Влияние условий культивирования in vitro на морфогенные процессы и активность ферментов антиоксидантной системы в растениях люпина узколистного
На правах рукописи
БАЛАКИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА Влияние условий культивирования in vitro на морфогенные процессы и активность ферментов антиоксидантной системы в растениях люпина узколистного Специальности: 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.05 – Физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва — 2012 1
Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем химической физики РАН Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Калашникова Елена Анатольевна кандидат биологических наук Терентьев Алексей Алексеевич
Официальные оппоненты:
Загоскина Наталья Викторовна, доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, руководитель группы фенольного метаболизма растений Муратова Светлана Александровна, кандидат биологических наук, ФГБОУ ВПО Мичуринский государственный, аграрный университет, заведующая лабораторией биотехнологии
Ведущая организация: Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН
Защита состоится «25» апреля 2012 года в 14.30 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 49;
тел./факс. (499) 976-24-
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева
Автореферат разослан « 23 » марта 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Л.С. Большакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Растительный белок является важным источником незаменимых аминокислот для питания человека и животных. Одной из задач селекции сельскохозяйственных растений является получение новых сортов с высокой продуктивностью и содержанием белка, а также сбалансированным аминокислотным составом. В качестве основного источника растительного белка в мировом сельском хозяйстве используется соя (Glycine max L.) благодаря сравнительно высокой урожайности и содержанию белка (до 50%) во многом аналогичного животному. Однако широкому распространению этой культуры на территории Российской Федерации препятствуют ее некоторые недостатки: теплолюбивость, требовательность к условиям возделывания, низкая устойчивость к болезням и вредителям. Заменой сое в нашей стране может стать люпин узколистный (Lupinus angustifolius L.), содержащий в семенах до 50% белка и до 12% масла. Эта культура менее требовательна к плодородию почв и климатическим условиям, за что получила название «северная соя». Другим преимуществом люпина является более низкое по сравнению с другими зернобобовыми (в 10 раз меньше, чем у гороха, и в раз меньше, чем у сои) содержание ингибиторов трипсина.
Селекционная работа направлена на получение скороспелых, низкоалкалоидных, высокоурожайных сортов люпина со сбалансированным аминокислотным составом, устойчивых к болезням и вредителям, а также пригодных к технологическим операциям. Селекционный процесс является длительным, поскольку наследование ряда сельскохозяйственно-ценных признаков носит полигенный характер. Одним из путей ускорения селекционного процесса является сочетание методов классической селекции с биотехнологией.
Современная биотехнология позволяет создавать новые формы растений за короткий промежуток времени с помощью методов клеточной и генной инженерии. Однако разные сорта люпина узколистного в значительной степени отличаются регенерационным потенциалом, что вызывает необходимость дифференцированного подхода к применению и совершенствованию технологий клонального микроразмножения. Кроме того, как и все бобовые культуры, люпин характеризуется низким уровнем тотипотентности клеток, что затрудняет проведение работ в области клеточной инженерии и трансформации.
Одной из основных проблем при получении регенерантов люпина является высокая восприимчивость растений к условиям культивирования, а также экзогенным фитогормонам. В процессе клонального микроразмножения часто происходит формирование растений с нарушенной морфологией, анатомией и физиологией. Одной из причин подобных изменений является окислительный стресс, происходящий при нарушении равновесия между образованием активных форм кислорода (АФК) в клетках и их разрушением под действием антиоксидантной системы (АОС) (Cutler et al., 1991;
Roubelakis Angelakis, 1993;
Papadakis et al., 2001).
На сегодняшний день относительно мало известно о влиянии регуляторов роста на изменение уровня АФК в клетках растений в условиях in vitro и воздействии АФК на процессы дифференцировки и морфогенеза. Таким образом, является актуальным исследование взаимосвязи активности ферментов антиоксидантной системы с морфогенезом растений и условиями их культивирования in vitro.
К настоящему моменту существует ряд работ по получению регенерации люпина узколистного, однако исследования активности ферментов антиоксидантной системы и их связи с процессами морфогенеза в культуре in vitro не были проведены.
Цель работы заключалась в изучении влияния условий культивирования in vitro на морфогенетические процессы и активность ферментов антиоксидантной системы в растениях люпина узколистного на разных этапах клонального микроразмножения.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Выявить оптимальные условия получения стерильной культуры различных сортов люпина узколистного.
2. Провести анализ влияния культуральных сред различного гормонального состава на морфогенетические процессы люпина узколистного in vitro.
3. Исследовать влияние условий культивирования на ризогенез микропобегов люпина узколистного in vitro.
4. Изучить активности ферментов антиоксидантной системы на различных этапах культивирования люпина узколистного in vitro.
Научная новизна и значимость. Проведен сравнительный анализ эффективности регенерации люпина узколистного сортов Ладный, Деко, Куршавель, Миртан из различных типов первичного экспланта.
