Молекулярно-генетические исследования функционирования полиморфных вариантов генов цитокиновой сети и биотрансформации ксенобиотиков при онкопатологии
На правах рукописи
ВАСИЛЬЕВА ЭЛЬВИРА МАНСУРОВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВОЙ СЕТИ И БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ ПРИ ОНКОПАТОЛОГИИ 03.02.07 – генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2012
Работа выполнена в центре молекулярно-генетических исследований при кафедре генетики Башкирского государственного педагогического университета им.М.Акмуллы
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Горбунова Валентина Юрьевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Ким Александр Иннокентьевич кафедры генетики МГУ им. М.В.Ломоносова кандидат биологических наук, Бермишева Марина Алексеевна старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения Российской академии наук Института биохимии и генетики УНЦ РАН Казанский (Приволжский) федеральный
Ведущая организация:
университет
Защита диссертации состоится «_» _2012 г. в «_» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу:
450054, Уфа, просп. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru/dissov.html, e-mail: [email protected].
Автореферат разослан «_» _2012 г.
Ученый секретарь С.М. Бикбулатова диссертационного совета
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Цитокиновая система относится к центральным регуляторам гомеостаза, так как обладает широким спектром биологических эффектов (Симбирцев, 2008;
Баранов, 2010). Одной из важнейших функций цитокинов является обеспечение согласованного действия иммунной, эндокринной и нервной систем (Mosmann 1986;
Belardelli, 1999), при котором происходит модуляция как локальных, так и глобальных механизмов защиты.
Образование и высвобождение этих высокоактивных молекул жестко регулируется генетическими механизмами (Симбирцев, 2002;
Сенников, 2004).
Генетически детерминированная дисрегуляция цитокинов ведет к инициации не только хронических воспалительных процессов, но и к генерализированным нарушениям. Показано, что дисбаланс в продукции белков семейства IL-1 (IL 1/IL1RA/IL1RI) влияет на характер протекания воспалительных заболеваний и является одним из пусковых механизмов патологических процессов (Громова, Симбирцев, 2005). В последние десятилетия активно изучается роль цитокинов в регуляции состояний, связанных с развитием иммунопатологии: острых и хронических воспалительных процессов инфекционной природы, аутоиммунных реакций и различных проявлений аллергии (Карунас, Хуснутдинова, 2007).
Особый интерес вызывает вопрос о влиянии цитокинов на процесс неопластической трансформации клеток. Имеется достаточно подтверждений тому, что хроническое воспаление является фактором риска развития опухоли, ее прогрессирования и метастазирования (Coussens, 2002;
Tan, 2007;
Porta, 2007;
Lee et al., 2008;
Fidler, 2008;
Mantovani, 2008). Согласно современным исследованиям, наиболее перспективными в качестве маркеров опухолевого роста и прогностических факторов при злокачественных новообразованиях являются такие цитокины, как IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, -TNF и др. Для ряда онкологических заболеваний показана взаимосвязь между концентрацией цитокинов в сыворотке крови и агрессивностью течения, метастатическим потенциалом и риском развития рецидивов (Sivaparvathi et al.,1995;
Glas et al., 2004).
На функционирование системы цитокинов могут влиять ксенобиотики, образующие реактивные метаболиты в ходе биотрансформации, которые могут выступать в роли аутоантигенов, вызывающих клеточный или гуморальный иммунный ответ (Ляхович и др., 2000).
В настоящее время, для определения степени напряженности регуляторных механизмов иммунного ответа в клинической практике проводится оценка концентрации цитокинов в сыворотке крови, что лишь констатирует сам факт е повышения или понижения у данного индивида, без учета его генетической конституции. В связи с этим, возрастает необходимость исследования индивидуального генетического профиля, соответствующего его иммунному статусу, что определит направление превентивной и предиктивной корректировки образа жизни каждого человека. Поэтому имеется настоятельная необходимость изучения функционирования полиморфных вариантов генов цитокинового каскада не только семейства интерлейкина-1, но и других цитокинов про- и противовоспалительного ряда, а также генов, регулирующих систему биотрансформации ксенобиотиков в норме и при патологических состояниях.
Цель настоящего исследования заключается в комплексном анализе содержания цитокинов в сыворотке крови при различных сочетаниях аллелей генов цитокинового каскада и системы биотрансформации ксенобиотиков в норме и онкопатологии.
Задачи исследования.
1. Изучить содержание цитокинов IL-1, IL1RA, IL2, IL4, IL-6, IL10, -TNF, и СRP в сыворотке крови у здоровых индивидов и онкобольных.
2. Провести генетический анализ наследования аллелей генов семейства интерлейкин-1, локализованных на 2 хромосоме и аллелей генов микросомальной эпоксидгидролазы-1 и интерлейкина-10, локализованных на хромосоме 1.
3. Изучить динамику изменения показателей цитокинового профиля при:
активации клеток цельной крови митогеном ex vivo и действии иммуномодулятора растительного происхождения «Эхинацея» у здоровых индивидов с различной генетической конституцией.
4. Проанализировать распределение полиморфных вариантов генов цитокинового профиля (IL-1 (rs1143634, 3953CT), IL1RА(VNTR во 2 интроне), IL1R1(rs2287047, -976TC), IL4(VNTR в 3 интроне), IL6 (rs1800796, -572GC), IL -TNF и биотрансфорации (rs1800872, -627СА), (rs1800629, -308GA)) ксенобиотиков (CYP1A1 (rs1048943, 4889AG), CYP2E1 Ins 96 bp., EPHX (rs1051740, 337TС и rs2234922, 4156AG);
NQO1 (rs1800566, 609CT;
rs1131341, 465СТ)) у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией.
5. Проанализировать распределение частот сочетаний генотипов и оценить роль межгенных взаимодействий полиморфных локусов в изученных генах.
