Эффективность взаимодействия гороха (pisum sativum l.) с комплексом полезной почвенной микрофлоры. новый признак селекции зернобобовых культур

На правах рукописи

ДАНИЛОВА Татьяна Николаевна ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГОРОХА (Pisum sativum L.) С КОМПЛЕКСОМ ПОЛЕЗНОЙ ПОЧВЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ.

НОВЫЙ ПРИЗНАК СЕЛЕКЦИИ ЗЕРНОБОБОВЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург – 2011

Работа выполнена в лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии

Научный консультант: доктор биологических наук Борисов Алексей Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Киру Степан Дмитриевич, Всероссийский научно исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Кожемяков Андрей Петрович, Всероссийский научно исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии

Ведущая организация: Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук.

Защита состоится «_» _ 2011 г. вч на заседании объединенного совета ДМ 212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт – Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, Биолого-почвенный факультет, аудитория.

С диссертацией можно ознакомится в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «_» _ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е. И. Шарова Список сокращений АМ – арбускулярная микориза АФС – азотфиксирующий симбиоз ППМ – полезная почвенная микрофлора N60P60K60 – полная норма минеральных удобрений КМУ – комплексное микробное удобрение PGPB – Plant Growth Promoting Bacteria (бактерии, стимулирующие рост растений) Cv – коэффициент вариации

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. У растений питание, развитие, адаптация к стрессам, защита от патогенов и вредителей обеспечивается за счет взаимовыгодных (мутуалистических) симбиотических взаимодействий с широким спектром микроорганизмов. По своим функциям растительно микробные мутуалистические симбиозы могут быть разделены на трофические и защитные. Бобовые растения (сем. Fabaceae) уникальны тем, что в процессе эволюции приобрели способность формировать два типа мутуалистических эндосимбиозов: арбускулярную микоризу (АМ) с грибами отдела Glomeromycota, а также азотфиксирующий симбиоз (АФС) с ризобиями, которые обеспечивают фосфорное и азотное питание растений в обмен на фотосинтаты (Borisov et al., 2007;

Shtark et al., 2010). Многочисленные признаки, определяющие сходство между этими типами симбиозов, указывают на общие механизмы взаимодействия между макро- и микросимбионтом, по крайней мере, на некоторых стадиях развития (Borisov, 2007;

Parniske, 2008;

Проворов, 2009). Также широко известны антистрессовые и защитные эффекты взаимодействий с PGPB, к которым относятся ризосферные/эндофитные бактерии (например, Azospirillum, Arthrobacter, Pseudomonas, Bacillus и др.).

Было показано, что существуют общие растительные гены, контролирующие взаимодействие с эндосимбионтами и данной группой бактерий (Sanchez et al., 2005;

Shtark, 2010). Это заставляет рассматривать генетическую систему бобовых растений, контролирующую взаимодействие с полезной почвенной микрофлорой (ППМ), как единую для развития комплексного симбиоза бобовое растение + грибы АМ + ризобии + PGPB, и решающую роль в установлении симбиоза отвести растению-хозяину, обладающему наиболее стабильным геномом, предоставляющему экологические ниши и источник углерода. В сельскохозяйственной практике никогда не использовался комплексный симбиоз между бобовыми растениями, грибами АМ, ризобиями и PGPB, хотя проводимые в этом направлении исследования (Якоби, 2000;

Barea et al., 2005) показывают возможность эксплуатации мутуалистических взаимодействий в адаптивном сельском хозяйстве.

Горох (Pisum sativum L.) является одной из наиболее важных культур в мире, которую выращивают в различных почвенно-климатических зонах на больших площадях (Чекалин, 2003). Как представитель сем. Fabaceae он обладает способностью к образованию всех перечисленных симбиозов, однако в процессе интенсификации сельского хозяйства у культурных растений была понижена эффективность данных взаимодействий (Тихонович, Проворов, 2009). В рамках современной концепции развития адаптивного, экологически ориентированного сельскохозяйственного производства использование микробиологических препаратов комплексного действия (с трофической и защитной функцией), может быть альтернативой применению высоких доз минеральных удобрений и химических средств защиты. Для этого необходимо создание сортов нового типа, высоко эффективных во взаимодействии с ППМ (Борисов и др., 2004;

Shtark et al., 2010). Селекция генотипов с подобными свойствами позволит максимально использовать сложившийся в ходе эволюции потенциал продуктивности растений, повысить качество урожая, снизить загрязнение окружающей среды и затраты на производство за счет снижения доз агрохимикатов.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение взаимодействия гороха посевного (Pisum sativum L.) с комплексом ППМ (грибы АМ, ризобии, PGPB) для конструирования высокоэффективных взаимовыгодных растительно-микробных систем с целью повышения продуктивности растений в экологически ориентированном адаптивном растениеводстве. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучение внутривидового полиморфизма гороха по эффективности взаимодействия с ППМ.

2. Сравнительный анализ развития эндосимбиотических систем и параметров урожая. Выбор параметров оценки эффективности взаимодействия растений с комплексом ППМ.

3. Разработка методологии анализа исходного материала для селекции гороха на повышение эффективности взаимодействия с ППМ.

4. Разработка принципов селекции гороха с учетом нового сельскохозяйственно значимого признака - “эффективность взаимодействия с ППМ”.

Научная новизна работы. Впервые на основе экспериментальных данных о сложившихся в ходе эволюции общих элементах генетической системы бобового растения, регулирующей симбиотические взаимоотношения с различными компонентами ППМ разработана и апробирована система «многокомпонентного» мутуалистического симбиоза для применения в адаптивном растениеводстве. Впервые показан полиморфизм гороха при взаимодействии с ППМ, основными группами которой являются: грибы АМ, ризобии и PGPB.

