Кинетика образования и свойства промежуточных и неправильно свернутых мономерных и агрегированных форм актина
На правах рукописи
ПОВАРОВА Ольга Игоревна КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ И СВОЙСТВА ПРОМЕЖУТОЧНЫХ И НЕПРАВИЛЬНО СВЕРНУТЫХ МОНОМЕРНЫХ И АГРЕГИРОВАННЫХ ФОРМ АКТИНА 03.00.03 – Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2005 2
Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор физико-математических наук Научные руководители:
Константин Константинович ТУРОВЕРОВ, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург кандидат биологических наук Ирина Михайловна КУЗНЕЦОВА, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Владимир Иосифович ВОРОБЬЕВ, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор биологических наук, Надежда Владимировна КУЛЕВА Биолого-почвенный факультет, СПбГУ, Санкт-Петербург Биологический факультет Московского
Ведущая организация:
Государственного Университета имени М.В. Ломоносова
Защита состоится "9" декабря 2005 года в 13 ч. на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.
Автореферат разослан "8" ноября 2005 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е. В. Каминская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Вопрос о том, как белки сворачиваются в уни кальное компактное высокоорганизованное функционально-активное состояние, является одним из центральных вопросов физико-химической и клеточной биоло гии. Основным подходом к решению проблемы фолдинга белков является изучение процессов их сворачивания–разворачивания и характеристика возникающих при этом промежуточных частично-свернутых и неправильно свернутых состояний.
Стабилизация структуры неправильно свернутых состояний, возникающих в процессе сворачивания–разворачивания белков, часто осуществляется за счет их ассоциации и агрегации. При этом могут возникать как неупорядоченные аморфные агрегаты, так и упорядоченные структуры – амилоидные фибриллы (Kelly, 2000;
Fink, 1998). Возникновение неправильно свернутых аморфных агрегированных форм рекомбинантных белков и их аккумуляция в телах включения (Frankel et al., 1990;
Wetzel, 1992;
Speed et al., 1996) является существенной проблемой биотехно логии. Фибриллогенез является причиной возникновения ряда тяжких заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, прионные болезни и т.д., ко торые иногда называют конформационными болезнями (Carrell and Gooptu, 1998;
Kelly, 1997;
Harper and Lansbury 1997;
Koo et al., 1999;
Hashimoto and Masliah, 1999;
Fink, 1998). Таким образом, изучение структуры и путей образования денатуриро ванных частично-свернутых агрегированных (ассоциированных) форм белков важ но не только для решения фундаментальной проблемы фолдинга белка, но имеет также большое практическое значение.
Большинство исследований по изучению фолдинга белков выполнено на не больших однодоменных белках, для которых процесс разворачивания является об ратимым. Актуальным является изучение путей сворачивания более сложных мультидоменных белков, а также изучение возникающих при этом промежуточных и неправильно свернутых агрегированных форм белков. Актин, один из основных белков системы мышечного сокращения и цитоскелета эукариотических клеток, – чрезвычайно интересная модель для такого рода исследований.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении процессов сворачивания–разворачивания глобулярного актина. В задачи исследования входи ло:
1. Изучение кинетики разворачивания актина и образования инактивированно го актина под действием гуанидингидрохлорида (GdnHCl) различной концентра ции, поиск возможных кинетических интермедиатов, возникающих при реализации этих процессов.
2. Выяснение места инактивированного актина в процессах сворачивания– разворачивания белка.
3. Изучение влияния GdnHCl на свойства инактивированного актина.
4. Выяснение причин необратимости процесса разворачивания актина in vitro.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разворачивание актина проходит через образование двух, до этого неизвест ных, кинетических интермедиатов N* и U*, возникающих на ранних стадиях дена турации актина.
2. В состоянии U* макромолекула актина существенно развернута, однако ее свойства отличаются от свойств полностью развернутого актина.
3. Инактивированный актин, долгое время считавшийся промежуточным со стоянием на пути разворачивания–сворачивания белка, является монодисперсным ассоциатом лишь в водных растворах. В присутствии GdnHCl происходит агрегация ассоциатов, обусловленная изменением поверхностного заряда инактивированного актина.
Научная новизна. Показано существование двух ранее неизвестных кинетиче ских интермедиатов, возникающих на ранних стадиях денатурации актина (N* и U*). Охарактеризован существенно развернутый интермедиат U* и, в частности, показано, что свойства этого интермедиата отличаются от свойств полностью раз вернутого актина. Предложена новая схема процессов сворачивания– разворачивания актина, согласно которой обнаруженные кинетические интермедиа ты являются промежуточными состояниями на пути разворачивания актина, в то время как инактивированный актин является ассоциатом частично-свернутых дена турированных макромолекул белка.
Показано, что инактивированный актин является монодисперсным ассоциатом лишь в водном растворе. В присутствии GdnHCl происходит агрегация ассоциатов.
Размеры агрегатов инактивированного актина зависят от концентрации денатуран та. Эффект объяснен изменением поверхностного заряда инактивированного актина при его взаимодействии с ионами GuH+.
Теоретическое и практическое значение. Новые представления о процессах сворачивания–разворачивания актина, полученные в настоящей работе, существен ны для понимания процессов фолдинга этого белка. Обнаружение и характеристика ранее неизвестных интермедиатов, а также выяснение роли инактивированного ак тина в процессе сворачивания–разворачивания, может явиться основой для прове дения дальнейших исследований, направленных на поиск путей ренатурации пол ностью развернутого актина in vitro. Результаты работы используются при проведе нии лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ.
