85 * 80 * И Ф А,% * * 70 65 * ** 65 * ** ** * ** 60 * # ** * ** 55 ** 50 # ** # 45 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 мин Рис. 10. Влияние ХГ на фагоцитарную активность моноцитов женщин. Роль ИЛ-2-активации клеток (n=8). Примечание: *, **, # - достоверные (p0,05) по t критерию Стьюдента различия с контролем.

Таблица Влияние ХГ на продукцию АФК, на уровень секреторной МПО, АПО-А1 и эластазы в супернатантах культур моноцитов. Роль ИЛ-2 (n=8) Экспери- Эластаза, МПО, ЛЗХЛ APO-A1, ментальное нМ/млн.кл/ секреторная Стим., мг/дл Спонт. (RLU) (опт.ед) воздействие мин 20 мин (RLU) Контроль 0,083±0,004 0,451±0,056 0,402±0,011 1,148±0,372 1,490±0, ХГ (10МЕ/мл) 0,083±0,009 0,418±0,056 0,354±0,014* 1,754±0,230 1,734±0,046* ХГ (100МЕ/мл) 0,057±0,007* 0,358±0,057* 0,336±0,021* 2,088±0,243* 1,992±0,030* ИЛ- 0,051±0,007* 0,230±0,034* 0,442±0,027 1,995±0,091* 1,935±0,028* (100 МЕ/мл) ХГ (10 МЕ/мл) 0,068±0,010 0,391±0,056 0,374±0,009 1,866±0,110* 1,791±0,019* +ИЛ- ХГ (100 МЕ/мл) 0,053±0,011* 0,290±0,029* 0,320±0,016* 2,009±0,095* 1,892±0,015* +ИЛ- Примечание: *- достоверные (p0,05) отличия по t-критерию Стьюдента с контролем В отношении спонтанной ЛЗХЛ моноцитов показано, что ХГ (100 МЕ/мл), угнетает продукцию АФК, в то время как ХГ в низкой концентрации не влияет на этот показатель (табл. 8). На фоне ИЛ-2-активации эффекты гормона полностью воспроизводились, что, вероятно, свидетельствует о доминирующем действии ХГ. В отношении стимулированного варианта ЛЗХЛ показано, что ХГ (100 МЕ/мл) угнетал продукцию АФК моноцитами, также как и совместно ХГ+ИЛ-2. Таким образом, ХГ оказывает депрессивное действие на окислительную активность как интактных, так и ИЛ-2-активированных моноцитов.

Учитывая, что секреция МПО, а также продукция АФК являются важнейшими факторами бактерицидности моноцитов, оценивали уровень секреторной МПО. Показано, что ХГ угнетал активность этого фермента, и статистически достоверной разницы в эффектах изучаемых доз гормона выявлено не было. В условиях активации клеток ИЛ-2 отменялся депрессивный эффект низкой концентрации ХГ (табл. 11).

Показано, что ХГ в высокой дозе (100 МЕ/мл) стимулирует секрецию АПО-А1, на фоне активации клеток ИЛ-2 стимулирующий эффект оказывает как низкая, так и высокая доза ХГ (табл. 12). В отношении продукции эластазы установлено, что активация клеток ИЛ-2 не влияет на реализацию стимулирующих эффектов ХГ (табл.12).

Резюмируя данные, можно сделать вывод, что на фоне активации клеток ИЛ-2 модулировался TLR4-зависимый эффект ХГ (фагоцитоз), в то время как ПКА-зависимые эффекты ХГ практически не зависели от цитокина (АПО-А1, МПО). Таким образом, активация клеток ИЛ-2 служит важным фактором, модулирующим эффекты ХГ в отношении функциональной активности моноцитов.

ВЛИЯНИЕ ХГ НА ЭКСПРЕССИЮ CD16/СD NK- И NKT-КЛЕТКАМИ Для подтверждения роли TRIF-комплекса в реализации гормонального сигнала ХГ в клетках иммунной системы, нами дополнительно были исследованы NK-клетки, которые не экспрессируют ЛГ/ХГ-Р. В этих клетках TLR-сигналинг, включающий TRIF-комплекс, приводит к экспрессии молекул CD16 [Pisegna S. et al., 2004]. Установлено, что в концентрациях, характерных для беременности, ХГ достоверно увеличивает количество NK-клеток, экспрессирующих молекулу CD16 (табл. 9). Таким образом, гормон, по видимому, активирует TRIF-комплекс в NK-клетках, что подтверждает существование альтернативной гормональной активации клеток иммунной системы через паттерн-распознающие рецепторные молекулы (рис. 11).