Усовершенствована методика клонального микроразмножения, включающая изолирование пазушных почек с 3-7-ми суточных проростков и добавление в состав питательной среды ИМК в концентрации 4,5 мкМ, обеспечивающая получение до 10 тыс. мериклонов с одного первичного экспланта за 6 циклов культивирования. Показана возможность индукции ризогенеза у микропобегов люпина узколистного после 6 пассажей культивирования на гормональной питательной среде. Выявлено изменение активности ферментов антиоксидантной системы в зависимости от состава культуральной среды.
Обнаружены различия в изоферментном составе супероксиддисмутазы в зависимости от этапа культивирования и сорта растений.
Практическая ценность исследований. Полученные результаты расширяют представления о взаимосвязи активности ферментов антиоксидантной системы и морфогенетических процессов в культуре in vitro.
Разработанные подходы к методике клонального микроразмножения могут быть использованы для проведения агробактериальной трансформации и последующего получения трансгенных растений люпина узколистного, а также для быстрого размножения ценных генотипов этой культуры.
Данные методы исследований могут быть применены для решения разнообразных задач в области биотехнологии, биохимии и физиологии растений.
Полученные результаты могут быть использованы в теоретической части курса дисциплины «Сельскохозяйственная биотехнология».
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на: 2-й Международной школе-конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях" (Звенигород, 2011);
VII Mezinarodni vedecko-prakticka konference «Vedecky prumysl evropskeho kontinentu – 2011» (Прага, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, включенных в перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендуемых ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Объем работы составляет 140 страниц. В диссертации содержится 30 рисунков и 3 таблицы. Список использованной литературы содержит 152 источника, в том числе 135 работ иностранных авторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служили сорта и образцы люпина узколистного:
Ладный (РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, НПО «Подмосковье»);
Деко (образец НПО «Подмосковье»);
Куршавель (БелНИИЗБК);
Миртан (БелНИИЗБК). Материал предоставлен кафедрой селекции и семеноводства полевых культур РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
Культивирование микрорастений люпина in vitro проводили согласно методикам кафедры генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А.
Тимирязева. Семена люпина промывали проточной водой и протравливали препаратом Максим в течение 10 суток. Затем семена стерилизовали 50%-м раствором коммерческого отбеливателя «Белизна» с добавлением 0,01 % Tween 20 в течение 15 минут с последующей 3–4-х кратной отмывкой их стерильной дистиллированной водой. Стерильные семена помещали на агаризованную питательную среду, содержащую половинную концентрацию микро- и макросолей по прописи Мурасиге-Скуга (МС) (Murashige and Skoog, 1962), половинную концентрацию витаминов по прописи Гамборга (В5) (Gamborg et al., 1968), 29,2 мМ сахарозы, 0,8% агара (Bacto-Agar) и проращивали в термостате при температуре 20С (Hanafy et. al, 2005). Полученные проростки разделяли на первичные экспланты: пазушные почки с семядолей и сегментом зародышевой оси;
верхушечные почки.
На этапе размножения и укоренения питательные среды содержали минеральные соли по прописи МС и витамины по прописи В5. В качестве регуляторов роста использовали 6-бензиламинопурин (6-БАП), кинетин (КИН), индолилмасляную кислоту (ИМК), индолил-3-уксусную кислоту (ИУК), -нафтилуксусную кислоту (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4 Д), а также препараты Дропп и Цитодеф в различных концентрациях и комбинациях.
Среды для индукции морфогенеза и микроразмножения содержали сахарозу в концентрации 87,64 мМ, а для укоренения – 58,43 мМ. Питательные среды доводили до рН 5,7 и автоклавировали в течение 20 минут при температуре 120С. Первичные экспланты и микропобеги культивировали при интенсивности света 5000 люкс, 16-часовом фотопериоде и температуре 24±1С. Продолжительность пассажа составляла 14 суток. Укоренившиеся микрорастения переносили в горшки со смесью торфа и песка в соотношении 1:1.
Выделение белка из тканей растений проводили в лизирующем буфере, содержавшем 0,15 М К-фосфатный буфер (PB) рН 7,8 и 1 мМ ЭДТА. Лизат центрифугировали в течение 20 мин при 15000 g и 4°С. Супернатант собирали и замораживали в жидком азоте. Образцы хранили на -20°С в течение месяца.
Анализ количества белка в пробе проводили методом Lowry (Lowry et al., 1951).
Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли путем измерения ингибирования фотохимического восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) с использованием модифицированного метода Beaushamp & Fridovich (Beaushamp, Fridovich, 1971). Поглощение образовавшегося формазана измеряли при 560 нм. За одну единицу активности супероксиддисмутазы (Ед) принимали количество фермента, необходимое для 50% ингибирования фотовосстановления НСТ.
Активность каталазы (КАТ) определяли согласно методике Aebi & Lester по снижению поглощения перекиси водорода при 240 нм (Aebi, Lester, 1984). Активность фермента рассчитывали с использованием коэффициента экстинции перекиси водорода (40 М-1 ·см-1) и выражали как мМ Н2О2 /мин·мг белка.
Активность аскорбатпероксидазы (АПО) определяли модифицированным методом Nakano & Asada по снижению поглощения аскорбата (АК) при 290 нм (Nakano, Asada, 1981). Активность фермента рассчитывали с использованием коэффициента экстинции восстановленного аскорбата (2.8 мМ-1 ·см-1) и выражали как мкМ АК/мин·мг белка.