Практическая значимость работы. Разработаны приемы повышения эффективности симбиотических систем гороха за счет применения комплексного микробного удобрения (КМУ), содержащего основные группы ППМ. Данные приемы способствуют повышению продуктивности растений и качества урожая. В результате комплексных исследований признака «эффективность взаимодействия с ППМ» 26 генотипов гороха отобраны наиболее эффективные для использования в селекции. Показано, что основными параметрами оценки эффективности растений при взаимодействии с ППМ являются биомасса растения, масса семян и содержание белка в семенах. Разработана методология анализа исходного материала для селекции гороха на повышение эффективности взаимодействия с ППМ и принципы селекции гороха с учетом нового сельскохозяйственно значимого признака “эффективность взаимодействия с ППМ”.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Инокуляция растений комплексом ППМ в среднем за три года по генотипам эквивалентна применению N60P60K60.

2. Уровень генетического полиморфизма гороха посевного (Pisum sativum L.) по признаку «эффективность взаимодействия с ППМ» позволяет вести селекцию и создавать сорта с высоким показателем данного признака.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на всероссийской конференции “Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках” (Санкт-Петербург, 2001);

на 1-ой региональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, 2002);

на 1-ом съезде микологов России (Москва, 2002);

на 11-м международном конгрессе “Молекулярные растительно-микробные взаимодействия” (Санкт-Петербург, 2003);

на 6-м международном симпозиуме "Строение и функции корней" (Словакия, Стара Лесна, 2003);

на 3-м съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров “Генетика в 21 веке:

современное состояние и перспективы развития” (Москва, 2004);

на 5-й Европейской конференции “Зерновые бобовые культуры” и 2-й международной конференции “Геномика и генетика бобовых” (Франция, Дижон, 2004);

на 9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология наука ХХI века” (Пущино, 2005);

на 14-й Международной конференции “СПИД, рак и общественное здоровье” (Санкт-Петербург, 2005);

на конференции “Использование грибов арбускулярной микоризы для повышения плодородия почв и здоровья растений в сельском хозяйстве” (Франция, Дижон, 2005);

на 15-м международном конгрессе “Фиксация азота” и 12-й международной конференции “Африканская ассоциация по биологической фиксации азота” (2008);

на 16-й летней школе по биотехнологии университета Гданьска “Адаптация к климатическим изменениям в регионе Балтийского моря: вклад биотехнологии растений и микроорганизмов” (Польша, Гданьск, 2010);

на Всероссийской научной конференции “Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России” (Сергиев Посад, 2009;

Москва, 2010) Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 работы: 7 статей (3 из списка ВАК), 15 тезисов конференций, получен 1 патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 12 рисунков. Список литературы включает наименования, в числе которых 317 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Растительный материал: В экспериментах использовались следующие генотипы гороха Pisum sativum L.: из коллекции ГHУ ВИР им. Вавилова К-925, К-1693, К-7128, К-8274 (высокоэффективные при взаимодействии с ППМ) и К 3064, К-3358 (низкоэффективные при взаимодействии с ППМ), используемые как стандарты;

селекционные линии ГНУ ВНИИЗБК Скиф и Триумф;

селекционный материал Центра исследований генетики зернобобовых Департамента сельского хозяйства США при Вашингтонском университете (Franklin, Lifter, Fallon, Shawnee, PS 610152, PS 610324, PS 710048, PS 810191, PS 810240, PS 810765, PS 7101044, PS 7101047, PS 7101149, PS 9910029, PS 9910134, PS 9910135, PS 9910140, PS 9910188). Данные генотипы обладали необходимыми сельскохозяйственно значимыми признаками и структурой надземной части, соответствующей способам производства. Селекционная линия Триумф получена методом насыщающих скрещиваний (беккроссирование) генотипа К-8274 (источник признака “эффективность взаимодействия с ППМ”) и сорта Classic (Дания), выбранного по архитектонике растения, качеству семян и продуктивности.

Схема создания сорта гороха Триумф, отзывчивого на инокуляцию ППМ. Данная работа проводилась совместно с Наумкиной Т.С. (ГНУ ВНИИЗБК).

(К-8274 x Classik) x 5 Classik 1. В5F1 Размножение.

2.В5F2 - F3 Отбор потенциально перспективных морфотипов на фоне инокуляции КМУ.

3. В5F4 Отбор высокопродуктивных генотипов на фоне инокуляции КМУ.

4. Отбор и изучение в селекционных питомниках на фоне инокуляции КМУ.

5. Конкурсное сортоиспытание и государственное сортоиспытание.

Использованные микроорганизмы и метод доставки ППМ в ризосферу растения. Для отбора генотипов бобовых, эффективных во взаимодействии с ППМ был создан селекционный питомник с организацией шестипольного севооборота. В почву на территории питомника перед посевом вносили КМУ (500 кг/га), в состав которого входят резидентные для субстрата-носителя (фильтрационно-моечный осадок производства сахара из сахарной свеклы) представители ППМ и искусственно внесенные производственные штаммы RCAM 1022 (2002, 2004 гг) или RCAM 1026 (2003 г) Rhizobium leguminosarum bv. viciae, изоляты Glomus fasciculatum BEG 53 и G. intraradices BEG 144, G.

intraradices RCAM 7, а также штамм Bacillus subtilis Ч13. Среди резидентной микрофлоры доминируют Arthrobacter spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp., Alcaligenes spp., также присутствуют ризобии и грибы АМ. КМУ производилось по оригинальной технологии (патент № 2318784, зарегистрирован 10.03.2008) на отвалах Сотницынского сахарного завода, Сасовский район, Рязанская область.

