авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Особенности формирования лигноуглеводной матрицы хвойных на примере можжевельника

На правах рукописи

Зубов Иван Николаевич ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ЛИГНОУГЛЕВОДНОЙ МАТРИЦЫ ХВОЙНЫХ НА ПРИМЕРЕ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА Специальность 05.21.03 – Технология и оборудование химической переработки биомассы дерева, химия древесины

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Архангельск 2013

Работа выполнена в лаборатории химии растительных биополимеров федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт экологических проблем Севера Уральского отделения Российской академии наук Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, доктор химических наук, профессор Боголицын Константин Григорьевич кандидат технических наук, Гусакова Мария Аркадьевна

Официальные оппоненты: Пономарев Дмитрий Андреевич, доктор химических наук, профессор, профессор кафедры органической химии СПбГЛТУ Миловидова Любовь Анатольевна кандидат технических наук, доцент, доцент кафедры технологии целлюлозно бумажного производства института теорети ческой и прикладной химии САФУ имени М.В. Ломоносова Ведущая организация Институт биологии Коми НЦ УрО РАН

Защита состоится «15» ноября 2013 года в 1000 часов в ауд. 1220 на заседании диссер тационного совета Д 212.008.02 при ФГАОУ ВПО «Северный (Арктический) феде ральный университет имени М.В. Ломоносова» (САФУ) по адресу: 163002, г. Архан гельск, наб. Северной Двины, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке САФУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» октября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент Т.Э. Скребец

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Состав, строение и свойства лигноуглеводных композитов формируются на на ноуровне при непосредственном участии мультиферментативных комплексов в про цессе биосинтеза древесного вещества. В дальнейшем это предопределяет поведение растительных полимеров при химических и физических воздействиях. Активность ферментативных комплексов клетки зависит от внешних условий, к которым относят ся абиотическое, биотическое и антропогенное воздействия. В связи с этим, изучение вопросов биосинтеза компонентов клеточных оболочек, их самоорганизации, а также влияние на эти процессы комплекса внешних и внутренних факторов приобретают все большую актуальность.

С современных позиций древесное вещество рассматривается как бионаноком позит. Основу древесины как хвойных, так и лиственных видов составляют полисаха ридные компоненты (целлюлоза, гемицеллюлозы и пектиновые вещества), а также полифенол нерегулярного строения – лигнин. Функции лигнина в древесине заклю чаются в непосредственном его участии в процессах биосинтеза и формирования надмолекулярной структуры древесного вещества, придании жесткости углеводной композиции клеточной стенки и защите растения от патогенов. Во многом это опре деляется функциональной природой и физико-химическими свойствами лигнина. Ос новной трудностью при изучении лигнинов является невозможность их выделения в неизменном виде в силу высокой лабильности, что делает предпочтительным исполь зование неразрушающих методов анализа древесного вещества.

Применение современных методов исследования и высокоточной приборной базы позволит получить новые данные и уточнить имеющиеся сведения о распреде лении лигнина в клеточной стенке, его связи с полисахаридами, а также особенностях строения и надмолекулярной структуры лигноуглеводной матрицы.

Целью данной работы является изучение особенностей формирования соста ва и структуры древесного вещества хвойных на примере можжевельника обыкно венного (Juniperus Communis L.).

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

обосновать выбор биообъекта и региона исследования;

изучить компонентный состав древесины можжевельника различных природ но-климатических зон и определить приоритетные факторы формирования компонентов древесного вещества;

определить влияние ферментативного (пероксидазного) катализа на химиче ские процессы формирования древесины можжевельника;

исследовать функциональную природу и физико-химические свойства лигнина в процессе биосинтеза и формирования древесного вещества;

изучить особенности ультрамикростроения и надмолекулярной структуры лиг ноуглеводной матрицы, а также влияние на процесс их формирования химиче ской природы компонентов древесины.

Научная новизна Получены новые сведения об особенностях компонентного состава древесины можжевельника обыкновенного различных природно-климатических зон Европейско го Севера России. Определены приоритетные факторы формирования компонентов древесного вещества. Установлено, что интенсивность биохимических процессов об разования углеводной составляющей древесного вещества можжевельника определя ется температурным режимом региона.

Получены новые данные о функциональной природе, физико-химических свойствах и молекулярно-массовых характеристиках малоизмененных препаратов на тивного лигнина можжевельника. Показана значительная роль растительных перок сидаз как регуляторов биохимических процессов в биосинтезе и функционализации лигнина.

Методами сканирующей электронной и атомно-силовой микроскопии получе ны новые экспериментальные данные об особенностях строения древесного вещества можжевельника. Доказана спиральная ориентация микрофибрилл в слоях вторичной клеточной стенки. Получено подтверждение глобулярной структуры макромолеку лярных образований лигнина с нецеллюлозными полисахаридами.



Практическая значимость Предложена усовершенствованная методика исследования строения лигно углеводной матрицы древесины методом сканирующей электронной микроскопии, включающая стадию криомеханической пробоподготовки. Проведена доработка и адаптация методики определения параметра активности пероксидазы в растительном сырье.

На защиту выносятся Влияние абиотических факторов на компонентный состав древесины можже вельника обыкновенного.