Существенной методической разработкой является использование параметри ческого метода представления экспериментальных данных по денатурации белков (Бурштейн, 1976) для анализа результатов кинетических экспериментов. Этот под ход, позволивший охарактеризовать свойства вновь обнаруженного кинетического интермедиата актина U*, не только широко используется в нашей лаборатории, но и другими исследователями (см. например, Altschuler et al., 2005).
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Ме ждународном симпозиуме “Biological motility: new trends of research” (Пущино, 2001, 2004), на III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на 8 й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена с использованием обору дования ЦКП "Материаловедение и диагностика в передовых технологиях" при фи нансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 00-04-49224, 02-04-06995_мас, 02-04-81013_Бел, 04-04-49622), Программы МКБ РАН, и INTAS (грант 01-2347).
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, трех Глав, Выводов и Списка публикаций. В первой главе дан обзор литературы, посвя щенной проблеме фолдинга белков и структуре актина. Во второй главе приводится описание использованных в работе материалов и методов исследования. И, нако нец, в третьей главе изложены результаты и их обсуждение. Диссертация изложена на 115 страницах, содержит 6 таблиц и 34 рисунка. Библиография включает 129 на именований.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы. В работе использовались препараты G-актина, выделенные из скелетных мышц кролика с использованием стандартной методики (Pardee and Spu dich, 1982). Контроль за нативностью препаратов актина осуществляли путем реги страции параметра А, характеризующего положение спектра флуоресценции (см.
ниже). Использовали препараты актина, для которых величина А была не менее 2.53, что соответствует содержанию инактивированного актина не более 4 % (Turoverov et al., 1976). Актин в буфере G (0.2 мМ АТФ, 0.1 мМ CaCl2, 1 мМ NaN3, 0.5 мМ DTT, 5 мМ трис-HCl, pH 8.2) хранили на льду и использовали в течение не дели, ежедневно контролируя нативность препарата. Инактивированный актин по лучали из G-актина путем его инкубирования при температуре 70 °С в течение 30 мин. Концентрацию актина в растворе определяли путем регистрации оп тической плотности с помощью спектрофотометра фирмы Hitachi (Япония) с использованием известных данных о коэффициенте молярной экстинкции актина E280 = 1.09 (мг/мл)-1см-1 (Rees and Young, 1967). В большинстве экспериментов кон центрация растворов актина составляла от 0.1 до 0.44 мг/мл.
В работе использованы 1,8-анилино-нафталин сульфонат (АНС) и NaN3 (Serva, США);
формамид и DTT (Wako, Япония);
АТФ, трис, CaCl2, гуанидингидрохлорид (GdnHCl) и мочевина (Sigma, США) без дополнительной очистки.
Методы. Флуоресцентные измерения были выполнены с использованием спектрофлуориметрической установки со стационарным возбуждением (Туроверов и др., 1998). Спектрофлуориметр оборудован термостатом, поддерживающим по стоянную температуру в кювете и в специальной камере, где образцы выдерживали перед измерениями.
Флуоресценцию возбуждали на длинноволновом краю спектра поглощения белка, т.е. в условиях, когда флуоресценция обусловлена исключительно триптофа новыми остатками. Положение и форму спектра флуоресценции характеризовали величиной параметра А = (I320 / I365)297, где I320 и I365 – интенсивности флуоресцен ции, зарегистрированные при длинах волн 320 и 365 нм, соответственно;
длина вол ны возбуждающего света 297 нм (Туроверов и др., 1998). Значение величины параметра А и спектры флуоресценции были исправлены на спектральную чувстви тельность установки. Интенсивность флуоресценции гидрофобного зонда АНС ре гистрировали при возб = 365 нм и рег = 480 нм.
Все кинетические эксперименты были выполнены в микрокюветах 101.016-QS 55 мм (Helma, Германия). При проведении кинетических экспериментов перевод белка в растворы с различной концентрацией GdnHCl выполнялся путем ручного смешивания раствора белка (50 мкл) с буфером, содержащим соответствующую концентрацию GdnHCl (350 мкл). В экспериментах по ренатурации необходимую концентрацию GdnHCl получали разведением растворов актина в 4 М GdnHCl G буфером. Измерение быстрой кинетики выполняли с помощью аппаратуры стоп флоу MOS 450 фирмы Bio-Logic в лаборатории д-ра Форже (СЕА, Гренобль). Ко нечная концентрация GdnHCl в растворах контролировалась по показателю пре ломления с использованием рефрактометра ИРФ-454Б (ЛОМО, Россия).
Для построения кинетических кривых анизотропии флуоресценции использо V V вали временные зависимости вертикальной ( I V ) и горизонтальной ( I H ) составляю щей интенсивности флуоресценции, на основании которых определяли анизотро пию:
( )( ) r = I V GI H / I V + 2GI H V V V V где G – коэффициент, характеризующий различие чувствительности установки к вертикально и горизонтально поляризованному свету ( G = I VH / I H ). Кинетические H кривые параметра А построены на основании измерения временных зависимостей интенсивностей флуоресценции, зарегистрированных при длинах волн 320 и нм.