Схема опыта: 1. Контроль (без КМУ и минеральных удобрений);

2. КМУ (предпосевное внесение – 500 кг/га);

3. N60P60K60 – полная норма минеральных удобрений для почв Орловской области (данные ГНУ ВНИИЗБК).

Условия проведения экспериментов и методы анализа: Все эксперименты проводились на экспериментальных полях ГНУ ВНИИЗБК (Орловская область, поселок Стрелецкое). В 2002-2004 годах растения выращивали на делянках площадью 3 м2 (по 250 растений на делянке) в двухкратной повторности. Метод размещения опытных делянок – рендомизированный. Посев осуществлялся вручную. Технология возделывания гороха общепринятая для данной зоны (Голопятов и др., 2010). Севооборот: чистый пар – озимая пшеница – горох – картофель – яровая пшеница – гречиха. В качестве минерального удобрения использовалась "Нитрофоска" (N16P16K16 ГОСТ 11365-75), 105 г на делянку.

Изучение структуры урожая у растений, отобранных в фазу полной спелости, проводили согласно стандартной методике (Вишнякова и др., 2010). Число клубеньков на корнях оценивали по методике В.П. Орлова и др. (1984), нитрогеназную активность оценивали методом ацетиленовой редукции (Hardy et al., 1968) в модификации В.П. Орлова и др. (1984). Содержание азота в семенах определялось методом Кьельдаля с последующим пересчетом на белок. Оценку микоризной инфекции выполняли по классической методике (Trouvelot et al., 1986). Использовали следующие параметры: частота встречаемости микоризной инфекции (F,%), интенсивность ее развития на 1 см корня (М,%) и обилие арбускул в микоризованной части корня (а,%). Для анализа брали по пять растений на вариант.

Для оценки изменения (за счет взаимодействия с КМУ или применения N60P60K60) массы сухого растения, семенной продуктивности, содержания белка в семенах, нитрогеназной активности, количества клубеньков и параметров, характеризующих развитие эндомикоризного симбиоза (F,%;

M,%;

a,%) рассчитывали относительные прибавки (%): 100(Хо-Хк)/Хк, где Хо-значения параметров в варианте с обработкой (КМУ или N60P60K60), Хк-значения параметров в контрольном варианте. Оценку достоверности различий между вариантами опытов производили с использованием t-критерия Стьюдента, для определения зависимости между параметрами вычисляли коэффициент корреляции Пирсона, для оценки изменения параметров - z-критерий знаков (Лакин, 1990), результаты многофакторных экспериментов обрабатывались при помощи дисперсионного анализа (Доспехов, 1985) и факторного анализа (Кулаичев, 2006).

Агроклиматические условия: Почвы опытного участка темно-серые лесные среднесуглинистые, подстилаемые лесовидным суглинком, средней окультуренности, pH 5,3-6,3, содержание гумуса в пахотном горизонте – 3,3 5,5%, биологически доступного фосфора по Кирсанову – 9,2-11,3 мг/100 г, K по Масловой – 4,0-7,8 мг/100 г, легкогидролизуемого азота - 6,5-7,8 мг/100 г;

сумма поглощенных оснований – 21,0-26,5 мг-экв./100 г, степень насыщенности основаниями – 76-94%. Метеорологические условия в годы исследований можно охарактеризовать как контрастные, но в среднем повторяющие среднемноголетние климатические закономерности, что позволило достаточно достоверно и объективно оценить особенности развития гороха при использовании различных видов обработки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Влияние инокуляции КМУ и применения N60P60K60 на биомассу растений. Средние за три года значения массы растений и семян при инокуляции гороха КМУ равны их значениям в варианте с N60P60K60 (рис. 1).

Годы наблюдений характеризовались контрастными погодными условиями.

Наиболее благоприятными для развития гороха условиями отличался 2003 г.

2004 г. характеризовался низкими температурами и очень неравномерным выпадением осадков в вегетационный период, поэтому значения надземной биомассы минимальны. 2002 г. отличался повышенными температурами и недостатком влаги, уровень развития растений средний (рис. 2).

10 B масса семян масса семян масса растения B 10 масса растения В A A C г г b b b a а c 0 ь У K л NP 2002 2003 ро КМ нт Ко Рис. 1. Средние значения массы растений и Рис. 2. Средние значения массы растений и семян гороха со стандартными ошибками за семян гороха со стандартными ошибками 2002-2004 гг, 26 генотипов. суммарно по трем вариантам, 26 генотипов.

Значения, маркированные разными буквами, достоверно различаются при Р0,95%.

В 2003 г. в контроле в среднем по 26 генотипам масса растения и масса семян составила 9,2 г и 4,2 г, соответственно (рис. 3, 4). Изменения данных параметров при инокуляции КМУ по отношению к контролю составили 17% и 22%, а в присутствии N60P60K60 – 46% и 47%. В 2004 г. масса растения в среднем по генотипам составила в контроле 6,5 г, а масса семян – 2,6 г (рис. 3, 4). Изменения данных параметров при инокуляции КМУ составили 47% и 32%, а в присутствии N60P60K60 – -1% и 4%. Т.о. действие N60P60K60 было на уровне контроля, т. е. не оказало влияния на биомассу растений. Следует отметить, что при этом коэффициент вариации (Cv), характеризующий внутривидовую изменчивость по массе растения и по массе семян, при инокуляции КМУ (15% и 21%) был достоверно ниже Cv при N60P60K60 (26% и 32%), что говорит о выравнивании генотипов по параметрам развития при взаимодействии с ППМ в неблагоприятный по погодным условиям год. В 2002 г. масса растения составила в контроле 7,6 г, а масса семян – 3,6 г (рис. 3, 4). Изменения данных параметров при инокуляции КМУ составили 14% и 16%, а в присутствии N60P60K60 – 13% и 12%, соответственно.

d Контроль 6 NPK Контроль 14 d КМУ NPK e КМУ 12 c Масса семян, г масса растения, г e bb g c 10 a 4 g bb a f f f f 2002 2003 2002 2003 Рис. 3. Масса растений гороха со Рис. 4. Масса семян гороха со стандартной стандартной ошибкой, 26 генотипов. ошибкой, 26 генотипов.