Разделение изоформ супероксиддисмутазы и каталазы проводили методом нативного электрофореза в 12% и 8% полиакриламидных гелях соответственно. Электродный буфер (рН 8.8) содержал 50 мМ Трис-HCl, мМ глицина и 1.8 мМ ЭДТА. В каждую лунку наносили 100 или 50 мкг белка для идентификации СОД и 20 мкг белка для КАТ. Электрофорез проводили при температуре 4°С и 200 V в течение 2 ч.
Визуализацию изоферментов супероксиддисмутазы проводили модифицированным методом Beaushamp & Fridovich с использованием НСТ (Beaushamp, Fridovich, 1971). После электрофореза гели промывали 10 мин мМ РВ (рН 7,8) с добавлением 1 мМ ЭДТА, а затем выдерживали 45 мин в темноте в окрашивающем растворе, содержащем 50 мМ РВ (рН 7,8), 0,25 мМ НСТ, 28 мкМ рибофлавина, 0,2% TEMED. Затем гели промывали дистиллированной водой и освещали люминесцентной лампой в 50 мМ РВ при температуре 20–25°С до проявления полос СОД. Идентификацию изоформ проводили путем обработки гелей 5 мМ перекисью водорода в течение 30 мин (ингибирование Cu,Zn-СОД и Fe-СОД).
Визуализацию изоформ каталазы проводили модифицированным методом Chandlee & Scandalios (1983). После электрофореза гели промывали дистиллированной водой в течение 45 мин, а затем 10 мин обрабатывали 0,01 % раствором перекиси водорода. Окрашивание гелей проводили в течение 10 мин в растворе, содержащем 1 % FeCl3 и 1 % K3Fe(CN)6 (Chandlee, Scandalios, 1983).
Статистическая обработка данных. Опыты проводили в пятикратной повторности. Результаты трех независимых экспериментов представлены в виде x ± t 05 S x, где x – среднее значение, S x – ошибка средней, t05 – значение критерия Стьюдента.
Коэффициент размножения рассчитывали по формуле: K=M2/M1, где М2 – среднее геометрическое образовавшихся мериклонов за 6 пассажей, М1 – среднее геометрическое исходных мериклонов за 6 пассажей.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение культуры in vitro люпина узколистного Существует несколько методов получения регенерантов люпина узколистного в культуре in vitro, например, активация развития уже существующих меристем, индукция соматического эмбриогенеза или дифференциации адвентивных почек в каллусной ткани. В настоящее время наиболее эффективным как для клонального микроразмножения, так и для трансформации является индукция развития верхушечных и пазушных почек люпина.
Для проведения экспериментов использовали культуральную среду, состав которой был установлен на основе литературных данных (Pniewski, Kapusta, 2005). В работе использовали пять типов первичных эксплантов: 1) верхушечные меристемы;
2) пазушные меристемы;
3) пазушные меристемы с сегментом зародышевой оси и семядолей;
4) пазушные почки с сегментом зародышевой оси и семядолей;
5) верхушечные почки. Развитие побегов индуцировали добавлением в питательную среду кинетина в концентрации 1, мкМ. Присутствие аскорбата в концентрации 142 мкМ позволяло избежать выделения фенольных соединений тканями экспланта и ускорить процесс развития почек.
Исследования показали, что использование в качестве эксплантов пазушных почек с семядолей и фрагментом зародышевой оси приводило к повышению эффективности регенерации до 86,7–93,3%. При этом из одной почки формировалось по 2–4 побега. Существенных различий по регенерационной способности между исследуемыми генотипами при использовании данного типа экспланта не наблюдали. Поэтому в последующих экспериментах в качестве первичного экспланта использовали пазушные почки с сегментом зародышевой оси и семядолей.
В связи с низким коэффициентом размножения было необходимо оптимизировать состав культуральной среды. Поэтому было протестировано группы питательных сред, различающихся по составу и концентрациям регуляторов роста (от 0,45 до 6,75 мкМ). В первую группу входили среды, содержащие цитокинин (6-БАП или КИН) и ауксин (ИУК или НУК) в сочетании. В состав питательных сред второй группы были введены только цитокинины, а третья группа не содержала регуляторы роста.
В результате проведенных исследований установлено, что в присутствие в составе среды цитокинина и ауксина приводило к активному образованию каллусной ткани на первичном экспланте, а также к формированию витрифицированных хлоротичных побегов. Для получения первичной регенерации из пазушных почек люпина узколистного наиболее оптимальной была питательная среда с добавлением 2,25 мкМ 6-БАП или 1,13 мкМ КИН в качестве регуляторов роста. На средах без регуляторов роста наблюдали формирование только одного побега (Рис. 1).