Одним из необходимых факторов активации NK-клеток является ИЛ-2, который усиливает их цитотоксический потенциал, трансформируя NK-клетки в лимфокинактивированные киллеры (LАК-клетки), способные лизировать трофобласты [King A., Loke Y.W., 2006]. Показано, что на уровне NK-клеток ХГ, сохраняя свое собственное стимулирующее действие на процессы экспрессии молекулы CD16, ослабляет ИЛ-2-стимулирующие эффекты (табл. 9). Данный механизм действия гормона является чрезвычайно важным, поскольку выявляет протективное действие ХГ в отношении трофобласта, снижая генерацию LAK клеток, которые наиболее опасны для реализации цитолиза нативного трофобласта.

CD16 CD ХГ CD ХГ TLR ИЛ-2 TLR Trif Trif NK Trif NK Рис. 11. Влияние ХГ на экспрессию CD16 NK-клетками. Роль активации клеток ИЛ- Показано наличие тесной корреляционной связи (r=0,76;

p0,05) между самостоятельным эффектом ХГ(100 МЕ/мл) и совместным действием ХГ ( МЕ/мл) и ИЛ-2, а также обратной корреляции между эффектами ИЛ-2 и совместным действием ХГ (100 МЕ/мл) и ИЛ-2 (r=-0,84;

p0,05) подтверждает вывод, что нивелирующий эффект реализуется за счет гормона. Известно, что NK-клетки с фенотипом CD16+ являются наиболее зрелыми и обладают высокой цитолитической активностью [Mittag A. et al., 2007;

Keskin D.B., 2007]. Таким образом, ХГ усиливает фенотипическое созревание NK-клеток, отменяя, по видимому, ЛАК-трансформирующее действие ИЛ-2, что является возможным механизмом гормонального контроля, протектирующего плод от иммунной атаки матери. В 2009 г. Kane с коллегами показали, что взаимодействие ХГ с uNK клетками осуществляется через маннозный рецептор CD206, более того, на этих клетках почти не экспрессируется ЛГ/ХГ-рецептор. Однако, ХГ модулирует активность этих клеток, что подтверждает существование альтернативной гормональной активации клеток иммунной системы через паттерн-распознающие рецепторные молекулы.

Таблица Влияние ХГ уровень NK- и NKT-клеток (n=7) Исследуемый NK-клетки NKТ-клетки CD3-CD16+CD56+ CD3+CD16+CD56+ показатель 7,63±1,10 1,44±0, Контроль 14,01±1,33* 3,29±0,84* ХГ (10 МЕ/мл) 13,84±1,15* 4,23±0,69* ХГ (100 МЕ/мл) 17,22±2,78* 1,69±0, ИЛ-2 (100 МЕ/мл) 15,96±1,82* 5,61±0,56*^# ХГ (10 МЕ/мл) +ИЛ- 12,12±1,73*^ 5,75±1,46*^ ХГ (100 МЕ/мл) +ИЛ- Примечание: *- достоверные (p0,05) различия по t-критерию Стьюдента с контролем;

^ - в сравнение с ИЛ-2;

# - в сравнении с ХГ.

Во время беременности важную роль играют также NKT-клетки. Они являются активными продуцентами цитокинов, индуцирующих иммунный ответ 2-го типа [Boyson J.E., 2002;

Collucci F., 2003]. Одним из необходимых факторов активации NKT-клеток является ИЛ-2, который усиливает их цитотоксический потенциал. Показано, что ХГ независимо от концентрации увеличивает процент CD16+CD56+NKT-клеток, в то время как ИЛ-2 не оказывает самостоятельного эффекта в отношении этих клеток. При совместном действии цитокина и ХГ, последний сохраняет свое стимулирующее действие (табл. 9). Важно отметить, что в случае совместного стимулирующего эффекта низкой концентрации ХГ ( МЕ/мл) и ИЛ-2, цитокин выступает как костимулятор гормона, так как стимулирующий эффект гормона в этой концентрации достоверно выше, чем эффект самого ХГ (10 МЕ/мл). Таким образом, присутствие ИЛ-2 не изменяет направленность стимулирующего эффекта ХГ, а в случае низкой концентрации ХГ усиливает его NKT-потенцирующее действие.