Значения, маркированные разными буквами, достоверно различаются при Р0,95%.

Генетический полиморфизм гороха по продуктивности. В ходе изучения отзывчивости различных генотипов на воздействие ППМ было подтверждено, что горох посевной обладает высоким генетическим полиморфизмом по признаку «эффективность взаимодействия с ППМ», т.е. по способности растений полноценно развиваться за счет взаимовыгодных симбиотических взаимодействий. Изменение надземной биомассы растений при инокуляции КМУ в исследуемом наборе из 26 генотипов варьировало в среднем за 2002 2004 гг. полевых испытаний от –7% до 68%, а массы семян - от –9% до 115% по отношению к контролю (табл.1). Изменение данных параметров в варианте с N60P60K60 варьировало от -8% до 81% и от –11% до 171%, соответственно (табл.

2). Изменение данных параметров при инокуляции КМУ по отношению к варианту с N60P60K60 варьировало от -19% до 49% и от -14% до 57% (табл. 3).

Табл. 1. Изменение (%) массы растения и семян при инокуляции гороха КМУ по отношению к контролю, 2002-2004 гг.

Масса сухого растения Масса семян с растения генотип 2002 2003 2004 среднее 2002 2003 2004 среднее К-8274 53,7* 82,1* нд 67,1* 162,1* нд 67,9 114, Franklin 70,4* 19,2* 41,2* 67,4* 12,4 22, 43,6 34, Lifter -2,4 -3,8 36,1* -5,2 -11,3 13, 9,9 -1, Скиф 37,4* 7,5 9,1 35,9* 1,9 15, 18,0 17, Триумф 26,9* 9,8 53,7* 25,3* 11,5 35,7* 30,1 24, К-3358 0 11,1 -3,2 -5,6 0 -19, 2,62 -8, PS610324 -5,3 88,8* 77,9* -0,3 118,2* 53,2* 53,8 57, Табл. 2. Изменение (%) массы растения и семян гороха в присутствии N60P60K по отношению к контролю, 2002-2004 гг.

Масса сухого растения Масса семян с растения генотип 2002 2003 2004 среднее 2002 2003 2004 среднее К-8274 61,9* 99,4* нд 61,5* 280,5* нд 80,7 170, Franklin 18,5* 37,6* -34,6* 20,3* -16, 7 -37,5* -11, 7, Lifter 1,9 45, 7* -12,5 0,8 18,0 -13, 11,7 1, Скиф 19,8* 73,1* 8,9 27,3* 48,4* 19,9* 33,9 31, Триумф -5,6 27,7* -3,2 10,2 32,0* 5, 6,3 16, К-3358 -20,9* 20,1 -14,3 -18,4* 12,0 -24,9* -10, -5, PS610324 12,8 107,8* 34,6* 22,0* 133,2* 34, 8* 51,7 63, Табл. 3. Изменение (%) массы растения и семян при инокуляции гороха КМУ по отношению к варианту с N60P60K60, 2002-2004 гг.

Масса сухого растения Масса семян с растения генотип 2002 2003 2004 среднее 2002 2003 2004 среднее К-8274 -5,1 -8,7 нд 3,4 -31,1* нд -6,9 -13, Franklin 43,8* -13,3* 115,9* 39,2* 34,9* 96,9* 48,8 57, Lifter -4,3 -33,9* 55,6* -5,9 -24,9* 30,7* 5, 8 -0, Скиф 14,7* -37,9* 0,1 6,8 -31,4* -4, -18, 9 -9, Триумф 34,5* -14,0* 58,9* 13,7 -15,5* 28,2* 26,5 8, К-3358 26,5* -7,6 12,9 15,7 -10,7 7, 10,6 4, PS610324 -16,1* -9,2 32,2* -18,3* -6,4 13, 2,3 -3, *-Значение достоверно отличается от контроля при Р0,95;

нд - нет данных На основании полученных за три года данных можно выделить четыре группы контрастных генотипов: 1 – хорошо отзывчивые на внесение как КМУ, так и N60P60K60 (К-8274, PS 610324, К-1693, PS 7101149, Shawnee);

2 – слабоотзывчивые на внесение как КМУ, так и N60P60K60 (Lifter, PS 9910134, PS 9910135, К-3358);

3 – в большей степени отзывчивые на внесение КМУ, чем на N60P60K60 (Franklin, PS 9910140, PS 710048, Триумф), 4 – в большей степени отзывчивые на внесение N60P60K60, чем на КМУ (Скиф). Генотипы 1-ой и 3-ей групп рекомендуется использовать в селекции как источники признака “эффективность взаимодействия с комплексом ППМ”. Отобранные как стандарты высокой эффективности взаимодействия с ППМ генотипы К-8274, К-7128, К-1693, К-925 и низкоэффективные К-3064, К-3358 подтвердили данное свойство, сохранив тенденцию изменения параметров биомассы.

Селекционная линия Триумф показала достоверное увеличение семенной продуктивности при инокуляции КМУ по сравнению с контролем в 2002 году 25%, в 2003 году 11% (недостоверно), в 2004 – 36%. Увеличение массы растения составило, соответственно, 27%, 10% (недостоверно) и 54% (табл. 1).

Таким образом, эффективность Триумфа за годы полевых испытаний при взаимодействии с ППМ по массе семян – 24%, (средняя эффективность), максимальная эффективность (потенциал взаимодействия с ППМ) при этом составила 36%.

Анализ средних значений Cv как по массе растений, так и по массе семян генотипов показал, что по результатам трех лет исследований инокуляция КМУ вызывает снижение изменчивости растений внутри генотипа по сравнению с применением N60P60K60 (при Р0,95%). Таким образом, инокуляция КМУ оказывает более стабильное положительное действие на развитие растений, чем N60P60K60, вызывая его оптимизацию при различных (особенно стрессовых) погодных условиях.