Роль пероксидазы в процессах биосинтеза и функционализации лигнина.

Результаты исследования функциональной природы, молекулярно-массовых характеристик и реакционной способности диоксанлигнинов из разновозраст ной древесины можжевельника.

Данные по ультрамикростроению и надмолекулярной структуре древесной матрицы хвойных.

Личный вклад автора Автор принимал участие в формулировке целей и задач исследования, получе нии основного массива экспериментальных данных, их интерпретации, подготовке публикаций по теме диссертационной работы.

Апробация работы Основные положения диссертационной работы докладывались на: IV Между народной молодежной конференции «Экология-2011» (Архангельск);

XIV Молодеж ной конференции по органической химии (Екатеринбург, 2011);

IV Международной конференции «Физикохимия растительных полимеров» (Архангельск, 2011);

V Все российской конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2012);

12-th European Work shop on lignocellulosics and pulp «EWLP 2012» (Finland, 2012);

Всероссийской конфе ренции с международным участием «Экология и геологические изменения в окружа ющей среде северных регионов» (Архангельск, 2012);

V Международной конферен ции «Физикохимия растительных полимеров» (Архангельск, 2013).

Публикации По теме диссертации опубликовано 11 научных трудов, из них 3 статьи в жур налах, входящих в список ВАК.

Структура и объем диссертационной работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной ча сти, включающей 3 раздела, выводов и списка литературы. Работа изложена на странице машинописного текста, включая 37 рисунков, 3 схемы и 16 таблиц. Список литературы содержит 172 наименования.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В литературном обзоре дана краткая характеристика комплекса абиотических факторов и их влияния на особенности состава и структуры древесного веще ства. Рассмотрены: морфологические особенности строения древесины хвойных по род;

состав, строение и особенности биосинтеза основных компонентов клеточной стенки;

характеристика ферментов класса оксидоредуктаз, их роль в растительных организмах и процессе лигнификации;

методы анализа компонентов клеточной стен ки и древесного вещества в целом.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1. Можжевельник как биообъект исследования Химический состав древесины не является строго постоянным и меняется под воздействием ряда факторов, в числе которых абиотические, биотические и антропо генные. Абиотические (факторы неживой природы) играют определяющую роль в процессах распределения растительности, а также формирования состава и структуры древесного вещества. Для оценки их влияния на процесс биосинтеза лигноуглеводной матрицы необходимо исключить (минимизировать) биотическое и антропогенное воздействия. Достичь этого возможно при использовании в качестве биообъекта ис следования стрессоустойчивого вида, обладающего низкой заболеваемостью, дли тельным периодом жизни и обширным географическим ареалом. Одним из немногих биообъектов, отвечающих заданным условиям, является можжевельник обыкновен ный (Juniperus Communis L).

Архангельская область (АО) и Ненецкий автономный округ (НАО) характери зуются разнообразием природных ландшафтов, с различным геологическим строени ем и климатическими особенностями, что совместно с широким распространением можжевельника обыкновенного позволяет использовать эти территории в качестве региона проведения исследований. На основе справочных данных произведен выбор районов отбора, расположенных в различных природно-климатических зонах АО и НАО (рис. 1).

Рис. 1 – Участки отбора проб древесины можжевельника: 1 – НАО;

2 – Приморский район, АО;

3 – Пинежский район, АО;

4 – Онежский район, АО;

5 – Соловецкий район, АО.

Первый район отбора проб расположен в зоне тундры (субарктический пояс, с.ш.), а районы 2-5 в зоне северной тайги (умеренно климатический пояс, 6511- с.ш.). Распределение точек отбора по широте позволяет оценить влияние климата на процесс формирования особенностей компонентного состава древесного вещества.





На вышеуказанных участках был произведен отбор представительных образцов дре весины и хвои можжевельника. Количество образцов древесины, их возраст и ключе вые климатические характеристики районов отбора представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Характеристика образцов древесины и районов исследования Район 1 2 3 4 Количество образцов, шт 3 16 4 4 Возраст образцов, лет 72-90 17-140 90-115 68-107 59- Средняя температура июля, C 12,6 15,6 15,6 12,0 15, Число дней в году с устойчивой темпера 100 120 120 140 турой выше 50C Сумма температур выше 50C 950 1500 1500 1200 Примечание: Отбор представительных проб древесины произведен согласно ГОСТ 16128-70.

2. Компонентный состав древесины можжевельника Компонентный состав древесины во многом определяет особенности ее строе ния и свойства. Однако в литературе имеются лишь незначительные сведения о со держании основных компонентов в древесине можжевельника.

Согласно представленным данным (таблица 2), древесина можжевельника об ладает специфическим компонентным составом и по соотношению лигнин-целлюлоза занимает промежуточное положение между хвойными и лиственными породами. По ниженное содержание целлюлозы (в среднем 38-41%), не характерное для хвойных пород, совместно с высоким содержанием лигнина (в среднем 30-32%) может слу жить объяснением высокой плотности, гидрофобности и устойчивости древесного вещества можжевельника.

Таблица 2 – Компонентный состав некоторых видов хвойных и лиственных пород древесины Содержание, % к а.с.д.