В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что ХГ способствует фенотипическому созреванию NK- и NKT-клеток, ассоциированному с усилением их цитотоксической и цитокинпродуцирующей активности. На уровне NK-клеток ХГ является антагонистом ИЛ-2, отменяя LАК-активирующее действие цитокина. В то же время, на уровне NKT-клеток ХГ и ИЛ-2 являются костимулирующими факторами фенотипического созревания этих клеток.

РОЛЬ ХГ В ФОРМИРОВАНИИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ Влияние ХГ на уровень ИФН- и ИЛ-4. Учитывая, что баланс ИФН- и ИЛ-4, продуцируемых Т-лимфоцитами имеет большое значение для сохранения беременности, изучали влияние ХГ на их уровень. Установлено, что ХГ достоверно повышал уровень ИЛ-4 в условиях стимуляции клеток ЛПС, причем присутствие ИЛ-2 отменяло этот эффект. Кроме того, не выявлено эффектов гормона на продукцию ИЛ-4 в спонтанном варианте эксперимента. В отношении ИФН- показано, что ХГ не влиял на продукцию данного цитокина как в спонтанном, так и стимулированном варианте, однако в присутствии ИЛ- гормон оказывал стимулирующий эффект на продукцию интерферона.

Таким образом, ХГ повышает продукцию ИЛ-4 лимфоцитами, способствуя, таким образом, переключению иммунного ответа по Th2-типу. В то же время, совместно с ИЛ-2, гормон оказывал противоположные эффекты – отменял повышение продукцию ИЛ-4 и стимулировал продукцию ИФН-.

Таблица Влияние ХГ на уровень ИЛ-4 и ИФН- в супернатантах суточных культур лимфоцитов женщин in vitro, роль ИЛ-2 (n=10) Экспериментальное ИЛ-4, пг/мл ИФН-, пг/мл воздействие спонт стим спонт стим 56,76±11,34 305,25±10,94 15,42±1,46 23,31±2, Контроль 65,33±9,13 395,66±52,66 14,79±1,51 29,66±1,02* ХГ (10 МЕ/мл) 77,05±7,08 457,81±168,78 17,52±1,66 41,15±5,41* ХГ (100 МЕ/мл) 142,83±19,46* 374,45±17,69* 17,09±1,50 21,15±2, ИЛ-2 (100 МЕ/мл) 208,99±20,26*^ 549,92±69,62* 19,29±1,58 25,54±2, ХГ (10 МЕ/мл)+ИЛ- 238,23±26,32*^ 621,84±28,09* 18,10±1,95 24,89±2, ХГ (100 МЕ/мл)+ИЛ- Примечание: здесь и далее в таблицах * -достоверные по t-критерию Стьюдента различия по отношению к контролю;

^ - по отношению к пробе с ИЛ-2.

Далее изучали способность CD3+CD4+ и CD3+CD8+ Т-лимфоцитов продуцировать данные цитокины под влиянием ХГ на уровне внутриклеточного синтеза. Как видно из рис. 12, суточная инкубация ХГ (100 МЕ/мл) с МПК приводила к повышению процента ИЛ-4–позитивных CD3+CD4+T-клеток. В то же время, гормон не оказывал влияния на внутриклеточную продукцию ИФН- и ИЛ-4 в субпопуляции CD3+CD8+Т-лимфоцитов, равно как и на продукцию ИФН CD3+CD4+T-клетками. Таким образом, в концентрации, характерной для I триместра беременности ХГ является одним из факторов, способствующим формированию иммунного ответа по Тh2-типу.