О высокой изменчивости признака “масса растений” и “масса семян” внутри генотипа свидетельствуют значения Cv, находящиеся в диапазоне 30 – 50% у большинства генотипов в контроле вне зависимости от погодных условий. Cv, характеризующий межсортовую изменчивость в контроле составлял 17% - 28% по массе растения и 26% - 28% по массе семян в разные годы, что также указывает на значительную изменчивость (Доспехов, 1985). Данный факт указывает на возможность и необходимость ведения селекции отобранных как перспективные генотипов по индивидуальным растениям.

Сопоставление развития гороха при инокуляции КМУ и при внесении N60P60K60. Наблюдалась достоверная высокая корреляция между изменениями семенной продуктивности и массы растения как при инокуляции КМУ, так и при внесении N60P60K60 по отношению к контролю (табл. 4).

При изучении связи между массой семян в контроле и прибавками этого параметра при инокуляции КМУ обнаружена достоверная отрицательная корреляция. Отрицательная корреляция обнаружена также между массой семян в контроле и прибавками параметра в присутствии N60P60K60. Данные факты указывают на генетически детерминированную оптимизацию развития растений при обоих видах обработки (т. е. наибольший выигрыш получают плохо адаптированные к сложившимся условиям генотипы), но по сравнению с N60P60K60 эффект от применения КМУ более стабилен из года в год, что говорит о важной роли использования комплекса ППМ в системах адаптивного растениеводства (табл. 4).

Табл. 4. Сопоставление развития гороха при внесении КМУ и N60P60K60.

Коэффициенты корреляции (r) Сопоставляемые признаки 2002 2003 МРКМУ - МСКМУ 0,92 0,93 0, МРNPK - МСNPK 0,88 0,76 0, МРКМУ - МРNPK 0,72 0,58 0, МСКМУ - МСNPK 0,71 0,83 0, МСКОНТР. - МСКМУ -0,63 -0,71 -0, МСКОНТР. - МСNPK -0,68 -0,74 -0, МР – масса растения;

МС – масса семян - изменение изучаемого параметра относительно контроля Изучение связи между изменениями значений массы растений при инокуляции КМУ и при внесении N60P60K60 по отношению к контролю показало наличие достоверной корреляции в 2002 и 2003 годах. В случае изучения изменения массы семян с растения достоверная корреляция была обнаружена во все годы исследований. Эта корреляция указывает на то, что механизмы вовлечения минеральных элементов в формирование биомассы при симбиотрофном и автотрофном питании сходны (табл. 4).

Анализ содержания белка в семенах гороха. В среднем по 26 генотипам содержание белка в семенах в результате инокуляции КМУ изменилось по сравнению с контролем в 2002 году на +0,40%, в 2003 – на +1,51%, в 2004 – на +1,35% (табл. 5), сбор белка увеличился на 93,9 кг/га, 169,9 кг/га (достоверно) и 209,5 кг/га (достоверно), соответственно.

Применение N60P60K60 в среднем по 26 генотипам привело к изменению содержания белка в семенах по сравнению с контролем в 2002 году на -0,90%, в 2003 – на +0,62%, в 2004 – на +0,76% (табл. 5). Сбор белка повысился по сравнению с контролем в среднем по генотипам в 2002 году на 28,2 кг/га, в 2003 – на 392,3 кг/га (достоверно), в 2004 – на 4,7 кг/га. То есть применение N60P60K60 является менее эффективным средством повышения качества зерна, чем инокуляция КМУ.

Табл. 5. Изменение (%) концентрации белка в семенах гороха по отношению к контролю, 2002-2004 гг.

КМУ N60P60K генотип 2002 2003 2004 среднее 2002 2003 2004 среднее К-8274 0,22 1,95 1,61 -1,30 1,99 1, 1,26 0, Franklin 1,12 2,42 1,95 -0,89 0,86 1, 1,83 0, Lifter 2,11 1,59 1,55 -2,30 0,40 2, 1,75 0, Скиф 1,12 2,34 1,34 -1,79 -0,82 2, 1,60 -0, Триумф 1,0 1,99 1,05 -1,83 0,16 -1, 1,35 -1, K-3358 0 1,57 1,71 -0,45 -2,07 -1, 1,09 -1, PS610324 0,90 2,18 1,25 0,45 1,62 1, 1,44 1, Анализ параметров, характеризующих развитие АМ. Изменение величины F при инокуляции КМУ относительно контроля варьировало от -76% (Shawnee) до +191% (PS 9910140), а изменение величины М от -92% (Shawnee) до +377% (К-925) (табл. 6). У генотипов Franklin, PS 710048, PS 7101044, PS 7101047, PS 610152 и PS 610324 при инокуляции КМУ достоверно возрастало количество арбускул в микоризованной части корня (а). В целом значения изменения а в данном варианте по отношению к контролю находились в диапазоне от -100% до 9800%.

Достоверное уменьшение значений F и М (табл. 6) по сравнению с контролем при Р0,95 (по z-критерию знаков) и практически полное отсутствие арбускул в варианте с N60P60K60 указывает на переход растения на автотрофный тип фосфорного питания. Значения изменений F в данном варианте были отрицательные у большинства генотипов максимально до -90% (PS 7101044), за исключением PS 9910140 (245%), PS 9910135 (118%), PS 810191 (16%), K- (14%). Значения изменений М в данном варианте были отрицательные максимально до -99% (PS 7101047), за исключением PS 9910140 (167%), K- (127%).

Табл. 6. Изменение (%) параметров развития микоризной инфекции по отношению к контролю.