6. Выявить особенности функционирования генов цитокинового ряда и биотрансформации ксенобиотиков у онкологических больных, носителей «рисковых» аллелей в гене онкосупрессора ТР53.
Научная новизна исследования. Установлена взаимосвязь полиморфных локусов генов цитокинового профиля с показателями спонтанной продукции цитокинов. Выявлены сочетания генотипов семейства интерлейкин-1, имеющих функциональную и адаптивную значимость. Выявлены межгенные взаимодействия полиморфных локусов в генах (IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), влияющие на функционирование генов семейства IL1RI (rs2287047), интерлейкин-1. Показано, что лица, являющиеся носителями сочетаний генотипов семейства интерлейкин–1 (IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI (rs2287047):
E1E1//I/I//TT, E1E1//I/II/TT, E1E1//I/II/CC, E1E2//I/II/TC, более отзывчивы на действие эндогенного иммуномодулятора, чем индивиды с сочетаниями генотипов E1E1//I/I//TС, E1E1//I/II/TС. Генеалогическим анализом впервые установлено неполное сцепление между генами IL-1 и IL1RA семейства интерлейкин-1, расположенными на 2 хромосоме, генетическое расстояние между которыми составляет 3,3 сМ. Показано, что вследствие кроссинговера образуются новые гаплотипы у потомков. Впервые выявлено что «непротективные» аллели (*E2/*II/*C) в генах семейства интерлейкина-1 достоверно чаще встречаются у онкологических больных с «рисковыми» аллелями в гене ТР53.
Научно-практическая значимость. Основные положения работы включены в лекционный материал к дисциплинам биологического цикла: «Общая генетика», «Биохимия», «Иммунология», «Генетика человека», «Экологическая генетика».
Разработан спецкурс «Генетические основы здоровья» и лабораторные практикумы для специальности «Генетика», в рамках которых определяется степень напряженности цитокинового звена иммунитета как прогностического критерия диагностики состояния здоровья студентов. Результаты работы внедрены на кафедре онкологии и хирургии Башкирского государственного медицинского университета и в Республиканском клиническом онкологическом диспансере МЗ РБ при проведении ранней диагностики и организации превентивных мероприятий. В «Центре молекулярно-генетических исследований» кафедры генетики БГПУ им. М.Акмуллы результаты используются при сравнительном исследовании состояния здоровья студентов и спортсменов. Проводятся совместные мероприятия с кафедрой охраны здоровья и безопасности жизнедеятельности БГПУ им. М.Акмуллы, направленные на развитие осознанного отношения к здоровью и формирование здорового образа жизни молодежи и студентов.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на ежегодных международных конференциях Европейского общества генетиков человека (Амстердам, 2007;
Гтеборг, 2010), II Международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), на республиканской молодежной научно-практической конференции «Инновационный потенциал молодежной науки» (Уфа, 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС, Москва, 2009), IV Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2009), 14-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на Дону, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Биомика – наука XXI века» (Уфа, 2011), на международном Конгрессе нанотехнологий (круглый стол «Нанотехнологии в медицине», (Уфа, 2011);
I Международной Школе конференции молодых учных «Спорт: медицина, генетика, физиология, биохимия, педагогика, психология и социология» (Уфа, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе, в журналах из Перечня ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 143 листах машинописного текста, включает обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 26 рисунками. Список цитируемой литературы включает 247 источников, в том числе – 172 иностранных авторов.
Связь работы с крупными научными программами. Работа поддержана грантами РФФИ «Исследование мобильного генома на примере человека» на 2008-2010 гг.;
РГНФ «Молекулярно-генетические и средовые факторы в развитии когнитивных способностей человека» на 2010-2011 гг.;
Грантом Министерства Образования РФ:
Тематический план на 2009/2010 и 2010/2011 гг. «Молекулярно-генетическое исследование здоровья и адаптационных возможностей человека»;
Грантами БГПУ им. М.Акмуллы по направлению 10.04 «Фундаментальные и прикладные исследования и инновационные образовательные проекты молодых ученых (до лет)». «Изучение нормы реакции организма в зависимости от молекулярно генетических особенностей и экологических условий среды обитания»;
стипендией Президента Республики Башкортостан на 2010-2011 уч. год;
Грантом Республики Башкортостан для государственной поддержки молодых ученых и молодежным научным коллективам на 2011 гг. «Технология комплексной оценки состояния здоровья: молекулярно-генетические и физиолого-биохимические аспекты».
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. В работе использованы образцы ДНК человек в возрасте от 18 до 72 лет (медиана 35.57), проживающих в Республике Башкортостан, с их информированного согласия на проведение исследований.
Среди них: 1016 здоровых индивидов без отягощенного онкологического анамнеза и 164 онкологических больных, находившихся на стационарном лечении в Республиканском клиническом онкологическом диспансере МЗ Республики Башкортостан. У 88 обследованных обнаружен рак молочной железы (РМЖ), у выявлен рак желудочно-кишечного тракта различной локализации. В исследование включены больные со стадиями, соответственно, клинико морфологической (TNM) классификации опухолей: T1-4N0-2M0. Для выделения ДНК использовали стандартный метод фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984). Анализ изученных полиморфных локусов генов цитокинового профиля и биотрансфорации ксенобиотиков проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на термоциклере (ПЦР) в автоматическом режиме с использованием локус-специфических олигонуклеотидных праймеров.
У здоровых индивидов определяли скорость оседания эритроцитов (СОЭ) по методу Панченкова (Ронин, 1989).
