Роль азотфиксирующих микроорганизмов в фиторемедиации промышленных углеводородных шламов
На правах рукописи
ГРИГОРЬЕВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА РОЛЬ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ФИТОРЕМЕДИАЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ УГЛЕВОДОРОДНЫХ ШЛАМОВ 03.00.07 – микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Казань – 2009
Работа выполнена на кафедре микробиологии ГОУ ВПО «Казанский государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина»
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Наумова Римма Павловна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Чиков Владимир Иванович кандидат биологических наук, Шурхно Равиля Абдулловна
Ведущая организация: Институт проблем экологии и недропользования АН РТ
Защита диссертации состоится « 24 » сентября 2009 г. в _ часов _минут на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при Казанском государственном университете.
Автореферат разослан « 19 » августа 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук З. И. Абрамова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Для промышленных отраслей, связанных с добычей, переработкой углеводородного сырья и химическим синтезом на его основе, характерно образование значительных объемов углеводородсодержащих отходов (шламов), которые по своим характеристикам (III класс опасности) представляют угрозу для окружающей среды и здоровья населения. Количество таких отходов, образующихся в процессе очистки промышленных сточных вод, зависит от мощностей предприятия и варьирует от 2 до 10 тыс. т в год. В соответствии с требованиями по обращению с опасными отходами шламы размещают в специально оборудованных накопителях, что не решает проблему по существу, т.к. переполнение накопителей означает необходимость поиска путей обезвреживания и переработки данной категории отходов. Можно утверждать, что данная проблема не имеет общих решений в мировом масштабе, хотя попытки ее решения предпринимаются в рамках многих национальных и международных проектов.
На фоне дорогостоящих технологий типа сжигания шламов с улавливанием компонентов газовых выбросов надежды на решение данной проблемы все больше связывают с биотехнологиями, позволяющими обезвреживать углеводородные шламы и тем самым расширить сферу их дальнейшей утилизации. Среди известных биотехнологий фиторемедиация (с участием растений) обладает экономическими и экологическими преимуществами, возможность ее применения для обезвреживания углеводородного шлама нефтехимического предприятия продемонстрирована в работе Галиева с соавт. (2005).
Несмотря на различия в происхождении углеводородных шламов, для них характерны высокие нагрузки по органическим загрязнениям, поэтому любой биотехнологический подход, как правило, основан на активизации микробного метаболизма путем корректировки соотношения биогенных элементов, в первую очередь углерода и азота C:N. Как правило, это достигается путем применения минеральных азотных удобрений, которые составляют одну из основных статей расходов при обезвреживании большинства загрязненных объектов.
При реализации технологии фиторемедиации, основанной на микробно-растительных взаимодействиях, необходимо учитывать интересы обоих компонентов ассоциации. Необходимое для жизнедеятельности микроорганизмов соотношение биогенных элементов C:N:P в загрязненном объекте варьирует в пределах 100:10:1-1000:20:1 (Dibble, Bartha, 1979;
Beaudin et al., 1999;
Atagana et al., 2003). Нетрудно представить, что для углеводородных шламов, дефицитных по азоту (0-4 гN/кг) на фоне экстремальных нагрузок по органическим загрязнениям (160-300 гC/кг) (Lazar et al., 1999;
Якушева с соавт., 2002;
Яковлев с соавт., 2002) необходимо большое количество азотных удобрений (порядка 3,5-5 гN/кг шлама) (Vasudevan, Rajaram, 2001;
Наумова с соавт., 2008), которое зачастую является токсичным для микроорганизмов и тем более для растений (Chen et al., 1990;
Chaineau et al., 2003).
В свою очередь, в природных экосистемах баланс биогенных элементов поддерживается благодаря обогащению пула доступного азота путем биологической азотфиксации. До 90% запасов азота в почве связано с активностью диазотрофных микроорганизмов (Емцев, Мишустин, 2006).
Прогресс, достигнутый за последние два десятилетия в изучении диазотрофии, радикально изменил представления о распространении данного свойства среди микроорганизмов. Оказалось, что к фиксации атмосферного азота способны многие представители домена Bacteria (Alpha-, Beta-, Gamma, Delta-, Epsilon-Proteobacteria, Cyanobacteria и Firmicutes) и некоторые представители домена Archaea (Zehr et al., 2003;
Olsen et al., 2009).
С учетом широкого распространения диазотрофных микроорганизмов и их важной роли в поддержании и стимуляции роста растений особый интерес представляет возможность реализации таких взаимоотношений в условиях токсичных и в то же время дефицитных по азоту углеводородных шламов.