Для анализа зарегистрированных кинетических зависимостей интенсивности флуоресценции был использован метод “фазовых диаграмм” (Бурштейн, 1976), ос нованный на построении параметрических зависимостей двух независимых экстен сивных характеристик, в качестве которых были использованы интенсивности флуоресценции, измеренные при длинах волн 320 и 365 нм. Параметром выступало время, прошедшее после добавления к нативному актину растворов GdnHCl раз личной концентрации.
Регистрация спектров КД дальней УФ-области была выполнена с использова нием дихрографа Mark V (Jobin-Yvon, США). Длина оптического пути используе мых кювет 0.1 см. При построении КД спектра белка учитывался спектр КД раство рителя.
Кинетику затухания фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ) реги стрировали с помощью автоматизированного высокочувствительного устройства с монохроматорами в каналах возбуждения и регистрации (Институт фотобиологии НАН, Минск). Возбуждение фосфоресценции проводили при = 297 нм, регистра цию кинетики затухания фосфоресценции при = 445 нм. ФКТ актина измеряли в кварцевой кювете с длиной оптического пути, равной 2 мм. Кислород из растворов белка удаляли с помощью сульфита натрия. Время инкубации с сульфитом натрия составляло 7 мин.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Актин, один из основных белков сис темы мышечного сокращения, является глобулярным двухдоменным белком. При низкой ионной силе актин является моно мером (G-актин), в присутствии нейтраль ных солей он полимеризуется с образовани ем двухнитевой спирали (F-актин). F-актин является основным компонентом тонких филаментов мышечной ткани. В состав макромолекулы входит одна молекула АТФ и прочно связанный двухвалентный катион Рис. 1. Пространственная структура Ca2+ (Kabsch et al., 1990, рис. 1).
молекулы актина.
До недавнего времени считалось, что процесс сворачивания–разворачивания актина проходит через стадию образования промежуточного состояния, получив шего название инактивированного актина (Lewis et al., 1963;
Lehrer and Kerwar, 1972;
Bertazzon et al., 1990;
Turoverov et al., 1999;
Schuler et al., 2000). Было показа но, что денатурированное состояние, в котором актин не способен к полимеризации (инактивированный актин) возникает при отщеплении катиона кальция, в результа те тепловой денатурации, под воздействием умеренных концентраций мочевины или GdnHCl, путем диализа из растворов 8 М мочевины или 6 М GdnHCl и даже спонтанно при длительном хранении препаратов (Kuznetsova et al., 1999a).
Характер равновесных (а точнее квазиравновесных) зависимостей ряда флуо ресцентных характеристик актина от концентрации гуанидингидрохлорида (GdnHCl), казалось бы однозначно свидетельствует о существовании двух последо вательных конформационных переходов и о существовании области концентраций GdnHCl, в которой актин находится преимущественно в инактивированном состоя нии (рис. 2). На основании подобного рода данных во всех без исключения работах, ботах, посвященных денатурации актина, считалось, что инактивированный актин (I) является промежуточным состоянием между нативным (N) и полностью развер нутым (U) состоянием белка N I U.
В эту схему, однако, совершенно не укладываются данные о том, что инактивиро ванный актин является термодинамически стабильным монодисперсным ассоциа том, состоящим из 15 мономерных единиц, (Kuznetsova et al., 1999b). В связи с этим в настоящей работе было предпринято более тщательное, с привлечением новых методических подходов, исследование равновесных (квазиравновесных) денатура ционных зависимостей, а также кинетики разворачивания актина и образования инактивированного актина.
I A r 1.0 0. 2.5 Рис. 2. Изменение параметров собственной флуоресценции актина под действием GdnHCl 0. 0. 2.0 (Kuznetsova et al., 1999a). 1 – интенсивность флуоресценции, зарегистрированная при длине 0. 1.5 волны 320 нм (I320);
2 – параметр A= (I320/I365)297;
0. 3 0.10 3 – анизотропия флуоресценции, r;
1.0 открытые и закрытые символы – эксперимен 0.4 0. ты по денатурации и ренатурации соответст 0. венно.
0. 0. 0. 0 1 2 3 4 [GdnHCl], M Кинетика денатурации актина Переход от нативного к инактивированному актину необратим. Поэтому в об ласти концентраций GdnHCl от 0 до 0.8 М зависимости флуоресцентных характери стик актина от концентрации денатуранта носят квазистационарный характер. Это обстоятельство, а также то, что инактивированный актин, является ассоциатом и должен образовываться путем постепенного наращивания массы, определило необ ходимость изучения кинетики денатурации актина.
Существенно развернутый кинетический интермедиат, предшествующий образованию инактивированного актина. Характер кинетических зависимостей интенсивности флуоресценции, параметра А и анизотропии триптофановой флуо ресценции (кривые с минимумом при концентрациях GdnHCl 1.2 – 1.5 М;
рис. 3) а б в 0.0 N 0.0 N 0.16 I 1.0 2. Инт. фл., отн. ед.
Анизотропия фл.
0.7 0.14 1. Параметр А 0. 2. I 1. 0. 0.6 N 1.2 1. 1. 0. 0. 0.4 1.5 I 1. 1.8 1.5 4. 1. 0.2 0. U U 1. 4. 0. 0. 0 180 360 0 180 24 20 ч ч Время, мин ч Время, с Время, с Рис. 3. Кинетические кривые денатурации актина под действием GdnHCl различной концентрации. (а) Изменение интенсивности собственной флуоресценции актина при рег = 320 нм. (б) Изменение параметра А. (в) Изменение анизотропии флуоресценции.