Иммуноферментным методом измеряли концентрацию следующих цитокинов в сыворотке крови: интерлейкин-1 бета (IL-1), рецепторного антогониста интерлейкина–1 (IL1RA), интерлейкин-2 (IL2), интерлейкин – 4 (IL4), интерлейкин – 6 (IL-6), интерлейкин – 10 (IL10), фактор некроза опухоли- ( TNF), С-реактивный белок (СRP), с использованием реактивов ЗАО «Вектор-бест» (Новосибирск) у 180 здоровых индивидов и 44 женщин, больных раком молочной железы, стадии T2-3N0-2M0 (сыворотка крови взята до проведения операции по удалению опухоли и через 14 дней после проведения операции). У 28 индивидов проведена стимуляция продукции цитокинов ex vivo посредством митоген индукции клеток цельной крови, и анализировалась концентрация цитокинов в сыворотке крови после приема иммуномодулятора растительного происхождения «Эхинацея», по схеме 1т21день.
Проведены генеалогический и генетический анализ наследования аллелей генов семейства интерлейкин-1 и аллелей генов микросомальной эпоксидгидролазы-1 и интерлейкина-10 (Курчанов, 2006).
Статистические методы. Математическую обработку полученных данных проводили с использованием критерия Стьюдента. Различия между параметрами считались статистически достоверными при p0,05. Для определения статистических параметров использовались программы MS Excel и Statistica 6.0, анализ сцепления 2 LD (Zapata C, 2001), гаплотипный анализ EH (Xiex, 1993).
Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) проводили с использованием статистического пакета SPSS (версия 13.0): для сравнения средних значений, сопоставления компонентов дисперсии изучаемой переменной, анализа общей изменчивости переменной, обусловленной различием групп (средних значений), сравнения между собой средних значений каждой выборки и вычисления общего уровня значимости различий (Юнкеров, 2002). При анализе межгенных взаимодействий использовали метод моделирования ген-генных и ген-средовых взаимодействий с помощью непараметрической программы GMDR - Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction (Lou, 2007).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Иммуноферментный анализ концентрации цитокинов в сыворотке крови У обследованных здоровых индивидов (n=180) СОЭ находилась в пределах физиологической нормы, что свидетельствует об отсутствии активного воспалительного процесса на момент забора биологического материала.
При оценке спонтанной продукции цитокинов в группе условно здоровых лиц, проживающих в Республике Башкортостан, выявлены различия по концентрации IL-1 в сыворотке крови относительно клинической нормы. У части здоровых индивидов выявлено повышение концентраций IL-1, IL6 и -TNF (табл.1). Причем, высокая концентрация интерлейкина-1 в сыворотке крови обуславливает высокие уровни других провоспалительных медиаторов - IL6 и -TNF, так как они синергидно участвуют в иммуно-воспалительном ответе (Aggarwal, 1992;
Фрейдлин, 1998).
Анализ содержания основных про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови у больных РМЖ показывает достоверное изменение их уровня по сравнению со здоровыми (табл. 1).
Таблица Показатели цитокинового статуса1 у больных РМЖ до операции и здоровых индивидов Больные РМЖ Здоровые Показа тели р ±m ±m n Xmin Xmax n Xmin Xmax IL-1 44 0,4 8,5 2,5±0,21 1,4 56 0,56 9,97 3,8±0,28 2,1 0, IL1RA 44 101,2 3449,7 1031,43±75,71 502 56 0 767 215±23,8 178 0, IL2 44 0 6,54 1,26±0,06 0,4 56 0 85,6 9,6±0,6 4,5 0, IL4 44 0 5,51 1,3±0,09 0,6 56 0 6,26 1,8±0,06 0,5 0, IL6 44 0,8 115 25±1,96 13 56 0 8,21 11,3±0,52 3,9 0, IL10 44 0 70 22,8±1,85 12,3 56 0 48 10,3±0,6 4,5 0, -TNF 44 0 7,5 3,62±0,22 1,5 56 0 7,78 1,86±0,09 0,7 0, CRP 44 0,1 1,44 1,2±0,18 0,3 56 0,05 11,09 2,6±0,12 0,9 0, Примечание:
- значение клинической нормы продукции цитокинов приводится в табл. Так, выявлена повышенная продукция IL6 и сниженная -TNF у больных РМЖ. Полученные результаты вполне адекватно согласуются с данными других исследователей (Yamamoto et al, 1995;
Carpi, 2009;
Sangaletti et al, 2010), показавших ассоциацию этих изменений с ростом и ангиогенезом опухоли.
В послеоперационный период не выявлено динамики концентрации цитокинов в сыворотке крови у больных РМЖ.
2. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров генов со средними значениями количественных показателей цитокинов (ANOVA) У здоровых индивидов обнаружена ассоциация повышенной концентрации IL-1 c аллелем *Е2 гена IL-1 (р=0,001, рис.1) и ассоциация низких значений IL 1 с аллелем IL1RA*I (р=0,005).
Рис.1. Ассоциация повышенной концентрации IL-1 c аллелем *Е2 гена IL- Выявлено также влияние не только соответствующего гена, но и комплекса генов цитокинов близкой или противоположной функциональной направленности на концентрацию цитокинов в сыворотке крови.
3. Анализ наследования аллелей генов, регулирующих цитокиновый каскад Молекулы гликопротеидов IL-1, IL1RA, IL1RI кодируются генами, локализованными кластерно на хромосоме 2 в локусе q12-14, что позволяет предположить их сцепленное наследование. Изучение сцепления полиморфных локусов в генах семейства интерлейкин-1 в исследованной выборке практически здоровых индивидов выявило неравновесие по сцеплению. Так, между полиморфными вариантами генов имеется IL-1(rs1143634)/IL1RА(VNTR) значительное сцепление (D'=0,99). Коэффициент для генов D' IL- (rs1143634)/IL1RI(rs2287047) составил 0,74. Сила сцепления генов IL1RА (VNTR)/IL1RI(rs2287047) равна 0,46. Итак, полиморфные варианты генов семейства интерлейкин-1, расположенные на одной хромосоме, образуют группу сцепления и совместно передаются потомству, что позволяет проведение гаплотипного анализа для определения типа наследования генов данного семейства. Проанализировано 18 семей, включающих 60 человек.