Рисунок 1. Влияние регуляторов роста растений на количество побегов, образующихся на экспланте 2. Клональное микроразмножение люпина узколистного Получение новых сортов люпина узколистного с использованием методов современной биотехнологии невозможно без подбора оптимальных условий клонального микроразмножения с целью достижения максимального коэффициента размножения. Применение высоких концентраций регуляторов роста цитокининового типа действия, как правило, приводит к появлению ряда нежелательных эффектов, таких как снижение регенерационной способности, витрификация, карликовость и потеря способности к корневому органогенезу (Nadolska-Orczyk, 1992;
Pniewski et al., 2002). Таким образом, является актуальным поиск оптимальных условий культивирования люпина узколистного на разных этапах клонального микроразмножения.
Поэтому дальнейшие исследования были направлены на изучение влияния различных регуляторов роста цитокининового типа действия на эффективность клонального микроразмножения. Для этого микропобеги, полученные из пазушных почек 3-х суточных проростков люпина, культивировали в течение 28 суток (2 пассажа) в присутствии 2,25 мкМ 6-БАП, КИН, Дропп или Цитодеф.
Анализ полученных результатов показал, что реакция изолированных эксплантов на добавление в культуральную среду регуляторов роста различалась и зависела от сортовых особенностей люпина (Рис.2).
Рисунок 2. Влияние регуляторов роста цитокининового типа действия на побегообразование люпина узколистного Данные, представленные на рис. 2 свидетельствуют о том, что присутствие в культуральной среде 6-БАП индуцирует образование наибольшего количества побегов (до 7 шт.) за один пассаж у всех исследованных генотипов люпина. Однако все протестированные регуляторы роста вызывали ряд необратимых изменений, проявляющихся в морфологии (укороченные междоузлия) и физиологии (витрификация и хлороз) микрорастений, что не позволяет их использовать при культивировании в течение 2 и более пассажей.
Поэтому, для уменьшения негативного эффекта регуляторов роста цитокининового типа и сохранения способности к ризогенезу нами был предложено введение в состав культуральной среды для микроразмножения препаратов ауксинового типа действия (НУК, ИУК, ИМК).
Проведенные предварительные исследования показали, что использование НУК или ИУК в концентрации от 0,57 до 4,5 мкМ в сочетании с 6-БАП индуцирует образование каллусной ткани в базальной части побегов, а также развитие витрифицированных карликовых побегов. При этом следует отметить, что количество мериклонов увеличивалось и достигало в среднем 12– 20 шт. на эксплант. Другой эффект наблюдали в присутствии ИМК в концентрации 4.5 мкМ: количество образовавшихся микропобегов снижалось, однако в этом варианте все побеги формировались с правильной морфологией.
Было также выявлено, что для получения микропобегов с нормальной морфологией максимальные концентрации составляют 1,13 мкМ для КИН и 2,25 мкМ для 6-БАП. Следует заметить, что увеличение концентрации 6-БАП в питательной среде более 2,25 мкМ стимулировало развитие 9–15 микропобегов на экспланте, однако данный вариант оказался неэффективным, поскольку регенеранты были витрифицированы и при дальнейшем культивировании погибали.
Данные, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о том, что наибольшее количество микропобегов с одного экспланта было получено в присутствии 2,25 мкМ 6-БАП. Добавление в состав культуральной среды, содержащей 6-БАП, ИМК существенно снижало выход мериклонов, однако их количество было выше, чем при использовании КИН в качестве регулятора роста. Следует отметить, что этот эффект наблюдали у всех исследованных генотипов.
Рисунок 3. Эффективность микроразмножения различных сортов люпина узколистного на культуральных средах различного состава Добавление в культуральную среду КИН и 4,5 мкМ ИМК не оказало существенного влияния на эффективность микроразмножения. Таким образом, ИМК оказывает влияние на побегообразование в культуре люпина узколистного только в сочетании с 6-БАП.
Оценка эффективности отдельных циклов микроразмножения в присутствии 6-БАП в сочетании с ИМК и КИН показала, что при длительном культивировании микрорастений люпина всех исследованных генотипов не наблюдается снижения их способности к побегообразованию, и этот показатель не зависел от исследуемого варианта питательной среды. Наибольшее количество микропобегов образовывалось в присутствии 6-БАП и ИМК, что согласуется с полученными нами ранее данными.
Анализ результатов эксперимента показал отсутствие существенных различий по количеству образованных мериклонов между исследованными сортами люпина узколистного. В зависимости от генотипа на первичном побеге развивалось в среднем 3,8–5,0 микропобегов, что соответствует данным других авторов (1,2–5,0) и показывает высокую эффективность разработанной методики.
Было выявлено, что использование в качестве регуляторов роста в составе культуральной среды 6-БАП и ИМК позволяет получать в течение 6 пассажей от 4,000 до 10,000 микрорастений люпина за 6 циклов размножения с одного первичного экспланта. При введении в состав питательной среды 1,13 мкМ КИН этот показатель составляет 200–2,000 штук.
3. Индукция ризогенеза и адаптация микрорастений к условиям ex vitro Укоренение микропобегов и их последующая адаптация к почвенным условиям являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. Основная проблема в получении укорененных микрорастений люпина узколистного в первую очередь связана с быстрым снижением их способности к ризогенезу в процессе культивирования.