Числа – концентрация GdnHCl (М).
свидетельствует о том, что переход из нативного состояния в инактивированное осуществляется через некоторое промежуточное состояние, в котором интенсив ность флуоресценции, параметр А и величина анизотропии флуоресценции меньше, чем в нативном и в инактивированном состояниях. Как известно, среди трех кон формационных состояний актина (нативного, инактивированного и полностью раз вернутого), наименьшие значения интенсивности при длине волны 320 нм, величи ны параметра А и величины анизотропии флуоресценции имеет актин в полностью развернутом состоянии. На основании этого было сделано заключение, что переход от нативного к инактивированному актину осуществляется через стадию сущест венного разворачивания макромолекулы белка:
k k U, k где ki – константы скорости соответствующих процессов и U* существенно раз вернутый кинетический интермедиат, флуоресцентные свойства которого сходны со свойствами полностью развернутого актина.
В предположении справедливости предложенной кинетической схемы были определены константы скоростей ki, и их зависимость от концентрации GdnHCl (рис. 4). Константа скорости k3, как и следовало ожидать, практически равна нулю.
При небольших концентрациях GdnHCl величина k2 значительно больше, чем вели чина k1. Значит, лимитирующей стадией при этих условиях является стадия разво рачивания белка, в то же время после разворачивания молекулы быстро переходят в состояние инактивированного актина. С увеличением концентрации GdnHCl кон станта скорости k1 увеличивается, а константа скорости k2 уменьшается. Это приво дит к накоплению существенно развернутого 0.3 0. интермедиата на ранних стадиях в процессе денатурации и, как следствие, к появлению 0.2 k 0.04 характерного минимума на кинетических k k2, k кривых.
0.1 k Проведено измерение кинетических за 0. 0.0 висимостей интенсивности флуоресценции k актина при его разворачивании под действи 0. ем мочевины и формамида различной кон 0.0 0.5 1.0 1.5 2. [GdnHCl], M центрации, аналогичные тем, которые были Рис. 4. Зависимость констант скоро стей (ki) денатурации актина от концен- выполнены при использовании в качестве трации GdnHCl. денатуранта GdnHCl. Полученные данные подтверждают справедливость заключения о том, что возникновению инактивиро ванного актина предшествует стадия существенного разворачивания макромолеку лы белка.
Кинетика образования инактивированного актина. Для изучения кинетики образования инактивированного актина, возможно, более удобно использовать ха рактеристики, которые отражают изменение содержания только этого компонента системы и не зависят от наличия других компонент. Такой характеристикой может быть, в первую очередь, интенсивность флуоресценции АНС, и, в какой-то мере, – интегральная интенсивность и среднее время затухания фосфоресценции при ком натной температуре.
Флуоресценция АНС. Известно, что АНС не связывается с нативным и полно стью развернутым актином, но эффективно связывается с инактивированным акти ном и интенсивно флуоресцирует в его присутствии в растворе. Есть все основания полагать, что краситель не будет связываться с вновь обнаруженным существенно развернутым кинетическим интермедиатом, предшествующим образованию инак тивированного актина. А если это так, то кинетические зависимости интенсивности флуоресценции АНС при разворачивании актина GdnHCl будут отражать исключи тельно изменение содержания инактивированного актина в системе.
Кинетические зависимости изменения интенсивности флуоресценции АНС при переводе нативного актина в растворы с различным содержанием GdnHCl (рис.
5, а) свидетельствуют о том, что начальная скорость образования продукта, связы 1.0 0. а б 1. 1. 0. 1. IАНС, отн. ед.
0. 0. 0. 0. 1. 0. 0.2 0. 0. 0. 4. 0. 0 1 2 3 0 100 200 300 400 [GdnHCl], M Время, с Рис. 5. Денатурация актина под действием GdnHCl, зарегистрированная путем измере ния интенсивности гидрофобного зонда АНС. (а) Кинетические кривые денатурации ак тина под действием GdnHCl различной концентрации. Числа – концентрация GdnHCl (М);
(б) квазистационарные зависимости интенсивности флуоресценции АНС от кон центрации GdnHCl, измеренные через 10 мин (1) и через 24 ч (2) инкубации в растворах GdnHCl.
вающего АНС, возрастает по мере увеличения конечной концентрации GdnHCl от до 1.2 М. Однако при концентрациях GdnHCl 1.0, 1.1 и 1.2 М скорость образования этого продукта вскоре существенно замедляется, так что через 10 мин после начала инкубации актина в растворах GdnHCl максимальная концентрация этого продукта имеет место при конечной концентрации 0.9 М GdnHCl. При меньших концентра циях этот процесс осуществляется дольше из-за низкой скорости превращения N U*, а при более высоких – из-за замедления процесса U* I. Зависимо сти интенсивности флуоресценции АНС от концентрации GdnHCl, зарегистриро ванные через 10 мин и через 24 ч после начала инкубации, существенно различают ся (рис. 5, б).