Генеалогический анализ двух семей выявил наличие кроссинговера, при котором меняется комбинация аллелей, приводящая к возникновению новых гаплотипов.
Семья №2 состоит из 6 человек (3 мужчин и 3 женщины). Анализ семьи № (рис. 2) начат с анализа третьего поколения. Генотип дочери (III.5) пробанда (II.4) гомозиготен по «протективным» сочетаниям аллелей. Один набор сочетаний аллелей (*T/*E1/*I) унаследован от отца, а другой набор сочетаний аллелей *T/*E1/*I - от матери.
У сына (III. 6) пробанда получение однозначного ответа о типе наследования аллелей от родителей, как в случае с дочерью, невозможно. Если предположить, что аллели *С/*E1/*II сцепленно унаследованы от отца, то сочетание аллелей *Т/*E1/*II - от матери. В этом случае, у пробанда (II.4) в профазе мейоза I произошел кроссинговер, и аллели сцепленной группы разобщились и этот кроссоверный участок унаследовал сын. У II.4 возможны 4 варианта сочетания аллелей в гаплотипах:*T/*E1/*I, *C/*E2/*I, *C/*E2/*II*, T/*E1/*II. Последний гаплотип наследуется индивидом III. 6.
Анализ наследования состава гаплотипа, образованного из аллелей генов семейства интерлейкина-1 в 18 семьях у 60 человек позволяет рассчитать расстояние между генами IL-1 и IL1RА, расположенными на 2 хромосоме.
Генетический анализ показывает, что расстояние между ними равняется 3,3 сМ.
Рис. 2. Наследование генов семейства IL-1 в семье № В семье №2, помимо ДНК–типирования, были определены концентрации цитокинов методом ИФА, в котором измерены спонтанная выработка цитокинов, митоген-индуцированная продукция цитокинов клетками цельной крови и в сыворотке после приема иммуномодулятора растительного происхождения «Эхинацея».
Индивид II.3 (63 года) - носитель сочетаний генотипов (Е1Е1//I/II//TC) по полиморфным вариантам генов семейства интерлейкин-1 (IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI (rs2287047). Выявлено повышение концентрации интерлейкина- (IL-1) в сыворотке крови относительно нормы в 3 раза (в норме концентрация не превышает 11 пг/мл, рис.3). В ответ на индукцию митогеном наблюдается прирост цитокина, что говорит о высокой индуцибильности иммунокомпетентных клеток к секреции IL-1. Прием иммуномодулятора не повлиял на концентрацию IL-1 в сыворотке крови.
Рис.3. Уровни спонтанной, митоген индуцированной продукции цитокина IL-1 клетками цельной крови и в сыворотке после приема иммуномодулятора у индивида II.3, в пг/мл Индивид II.4 (62 года). Носитель сочетаний генотипов (Е1Е2//I/II//TC) по изученным полиморфным вариантам генов семейства интерлейкин-1 (IL 1/IL1RA/IL1RI). Отмечается повышенная концентрация IL-1 в сыворотке крови относительно нормы в 7 раз (рис.4). Митоген-индукция показывает, что у индивида II.4 прирост IL-1 не значителен, что может свидетельствовать о напряжении иммунокомпетентных клеток по выработке данного цитокина, который находится практически на пределе своего максимума.
Прием иммуномодулятора повлиял на выработку IL-1, снижая его концентрацию до нормы. Исходя из литературных данных, полисахариды, входящие в состав растений рода Echinacea Moench активируют секреторную активность моноцитов человека, повышая продукцию интерлейкинов IL-1, IL6, IL10, -TNF (Luettig, 1989, Burger, 1997). Исходя из этого, при приеме иммуномодулятора могло произойти изменение баланса IL-1/IL1RA в сторону большей выработки IL-1, вследствие чего интерлейкин-1 получил возможность связаться с клеточным рецептором и запустить цитокиновый каскад.
Рис. 4 Уровни спонтанной, митоген-индуцированной продукции цитокина IL- клетками цельной крови и в сыворотке после приема иммуномодулятора у индивида II.4, в пг/мл Индивид III.5 (33 года) является носителем сочетаний благоприятных генотипов (E1E1//I/I//TT) по изученным полиморфным вариантам генов семейства интерлейкин-1 У индивида (рис. 5) отмечена (IL-1/IL1RA/IL1RI). III. физиологическая концентрация IL-1 в сыворотке крови. Митоген-индукция показала значительный прирост, что позволяет оценить потенциальную способность к секреции данного цитокина как высокую.
Рис.5. Уровни спонтанной, митоген-индуцированной продукции цитокина IL- клетками цельной крови и в сыворотке после приема иммуномодулятора у индивида II.4, в пг/мл Также были проведены генеалогический и генетический анализ наследования аллелей генов микросомальной эпоксидгидролазы-1 и интерлейкина-10, локализованых на 1 хромосоме в бендах 1q42 и 1q31-q соответственно. Анализ сцепления полиморфных локусов в данных генах показал полное сцепление между полиморфными вариантами EPHX1(rs2234922) и IL (rs1800872), где коэффициент D' составил 1, а между EPHX1 (rs1051740) и IL (rs1800872) - D'=0,99. В изученных семьях кроссинговер выявлен не был.
4. Анализ сочетаний генотипов по генам семейства IL-1 и их влияние на концентрацию цитокинов в сыворотке крови Для понимания закономерностей функционирования цитокиновой системы, в качестве контроля были взяты индивиды, являющиеся носителями «протективных» генотипов E1E1//I/I//TT полиморфных вариантов генов семейства интерлейкин–1 (IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI (rs2287047). У данных индивидов цитокины и белок острой фазы-С-реактивный белок (CRP) в сыворотке крови находятся в пределе физиологической нормы (табл. 2) и определяют гармоничное функционирование иммунной системы.