В нашей работе для получения укорененных растений люпина узколистного использовали следующие модификации состава культуральной среды: снижение концентрации макросолей в питательных средах, снижение концентрации сахарозы, добавление различных ауксинов, введение в состав питательной среды активированного угля. Подбор оптимальных условий ризогненеза проводили после 3 циклов микроразмножения.
Оценку эффективности процесса корнеобразования проводили в присутствии ИУК и ИМК в концентрации 4,5 мкМ. В качестве контроля использовали питательную среду без добавления регуляторов роста растений.
Результаты исследований представлены на рисунке 4.
Рисунок 4. Эффективность ризогенеза в культуре люпина узколистного Следует отметить, что существенные различия по способности к корневому органогенезу между исследуемыми генотипами не были выявлены.
Однако для сортов Деко и Ладный не было получено статистически достоверных различий по изученному показателю между вариантами питательной среды с добавлением ИУК и ИМК. В то же время сорта Куршавель и Миртан показали большую корнеобразующую способность в присутствии 4, мкМ ИМК.
Присутствие ИМК в культуральной среде индуцировало образование многочисленных адвентивных корней (до 7–9 шт. на одном растении), в то время как на питательной среде с ИУК развивалось не более 2–3 корней. При культивировании микрорастений на безгормональной среде, как правило, наблюдали образование только одного адвентивного корня.
Следует отметить, что полученные нами данные по корнеобразованию (25,0–33,3%) существенно превышали результаты других авторов для регенерантов люпина узколистного (10,0–13,3%) (Pniewski et al., 2002), но при этом уступали результатам, полученным при укоренении не регенерантов, а верхушек побегов (60–74%) (Sator, 1985).
Предложенный нами протокол позволяет получать укорененные регенеранты после 6 пассажей (с эффективностью 8–12%), что можно объяснить присутствием в питательной среде на этапе микроразмножения ИМК в концентрации 4,5 мкМ. Также следует отметить, что КИН в концентрации 1,13 мкМ не оказывает негативного влияния на способность микрорастений люпина узколистного к укоренению и его использование позволяет также индуцировать ризогенез после 6 циклов микроразмножения.
Растения, полученные методом клонального микроразмножения in vitro, как правило, имеют нарушения в работе устьичного аппарата и корневых волосков, что усложняет процесс их адаптации к условиям ex vitro.
В наших исследованиях адаптацию микрорастений к условиям in vivo проводили в несколько этапов. На первом этапе растения в течение суток выдерживали в воде при 100% влажности воздуха, а затем переносили в смесь торфа и песка в соотношении 1:1. В первые две недели микрорастения выращивали в условиях 100% влажности и пониженной освещенности. После того, как у растений начинали образовываться новые листья, влажность постепенно снижали, а освещенность увеличивали. Активное образование новых зеленых листьев свидетельствовало о развитии корневой системы и нормальном функционировании корневых волосков.
Расчет количества растений люпина узколистного, адаптированных к условиям ex vitro, показал, что исследованные сорта существенно отличаются по данному показателю. Наибольшую адаптационную способность (70–80% растений образовывали семена) показали сорта Куршавель и Ладный, в то время как сорт Деко существенно уступал им по данному показателю (50%).
Наименьшая адаптационная способность была отмечена у сорта Миртан (37%).
Все адаптированные растения зацветали и образовывали семена как в условиях закрытого, так в условиях открытого грунта. Процесс адаптации занимал в среднем от 28 до 40 суток в зависимости от генотипа и размера микрорастений.
4. Методические рекомендации по клональному микроразмножению люпина узколистного Протокол клонального микроразмножения люпина узколистного включает в себя следующие этапы: получение первичных экплантов из проростков люпина, индукция побегообразования из почек на первичном экспланте, собственно микроразмножение, укоренение микропобегов, адаптация микрорастений к условиям ex vitro.
Получение первичных экплантов из проростков люпина. Для изолирования первичных эксплантов оптимальным является использование 3-7 ми суточных проростков люпина узколистного. Культуральная среда для получения проростков содержит концентрации макро- и микроэлементов по прописи МС, концентрации витаминов по прописи В5, 29,2 мкМ сахарозы и 0.8% агара. В качестве первичного экспланта следует использовать семядоли с сегментом зародышевой оси и пазушной почкой.
Индукция побегообразования из почек на первичном экспланте. Для регенерации побегов из пазушных почек оптимальной является агаризованная культуральная среда на основе макро- и микросолей среды МС, витаминов среды В5 с добавлением 87,6 мМ сахарозы, 142 мкМ аскорбата, 1,13 мкМ КИН или 2.25 мкМ 6-БАП в качестве регуляторов роста. Использование данного протокола обеспечивает эффективность регенерации в среднем от 87 до 93%.
Собственно микроразмножение. Для получения максимального коэффициента размножения микропобеги следует культивировать на питательной среде на основе макро- и микросолей среды МС, витаминов среды В5 с добавлением 87,6 мМ сахарозы, 142 мкМ аскорбата и 2,25 мкМ 6-БАП в течение одного пассажа. Чтобы избежать негативного влияния 6-БАП на морфологию побегов в течение следующих пассажей микрорастения культивируют на аналогичной культуральной среде, но с добавлением 4,5 мкМ ИМК. Такой подход обеспечивает получение от 4,000 до 10,000 мериклонов с одного первичного экспланта за 6 циклов культивирования.