Фосфоресценция при комнатной температуре. К настоящему времени уста новлено, что некоторые белки фосфоресцируют при комнатной температуре. Это обусловлено тем, что необходимая жесткость микроокружения триптофановых ос татков в этих белках обеспечивается структурой самого белка (Strambini, 1989). Ак тин относится к числу белков, которые фосфоресцируют при комнатной температу ре. Более того, при переходе от нативного актина к инактивированному значение среднего времени затухания ФКТ возрастает в несколько раз (Мажуль и др., 2001). Очевидно, что существенно развернутый кинетический интермедиат не дол жен фосфоресцировать при комнатной температуре. Поэтому его присутствие в системе должно приводить к уменьшению интегральной интенсивности фосфорес ценции и не должно сказываться на среднем времени затухания фосфоресценции, которое будет определяться только соотношением вкладов нативного и инактиви рованного актина в системе. Эти особенности фосфоресценции актина в различных структурных состояниях были использованы для того, чтобы более подробно оха рактеризовать процесс образования инактивированного актина. Если бы процесс образования инактивированного актина из существенно развернутого кинетическо го интермедиата являлся бы одностадийным процессом, то значение среднего вре мени жизни фосфоресценции должно было бы быть равным значению соответст вующей характеристики инактивированного актина во всем диапазоне изменения интегральной интенсивности от нуля (когда в системе присутствует в основном ак тин в состоянии U*) до максимального значения. Однако значение этой характери стики возрастает симбатно с увеличением Iинт (рис. 6), и это означает, что инакти вированный актин – ассоциат, состоящий из 15 мономерных единиц (Kuznetsova et al., 1999a), – образуется из существенно развернутого состояния путем постепенно го наращивания массы ассоциата:
I1 I15.
U* In Как и следовало ожидать, время достижения максимальных значений Iint и ФКТ, отвечающих образованию инактивированного актина, сокращается при уве личении содержания белка в растворе (рис. 6).
400 а б Iинт, отн.ед.
300, мс 4 2 0 30 60 90 0 30 60 24 Время, мин ч Время, мин ч Рис. 6. Денатурация актина под действием 1.8 M GdnHCl. (а) Кинетика изменения средне го времени жизни ФКТ. (б) Кинетика изменения интегральной интенсивности ФКТ. Ко нечное содержание актина составляло 0.8, 1.0, 1.5, 2.0 и 2.5 мг/мл, кривые 2, 3, 4, 5 и 6, со ответственно. Кривая 1 – контроль (инкубация без GdnHCl).
Таким образом, данные, полученные с использованием метода ФКТ, подтвер дили образование существенно развернутого кинетического интермедиата, пред шествующего образованию инактивированного актина, и показали, что образова ние инактивированного актина из существенно развернутого кинетического интер медиата осуществляется путем постепенного наращивания массы образующегося ассоциата.
Специфические взаимодействия актина с GdnHCl Для объяснения причины сложного характера зависимости интенсивности флуоресценции АНС от концентрации GdnHCl в растворах актина (см. рис. 5) были зарегистрированы аналогичные зависимости для ряда других характеристик, в том числе для интенсивности светорассеяния (рис. 7).
1. Светорассеяние, отн. ед.
1. а б Инт. фл. АНС, отн. ед.
2 0.8 0. 0.6 0. 0.4 0. 0.2 0. 0.0 0. 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 [GdnHCl], M [GdnHCl], M Рис. 7. Зависимость интенсивности флуоресценции АНС (а) и светорассеяния (б) от кон центрации GdnHCl для исходно нативного и исходно инактивированного актина, кривые и 2, соответственно.
Сходство характера зависимостей флуоресценции АНС и интенсивности све торассеяния для исходно нативного и исходно инактивированного актина заставля ет искать причину обнаруженных эффектов в универсальном характере взаимодей ствия GdnHCl при его небольших концентрациях в растворе, с макромолекулами белка. Мы объяснили этот эффект взаимодействием групп NH2 катионов GdnHCl (GuH+) с группами C=O групп глутаминовой и аспарагиновой кислот, глутамина и аспарагина, локализованными на поверхности макромолекулы (рис.8). С ростом числа ионов GuH+, связанных с белком, увеличивается количество положительных групп на поверхности белка и при некоторой концентрации GdnHCl в целом исход но отрицательно заряженная макромолекула актина становится нейтральной. При а б Рис. 8. Локализация отрицательно и положительно заряженных групп, а также атомов кислорода групп С=О на поверхности макромолекулы актина.
Панели а и б отличаются друг от друга поворотом молекулы на 180о вокруг вертикальной оси. Темно-серые сферы – отрицательно заряженные атомы кислорода групп OE2 и OD глутаминовой и аспарагиновой аминокислот;
белые сферы – положительно заряженные атомы азота групп NZ, NH1 и NE2 лизина, аргинина и гистидина;
черные сферы – атомы кислорода групп С=О (OE1 Glu, OD1 Asp, OE1 Gln, OD1 Asn).
этом создаются условия агрегации макромолекул актина между собой. Это и явля ется причиной возрастания светорассеяния и связывания молекул АНС, которые встраиваются между макромолекулами актина, образующими ассоциат. При даль нейшем увеличении концентрации GdnHCl число положительно заряженных групп на поверхности макромолекулы белка начинает превышать число отрицательно за ряженных групп. Наличие положительно заряженных групп на поверхности макро молекулы препятствует их агрегации. То обстоятельство, что зависимости интен сивности флуоресценции АНС и интенсивности светорассеяния от концентрации GdnHCl для исходно нативного и исходно инактивированного актина имеют неко торые различия, позволяет предположить, что в состав агрегатов могут входить макромолекулы как нативного актина, так и инактивированного актина. Сделан вы вод о том, что в растворах GdnHCl размер агрегатов инактивированного актина су щественно зависит от концентрации денатуранта. Инактивированный актин пред ставляет из себя монодисперсный ассоциат, состоящий из 15 мономерных единиц (Kuznetsova et al., 1999a), лишь в водном растворе в отсутствие GdnHCl.