Частота встречаемости Интенсивность развития генотип (F, %) (М, %) КМУ N60P60K60 КМУ N60P60K К-8274 -10,1 -44,1* 0 -77,3* Franklin 18,2 -81,8* 32,0 -92,8* Lifter -2,9 -59,6* 28,8 -73, Скиф -60,9* -37,2* -67,5* -60,0* Триумф -28,6* нд -1,8 нд K-3358 -48,2* -55,0 -60,6* -67, PS610324 -42,2* -75,0* -61,6* -96,5* *-Значение достоверно отличается от контроля при Р0,95;

нд – нет данных Не обнаружено достоверной корреляции между изменением параметров F, М, а и семенной продуктивности растений при инокуляции КМУ, а также между изменением этих параметров и надземной биомассы растений. Изменение параметров F, М, а не коррелировало с изменением содержания белка в семенах при инокуляции КМУ.

Анализ параметров, характеризующих развитие АФС показал достоверное увеличение количества клубеньков по z-критерию знаков (Р0,95%) при инокуляции растений КМУ по сравнению с контролем и их уменьшение при внесении N60P60K60 в 2002, 2003 и 2004 гг. В среднем за три года клубенькообразование повысилось при инокуляции КМУ по сравнению с контролем от 1% (Shawnee) до 200% (PS 7101044). В варианте с N60P60K количество клубеньков уменьшалось от -4% (PS 610152) до -63% (К-1693) (табл. 7).

Измерение нитрогеназной активности показало ее достоверное увеличение по z-критерию знаков (Р0,95%) в 2002 г. при инокуляции КМУ, в 2003 и 2004 гг.

четких тенденций в изменении данного параметра не обнаружено. В варианте с N60P60K60 значения нитрогеназной активности достоверно уменьшались по z критерию знаков (Р0,95%) в 2002, 2003 и 2004 гг. В среднем за три года увеличение данного параметра наблюдалось у большинства генотипов в варианте с инокуляцией КМУ по отношению к контролю на 4% (PS 610324) – 74% (К-3358). Исключение составили Shawnee (-7%), PS 9910188 (-8%), PS 9910134 (-13%), PS 810765 (-2%), PS 610152 (-16%) и К-3064 (-10%). В варианте с N60P60K60 значения нитрогеназной активности уменьшались в среднем за три года в пределах от -10% (PS 7101044) до -64% (PS 810240) (табл. 8).

Уменьшение количества клубеньков и нитрогеназной активности в присутствии N60P60K60 свидетельствует о переходе растений на автотрофный тип азотного питания как менее энергозатратный (Andrews, 2009).

Табл. 7. Клубенькообразующая способность генотипов гороха (Pisum sativum L.), изменения (%) относительно контроля, 2002-2004 гг.

КМУ N60P60K Генотип 2002 2003 2004 среднее 2002 2003 2004 среднее К-8274 28,2 72,9* нд -40,3* -25,0 нд 50,5 -32, Franklin 26,8 12,7 20,7 -55,5* -73,0* -55, 20,1 -61, Lifter 7,5 27,5 6,2 -37,3* -58,8* -53, 13,7 -49, Скиф 5,5 35,5* 4,5 -59,0* -71,0* -27, 15,2 -52, Триумф 14,1 23,7 47,6* -32,8* -74,6* -28, 28,5 -45, К-3358 26,0* 14,3 -1,4 -23,1 -61,9* -79,7* 13,0 -54, PS610324 40,3 65,6* 53,3 -35,5 -12,5 53,1 -16, *-Значение достоверно отличается от контроля при Р0,95, нд – нет данных Табл. 8. Нитрогеназная активность генотипов гороха (Pisum sativum L.), изменения (%) относительно контроля, 2002-2004 гг.

КМУ N60P60K Генотип 2002 2003 2004 среднее 2002 2003 2004 среднее К-8274 58,7* 75,9* нд -39,7* -41,4* нд 67,3 -40, Franklin 8,9 31,9* 45,4 -48,2* -42,5* -63,6* 29,0 -51, Lifter 37,0* 22,5 31,8 -26,0* -22,5* -68,2* 30,4 -38, Скиф 4,9 16,5* 4,9 -37,5* -55,7* -51,2* 8,8 -48, Триумф 11,2 5,6 100,0* -32,7* -51,4* -27,8 -37, 38, К-3358 7,1 63,2* 152,2* -42,8* -23,7* -56,5* 74,2 -41, PS610324 34,0* -32,2* 8,3 -51,3* -75,8* -33, 3,6 -53, *-Значение достоверно отличается от контроля при Р0,95;

нд – нет данных Достоверной корреляции между изменением числа клубеньков и семенной продуктивности при инокуляции КМУ обнаружено не было, как и между изменением числа клубеньков и массы растения, а также числа клубеньков и содержания белка в семенах. Не было обнаружено корреляции между изменением нитрогеназной активности и перечисленными выше параметрами урожая.

Таким образом, итоги трех лет полевых испытаний показали отсутствие четкой повторяющейся взаимосвязи между изменением параметров, характеризующих развитие симбиотических систем и параметров урожая и, следовательно, последние были выбраны как главные критерии оценки эффективности взаимодействия растений с комплексом ППМ.

Изучение реакции комплекса “растение + грибы АМ + клубеньковые бактерии” на воздействие КМУ и N60P60K60 с помощью факторного анализа показало уровень интеграции между всеми партнерами симбиоза 22%, что говорит о наличии взаимного влияния партнеров друг на друга, эффективность которого ограничена значительным влиянием неконтролируемых факторов на систему в виде внешних условий, разнородности выборки генотипов и пр.

Также для данной выборки генотипов была показана обратная взаимосвязь между числом клубеньков и числом арбускул, что указывает на способность системы к саморегуляции, в которой растения оптимизируют соотношение эндосимбионтов.

Изучение динамики развития растений. Проростки растений в варианте с инокуляцией КМУ появлялись на 2-3 дня раньше, чем в других вариантах выращивания, и отличались более зеленой окраской листьев, что свидетельствует о более высокой интенсивности фотосинтеза. В целом продолжительность вегетационного периода была в среднем на трое суток больше, чем в контроле. Обнаружена достоверная корреляция между изменением продолжительности вегетационного периода и семенной продуктивности по данным за три года, r =0,49 (Р0,95;

N=26).