Показано, что при ряде других сочетаний генотипов у здоровых индивидов наблюдается повышение концентраций провоспалительных цитокинов (IL-1, IL6, -TNF) в сыворотке крови в несколько раз. Например, при сочетании генотипов E1E1//I/II//TC, имеющих два «непротективных» аллеля (высокопродуцирующий аллель IL1RA*II рецепторного антагониста интерлейкина-1 и аллель *C в гене рецептора интерлейкина-1, приводящий к изменениям в конформации белка рецептора) выявлены высокие значения провоспалительных цитокинов в крови (IL-1, IL6, -TNF). Значения противовоспалительных цитокинов (IL4, IL10) были значительно ниже.
Таблица Концентрации про- и противовоспалительных цитокинов и белка острой фазы CRP в сыворотке крови у носителей различных сочетаний генотипов, в пг/мл Значения в Показа E1E1//I/I//TТ E1E1//I/II//TC E1E2//I/II//TC тели норме, пг/мл ±m ±m ±m IL-1 0-11 8,71±2,56 5,73 14,58 23, 45,07±6,53 48,82±9, IL1RA 50-1000 443,72±111,42 248,47 479,82±123 275,69 526,52±93,5 IL2 0-10 3,31±1 2,23 6,31±2,1 5,52 2,54±0,7 1, IL4 0-4 1,16±0,43 0,97 1,08±0,2 0,46 1,16±0,23 0, IL6 0-10 1,57±0,47 1,05 286,2 91, 343,27±118 338,13±40, IL10 0-20 5,86±1,8 4,07 7,97±3,13 7 9,3±1,3 -TNF 0-6 0,89±0,21 0,48 2,93 17, 24,8±1,31 29,25±5, CRP 0-5 1,32±0,8 1,84 0,35±0,1 0,24 1,32±0,3 0, У носителей трех «непротективных» аллелей также E1E2//I/II//TC отмечается повышение концентраций провоспалительных цитокинов (IL-1, IL6, -TNF) в сыворотке крови в несколько раз. Носительство одного или нескольких «непротективных» аллелей любого из изученных генов приводит к изменению фоновых концентраций IL-1 и других провоспалительных цитокинов (IL6, TNF).
При анализе сочетаний генотипов трех изученных генов семейства интерлейкин-1 (IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI (rs2287047) в группе онкологических больных выявлен 21 вариант из 27 возможных, а у здоровых индивидов – 13 сочетаний. В группе онкобольных наблюдается достоверное повышение частоты сочетаний генотипов E1E1//II/II//TC (2=3,76, р=0,05). А в группе здоровых индивидов частота сочетания «протективных» генотипов E1E1//I/I//TT достоверна выше (2 =3,43, р=0,06).
5. Продукция цитокинов у практически здоровых людей на фоне стимуляции клеток крови митогеном ex vivo и после приема иммуномодулятора Исследование способности лимфоцитов к продукции цитокинов при митоген-индукции клеток цельной крови ex vivo выявило схожую реакцию повышения концентрации IL-1 у всех обследованных лиц вне зависимости от генетической конституции (среднее значение –116,74±7,15 пг/мл). Это доказывает, что у обследуемых индивидов имеется достаточно высокий потенциал возможности реагирования на воздействие ксенобиотиков и является положительной характеристикой функционирования иммунной системы, тогда как, снижение продукции цитокинов при индукции митогеном ex vivo служит одним из признаков иммунодефицитного состояния (Тотолян, 2000).
Показано, также что носители следующих сочетаний генотипов E1E1//I/I//TT, E1E1//I/II/TT, E1E1//I/II/CC, E1E2//I/II/TC семейства интерлейкин– (IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI (rs2287047)) более отзывчивы на действие эндогенного иммуномодулятора, чем индивиды с сочетаниями генотипов E1E1//I/I//TС, E1E1//I/II/TС.
6. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов цитокиновой системы у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией При сравнении здоровых индивидов без отягощенного онкологического анамнеза и больными мы не акцентировали внимание на видах рака, его стадии и локализации, так как рассматривали группу лиц с онкопатологией как вариант срыва адаптационного механизма. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу rs1143634 в гене IL-1 выявил достоверное повышение частоты гомозиготного генотипа Е2Е2 (р=0,05, =3,81) и аллеля *Е2 (р=0,006, =7,65) в группе онкобольных.
При типировании по минисателлиту в гене рецепторного анатагониста интерлейкина–1 (IL1RА), у онкологических больных достоверно чаще встречается генотип IL-1RA *II/*II с частотой 24,39% (р=0,0005, =36,24) и аллель IL-1RA*II с частотой 51,83% (р=0,0005, =22, 36). Согласно литературным данным, по аллелю IL1RА*II отмечается увеличение продукции IL1RА in vitro и in vivo (Hurme, 1998, Daly, 2002) и кроме этого, наличие аллеля IL1RА*II ассоциируют с повышением продукции IL-1 in vitro (Santtila, 1998). Некоторые авторы рассматривают носительство аллеля IL1RА*II как генетическую детерминанту в развитии онкологических заболеваний, в частности, рака шейки матки (Mustea, Sehouli et al, 2003), рака яичников (Sehouli, Mustea, 2003) и рака молочной железы (Grimm, 2009).
Также выявлены статистически значимые различия между группой здоровых индивидов и онкобольными по полиморфному локусу rs1800796 в промоторной области гена интерлейкина-6 (IL6). Генотип GC встречается достоверно чаще в группе онкобольных (р=0,0005, =30,25). Исходя из литературных данных, носители аллеля *С гена IL6 обладают более высокой продукцией провоспалительного интерлейкина-6 (Brull et.al., 2001). В свою очередь, IL-6, являясь мощным ростовым и дифференцировочным фактором В клеток (Snick, 1990), обладает также и ангиогенным действиеми, играет важную роль не только в росте опухолевых клеток при различных онкопатологиях (Kawano et al., 1988;
Yoshizaki, 1989;
Hoosein, 1995;
Drachenberg, 1999;
Capri et al., 2009), но и усиливает метастазирование опухолевых клеток (Lu, 1997;
Телетаева, 2007;
Бережная, 2009).