Укоренение микропобегов. Для индукции ризогенеза оптимальным является использование питательной среды, содержащей концентрации макроэлементов по прописи МС, микроэлементы по прописи МС, витамины по прописи В5, 142 мкМ аскорбата, 58,4 мкМ сахарозы и 4,5 мкМ ИМК.
Адаптация микрорастений к условиям ex vitro. В качестве субстрата целесообразно использовать смесь торфа и песка в соотношении 1:1.
5. Влияние регуляторов роста на изоферментный состав супероксиддисмутазы в растениях люпина узколистного in vitro К настоящему времени существует ряд работ по изучению регенерации люпина узколистного, однако исследования окислительного стресса, активности ферментов антиоксидантной системы и их связи с морфогенезом в культуре in vitro не были проведены.
Поэтому наши исследования были направлены на изучение изменений в активности супероксиддисмутазы, каталазы и аскорбатпероксидазы на различных этапах клонального микроразмножения растений люпина узколистного.
На первом этапе были проанализированы изменения в изоферментном составе СОД при культивировании микрорастений люпина на питательных средах различного гормонального состава.
Для исследования использовали микрорастения сорта Ладный, полученные следующим образом: культивирование на безгормональной среде, затем культивирование в присутствии 4,5 мкМ ИМК (контроль);
культивирование два пассажа в присутствии 2,25 мкМ 6-БАП и 4,5 мкМ ИМК;
культивирование два пассажа в присутствии 2,25 мкМ 6-БАП.
семь изоформ Анализ изоферментных профилей выявил супероксиддисмутазы, которые обозначены как 1–7 (Рис. 5 и 6). Обработка гелей перекисью водорода, инактивирующей Cu,Zn-СОД и Fe-СОД, показала, что изоформы 1–2 представляют собой изоферменты Mn-СОД.
Ранее было доказано, что сильное увеличение активности как митохондриальной, так и пероксисомной изоформ Mn-СОД индуцируется в растительных тканях в условиях стресса (Racchi et al., 2001). Таким образом, можно предположить, что выявленная нами во всех исследованных образцах высокая активность Mn-СОД является следствием защиты от окислительного стресса при культивировании растений люпина узколистного в условиях in vitro. Было показано, что активность ферментов антиоксидантной системы возрастает в делящихся клетках, поэтому другой возможной причиной проявления активности изоформ Mn-СОД являются процессы морфогенеза, происходящие под действием экзогенных регуляторов роста.
Исследуемые варианты различались как по изоферментному составу, так и по активности дисмутации супероксид аниона. Сходные по изоферментному составу белковые профили получены в контроле и в варианте с 6-БАП и ИМК (Рис. 5). В обоих случаях были выявлены все 7 изоформ. Следует отметить и морфологическое сходство изучаемых микрорастений (нормальный габитус, крупные темноокрашенные листья). Выявленные нами различия в супероксиддисмутазной активности, возможно, связаны с процессами морфогенеза, происходящими под действием регуляторов роста.
Рисунок 5. Изоферментные профили Рисунок 6. Изоферментные профили супероксиддисмутазы супероксиддисмутазы А – укорененное растение в присутствии А – растение с нормальной морфологией 4.5 мкМ ИМК, Б – растение с нормальной в присутствии 2,25 мкМ 6-БАП, морфологией в присутствии 2,25 мкМ Б – витрифицированное микрорастение в 6-БАП и 4,5 мкМ ИМК присутствии 2,25 мкМ 6-БАП Проведенные исследования показали, что выявленные различия в супероксиддисмутазной активности изоформ СОД, по-видимому, связаны с процессами морфогенеза и изменением фотосинтетической активности, происходящими под действием регуляторов роста.
6. Изучение активности ферментов антиоксидантной системы на различных этапах культивирования люпина узколистного in vitro Дальнейшие исследования были направлены на изучение активностей ферментов АОС на различных этапах культивирования микрорастений люпина узколистного. Для анализа были выбраны ключевые ферменты системы защиты растений от окислительного стресса: супероксиддисмутаза, каталаза и аскорбатпероксидаза. Ранее было показано изменение активности данных ферментов на различных этапах морфо- и эмбриогенеза в культуре in vitro.
Поскольку люпин узколистный считается сложной культурой для индукции морфогенных процессов, изучение взаимосвязи условий его культивирования и изменений в активностях ферментов АОС является актуальной задачей.
Активность ферментов оценивали на следующих этапах: регенерация побегов, микроразмножение, индукция корнеобразования и адаптация к условиям ex vitro.
Следует отметить, что исследованные генотипы различались по изменению активности ферментов этапах АОС на различных микроразмножения.
На этапе регенерации между исследованными генотипами отсутствовали существенные различия по активности каталазы. На этапе микроразмножения наибольшая активность отмечена у сорта Миртан. В процессе укоренения наибольшую активность КАТ проявил сорт Деко, а между другими сортами существенные различия не выявлены. При адаптации микрорастений к условиям ex vitro наибольшая активность отмечена у сорта Миртан, а наименьшая у сорта Куршавель. Сорта Деко и Ладный существенно не отличались по данному показателю.