Цель работы – выявить диазотрофные микроорганизмы в составе микрофлоры промышленных углеводородных шламов и оценить их потенциальную роль в фиторемедиации этих отходов.
Основные задачи исследования:
1. Оценить возможность существования диазотрофных микроорганизмов в условиях экологически опасных углеводородных шламов;
2. Охарактеризовать распространение генетических детерминант азотфиксации (nifH гена) среди аэробных гетеротрофных микроорганизмов, населяющих химический углеводородный шлам;
3. Осуществить лабораторное моделирование фиторемедиации углеводородного шлама предприятия органического синтеза с оценкой масштабов реализации азотфиксирующей активности аборигенной микрофлоры;
4. Оценить физиолого-биохимические особенности культивируемых диазотрофов шлама с точки зрения наличия у них комплекса свойств, обеспечивающих стимуляцию роста растений;
5. Охарактеризовать эффекты бактеризации семян растений-мелиорантов азотфиксирующими изолятами, выделенными из шламов в лабораторном эксперименте при выращивании растений непосредственно в химическом углеводородном шламе;
6. Сопоставить нуклеотидную последовательность гена 16S рРНК перспективных азотфиксирующих изолятов с международной базой данных и провести их филогенетический анализ.
Научная новизна. Результаты диссертационной работы расширяют представления об экологии азотфиксирующих микроорганизмов и о их физиолого-биохимических свойствах. Впервые показана принципиальная возможность существования азотфиксирующих микроорганизмов в промышленных углеводородных шламах и реализация их активности в условиях фиторемедиации этих отходов. С использованием молекулярно генетических методов охарактеризовано распространение генетических детерминант азотфиксации (nifH ген) в составе ДНК бактерий, обитающих в экстремальных условиях углеводородного химического шлама. Осуществлён филогенетический анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, что позволило определить принадлежность аборигенных азотфиксаторов шлама к классу гамма-протеобактерий. Обоснована принадлежность бактерий, выделенных из шлама, к микроорганизмам, стимулирующим рост растений (plant growth promoting (PGP)), благодаря биотехнологически перспективному сочетанию следующих свойств: способность к утилизации компонентов шлама в качестве источников питания, способность к азотфиксации, к продукции индолилуксусной кислоты как биостимулятора из категории ауксинов, способность к растворению труднодоступных соединений фосфора, противопатогенная активность в отношении ряда возбудителей заболеваний растений, вызываемых грибами и растениями.
Впервые достигнуто существенное увеличение накопления биомассы растений-фитомелирантов в условиях их роста на углеводородном шламе при интродукции азотфиксаторов, выделенных непосредственно из данного отхода. Данные диссертационной работы послужили научной основой для создания новой биотехнологии обезвреживания и переработки промышленных углеводородных шламов, которая находится на стадии патентования.
Практическая значимость. Результаты работы способствуют решению насущных проблем обезвреживания экологически опасных отходов, образующихся на предприятиях переработки и использования углеводородного сырья. С эколого-экономических позиций важна продемонстрированная в работе возможность замены коммерческих азотных удобрений биологическим процессом фиксации атмосферного азота при реализации технологии биоремедиации шлама, частью которой является данная работа. Проведенный в работе скрининг шламовых азотфиксирущих бактерий как PGP микроорганизмов позволил выявить пять наиболее ценных изолятов, относящихся к родам Pseudomonas и Enterobacter. Данные лабораторных испытаний по бактеризации семян этими штаммами свидетельствуют о повышении устойчивости растений к шламу и о стимуляции их роста, что демонстрирует возможность усовершенствования технологии обезвреживания и переработки углеводородных шламов, основанной на микробно-растительных ассоциациях.
Положения, выносимые на защиту:
1. В промышленных углеводородных шламах впервые обнаружены генетические детерминанты процесса биологической фиксации азота и жизнеспособные диазотрофные бактерии;
2. Масштабы азотфиксирующей активности в процессе моделирования фиторемедиации углеводородного шлама без применения удобрений достаточны для обеспечения роста растений и биодеградации загрязнений в шламе;
3. Большинство диазотрофных бактерий, населяющих углеводородные шламы, сочетают способность к азотфиксации с деструкцией углеводородов и обладают рост-стимулирующим потенциалом в отношении растений мелиорантов;
Связь работы с научными программами. Работа выполнена в рамках госконтракта АН РТ №09-9.4-38 (2006 г), госконтракта Аналитической Ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП 2.1.1.1005, согласно темплану 1.15.06 «Механизмы регуляции функциональной активности клетки».