7. Анализ межгенных взаимодействий Анализ ассоциации отдельных полиморфных вариантов генов, вовлеченных в контроль многофакторных заболеваний, не дает достаточно полного представления о механизмах формировании наследственной предрасположенности. Поэтому было проведено моделирование ген-генных взаимодействий для трех полиморфных локусов в генах семейства IL-1 (IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI (rs2287047) с помощью непараметрической программы GMDR. Обнаружены статистически значимые двух- и трехлокусные модели (рис. 6). В двухлокусной модели (IL- (rs1143634), IL1Ra (VNTR)) в группе онкобольных достоверно чаще встречаются следующие сочетания генотипов: E1E1/II II (2=10,68, р=0,0019);
E1E2/II II (2=6,72, р=0,01);
E2E2/I II (2=6,82, р=0,0098). В трехлокусной модели (IL- (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI (rs2287047)) в группе онкобольных выявлено достоверное повышение частоты сочетания генотипов E1E1//II/II//TC (2=6,84, р=0,0097).
Рис. 6. Комбинации генотипов полиморфных локусов генов (IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI (rs2287047), 1-й столбик в квадрате – онкобольные, 2-й столбик –группа здоровых индивидов.
Полученные данные свидетельствуют о важной роли генов цитокинового каскада, в частности генов семейства интерлейкин–1, так как именно интерлейкин- является ключевым цитокином как в регуляции воспалительного процесса, так и при пролиферации и апоптозе (Фрейдлин, 1999;
Тотолян, 2000).
8. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией Исследование полиморфных локусов rs1800566 и rs1131341 в гене NAD(P)H-хиноноксидоредуктазы (NQO1) в выборке онкобольных и контроле показало статистически значимые различия в распределении частот генотипов и аллелей. У здоровых индивидов отмечена повышенная частота гомозиготного генотипа СС (rs1131341, р=0,001, =12,98), тогда как гомозиготный генотип, несущий «непротективные» аллели ТТ (р=0,001, =12,23) встречался достоверно чаще в группе онкобольных. Кроме того, у онкобольных, в сравнении с контролем, отмечено повышение частоты «непротективного» аллеля *Т (р=0,001, =12,23).
Согласно данным литературы, NQO1 кодирует фермент, метаболизирующий многие ксенобиотики, а также предотвращает образование свободных радикалов, защищая клетку от окислительного стресса (Perou, 2000;
Pineda-Molina, 2001).
Носительство аллеля NQO1*Т (rs1800566) характеризуется практически полным отсутствием ферментативной активности, а аллеля NQO1*Т (rs1131341) снижением активности фермента на 25 % (Moran, 1999). В результате снижения ферментативной активности происходит накопление метаболитов, проявляющих себя в качестве аутоантигенов.
Исходя из этого, нами проанализированы сочетания аллелей генов семейства интерлейкин-1 (IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI (rs2287047)) в группе больных РМЖ, являющихся носителями «непротективных» генотипов по полиморфным вариантам (rs1800566;
rs1131341) гена NQO1 (рис. 7).
Рис. 7. Распределение частот генотипов по локусам IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI (rs2287047) у носителей «непротективных» аллелей гена NQO1, в % Таким образом, выявлено, что у онкобольных в генотипе сочетаются «непротективные» аллели не только в гене NQO1, но и в изученных генах семейства интерлейкин-1.
9. Анализ сочетаний генотипов полиморфных локусов в генах семейства интерлейкин-1 и TP В лаборатории молекулярно-генетических исследований кафедры генетики БГПУ им. М.Акмуллы были изучены три полиморфных варианта (rs1042522, rs1625895, Ins16bp) в гене-онкосупрессоре ТР53 и было показано, что у онкобольных достоверно чаще, чем у здоровых, встречаются «рисковые» аллели гена ТР53, что согласуется с литературными данными (Kinzler, 1996;
Weinberg, 1996;
Денисов, 2008, 2009;
Галикеева и соавт., 2009).
В популяциях активность белка р53 в значительной степени модифицирована генетическим полиморфизмом. Наиболее значимыми и хорошо изученными являются три полиморфных варианта (rs1042522, rs1625895, Ins16bp) гена ТР53:
точечная замена гуанина на цитозин в 72-м кодоне 4-го экзона (rs1042522, Arg72Pro), в зависимости от того, какой аминокислотный остаток находится в положении 72 полипептидной цепи белка р53, меняется способность р53 запускать апоптоз (Thomas et al., 1999). Белок р53 с остатком Arg в положении 72 более эффективно вызывает индукцию апоптоза, чем белок, содержащий остаток Pro (Dumont et al., 2003;
Bourdon, 2005);
полиморфный локус в 6-м интроне (rs1625895) и инсерция/делеция 16 п.н. в 3-м интроне изменяют «дозу» гена, таким образом, влияя на активность белка р53 (Whibley et al., 2009).
Исходя из этого, мы проанализировали характер распределения частот генотипов трех изученных генов семейства интерлейкин-1 (IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI (rs2287047)) в группе больных РМЖ, являющихся носителями генотипа Pro/Pro гена ТР53 (rs1042522, Arg72Pro). Было обнаружено сочетаний из 27 возможных (рис. 8). На долю сочетания генотипов E1E2//I/II//TC приходилось 25%, сочетания генотипов E1E1//II/II//TC, и E1E1//I/II//TC, E1E2//I/I//TC встречались с частотой 16,6% каждый и с частотой по 9% - сочетания E1E1//I/II//CC, E1E1//II/II//TT и E2E2//II/II//TC.