вещества экстрагируемые:

целлюлоза Вид древесины лигнин диэтиловым эфиром / по методу Класона горячей водой спирто-бензольной Кюршнера смесью Литературные данные (Никитин Н.И., 1962;

Гелес И.С., 2007) Ель 27,0 – 29,6 46,1 – 53,1 1,1 – 3,0 0,9 – 1,5 / 2,3 – 2, Сосна 27,1 – 36,5 46,6 – 51,9 2,6 – 4,6 4,1 – 4,6 / 5,0 – 7, Лиственница 5,1 – 22,6 0,8 – 1,8 / 2,5 – 3, 23,1–25,5 39,5–45, Береза 19,5 – 23,8 1,4 – 3,5 0,9 – 2,4 / 3, 31–48, Дуб 0,5 / – 22,5 37,1 7, Можжевельник 6,3 / – 21,7;

35,18 48,3 0, Экспериментальные данные Можжевельник 28,6 – 34,2 36,4 – 47,0 0,74 – 4,98 (2,20 – 7,70)* Примечание: экспериментальные данные, определенные по стандартным методикам (Оболенская А.В., 1991);

* в качестве органического растворителя использовался этанол.

Древесина можжевельника обыкновенного, произрастающего в Архангельской обла сти, служит субстратом лишь для 2 видов дереворазрушающих грибов, в то время как для сосны и осины характерно 126 и 212 видов соответственно. Возможно, что повы шенная биотическая устойчивость можжевеловых деревьев также связана с высоким содержанием экстрактивных веществ, количество которых в исследуемых образцах достигает 7,7 %.

Стоит отметить, что компонентный состав исследованных образцов древесины варьируется в довольно широком диапазоне. Вероятно, это вызвано различными кли матическими условиями произрастания можжевельника (рис. 2). Одним из наиболее значимых климатических параметров для растительных организмов является дли тельность безморозного периода (количество дней с температурой 00С). Данный па раметр определяет продолжительность периода вегетации, однако для приарктиче ских территорий предпочтительнее использовать другую величину – число дней в го ду с устойчивой температурой выше 50C.

% 100 Рис.2 – Зависимость измене 130 30 ния содержания основных компонентов в древесине можжевельника, (% к а.с.д.) от 10 числа дней в году с устойчи вой температурой выше 50C.

Лигнин Целлюлоза Экстрактивные вещества Примечание: данные получены на образцах древесины можжевельника в возрастном диапазоне 70- лет.

Из результатов, приведенных на графике, видно, что содержание целлюлозы в древе сине можжевельника увеличивается с ростом количества безморозных дней в регионе и достигает максимума в более «мягких» климатических условиях зоны северной тай ги. Объяснением этому может служить большая продолжительность вегетационного периода и интенсификация процесса биосинтеза целлюлозы. Для лигнинной состав ляющей и экстрактивных веществ подобной зависимости не наблюдается. Вероятно, содержание этих компонентов, служащих защитным барьером растительного орга низма, определяется другими факторами. Анализ данных, представленных на рисунке 3 (а,б), позволяет сделать вывод о том, что содержание этих компонентов, выполня ющих защитные функции в растительных организмах, определяется продолжитель ностью процессов биосинтеза.

10 Содержание ЭВ, % 36 Содержание лигнина, % а б 30 28 50 70 90 110 130 150 50 70 90 110 130 Возраст древесины, лет Возраст древесины, лет Рис. 3 – Возрастная изменчивость содержания лигнина (а) и экстрактивных веществ (б) в древесине можжевельника обыкновенного.

В процессе роста и развития можжевеловых деревьев в условиях Европейского Севе ра идет активный процесс лигнификации древесного вещества, что подтверждается ростом содержания лигнинных компонентов, максимальное количество которых наблюдается в возрасте 90-110 лет (рис. 3а). Далее наблюдается снижение концентра ции лигнина, одновременно с этим происходит рост количества экстрактивных ве ществ в древесине можжевельника. Вероятно, в возрасте 90-110 лет происходит нарушение окислительно-восстановительного баланса. Оксикоричные кислоты, обра зующиеся в этот период, вступают преимущественно в окислительные процессы, что вызывает снижение интенсивности образования трех оксикоричных спиртов, и, напротив, рост количества образующихся экстрактивных веществ, таких как флаво ноиды и стильбены.

Таким образом, экспериментально показано, что древесина можжевельника об ладает специфичным для хвойных пород химическим составом. Содержание основ ных компонентов древесины варьируется в широком диапазоне. Для углеводной со ставляющей древесного вещества определяющим фактором является температурный режим региона, в то время как содержание лигнинных веществ определяется возрас том древесины.

3. Механизм пероксидазного катализа биосинтеза лигнина Формирование лигноуглеводной композиции древесного вещества можжевель ника обусловлено особенностями биосинтеза индивидуальных компонентов клеточ ной стенки и ходом лигнификации. По современным представлениям процесс био синтеза лигнина протекает по свободно радикальному механизму путем присоедине ния отдельных феноксильных радикалов к растущему полимеру. Важно отметить, что в биохимических реакциях участвуют монолигнолы, различающиеся редокс состоянием. Значительная роль в процессе образования феноксильных радикалов и инициации лигнификации отводится растительным пероксидазам. Учитывая выше сказанное, процесс биосинтеза лигнина может быть представлен в виде следующей общей схемы, составленной нами на основе литературных данных (Рогожин В.В., 2004):

E + PhOH [E-PhOH] PhO (рекомбинация) L E+O2 + DH2 E-ОО + HD + Н+ 1.