Новая кинетическая схема процессов сворачивания – разворачивания актина Для того, чтобы понять роль промежуточного состояния U* в общей схеме процессов сворачивания–разворачивания актина необходимо было охарактеризо вать свойства актина в этом состоянии и ответить на вопрос, не идентично ли это состояние полностью развернутому состоянию U.
Свойства кинетического предшественника инактивированного актина.
Для выяснения природы кинетического интермедиата U*, предшествующего обра зованию инактивированного актина, кинетические зависимости интенсивности флуоресценции, измеренные при длинах волн 320 и 365 нм, были использованы для построения параметрических зависимостей (рис. 9). Характер параметрической за Рис. 9. Параметрические зависимости ме N 1.0 жду интенсивностью флуоресценции I320 и I365, характеризующие кинетику развора чивания нативного актина под действием 0. GdnHCl. Параметр – время, прошедшее 1. I320, отн. ед.
после добавления к нативному актину рас 1.2 I 0.6 творов GdnHCl различной концентрации.
Числа – концентрация GdnHCl, (М). Дли 1. тельность эксперимента 10 мин. Символы 1. 0. большего размера – результат измерений после инкубации растворов в течение 24 ч.
0.2 За единицу принята интенсивность флуо U* U ресценции нативного актина при рег = нм. N, I, U*, U – нативный, инактивиро 0. ванный, существенно развернутый и пол 0.35 0.40 0.45 0.50 0. ностью развернутый актин.
I365, отн. ед.
висимости при денатурации актина под действием 1.8 М GdnHCl однозначно сви детельствует о существовании кинетического интермедиата между нативным и инактивированным актином. Точка на диаграмме, в которой пересекаются прямые, отвечающие процессу разворачивания нативного актина (N U*) и процессу образования инактивированного актина из существенно развернутого состояния (U* I), характеризует свойства кинетического интермедиата (U*). Величина параметра А, для кинетического интермедиата U* оказалась выше соответствующей величины для полностью развернутого актина. Этот результат позволил сделать за ключение о том, что свойства кинетического интермедиата не идентичны свойствам полностью развернутого актина в 6М GdnHCl. Характер параметрических зависи мостей между I320 и I365 для концентраций GdnHCl меньше чем 1.8 М свидетельст вует о том, что в любой момент времени в растворе существует более чем две ком поненты. Таким образом, характер параметрических зависимостей свидетельствует о том, что образование инактивированного актина происходит через стадию обра зования существенно развернутого белка, хотя время жизни этого состояния уменьшается с уменьшением конечной концентрации GdnHCl.
С использованием метода КД в дальней УФ-области спектра было показано, что обнаруженный интермедиат сохраняет (в отличие от полностью развернутого состояния) выраженную вторичную структуру. Показано также, что этот инетрме диат не имеет (в отличие от инактивированного актина) гидрофобных кластеров, способных связывать АНС.
Быстрая кинетика. Несколько неожиданным результатом построения пара метрических зависимостей явилось то обстоятельство, что зависимости, отвечаю щие процессам разворачивания актина под воздействием GdnHCl различной кон центрации, исходят не из одной точки, соответствующей нативному белку (N), а из разных точек (см. рис. 9). Одно из возможных объяснений этого эффекта состоит в предположении существования быстрого конформационного превращения, которое невозможно выявить в кинетических экспериментах без применения специальной аппаратуры. Для проверки этого предпо 3. 2. ложения были выполнены эксперименты 2. 2. по изучению быстрой кинетики структур 1. I, отн. ед.
2.7 0. ных превращений актина под действием 0. 2.6 0. 0. GdnHCl различной концентрации (Рис. 10) 2. 2.4 с использованием оборудования стоп 2.3 2. флоу. Эти эксперименты подтвердили 2. 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 предположение о существовании интерме Время, с Рис. 10. Быстрая кинетика разворачи- диата N*, предшествующего образованию вания актина под действием GdnHCl. существенно развернутого кинетического Числа – концентрация GdnHCl (М).
интермедиата U*.
Кинетика перехода инактивированный актин – полностью развернутый актин. Для более полного изучения процессов сворачивания – разворачивания ак тина было проведено изучение кинетики разворачивания инактивированного акти на. Результаты стационарных экспериментов (Turoverov et al., 1999) свидетельст вуют о том, что этот процесс обратим, и протекает в области концентраций GdnHCl от 1.8 до 3.5 М с серединой перехода при 2.5 М. Кинетические зависимости интен сивности флуоресценции при изменении концентрации GdnHCl от 1.8 до 4.0 М и от 4.0 до 1.8 М также доказывают обратимость перехода (рис. 11, а и б). Инактивиро ванный актин не разворачивается полностью даже через 24 ч после его перевода в Рис. 11. Изменение интенсивно 0.6 1.0 N 0.6 I I сти собственной флуоресценции актина при конформационном пе 0. реходе инактивированный актин 0.4 в 0.4 (I) – полностью развернутое со б а I, отн. ед.