В сотрудничестве с Наумкиной Т. С. был разработан протокол селекции сортов бобовых культур нового типа, высокоэффективных при взаимодействии с ППМ. Отличительной чертой протокола является создание селекционного питомника с повышенным содержанием и биоразнообразием ППМ, что может быть достигнуто ежегодным внесением КМУ (500 кг/га) и на его фоне отбор высокопродуктивных растений поколения F4. Примером подобной селекции служит создание сорта Триумф (см. Материалы и методы).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В сельскохозяйственной практике никогда не использовался комплексный симбиоз между бобовыми растениями, грибами АМ, ризобиями и PGPB (ризосферными/эндофитными). Взаимодействие с этими микроорганизмами, входящими в состав КМУ, в случае симбиотически эффективных генотипов поддерживается растением и использование их в комплексе способствует усилению функций каждой группы ППМ, их взаимодополнению, повышению конкурентоспособности и устойчивости в почве.

В результате проведенной работы показано, что эффект применения КМУ не уступает N60P60K60 и имеет ряд преимуществ по сравнению с последним, а именно: 1. более стабильный положительный эффект на накопление биомассы растений;

2. оптимизация развития, особенно в неблагоприятных условиях;

3.

повышение содержания белка в семенах, увеличение его общего сбора.

Впервые изучен генетический полиморфизм гороха по эффективности взаимодействия с КМУ, содержащем основные виды ППМ, и отобраны контрастные по этому признаку генотипы. Выявлены перспективные генотипы, отличающиеся высокой симбиотической отзывчивостью при взаимодействии с КМУ, с целью использования в селекции по созданию новых сортов. Показано, что отбор таких генотипов должен сопровождаться селекцией на уровне индивидуальных растений. В результате сравнительного анализа развития эндосимбиотических систем и параметров урожая показано, что в качестве параметров, характеризующих симбиотическую эффективность растений, целесообразно использовать изменение уровня накопления надземной биомассы, семенной продуктивности и содержания белка в семенах при инокуляции КМУ по сравнению с контролем и вариантом с N60P60K60. На основании полученных данных разработана методология анализа исходного материала для селекции гороха на повышение эффективности взаимодействия с ППМ и принципы селекции гороха с учетом нового сельскохозяйственно значимого признака “эффективность взаимодействия с ППМ”. В качестве первого опыта подобной селекции был создан сорт Триумф, по продуктивности не уступающий сортам-стандартам при традиционной технологии возделывания и повышающий ее как минимум на 10% при инокуляции КМУ.

Дальнейшая работа предполагает поиск нового материала для селекции, создание сортов с высокой эффективностью взаимодействия с ППМ, разработка оптимального соотношения КМУ и N60P60K60 при совместном применении для получения максимального эффекта на развитие растений.

ВЫВОДЫ 1. Впервые показано, что в целом по 26 генотипам гороха по данным трех лет инокуляция комплексным микробным удобрением (КМУ) влияет на параметры накопления биомассы растений и урожая семян (20% и 17%, соответственно) на уровне N60P60K60 (21% и 15%, соответственно).

2. Выявлена достоверная отрицательная корреляция между массой семян растения в контроле и изменением этого параметра при инокуляции КМУ (и при внесении N60P60K60), что указывает на генетически детерминированную оптимизацию развития растений гороха при обоих видах обработки. Впервые показано, что по сравнению с N60P60K60 эффект от применения КМУ более стабилен по годам.

3. Установлено, что инокуляция КМУ увеличивает скорость прорастания семян гороха и продлевает вегетационный период растений на 2-4 дня, что способствует дополнительному накоплению белка в семенах и биомассы в случае эффективных при взаимодействии с ППМ генотипов. Впервые показано, что инокуляция КМУ увеличивает содержание белка в семенах как у высокоотзывчивых на инокуляцию ППМ генотипов (например, PS 7101149, PS810240, Shawnee), так и низкоотзывчивых (например, Lifter, PS 9910135, PS 9910134).

4. Показано, что исследуемые генотипы обладают высоким полиморфизмом по признаку “эффективность взаимодействия с комплексом ППМ”, что доказывает возможность и целесообразность селекции сортов бобовых с учетом симбиотического потенциала.

5. В результате работы отобраны генотипы, контрастные по отзывчивости на инокуляцию КМУ и внесение N60P60K60. Впервые показано, что в случае определенных генотипов инокуляция КМУ более эффективна, чем применение N60P60K60 (Franklin).

6. Впервые показано отсутствие корреляции при комплексной сравнительной оценке развития эндосимбиотических систем и накопления биомассы (и изменения белка в семенах). Следовательно, показано, что главным критерием, по которому следует оценивать эффективность взаимодействия растений с комплексом ППМ, является относительное накопление биомассы растений и белка в семенах по отношению к контролю.

7. Разработана методология анализа исходного материала для селекции гороха на повышение эффективности взаимодействия с ППМ 8. Разработаны принципы селекции гороха на повышение эффективности взаимодействия с ППМ. Рекомендован для использования новый сельскохозяйственно значимый признак в селекции бобовых: “эффективность взаимодействия с ППМ”.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Борисов А.Ю., Васильчиков А.Г., Ворошилова В.А., Данилова Т.Н., Жернаков А.И., Жуков В.А., Королева Т.А., Кузнецова Е.В., Мадсен Л., Моффет М., Наумкина Т.С., Неманкин Т.А., Павлова З.Б., Пинаев А.Г., Радутоиу С., Розов С.М., Соловов И.И., Стоугаард Й., Топунов А.Ф., Уиден Н.Ф., Цыганов В.Е., Штарк О.Ю., Тихонович И.А. Регуляторные гены гороха посевного (Pisum sativum L.), контролирующие развитие азотфиксирующих клубеньков и арбускулярной микоризы: фундаментальные и прикладные аспекты // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т.43. №3. С. 265 271.