Рис. 8. Распределение частот сочетаний генотипов IL-1/IL1RA/IL1RI у носителей генотипа Pro/Pro по гену ТР53 у онкобольных, в % 10. Анализ ассоциаций гаплотипов Из группы онкобольных были выделены индивиды, которые являются носителями «рисковых» аллелей по полиморфным локусам (*Pro (rs1042522), *m (rs1625895), *196 (Ins 16bp) гена ТР53 (n=164). В группу сравнения вошли здоровые индивиды без онкологического анамнеза, являющиеся носителями нормальных аллелей (*Arg (rs1042522), *w (rs1625895), *180 (Ins 16bp)) по гену ТР53 (n=180). Группа контроля формировалась, таким образом, не случайно, так как доказано, что «рисковые» аллели гена ТР53 обнаруживаются с частотой от до 86% при различных онкопатологиях (Olivier, Hainaut, 2001;
Dimitrakakis et al., 2002;
Feki, Irminger-Finger, 2004;
Olivier, 2004;
Petitjean et al., 2007;
Brosh, Rotter, 2009;
Денисов, 2009).
Анализ распределения частот гаплотипов по аллелям генов IL-1, IL1RA, IL1RI (рис. 9) в группе практически здоровых индивидов и онкобольных выявил гаплотипа (р=0,004, 2=8,71), достоверное повышение частоты несущего «благоприятные» сочетания аллелей у практически здоровых *E1/*I/*T индивидов. Гаплотип *E2/*I/*T, в состав которого входит один аллель с измененной функцией (IL-1*E2), который ассоциирован с высокой выработкой интерлейкина-1, в группе онкобольных встречается достоверно чаще, чем у здоровых индивидов (р=0,02, 2=4,73). У онкобольных – гаплотип, несущий три «непротективных» аллеля *E2/*II/*C встречается достоверно чаще (р=0,0034, 2=9,14) чем у здоровых индивидов. В наших исследованиях выявлено, что у лиц с данным сочетанием аллелей отмечаются наиболее высокие показатели продукции интерлейкина-1 и антагониста в сыворотке крови. Согласно Hurme M. et al., (1998), подобное соотношение цитокинов может проявлять себя в качестве фактора дифференцировки клеток.
Рис. 9. Сравнительный анализ распределение частот гаплотипов на основе анализа локусов IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI (rs2287047) в группах онкобольных и здоровых индивидов, в %.
Гены микросомальной эпоксидгидролазы-1 (EPHX1) и интерлейкина- (IL10) локализованы на 1 хромосоме (1q42 и 1q31-q32 соответственно) и наследуются сцеплено. Анализ распределения частот гаплотипов по маркерам (rs1051740 и rs2234922) в гене EPHX1 и (rs1800872) в гене IL10 в группе онкобольных и здоровых индивидов не выявил статистически значимых различий.
Гаплотип EPHX1*А/EPHX1*Т/IL10*С, несущий все «протективные» аллели с одинаковой частотой встречается в изученных группах. Для оценки роли данного гаплотипа при онкопатологии отобрали больных только гомозиготных носителей по данному гаплотипу. У данных индивидов были проанализированы данные ДНК-типирования по другим изученным полиморфным локусам (системы биотрансформации ксенобиотиков, генов цитокинового каскада). Нами было установлено, что онкобольные являются носителями от 6 до 10 непротективных аллелей в изученных полиморфных локусах (*G - rs1048943;
*Т - rs1800566, rs1131341;
*Е2 - rs1143634;
*II -VNTR (IL1RА);
*С - rs2287047;
*В2 - VNTR (IL4);
*А - rs1800629;
*m - rs1042522;
*Pro - rs1625895)). У всех онкобольных отмечено наличие «непротективных» аллелей сразу в двух полиморфных локусах гена NQO1.
Полученные результаты позволяют говорить о том, что в ряде случаев, иммунологические механизмы в качестве посредников включены в патогенетическую связь между наследственной предрасположенностью к злокачественным новообразованиям и их клинической манифестацией, происходящих вследствие нарушения межклеточных взаимосвязей, регулируемых цитокинами. Показано, что патофизиологическую роль в возникновении и метастазировании опухоли играет высокая продукция рецепторного антагониста интерлейкина–1, и, несомненно, сам рецептор, при мутации в гене которого изменяется конформация рецепторного домена и вследствие чего происходит нарушение сигнальной трансдукции интерлейкина–1, что в итоге приводит к нарушению функционирования цитокиновой регуляторной сети. Эти изменения, в тандеме с носительством «рисковых» аллелей в гене ТР53 и NQO1 могут еще больше усугубить течение заболевания.
ВЫВОДЫ Установлено, что у больных РМЖ в до- и послеоперационном периоде 1.
достоверно понижено содержание противовоспалительного цитокина IL (p0,0001), достоверно повышен уровень IL1RA (р=0,01) и IL6 (p0,0001) в сыворотке крови.
Обнаружено полное сцепление между генами и 2. IL-1 IL1RI, расположенными на длинном плече второй хромосомы. Сцепление межу генами IL1RA и IL-1 нарушается кроссинговером и генетическое расстояние между ними составляет 3,3сМ.
На основании сравнительного анализа спонтанной продукции цитокинов в 3.
сыворотке крови показано, что нормальный цитокиновый профиль наблюдается только у гомозигот E1E1//I/I//TT по аллелям генов семейства интерлейкина 1: IL- (rs1143634), IL1Ra (VNTR 2 интрона), IL1RI (rs2287047).
Установлена высокая иммуномодулирующая эффективность препарата 4.
«Эхинацея» для носителей следующих сочетаний аллелей генов семейства интерлейкин–1 (IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI(rs2287047))-E1E1//I/I//TT, E1E1//I/II/TT, E1E1//I/II/CC, E1E2//I/II/TC.