На этапе регенерации наибольшую активность АПО наблюдали у сортов Деко и Куршавель, а между сортами Миртан и Ладный существенные различия не выявлены. На этапе укоренения наоборот наименьшая активность отмечена у сортов Деко и Куршавель, а наибольшая у сортов Миртан и Ладный. При адаптации микрорастений к условиям ex vitro наименьшую активность каталазы показал сорт Куршавель, а наибольшую — сорт Миртан.
Наименьшая активность СОД на этапе микроразмножения была выявлена у сорта Миртан. На этапе укоренения наименьшую активность СОД наблюдали у сорта Деко, а наибольшую — у сорта Ладный. В процессе адаптации наименьшая активность супероксиддисмутазы отмечена у сорта Ладный.
У всех исследованных генотипов наименьшую активность каталазы наблюдали в процессе клонального микроразмножения при культивировании микрорастений в присутствии 6-БАП. По-видимому, такое снижение активности фермента способствует увеличению концентрации перекиси водорода в тканях экспланта.
В то же время, у исследованных сортов люпина в процессе образования побегов наблюдали максимальную активность АПО, которая, как и каталаза участвует в разрушении Н2О2.
Снижение активности аскорбатпероксидазы, которое показано на этапе укоренения, соответствует литературным данным (Li et al., 2009). Ранее было доказано, что накопление перекиси водорода в тканях растений под действием ИМК является необходимым условием корнеобразования и осуществляется по ИМК-АПО-зависимому механизму.
Следует также отметить, что у всех исследованных генотипов при культивировании in vitro на фоне снижения активности АПО наблюдается увеличение активности КАТ и наоборот. При этом в изменении активности СОД никаких общих закономерностей не выявлено.
У сорта Миртан в процессе адаптации наблюдается увеличение активностей СОД и КАТ, а также самый высокий уровень активно сти АПО по сравнению с другими сортами. По-видимому, увеличение активности антиоксидантных ферментов является следствием стресса, вызванного переносом микрорастений в условия ex vitro, поскольку у данного сорта выявлена наименьшая адаптационная способность.
Наши дальнейшие исследования были направлены на изучение изменений в изоферментном составе каталазы и супероксиддисмутазы на различных этапах клонального микроразмножения люпина узколистного. В качестве объекта в экспериментах использовали сорт Куршавель.
Образцы для изоферментного анализа были получены следующим образом: регенерацию побегов из верхушечных и пазушных почек индуцировали в присутствии 2,25 мкМ 6-БАП, на этапе микроразмножения растения культивировали в присутствии 2,25 мкМ 6-БАП и 4,5 мкМ ИМК, укоренение индуцировали в присутствии 4,5 мкМ ИМК, адаптацию проводили согласно вышеописанной методике. Выделение белка из тканей растений осуществляли после 14 суток культивирования на питательной среде соответствующего состава.
При анализе изоферментного состава каталазы на всех этапах культивирования в листьях люпина узколистного выявлена одна изоформа, что соответствует литературным данным (Racchi et al., 2001).
Наименьшую активность изоформы КАТ1 наблюдали на этапе микроразмножения (Рис. 7). Полученные нами данные, согласуются с проведенными ранее исследованиями активности каталазы в растениях сорта Куршавель.
Анализ белковых профилей выявил 7 изоформ супероксиддисмутазы, что соответствует полученным нами ранее данным. Однако, на различных этапах культивирования изоферментный состав СОД изменялся. Например, в листьях регенерантов и побегов на этапе микроразмножения выявлены только изоформы: 1, 3, 6 и 7. При пересадке микрорастений на культуральную среду для укоренения наблюдали появление дополнительной изоформы Mn-СОД (изоформа 2). У растений после адаптации показано присутствие 6 изоформ: 2, 3, 4, 5, 6 и 7 (Рис. 8).
Рисунок 7. Изменение изоферментного Рисунок 8. Изменение изоферментного состава каталазы в процессе состава СОД в процессе культивирования культивирования люпина узколистного in люпина узколистного in vitro vitro 1 – побеги на этапе микроразмножения, 2 А – побеги из пазушных почек на первичном – побеги на первичном экспланте из экспланте, Б – побеги из верхушечных почек пазушных почек, 3 – побеги на первичном на первичном экспланте, В – побеги на экспланте из верхушечных почек, этапе микроразмножения, 4 – микрорастение на этапе укоренения, Г – микрорастение на этапе укоренения, 5 – микрорастение перед адаптацией, Д – микрорастение перед адаптацией, 6 – микрорастение после адаптации Е – микрорастение после адаптации, 1-7 – изоформы супероксиддисмутазы Различия в изоферментном составе и активности СОД между регенерантами, полученными из пазушных и верхушечных почек не были выявлены.