2. Штарк О.Ю., Данилова Т.Н., Наумкина Т.С., Васильчиков А.Г., Чеботарь В.К., Казаков А.Е., Жернаков А.И., Неманкин Т.А., Прилепская Н.А., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Анализ исходного материала гороха посевного (Pisum sativum L.) для селекции сортов с высоким симбиотическим потенциалом и выбор параметров для его оценки // Экологическая генетика. 2006. T.4. №2. С.

36-42.

3. Борисов А.Ю., Наумкина Т.С., Штарк О.Ю., Данилова Т.Н., Цыганов В.Е.

Эффективность использования совместной инокуляции гороха посевного (Pisum sativum L.) грибами арбускулярной микоризы и клубеньковыми бактериями для повышения продуктивности растений в устойчивом экологически ориентированном земледелии // Доклады Россельхозакадемии.

2004. №2. С. 12-14.

Публикации в других изданиях:

1. Штарк О.Ю., Борисов А.Ю., Наумкина Т.С., Ахтемова Г.А., Жуков В.А., Данилова Т.Н., Чеботарь В.К., Васильчиков А.Г., Барбашов М.В., Зотиков В.И., Тихонович И.А. Создание новых высокоэффективных сортов бобовых при взаимодействии с полезными почвенными микроорганизмами // Факт.

експ. евол. органiзмiв: зб. наук. пр. / НАН України, АМН України, Укр. т-во генетикiв i селекционерiв iм. М.I. Вавилова;

редкол.: В.А. Кунах (голов ред.) [та iн.]. – К.: Логос, 2003-2010. T. 8: Присвяч. 110-рiччю вiд дня народж.

Теодосiя Григоровича Добржаньского. 2010. C. 472-475.

2. Borisov A.Y., Danilova T.N., Shtark O.Y., Solovov I.I., Kazakov A.E., Naumkina T.S., Vasilchikov A.G., Chebotar V.K., Tikhonovich I.A. Tripartite symbiotic system of pea (Pisum sativum L.): applications in sustainable agriculture / Dakora F.D., Chimphango B.M., Valentine A.J., Elmerich С., Newton W.E. (eds) // Biol.

Nitrogen Fixation: Towards Poverty Alleviation through Sustainable Agriculture.

Proceedings of 15th Int. Cong. Nitrogen Fixation and 12th Int. Conf. African Association Biol. Nitrogen Fixation. Springer Science and Business Media BV.

2008. P. 15-17.

3. Borisov A.Y., Danilova T.N., Koroleva T.A., Naumkina T.S., Pavlova Z.B., Pinaev A.G., Shtark O.Y., Tsyganov V.E., Voroshilova V.A., Zhernakov A.I., Zhukov V.A., Tikhonovich I.A. Pea (Pisum sativum L.) regulatory genes controlling development of nitrogen-fixing nodule and arbuscular mycorrhiza:

fundamentals and application // Biologia. 2004. V. 59/Suppl. 13 P. 137-144.

4. Borisov A.Y., Voroshilova V.A., Zhukov V.A., Zhernakov A.I., Danilova T.N., Shtark O.Y., Naumkina T.S., Tsyganov V.E., Madsen L.H., Sanjuan J., Olivares J., Priefer U.B., Ellis N., Stougaard J., Tikhonovich I.A. Pea (Pisum sativum L.) regulatory genes controlling development of nitrogen-fixing nodules and arbuscular mycorrhiza / In: Tikhonovich I., Lugtenberg B., Provorov N. (eds.) // Biol. Plant Microbe Interactions. V.4. Proceedings of the 11th Int. Cong. Molec. Plant-Microbe Interactions, St.-Petersburg, July 18-26, 2003. IS-MPMI, St. Paul, Minnesota, USA, 2004. P. 502-505.

5. Чеботарь В.К., Казаков А.Е., Ерофеев С.В., Данилова Т.Н., Наумкина Т.С., Штарк О.Ю., Тихонович И.А., Борисов А.Ю. Способ получения комплексного микробиологического удобрения // Патент No 2318784, зарегистрирован 10.03.2008.

6. Данилова Т.Н., Штарк О.Ю., Наумкина Т.С., Цыганов В.Е., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Ресурсы повышения продуктивности растений гороха за счет симбиотических взаимодействий с полезной почвенной микрофлорой // Тезисы 9-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых “Биология-наука ХХI века”. Пущино, Россия, 18-22 апреля 2005. С.

345.

7. Danilova T.N., Shtark O.Y., Naumkina T.S., Tsyganov V.E., Borisov A.Y. Highly beneficial plant-microbe system for sustainable agriculture // Abstracts of 11th Int.

Cong. Molec. Plant-Microbe Interactions, 18-26 July, 2003, St.-Petersburg, Russia.

P. 346.

8. Данилова Т.Н., Борисов А.Ю., Королева Т.А., Наумкина Т.С., Цыганов В.Е., Штарк О.Ю., Тихонович И.А. Ресурсы повышения продуктивности бобовых растений за счет симбиотических взаимодействий с почвенной микрофлорой // Материалы 1-ой региональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, 26- марта 2002. C. 15-16.

9. Borisov A.Y., Danilova T.N., Koroleva T.A., Naumkina T.S., Pinaev A.G., Shtark O.Y., Tsyganov V.E., Voroshilova V.A., Zhernakov A.I., Zhukov V.A., Tikhonovich I.A. Identification of pea (Pisum sativum L.) symbiotic genes controlling development of its symbiotic systems: nitrogen-fixing nodules and arbuscular mycorrhiza/Сost action 8.38. // Managing Arbuscular Mycorrhizal Fungi for Improving Soil Quality and Plant Health in Agriculture. Dijon, France, 2 4 June 2005.