E-ОО + DH2 + Н+ E + HD + H2O E + H 2 O 2 E1 + H 2 O 2.

Ph1OH Ph1O + Н+ E1 + Ph1O+ Н+ [E-Ph1OН] E2 + Ph1O Ph2OH Ph2O + Н+ E1 + Ph2O+ Н+ [E-Ph2OН] E + Ph2O + H2O, Ph1O + Ph2O … L схема 3.

где Е – несвязанная форма фермента;

O2, H2O2 – субстраты-окислители;

DH2 – субстрат восстановитель;

E-ОО – фермент-субстратный комплекс;

HD – радикал;

Е1, Е2 – промежу точные полу-окисленные формы фермента;

Ph1OH – быстро и Ph2OH – медленно окисляе мый субстрат-восстановитель (монолигнол);

Ph1O, Ph2O – фенолят-анионы;

Ph1O, Ph2O – феноксильные радикалы;

[E-PhOH] – промежуточный фермент-субстратный комплекс;

L – макромолекула лигнина.

На начальном этапе биосинтеза лигнина в ходе реакций оксидазного окисления субстратов происходит образование пероксида водорода. Данный процесс является пусковым механизмом для последующего протекания пероксидазного цикла реакций фермента. Очевидно, что лимитирующим фактором для лигнификации древесного вещества является интенсивность образования активных фермент-субстратных ком плексов E1. Этот процесс напрямую зависит от концентрации образующегося перок сида. Скорость второй стадии зависит от химической природы окисляемых лигнин ных соединений, их функционального состава и молекулярной массы.

Процесс образования феноксильных радикалов из неионизированных феноль ных структур проходит через стадию образования фенолят-анионов. Количественной мерой данного процесса служит константа кислотной ионизации Ka. Чем выше значе ние Ka для субстрата-восстановителя (монолигнола), тем выше его реакционная спо собность в кислото-основных взаимодействиях. Как следствие, образуется большее количество фенолят-анионов данного типа, вступающих в дальнейшие окислительно восстановительные взаимодействия. Критерием, характеризующим реакционную способность в процессе окисления фенолят анионов до феноксильных радикалов, яв ляется окислительно-восстановительный потенциал (ОВП). Именно величина ОВП окисляемых субстратов характеризует их редокс состояние и может определять функциональную природу конечных лигнинных структур.

Согласно предложенной схеме активность растительных пероксидаз служит ре гулятором процессов биосинтеза и функционализации лигнина. Как следствие, дина мика пероксидазной активности должна коррелировать с полученными эксперимен тальными данными о компонентном составе древесины (рис. 3а), а также должна от разиться на функциональной природе и физико-химических свойствах малоизменен ных препаратов лигнина.

4. Активность пероксидазы как маркер процесса биосинтеза лигнина В растениях пероксидазы представлены генетически разнородными белками с одинаковой активностью (Рогожин В.В., 2004). Этот факт позволяет использовать ак тивность пероксидазы хвои можжевельника как общий параметр активности всех изоформ растительных пероксидаз и провести оценку влияния данного параметра на ход процесса лигнификации.

Активность пероксидазы (АПО) хвои определяли при 25 0С по скорости окис ления гваякола пероксидом водорода в среде калий-фосфатного буфера (рН 7.0) при длине волны 417 нм на спектрофотометре UV-1800 (Shimadzu). Полученные данные представлены на рисунке 4.

24 АПО Рис. 4 – Возрастная измен чивость средних значений пероксидазной активности хвои можжевельника.

0 20 40 60 80 100 120 Возраст дерева, лет В растениях на ранних стадиях роста процессы биосинтеза наиболее интенси фицированы, а следовательно, для них характерен повышенный уровень активности ферментативных комплексов, вовлеченных в процесс формирования древесного био композита. С увеличением возраста дерева процесс лигнификации в нем замедляется, что косвенно подтверждается снижением значений параметра активности пероксида зы, промежуточный минимум которых наблюдается в возрасте 45-50 лет. Этот воз раст характеризуется как середина жизненного цикла большинства можжевеловых деревьев, произрастающих в этом регионе (Приморский район (АО), рис. 1). Возмож но, что в этот период содержание хинонных форм полифенолов, служащих катализа торами биологических процессов, достигает некоторого критического значения, вследствие чего происходит рост пероксидазной активности. Максимальные значения АПО наблюдаются в возрасте 90 лет и соответствуют наибольшему содержанию лиг нина в древесине можжевельника (рис. 3а.), что подтверждает значимую роль расти тельных пероксидаз в процессе лигнификации древесного вещества (схема 1).