0. стояние (U). (а) Переход I U при изменении концентрации 0. GdnHCl от 1.8 до 4.0 М;
(б) пере 0. 0.2 ход U I при изменении кон U U 0. центрации GdnHCl от 4.0 до 1. М;
(в) денатурация нативного ак 0 10 20 24 ч 0 1 0 10 20 24 ч тина, под действием 4.0 М Время, мин Время, мин Время, мин GdnHCl.
раствор в 4М GdnHCl (рис. 11, а), в то время как нативный актин при тех же условиях полностью разворачивается че рез 10 с (рис. 11, в). Это связано с тем, что инактивированный актин представляет ассоциат, и необходимо некоторое время для того, чтобы этот ассоциат был разру шен. Следует отметить, что переход от полностью развернутого актина к инактиви рованному протекает быстрее, чем разворачивание инактивированного актина.
Нелинейный характер параметрических зависимостей между I320 и I365 (рис. 12) и немоноэкспоненциальный закон изменения интенсивности флуоресценции свиде тельствуют о том, что переход от инактивированного актина к полностью разверну тому состоянию и обратный процесс не являются одностадийными. По-видимому, переход от полностью развернутого состояния к инактивированному происходит через стадию образования существенно развернутого кинетического интермедиата (рис. 12;
кривая 1).
I 0. I320, отн. ед.
0. 0. U* 0. 0. U 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1. I365, отн. ед.
Рис. 12. Параметрические зависимости между интенсивностью флуоресценции I320 и I365, характеризующие кинетику разворачивания инактивированного актина (1) и частичного сворачивания полностью развернутого актина (2), вызванных изменением концентрации GdnHCl от 1.8 до 4.0 М от 4.0 до 1.8 М соответственно. Параметр – время, прошедшее после изменения концентрации GdnHCl. За единицу принята интенсивность флуоресцен ции нативного актина при рег=320 нм (на рисунке эта точка не показана).
На основании всех представленных выше данных была предложена следую щая схема разворачивания актина под воздействием GdnHCl:
N N* U* I1… In… I, U Согласно этой схеме, вновь обнаруженные кинетические интермедиаты N* и U* являются промежуточными состояниями на пути сворачивания–разворачивания актина, в то время как инактивированный актин, стабилизация структуры которого происходит за счет ассоциации частично-свернутых макромолекул белка, является результатом неправильного сворачивания белка.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что разворачивание актина проходит через образование двух вновь об наруженных кинетических интермедиатов N* и U*, возникающих на ранних стади ях денатурации актина.
2. Показано, что существенно развернутый кинетический интермедиат U*, предше ствующий образованию инактивированного актина, имеет высокий уровень внут римолекулярной подвижности, но сохраняет элементы вторичной структуры и име ет несколько более коротковолновый, по сравнению с полностью развернутым со стоянием, спектр флуоресценции.
3. Предложена и обоснована новая схема процессов сворачивания – разворачивания актина, согласно которой вновь обнаруженные кинетические интермедиаты N* и U* являются промежуточными состояниями на пути сворачивания – разворачива ния актина, в то время как инактивированный актин образуется в результате ассо циации частично-свернутых денатурированных макромолекул белка. Последнее яв ляется причиной необратимости процесса разворачивания актина in vitro.
4. Показано, что в присутствии GdnHCl происходит агрегация инактивированного актина (агрегация ассоциатов), обусловленная изменением поверхностного заряда инактивированного актина при его взаимодействии с ионами GuH+.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Kuznetsova I.M., Biktashev A.G., Stepanenko O.V., Povarova O.I., Shavlovsky M.M., Turoverov K.K. 2001. Inactivated state of actin develops from native one via com pletely unfolding of protein macromolecule. International symposium " Biological motility: new trends of research". Pushchino, p.89.
Turoverov K.K., Verkhusha V.V., Shavlovsky M.M., Biktashev A.G., Povarova O.I., Kuznetsova I.M. 2002. Kinetics of actin unfolding induced by guanidine hydrochlo ride. Biochemistry. 41: 1014-1019.
Туроверов К.К., Шавловский М.М., Бикташев А.Г., Поварова О.И., Степаненко О.В., Кузнецова И.М. 2002. Кинетика процессов сворачивания – разворачивания актина. Механизм возникновения и свойства инактивированного актина. III Съезд биохимического общества. Тезисы докладов. Санкт-Петербург, стр.526.
Kuznetsova I.M., Stepanenko O.V., Stepanenko O.V., Povarova O.I., Biktashev A.G., Verkhusha V.V., Shavlovsky M.M., Turoverov K.K. 2002. The place of inactivated ac tin and its kinetic predecessor in actin folding-unfolding. Biochemistry. 41: 13127 13132.
Kuznetsova I.M., Povarova O.I., Stepanenko Olesia V., Stepanenko Olga V., Shavlovsky M.M. and Turoverov K.K. 2004. Kinetics of formation and properties of on-pathway folding intermediates and misfolded monomeric and aggregated forms of actin. Inter national symposium "Biological motility". Pushchino, p. Поварова О.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2004. Что является причиной ряда аномальных явлений в растворах актина с низким содержанием гуанидингидро хлорида? III Съезд биофизиков России. Тезисы докладов. Воронеж, стр.84.