% * CD4+ ИФН-g+ CD4+ИЛ-4+ CD8+ ИФН-g+ CD8+ИЛ-4+ контроль ХГ 10 МЕ/мл ХГ 100 МЕ/мл Рис. 12. Влияние ХГ на уровень внутриклеточных цитокинов (ИЛ-4 и ИФН ) в лимфоцитах периферической крови женщин in vitro (n=9).

Примечание: здесь и далее - *достоверные различия по t-критерию Стьюдента.

ХГ как модулятор экспрессии мембранных молекул лимфоцитов женщин. Показано, что ХГ в высокой концентрации снижает уровень CD25+ЦТЛ, однако на фоне активации клеток ИЛ-2 этот эффект отменялся. Как видно из таблицы 11, ХГ в дозах, характерных для беременности, не влияет на процент активированных (CD4+CD25dim) Т-лимфоцитов. Однако, при исследовании регуляторного действия ХГ в отношении количества Treg выявлено, что гормон в высокой дозе достоверно увеличивает число CD4+CD25bright клеток. Активация клеток ИЛ-2 оказывала самостоятельный стимулирующий эффект как на уровень CD4+CD25dim Т-лимфоцитов, так и на уровень CD4+CD25bright клеток. В то же время, ХГ на фоне ИЛ-2-активации также повышал уровень CD4+CD25bright, причем выявленный стимулирующий эффект был достоверно выше, чем самостоятельный эффект ХГ.

Таблица Влияние ХГ на экспрессию мембранных молекул лимфоцитов женщин (n=7) CD3+CD4+ CD3+CD4+ СD3+CD8+ Экспериментальное CD25dim CD25bright CD25+ воздействие Контроль 6,68±0,79 0,448±0,253 13,80±1, ХГ (10 МЕ/мл) 7,56±0,87 0,668±0,102 14,71±1, ХГ (100 МЕ/мл) 6,59±1,79 1,60±0,53* 9,07±2,66* 10,58±2,22* 2,10±0,45* 19,09±4, ИЛ-2 (100 МЕ/мл) 6,22±0,46^ 0,946±0,261*^ 13,96±2, ХГ 10 (МЕ/мл) +ИЛ- 6,62±1,11^ 1,086±0,219*^ 15,05±3, ХГ 100 (МЕ/мл) +ИЛ- Для детализации эффектов ХГ в отношении Treg изучали экспрессию Foxp в этих клетках. Установлено, что суточная инкубация лимфоцитов с ХГ (10 и МЕ/мл) достоверно повышает процент CD4+CD25brightFoxp3+ клеток в культуре (рис. 11). Так как результат оценивался после суточной инкубации, а для пролиферации естественных Treg требуется от 4 до 7 суток [De Rosa V. et al., 2007], полученный стимулирующий эффект можно интерпретировать, как способность гормона увеличивать долю адаптивных Treg.

Известно, что во время беременности происходит увеличение пула Treg периферической крови как за счет пролиферации естественных Treg, так и за счет индукции адаптивных Treg [Heikkinen J. et al., 2007]. Не исключено, что повышение относительного количества Treg в периферической крови женщин на ранних сроках беременности связано именно с действием ХГ. Подтверждением этого служит тот факт, что у женщин, проходящих подготовку в цикле ЭКО, и принимающих ХГ по принятым схемам, в периферической крови повышается уровень Treg [Koldehoff M. et al., 2011].

Принимая во внимание тот факт, что молекулярный механизм действия ХГ опосредован генерацией цАМФ, который активирует ПКА, исследовали участие данной протеинкиназы в реализации гормонального сигнала высокой концентрации гормона на уровне CD4+Foxp3+-клеток. Установлено, что блокада ПКА приводит к снижению содержания Treg в суточной культуре (рис.11). Это говорит о том, что клетки, входящие в пул мононуклеаров, способны поддерживать определенный уровень Foxp3+-лимфоцитов посредством стимуляции базальной активности ПКА. Вероятно, этот эффект достигается за счет простагландинов, синтезируемых моноцитами, которые индуцируют экспрессию Foxp3 у CD4+CD25--клеток, усиливая генерацию Treg in vivo [Sharma S. et al., 2005]. Под действием ингибитора ПКА стимулирующий эффект ХГ также отменяется, что свидетельствует о вовлечении аденилатциклазной системы в реализацию гормонального сигнала (рис. 12).