Итак, зависимости изменения параметра АПО и содержания лигнина от про должительности биосинтеза имеют схожий характер, что позволяет использовать АПО в качестве маркера биохимических процессов лигнификации и функционализа ции лигнина. Для оценки возможности его использования в качестве диагностическо го признака качественных (структурных) изменений в лигнине необходимо провести анализ малоизмененных препаратов лигнина, выделенных из разновозрастной древе сины можжевельника.

5. Изучение процесса функционализации лигнина можжевельника Для изучения функциональной природы и физико-химических свойств лигнина можжевельника, а также динамики изменения этих характеристик в процессе роста и развития древесины было выделено и проанализировано 16 малоизмененных препа ратов лигнина можжевельника из разновозрастных образцов древесины. Выделение представительных образцов лигнина проводили по методу Пеппера, выход препара тов диоксанлигнина (ДЛ) составил 25-35% от лигнина Класона.

Функциональный состав выделенных препаратов ДЛ можжевельника (ДЛМ) определен по стандартным методикам (Закис Г.Ф., 1975), молекулярно-массовые ха рактеристики – методом ВЭЖХ, элементный состав – методом сжигания на элемент ном анализаторе Evro EA 3000 (конфигурация [CNHS]) (таблица 3, рис. 5). Получен ные данные усреднены по 20-летним возрастным диапазонам, начиная с 50 до лет. Выделение ДЛ из более ранней древесины не проводилось из-за малой биомассы образцов.

Таблица 3 – Характеристика препаратов ДЛМ Эмпирическая формула Возрастной OCH3, С, Н, О, Mw, фенилпропановой P:G:S* MM а.е.м w/ n диапазон, лет % % % % единицы (ФПЕ) С9Н10,13О2,43(ОСН3)1, 50-70 17,2 64,4 6,0 29,6 17:61:22 7600 2, С9Н11,31О2,77(ОСН3)1, 70-90 16,4 62,3 6,4 31,3 20:59:21 7800 2, С9Н10,25О2,80(ОСН3)1, 90-110 16,7 62,4 5,9 31,7 17:61:22 7750 2, С9Н10,46О2,73(ОСН3)1, 110-130 16,9 62,6 6,0 31,4 17:61:22 7900 2, С9Н9,59О3,04(ОСН3)1, 130-150 17,4 61,1 5,4 33,5 13:64:23 9100 2, Примечание: * соотношение п-кумаровых, гваяцильных и сирингильных единиц лигнина.

OH фен COOH CO 5, % % 3, 2, 4, 2, 1,5 4, 1, 3, 0, 50 70 90 110 130 50 70 90 110 130 Возраст древесины, лет Возраст древесины, лет Рис. 5 – Изменение функциональной природы ДЛМ с возрастом.

Полученные значения молекулярных масс и полидисперсность препаратов лиг нина можжевельника соответствуют ДЛ хвойных. Причем максимальные значения среднемассовых молекулярных масс Mw характерны для лигнинов, выделенных из возрастной древесины, что свидетельствует об усилении процессов конденсации лиг нина с возрастом.

Анализ функциональной природы выделенных препаратов ДЛ выявил повы шенное содержание метоксильных групп, вероятно, вызванное присутствием сирин гильных структур. Наличие последних подтверждено методом ИК-спектроскопии, так установлено, что полоса поглощения 1510 см-1 является суперпозицией двух полос 1514 и 1502 см-1, относящихся к колебаниям ароматических колец (G) и (S) типов.

Соотношение интенсивностей полос поглощения G/S составляет примерно 2,8. Согласно данным элементного анализа препаратов ДЛМ и рассчитанным на его основе эмпирическим формулам ФПЕ, количество S-структур достигает максимума в возрасте 130-150 лет. Динамика изменения содержания гидроксильных и карбониль ных функциональных групп в ДЛМ с возрастом имеет схожий характер и, также как содержание лигнина, характеризуется перегибом в области 90 – 110 лет (рис.5). В це лом функциональный состав лигнинов не претерпевает значительных количествен ных изменений при увеличении возраста.

Методами ИК-спектроскопии, элементного и химического анализа установле но, что ДЛМ относится к композиционно неоднородным биополимерам, состоящим из мономерных единиц гваяцильного, сирингильного и п-кумарового типа в соотно шении 61:22:17.

Фенольные гидроксильные группы являются активными реакционными цен трами в макромолекулах лигнина. Их диссоциация в значительной мере определяет реакционную способность природного полимера в кислотно-основных и окислитель но-восстановительных взаимодействиях. Мерой кислотно-основных свойств является константа диссоциации. Определение pKa препаратов ДЛМ проводили методом спек трофотометрического титрования (Косяков Д.С., 2007).

Регрессионный анализ кривой спектрофотометрического титрования – зависи мости оптической плотности от pH раствора, позволяет дифференцированно опреде лить величины рКа трех основных типов фенольных структур лигнина (таблица 4).

Таблица 4 – Значения pKa основных типов фенольных структур ДЛМ из разновозрастной древесины Возрастной pKa1 pKa2 pKa диапазон, лет 50-70 8,08 10,04 11, 70-90 7,69 10,08 11, 90-110 9,13 10,69 11, 110-130 8,67 10,59 11, 130-150 7,32 9,72 11, Согласно полученным данным, структуры I типа имеют минимальные значения рКа в водной среде 7,32 – 9,13, что вызвано наличием сопряженной с бензольным кольцом карбонильной группы. Однако, согласно фотометрическим данным, полу ченным -методом, их содержание в выделенных препаратах ДЛМ незначительно и не превышает 8% от общего числа структур со свободным фенольным гидроксилом.