Как видно из рисунка 8, активность изоформ супероксиддисмутазы изменялась в процессе клонального микроразмножения. Так, активность изоформы 1 (Mn-СОД) была максимальной на этапах микроразмножения и ризогенеза, а у укорененных растений снижалась. У адаптированных ex vitro растений данная изоформа не была обнаружена. Таким образом, можно предположить, что выявленная нами в микропобегах люпина узколистного высокая активность Mn-СОД является следствием защиты от окислительного стресса при культивировании растений в условиях in vitro. Увеличение активности Mn-СОД на этапах микроразмножения и ризогенеза, вероятно, связано с процессами морфогенеза (побего- и корнеобразование).
Изоформа Mn-СОД 2 проявила активность только на этапе ризогенеза и также обнаружена у адаптированных растений. Активность изоформы увеличивается в процессе побегообразования, затем снижается при индукции ризогнеза. Максимальную активность данной изоформы наблюдали у адаптированных к условиям ex vitro микрорастений люпина. Изоформы 4 и обнаружены только у адаптированных растений люпина. Изоформа 6 показала наибольшую активность в процессе культивирования микрорастений in vitro. У растений со сформированной корневой системой и у адаптированных растений к условиям ex vitro активность данной изоформы снижалась. Активность изоформы 7 существенно не изменялась в процессе культивирования микрорастений in vitro и при их последующей адаптации.
Обнаруженные нами различия по активности и изоферментному составу СОД между сортами люпина узколистного при одинаковых условиях in vitro показывают, что реакция данных сортов на изменения условий культивирования, например, гормонального состава среды, также будет различной.
Выводы 1. Усовершенствован протокол клонального микроразмножения люпина узколистного, позволяющий получать высокий коэффициент размножения за счет индукции развития побегов из пазушных почек.
2. Установлено, что введение в состав питательной среды на этапе микроразмножения 2,25 мкМ 6-БАП в сочетании с ИМК в концентрации 4, мкМ обеспечивает получение 3,8-5,0 мериклонов с одного побега, кроме того, данный показатель не изменяется в течение 6 пассажей. При этом показано, что такое сочетание регуляторов роста позволяет исключить формирование микропобегов с аномальной морфологией.
3. Показано, что присутствие ИМК в культуральной среде на этапе микроразмножения способствует индукции ризогенеза у микропобегов люпина узколистного с эффективностью 25,0-33,3% после 3 пассажей и с эффективностью 8-12% после 6 пассажей культивирования, что позволяет исключить из технологии трудоемкую процедуру микропрививки.
4. Показано присутствие 7 изоформ супероксиддисмутазы и одной изоформы каталазы в микрорастениях люпина узколистного. Установлено, что изоферментный состав супероксиддисмутазы и активность отдельных изоформ изменяются в процессе культивирования in vitro.
5. Показаны изменения в активности супероксиддисмутазы, каталазы и аскорбатпероксидазы в процессе культивирования микрорастений in vitro.
Определено, что исследованные генотипы люпина узколистного существенно различались по активности ферментов антиоксидантной системы и динамике их изменения.
6. Отмечено существенное снижение активности каталазы на фоне увеличения или отсутствия изменений в активности супероксиддисмутазы и максимальная активность аскорбатпероксидазы в процессе образования побегов. Установлена обратная зависимость между изменением активности аскорбатпероксидазы и каталазы для всех исследованных генотипов в процессе их культивирования in vitro.
Список опубликованных работ по теме диссертации 1. Балакина А.А., Калашникова Е.А., Кунина Ю.В. Изучение морфогенетического потенциала изолированных эксплантов люпина узколистного (Lupinus angustifolius L.) in vitro // Тезисы докладов 2-й Международной школы-конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях" Звенигород, Россия, 2011. С. 19.
2. Балакина А.А., Калашникова Е.А., Кунина Ю.В. Влияние условий культивирования на ризогенез микропобегов люпина узколистного (Lupinus angustifolius L.) in vitro // Тезисы докладов 2-й Международной школы конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях" Звенигород, Россия, 2011.
С. 20.
3. Балакина А.А., Калашникова Е.А. Влияние типа первичного экспланта на морфогенез люпина узколистного (Lupinus angustifolius L.) в культуре in vitro // Materialy VII Mezinarodni vedecko-prakticka konference «Vedecky prumysl evropskeho kontinentu – 2011», Praha, Ceska Rebublika, 2011. S. 47-50.
4. Балакина А.А., Калашникова Е.А. Влияние регуляторов роста на морфогенез люпина узколистного (Lupinus angustifolius L.) в культуре in vitr // Естественные и технические науки, 2011, № 6 (56), С. 83-86.
5. Балакина А.А., Терентьев А.А., Калашникова Е.А., Белопухов С.Л.
Влияние регуляторов роста на изоферментный состав супероксиддисмутазы в растениях люпина узколистного (Lupinus angustifolius L.) in vitro // Бутлеровские сообщения, 2012, Т. 29, № 1, С. 55-61.
6. Балакина А.А., Калашникова Е.А. Экспериментальный морфогенез в культуре изолированных органов и тканей люпина узколистного (Lupinus angustifolius L.) // Известия ТСХА, 2012, № 2, С. 41-45.