Поварова О.И., Кузнецова И.М. и Туроверов К.К. 2005. Новая схема процессов сво рачивания – разворачивания и физико-химические свойства актина в различных структурных состояниях. Цитология. 47: 953-977.
Мажуль В.М., Зайцева Е.М., Поварова О.И., Шавловский М.М., Кузнецова И.М. и Туроверов К.К. 2005. Фосфоресценция при комнатной температуре интермедиа тов сворачивания белков, а также аморфных агрегатов и амилоидных фибрилл, возникающих в результате неправильного фолдинга белков. Цитология. 47: 978 987.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Бурштейн Э.А. 1976. Люминесценция белковых хромофоров. Сер. Биофиз, Т.7, ВИНИТИ, Москва.
Мажуль В.М., Зайцева Е.М., Шавловский М.М., Кузнецова И.М., и Туроверов К.К.
2001. Триптофановая фосфоресценция при комнатной температуре нативного и инактивированного актина. Биофизика 46, 988-996.
Туроверов К. К., Бикташев А. Г., Дорофеюк А. В., Кузнецова И. М. 1998. Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризаци онных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе. Цитология. 40:
806-817.
Altschuler G. M., Klug D.R., Willison K.R. 2005. Unfolding energetics of G--Actin: a discrete intermediate can be re-folded to the native state by CCT. J Mol. Biol. Avail able online at www.sciencedirect.com.
Bertazzon A., Tian G. H., Lamblin A., Tsong T. Y. 1990. Enthalpic and entropic contribu tions to actin stability: calorimetry, circular dichroism and fluorescence study and ef fect of calcium. Biochemistry. 29: 291-298.
Carrell R. W., Gooptu B. 1998. Conformational changes and disease-serpins, prions and Alzheimer's. Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 799-809.
Fink A. L. 1998. Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid.
Fold. Des. 3: R9-23.
Frankel S., Condeelis J., Leinwand L. 1990. Expression of actin in Escherichia coli: Ag gregation, solubilization, and functional analysis. J. Biol. Chem. 265: 17980-17987.
Harper J. D., Lansbury P. T. Jr. 1997. Models of amyloid seeding in Alzheimer's disease and scrapie: mechanistic truths and physiological consequences of the time-dependent solubility of amyloid proteins. Ann. Rev. Biochem. 66: 385-407.
Hashimoto M., Masliah E. 1999. Alpha-synuclein in Lewy body disease and Alzheimer's disease. Brain Pathol. 9: 707-720.
Kabsch W., Mannherz H. G., Suck D., Pai E. F., Holmes H. C. 1990. Atomic structure of the actin: DNase I complex. Nature. 347: 37-44.
Kelly J. W. 1997. Amyloid fibril formation and protein misassembly a structural quest for insight into amyloid and prion diseases. Structure 5: 595-600.
Kelly J. W. 2000. Mechanisms of amyloidogenesis. Nature Struct. Biol. 7: 824-826.
Koo E. H., Lansbury P. T. Jr, Kelly J. W. 1999. Amyloid disease abnormal protein aggregation in neurodegeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 9989-9990.
Kuznetsova I. M., Biktashev A. G., Khaitlina S. Yu., Vassilenko K. S., Turoverov K. K., Uversky V. N. 1999a. Effect of self-association on the structural organization of par tially folded proteins: inactivated actin. Bioph. J. 77: 2788-2800.
Kuznetsova I. M., Turoverov K. K., Uversky V. N. 1999b. Inactivated actin, and aggregate comprised of partially-folded monomers, has a overall native-like packing density.
Protein Peptide Lett. 6: 173-178.
Lehrer S. L., Kerwar G. 1972. Intrinsic fluorescence of actin. Biochemistry. 11: 1211 1217.
Lewis M.S., Maruyama K., Carroll W.R., Kominz D.R., Laki K. 1963. Physical properties and polymerization reactions of native and inactivated G-actin. Biochemistry. 2: 34 39.
Pardee J. D., Spudich J. A. 1982. Purification of muscle actin. Meth. Enzymol. 85: 164 181.
Rees M. K., Young M. 1967. Stadies on the isolation and molecular properties of homoge neous globular actin. Evidence for a single polypeptide chain structure. J. Biol. Chem.
242: 4449-4458.
Schuler H., Lindberg U., Schutt C.E., Karlsson R. 2000. Thermal unfolding of G-actin monitored with the DNase I-inhibition assay. Stabilities of actin isoforms. Eur. J. Bio chem. 267: 476-486.
Speed M. A., Wang D. I., King J. 1996. Specific aggregation of partially folded polypep tide chains: the molecular basis of inclusion body composition. Nat. Biotechnol. 14:
1283-1287. 16.
Strambini G.B. 1989. Tryptophan phosphorescence as a monitor of protein flexibility J.
Mol. Liq. 42: 155-163.
Turoverov K. K., Khaitlina S. Yu., Pinaev G. P. 1976. Ultra-violet fluorescence of actin.
Determination of native actin content in actin preparations. FEBS Lett. 62: 4-7.
Turoverov K. K., Biktashev A. G., Khaitlina S. Yu., Kuznetsova I. M. 1999. The structure and dynamics of partially folded actin. Biochemistry. 38: 6261-6269.
Wetzel R. 1992. in Protein Engineering. A Practical Approach (Rees A. R., Sternberg A.
R., Wetzel R., Eds.) pp 191-219, IRL Press, Oxford.