Основная часть фенольных гидроксильных групп ДЛМ содержится в структурах II типа (до 55%), рКа которых изменяется в пределах 9,72 – 10,69. К структурам III типа, имеющим наибольшее значение рКа 11,66 – 11,91, относятся структуры с несопря женной -карбонильной группой и с С-С связью в пятом положении, характерной для конденсированных структур лигнина.

Полученные данные свидетельствуют о значимом изменении величин рКа структур I и II типа в образцах ДЛМ, выделенных из разновозрастной древесины. Ве роятно, это обусловлено изменением функциональной природы и молекулярно массовых характеристик препаратов лигнина в процессе биосинтеза древесного веще ства. При этом значения рКа структур III типа практически не изменяются. Таким об разом, основной вклад в изменение значений константы кислотной ионизации ДЛМ вносят структуры I и II типа. Однако, учитывая данные об их количественном содер жании в выделенных препаратах лигнина, можно сказать, что именно структуры II типа будут играть определяющую роль в формировании особенностей строения и фи зико-химических свойств лигнина.

Максимальные значения рКа2 характерны для лигнинов, выделенных из древе сины можжевельника в возрасте 90 – 110 лет, следовательно, в данный период време ни лигнин можжевельника характеризуется наименьшим значением Ка (примерно в 10 раз ниже, чем в возрасте 130-150 лет) и минимальной способностью к образованию фенолят-анионов, что частично объясняет замедление процессов биосинтеза лигнина (рис. 3а).

Эффективный потенциал лигнина (*02), как основной физико-химический па раметр редокс состояния полимера, является интегральным показателем реакционной способности в окислительно-восстановительных взаимодействиях и зависит от его функциональной природы и макромолекулярных свойств. Эффективный потенциал препаратов ДЛМ определяли методом косвенной оксредметрии (Боголицын К.Г., 2010), для расчета значений использовали уравнение:

где *02 – эффективный потенциал органической окислительно-восстановительной системы (ОВС), В;

нач – стандартный (начальный) потенциал органической ОВС, В;

R – универсальная газовая постоянная 8,314103 Дж/(Кмоль);

T – абсолютная температура, К;

F – число Фарадея, 96487 Кл/моль;

С03нач – начальная аналитическая концентрация феррици анида, моль/л;

С03равн – равновесная аналитическая концентрация окисленной формы, моль/л;

C – суммарная концентрация форм ОВС, С = С03нач + С04нач = С03равн +С04равн;

СArO-нач – начальная концентрация фенольных гидроксильных групп лигнина, моль/л.

Все изученные препараты лигни *02, на обладают весьма высоким окисли мВ тельным потенциалом 842-860 мВ, что соответствует лигнинам хвойных пород.

Кроме того, прослеживается некоторая 850 зависимость ОВП от молекулярной мас сы образца, так для высокомолекулярных образцов, выделенных из древесины 840 можжевельника в возрасте 130-150 лет, 50 70 90 110 130 характерны максимальные значения по Возраст древесины, лет тенциала (рис. 6).

Рис. 6 – Изменение эффективного потенциала Эффективный окислительный по лигнина с возрастом дерева.

тенциал зависит от логарифма отношения концентраций lg (Cox/Cred), что позволяет судить об изменении относительного содер жания фенольных (Cred) и хинонных (Cox) форм лигнина. Так, высокие значения ОВП лигнинов в 50-летней древесине свидетельствуют о промежуточном максимуме отно сительного содержания хинонных форм, что косвенно подтверждает их роль – акти ваторов пероксидазы. Рост активности пероксидазы (рис. 4) интенсифицирует био синтез лигнина. Этот процесс сопровождается снижением относительного содержа ния хинонных структур и приводит к уменьшению значений эффективного потенциа ла, минимум значений которого наблюдается в возрасте 90-110 лет и соответствует максимальному содержанию лигнина.

Таким образом, изменение содержание лигнина в процессе роста можжевело вых деревьев действительно связано с нарушением окислительно-восстановительного баланса, регулятором которого служит фермент пероксидаза. Снижение концентра ции лигнина по достижении возраста 90-100 лет объясняется преобладанием окисли тельных и дегидрогенизационных процессов с образованием хинонных форм и по вышением термодинамической неравновесности в древесной матрице можжевельни ка и также подтверждается динамикой ферментативной активности.

6. Ультрамикростроение и надмолекулярная структура древесной матрицы Функциональная природа и физико-химические свойства лигнина определяют конформационные особенности макромолекул, их связь с углеводами и распределе ние полимера в клеточной стенке в процессах биосинтеза и формирования древесного вещества. Для изучения ультрамикростроения и надмолекулярной структуры можже вельника нами были проведены микросопические исследования с применением со временного высокоточного оборудования.