Выявлено две модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов 5.
генов семейства интерлейкина-1: двухлокусная (IL-1 (rs1143634)/IL1Ra (VNTR) E1E1/II II (р=0,0019), E1E2/II II (р=0,01), E2E2/I II (р=0,0098) и трехлокусная (IL-1 (rs1143634)/IL1Ra(VNTR)/IL1RI(rs2287047) – E1E1//II/II//TC (р=0,0097).
Установлено, что у онкобольных сочетаются в генотипе от 6 до 10 (*G 6.
rs1048943;
*Т - rs1800566, rs1131341;
*Е2 - rs1143634;
*II -VNTR (IL1RА);
*С rs2287047;
*В2 - VNTR (IL4);
*А - rs1800629;
*m - rs1042522;
*Pro - rs1625895)) «непротективных» аллелей в генах цитокинового каскада и биотрансформации ксенобиотиков, в том числе, у всех онкобольных встречаются «непротективные» аллели сразу по двум полиморфным локусам в гене NQO1.
Выявлено, что гомозиготные генотипы по «протективным» аллелям 7.
-*E1/*I/*T генов семейства интерлейкин-1: IL-1 (rs1143634), IL1Ra (VNTR), IL1RI (rs2287047) встречаются только у здоровых индивидов с «протективными» аллелями (*Arg (rs1042522), *w (rs1625895), *180 (Ins 16bp)) в гене ТР53.
Сочетание «непротективных» аллелей (*E2/*II/*C) в генах семейства интерлейкина-1 достоверно чаще (р=0,0034) встречаются у онкологических больных.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Анализ пяти полиморфных локусов трех генов системы биотрансформации ксенобиотиков (СУР2Е1, EPHX1, NQO1) в республике Башкортостан // Вестник ОГУ. Т. 3. 2009. С. 429-431.
2. Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Каюмова Л.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Анализ полиморфных вариантов генов биотрансформации ксенобиотиков GSTM1и ТР53 у больных раком молочной железы // Вестник ОГУ.
Т.4. 2009. С.659-661.
3. Васильева Э.М., Гумерова Г.Р., Галикеева Г.Ф., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Генетический мониторинг населения: изучение полиморфных вариантов генов цитохромоксидазной системы и цитокинового комплекса // Аграрная Россия. 2009. Специальный выпуск. С-118.
4. Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Исследование полиморфных вариантов генов цитохромоксидазной системы и генов цитокинового комплекса в Республике Башкортостан // Материалы съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200 летию со дня рождения Чарльза Дарвина (V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров). Т. 2. Москва: 2009. С. 151.
5. Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Гумерова Г.Р., Каюмова Л.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Исследование распределения частот генотипов и аллелей гена-супрессора опухолевого роста ТР53 в Республике Башкортостан // Материалы съезда генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров). Т. 2. Москва: 2009. С. 156.
6. Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Тимкова А.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Исследование распределения частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов гена – онкосупрессора ТР53 // Материалы Международной научно практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов». 2009. с. 61-63.
7. Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю.
Исследование полиморфных вариантов генов, участвующих в инактивации ксенобиотиков // Труды Всероссийской конференции, посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им.М.Акмуллы, приуроченной к ежегодным Вавиловским чтениям «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем». 2009. с. 159-165.
8. Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Каюмова Л.Р., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Изучение генетических маркеров устойчивости к генотоксическим эффектам среды обитания человека // Современный педагогический университет как центр интеграции науки и образования.
Материалы внутривузовской научно-практической конференции, проводимой в рамках Дней науки БГПУ им.М.Акмуллы.2009. С.25-28.
9. Васильева Э.М., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Молекулярно-генетическое изучение маркеров чувствительности организма человека к генотоксическим факторам среды // Материалы Международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов». Уфа. 2009. с. 49-52.
10. Галикеева Г. Ф., Васильева Э.М., Николаев И.В., Кильдиярова И.Ф., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Анализ полиморфных вариантов гена ТР53 в группах лиц, проживающих в условиях с различной экологической нагрузкой // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования». Уфа. 2010.
С. 157- 11. Vasilyeva E. M., Vorobjeva E. V., Gorbunova V. Y. Мolecular genetics study of polymorphic variations in genes within the cascade of reactions detoxifcation of xenobiotics with aromatic structure // European Conference of Human Genetics, Sweden,. 2010. Abst. P.01.11.P. 45.
12. Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю.
Молекулярно-генетическое исследование генов антиоксидантной защиты при онкопатологии // Материалы 14 Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино. 2010. С. 124.
13. Васильева Э.М., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Изучение полиморфных локусов в генах системы биотрансформации ксенобиотиков // Медицинская генетика 2010, Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. С.33.
14. Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Воробьева Е.В., Имельбаева Э.А., Батретдинова Р.Т., Горбунова В.Ю. Исследование корреляционной зависимости между продукцией цитокинов и генами цитокинового каскада у здоровых индивидов // Материалы II Всероссийской школы-конференции молодых ученых «Биомика – наука XXI века». Уфа. 2011. С.23-24.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ РМЖ рак молочной железы интерлейкин- IL цитохром Р-450 1А1 интерлейкин- CYP1A1 IL цитохром Р-450 2Е1 интерлейкин- CYP2Е1 IL C-реактивный белок CRP NQO1 NAD(P)H-хиноноксидоредуктаза- микросомальная варьирующее число тандемных EPHX1 VNTR эпоксидгидролаза-1 повторов интерлейкин-1 бета -TNF фактор некроза опухолей альфа IL- антагонист рецептора критерий значимости различий IL1RA интерлейкина-1 популяций по распределениям рецептор интерлейкина-1 первого частот генотипов IL1RI типа вероятность р интерлейкин-2 коэффициент корреляции IL2 r