* * %, CD4+CD25brigth+Foxp3+ # # * Контроль ХГ 10 ХГ 100 Н-89 ХГ 10 ХГ МЕ/мл МЕ/мл МЕ/мл + МЕ/мл + Н-89 Н- Рис. 12. Влияние ХГ на уровень экспрессии Foxp3 в гейте CD4+CD25bright лимфоцитов периферической крови женщин in vitro. Роль ПКА (n=9).

Примечание: *- достоверные различия по t-критерию Стьюдента в сравнении с контролем;

# в сравнении с ХГ в соответствующей дозе.

Одним из наиболее значимых механизмов формирования иммунологической толерантности является поддержание баланса между Treg и субпопуляциями IL-17-продуцирующих лимфоцитов (Th17) [Wang W.J. et al., 2010]. В то же время, плацента, наряду с ХГ, продуцирует высокие уровни TGF 1 [Ширшев С.В., 2009], дифференцирующего антигенпримированные CD4+CD25- наивные Т-клетки в направлении регуляторного (Treg) и анергичного Т-клеточного фенотипа [Walker M.R. et al., 2003]. Показано, что 72 ч инкубация ХГ с CD4+ T-клетками на фоне индуктора транскрипции Foxp3 TGF-1, вне зависимости от концентрации гормона, приводит к достоверному повышению количества Treg (CD4+Foxp3+). Одновременно, ХГ увеличивает уровень Treg, экспрессирующих CTLA-4 (CD4+CD152+Foxp3+) и продукцию ИЛ-10 в супернатантах культур этих клеток (табл.12).

Таблица Влияние ХГ на баланс Treg /Th17 лимфоцитов периферической крови женщин в системе in vitro (n=8) CD4+ CD4+ CD4+ CD4+ CD4+ Экспери- ИЛ-10, ИЛ-17A, Foxp3+, Foxp3+ IL17A+ RORt+, RORt+ ментальное пг/мл пг/мл CCR6+, IL17A+, воздействие % CTLA- % 4 +, % % % 6,60 4,76 823,0 2,24 0,542 1,610 247, Контроль ±1,31 ±0,97 ±62,8 ±0,09 ±0,091 ±0,227 ±15, 12,07 7,88 1081,4 1,26 0,319 0,880 178, ХГ (10 МЕ/мл) ±1,96* ±0,98* ±72,0* ±0,09* ±0,041* ±0,051* ±20,45* 11,89 8,63 1090,0 1,23 0,343 0,930 196, ХГ (100 МЕ/мл) ±1,77* ±1,42* ±51,7* ±0,16* ±0,056* ±0,081* ±13,04* Таким образом, установлено, что ХГ увеличивает как количество Treg, так и их функциональную активность, связанную с экспрессией CTLA-4 и продукцией ИЛ-10 на фоне индукции клеток TGF-1. Известно, что благодаря CTLA-4 Treg способны индуцировать экспрессию IDO в АПК, взаимодействуя с костимулирующими молекулами CD80/86, что является одним из механизмов периферической толерантности [Finger E.B., Bluestone J.A., 2002]. В отношении Th17 установлено, что ХГ снижает количество CD4+-лимфоцитов, экспрессирующих мастер-регулятор Th17 ROR-t. Кроме того, ХГ достоверно снижает уровень дубль-позитивных ROR-t+IL-17А+-лимфоцитов. Оценка уровня IL-17A в супернатантах фракционированных CD4+-клетках подтвердила угнетающий эффект ХГ на процессы дифференцировки Th в Th17. Помимо этого, гормон достоверно снижает экспрессию хемокинового рецептора CCR6, необходимого для направленной миграции Th17 в очаг воспаления [Maddur M.S.

et al., 2012]. Следовательно, ХГ не только препятствует дифференцировке Th в Th17, но и существенно угнетает функциональную активность данных эффекторов. Важно отметить, что ХГ реализует данные эффекты вне зависимости от исследованных концентраций, т.е. на протяжении всего периода физиологически протекающей беременности (табл. 12).



Pages:   || 2 |
 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.