В данном разделе представлены новые экспериментальные данные об особен ностях строения и структуры древесного вещества можжевельника. Снимки древеси ны получены на сканирующем электронном микроскопе SEM Sigma VP ZEISS и атомно-силовом микроскопе ACM Multimod 8 Bruker. По результатам проведенных микроскопических исследований сделаны следующие основные выводы.

Наряду с первичной (P) и вторичной (S) оболочками, для клеточной стенки древесины можжевельника характерно наличие третичной оболочки – бородавчатого слоя (W), несвойственного для древесины хвойных пород (рис. 7). Наличие бородав чатого слоя может служить объяснением присутствия в лигнине можжевельника си рингильных структур в количестве до 23%.

Рис. 7 – Расположение слоев клеточной Рис. 8 – Спиральная структура клеточной стенки древесины можжевельника и ориен стенки трахеиды.

тация в них целлюлозных микрофибрилл.

Рис. 9 – Микрофибриллы целлюлозы на Рис. 10 – Поверхность слоя S1 клеточной сколе слоя S2 клеточной стенки древесины стенки на радиальном сколе образца древеси можжевельника. ны можжевельника после обработки водой.

Методом SEM с применением предварительной криомеханической обработки получены снимки, подтверждающие разнонаправленную спиральную ориентацию микрофибрилл целлюлозы в различных слоях вторичной оболочки. Подобное распо ложение способствует большей механической устойчивости клеточной стенки (рис.

8). Для этого исследуемые образцы древесины (надсеченные по периметру) охлажда лись в жидком азоте, после чего производился скол. Для повышения контрастности снимков на поверхность исследуемых образцов наносилось золото-палладиевое по крытие.

Различное строение слоев связано с особенностями формирования микрофиб рилл целлюлозы и их компоновкой. Анализ (рис. 10) позволяет сделать вывод о том, что формирование кристаллов слоя S1 возможно лишь при наслаивании отдельных молекул целлюлозы на одно основание, причем каждая последующая молекула долж на повторять «дефекты» предыдущих. Рост микрофибрилл S2, напротив, осуществля ется вдоль, а не поперек. Можно предположить, что одна молекула фермента, катали зирующая синтез целлюлозы из глюкозы, обеспечивает удлинение сразу нескольких макромолекул целлюлозы, о чем свидетельствуют изгибы, переплетения и раздвоения микрофибрилл (рис. 9). Также для микрофибрилл целлюлозы характерен большой диапазон размеров, например, их диаметр в слое S2 может колебаться от 20 до 300 нм и более.

до обработки водой после обработки водой Рис. 11 – Поверхность слоя S1 на радиальном сколе образца древесины можжевельника.

Первичная оболочка клеточной стенки можжевельника (рис. 11) состоит из от дельных разнонаправленных целлюлозных волокон толщиной до 50 нм, помещенных в твердый раствор гемицеллюлоз в лигнине. Последний представляет собой частицы глобулярной формы (диаметр 5 – 60 нм), растворимые в водных растворах щелочей, диоксане и других растворителях. Лигнин в таком твердом растворе по своей функ циональной природе и полимолекулярным свойствам отличается от лигнина, находя щегося в жесткой композиции сеток.

Полученные экспериментальные данные согласуются с основными положени ями физико-химической модели формирования лигноуглеводной матрицы (Боголи цын К.Г., 2004, 2010).

В целом, результаты проведенных исследований подтверждают значимую роль растительных пероксидаз в процессах биосинтеза, функционализации и формирова нии физико-химических свойств лигнина, что определяет его распределение в кле точной стенке, связь с полисахаридами матрикса, а также особенности ультрамикро строения и надмолекулярной структуры древесного вещества ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 1. С использованием методов сканирующей электронной и атомно-силовой микроскопии получены новые экспериментальные данные по ультрамикростроению и надмолекулярной структуре древесной матрицы хвойных, подтверждающие возмож ность рассмотрения древесного вещества как нанокомпозита, основой которого слу жат целлюлозные нанофибрилы (20 – 50 нм) и лигноуглеводные образования глобу лярной формы (диаметр 5 – 60 нм).

2. Лигнификация древесины происходит как ферментативный радикальный окислительно-восстановительный процесс, характеризующийся изменением соотно шения п-кумаровых: гваяцильных: сирингильных (17:61:22) структур лигнина, а так же функциональной природы, реакционной способности (pKa2 = 9.72 – 10,69;

*02 = 842 – 860 мВ) и молекулярно-массовых характеристик лигнина можжевельника.

3. Показана значительная роль растительных пероксидаз в процессах биосинте за и формирования структуры лигнина.

4. Получены новые данные по компонентному составу древесины можжевель ника обыкновенного (Juniperus Communis L.) арктических и приарктических террито рий Европейского Севера России. Установлено, что климатические факторы, в первую очередь, определяют ход биосинтеза углеводной составляющей древесного вещества можжевельника, что выражается в повышенном содержании целлюлозы.

Для лигнинной составляющей древесины можжевельника определяющим фактором является продолжительность биосинтеза.

6. Предложена усовершенствованная методика исследования строения лигно углеводной матрицы древесины методом сканирующей электронной микроскопии, включающая стадию криомеханической пробоподготовки. Проведена доработка и адаптация методики определения параметра активности пероксидазы в растительном сырье.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях 1. Зубов И.Н. Влияние абиотических факторов на формирование лигноугле водной матрицы древесины можжевельника [Текст] / И.Н. Зубов, С.С. Хвиюзов, М.А. Лобанова, М.А. Гусакова, К.Г. Боголицын // Известия вузов. Лесной журнал. – 2012. – №1. – С. 113–120.

2. Боголицын К.Г. Ультрамикростроение и надмолекулярная структура древес ной матрицы [Текст] / К.Г. Боголицын, Д.Г. Чухчин, И.Н. Зубов, М.А. Гусакова // Химия растительного сырья. – 2012. – №3. – С. 37–44.

3. Bogolitsyn K. Ultramicroscopic composition and supramolecular structure of wood matrix [Text] / K. Bogolitsyn, D. Chuhchin, I. Zubov, M. Gusakova // Russian Jour nal of Bioorganic Chemistry. – 2013. – Vol. – 39. – №7. – P. 671–676.

4. Боголицын К.Г. Можжевельник обыкновенный как объект для изучения био геохимических аспектов формирования древесного вещества [Текст] / К.Г. Боголицын, М.А. Гусакова, С.С. Хвиюзов, И.Н. Зубов // Физикохимия расти тельных полимеров: материалы IV Междунар. конф. / под. ред. д-ра хим. наук, проф К.Г. Боголицына. – Архангельск. – 2011. – С. 28–31.

5. Хвиюзов С.С. Исследование лигнина можжевельника Juniperus [Текст] / С.С. Хвиюзов, К.Г. Боголицын,М.А. Гусакова, И.Н. Зубов // Физикохимия раститель ных полимеров: материалы IV Междунар. конф. / под. ред. д-ра хим. наук, проф К.Г. Боголицына. – Архангельск. – 2011. – С. 135–136.

6. Зубов И.Н. Активность пероксидазы хвои можжевельника различных при родно-климатических [Текст] / И.Н. Зубов, К.Г. Боголицын, М.А. Гусакова, С.С. Хвиюзов, М.А. Лобанова // Физикохимия растительных полимеров: материалы IV Междунар. конф. / под. ред. д-ра хим. наук, проф К.Г. Боголицына. – Архангельск.

– 2011. – С. 118–121.

7. Хвиюзов С.С. Физико-химические свойства лигнина можжевельника Juni perus [Текст] / С.С. Хвиюзов, И.Н. Зубов, М.А. Лобанова, М.А. Гусакова, К.Г. Боголицын // Новые достижения в химии и химической технологии растительно го сырья: материалы 5 Всероссийской конференции с международным участием. – Барнаул. – 2012. – С. 92-93.

8. Bogolitsyn K.G. Biochemical aspects of formation of the lignin-carbohydrate ma trix of coniferous wood: case study of Juniper [Text] / K.G. Bogolitsyn, M.A.Gusakova, I.N. Zubov, M.A. Lobanova, S.S. Hviyuzov // Proceedings 12th European workshop on lignocellulosics and pulp EWLP – Espoo, Finland. – 2012. – P. 362–365.

9. Боголицын К.Г. Морфология древесной матрицы можжевельника [Текст] / К.Г. Боголицын, И.Н. Зубов, М.А. Гусакова, Д.Г. Чухчин, С.С. Хвиюзов, А.А. Красикова // Физикохимия растительных полимеров: материалы V Междунар.

конф. / под. ред. д-ра хим. наук, проф К.Г. Боголицына. – Архангельск. – 2013. – С.

74-77.

10. Зубов И.Н. Химический состав древесины хвойных экологически «чистых» территорий Европейского севера России [Текст] / И.Н. Зубов, С.С. Хвиюзов, М.А. Гусакова, К.Г. Боголицын // IV Международная молодежная конференция «Эко логия-2011», материалы докладов. – Архангельск. – 2011. – 312 с.

11. Зубов И.Н. Сравнительная характеристика химического состава древесины можжевельника гетеротермальных зон [Текст] / И.Н. Зубов, К.Г. Боголицын, М.А. Гусакова, С.С. Хвиюзов, М.А. Лобанова // Материалы всероссийской конферен ции с международным участием «Экология и геологические изменения в окружаю щей среде северных регионов» посвященная памяти чл.-корр. РАН Ф.Н. Юдахина. – Архангельск. – 2012. – С. 97–100.

Автор диссертации выражает глубокую благодарность: коллективу лаборатории Хи мии растительных биополимеров ИЭПС УрО РАН за поддержку и помощь в про водимых исследованиях;

коллективу ЦКП НО «Арктика» и особенно Чухчину Д.Г.

за проведение целого ряда исследований и помощь в интерпретации полученных ре зультатов;

коллективу лаборатории Комплексного анализа наземной и космиче ской информации для экологических целей ИЭПС УрО РАН, а также Сурсо М.В.

за помощь в проведении дендрологических исследований.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах с заверенными гербовой печатью подпи сями просим направлять по адресу: 163002. Россия, г. Архангельск, набережная Северной Двины, д. 17, САФУ, диссертационный совет Д 212.008.02.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.