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на школах-конференциях молодых ученых “Экотоксикология:
современные биоаналитические системы, методы и технологии” (Пущино Тула, 2006) и “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2005, 2006, 2008), на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2005), на Специализированной конференции Международной водной ассоциации «IWA» «Обработка и утилизация осадков сточных вод:
состояние, тенденции и перспективы» (Москва, 2006), на III научной конференции «Промышленная экология и безопасность» (Казань, 2008), на Международной научно-практической конференции «Микробная биотехнология – новые подходы и решения» (Казань, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции “Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития” (Киров, 2007), на Первой межуниверситетской конференции “Bionews” (Казань, 2008), на Итоговых конференциях КГУ (2007-2008гг.), XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха, «Microbial enzymes in biotechnology and medicine» (Казань, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 4 статьи в центральных и международных научных журналах (2 из которых в журналах ВАК РФ), 4 – в сборниках материалов конференций и в тезисах докладов. Подана заявка на патент РФ (№2009114390 от 15.04.09) «Способ подготовки шламов».
Декларация личного участия автора. Автором проведен анализ литературы, лично получено и обработано большинство экспериментальных данных, проведено лабораторное моделирование фиторемедиации шлама.
Автор принимал основное участие в написании статей и тезисов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 18 таблиц и 18 рисунков.
Библиография насчитывает 180 наименований, из них 45 отечественных и 135 зарубежных работ.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю – проф. Р.П. Наумовой;
официальным оппонентам: проф. В.И.
Чикову, к.б.н. Р.А. Шурхно за внимательное отношение к работе;
асп.
кафедры микробиологии КГУ А.А. Несмелову за участие в экспериментах и помощь в оформлении результатов;
доцентам кафедры генетики КГУ: к.б.н.
А.А. Ризванову и к.т.н. Л.Л. Фроловой, а также отделу “Биологические методы анализа” Регионального центра коллективного пользования физико химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) за помощь в определении азотфиксирующих микроорганизмов методами молекулярной биологии и биоинформатики;
ведущему инженеру кафедры микробиологии КГУ – А.В. Гарусову за помощь в проведении газохроматографического анализа нитрогеназной активности;
лаборатории плазмид ИБФМ РАН в лице А.Б. Гафарова за помощь в выделении тотальной ДНК из шламов и почвы;
сотрудникам группы молекулярной биологии КИББ КазНЦ РАН: к.б.н. Ю.В.
Гоголеву и асп. В.Ю. Горшкову за сотрудничество в экспериментах по антагонистической активности азотфиксаторов с фитопатогенами;
НИЧ КГУ в лице Ф.Н. Имамутдинова за помощь в создании и оформлении патента;
О.И. Якушевой за плодотворное сотрудничество в области экологической биотехнологии;
руководству биологических очистных сооружений ОАО «Казаньоргсинтез» за возможность проведения экспериментов и химических анализов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом исследования являлись диазотрофные микроорганизмы, обитающие в промышленных углеводородных шламах. В работе использовали углеводородные шламы предприятий химической (ОАО «Казаньоргсинтез» (КОС)), нефтехимической (ОАО «Нижнекамскнефтехим» (НКНХ)) и нефтеперерабатывающей (Уфимский нефтеперерабатывающий завод (УНПЗ)) промышленности. Незагрязненная почва (выщелоченный среднегумусный чернозем) использовалась в качестве контроля и структурирующего агента для шлама при моделировании фиторемедиации.
Усредненные пробы шламов и почвы отбирали из верхнего 20-см слоя.
Численность и разнообразие свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов, населяющих углеводородные шламы, оценивали по количеству колоний на селективной безазотистой среде Эшби (Теппер с соавт., 2004), а также путем учета разнообразия и количества микроорганизмов, содержащих в геноме nifH ген, в сообществе аэробных гетеротрофов (выделенных из шламов на мясо-пептонном агаре (МПА)).
Выделение тотальной ДНК шлама проводили с использованием стандартного набора FastDNA SPIN Kit for Soil (Bio 101, США).
Для амплификации nifH гена использовали метод nested ПЦР, предложенный Widmer et al. (1999).
Филогенетический анализ отобранных диазотрофных изолятов проводили на основании нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК, амплифицированных с использованием стандартных праймеров 16-18s U1F-U1R и просеквенированных на секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (USA). Поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью программного пакета BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Филогенетические деревья построены программой Phylip методом максимальной экономии.
Визуализация филогенетических деревьев проведена с помощью программы TreeView (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html). Полученные последовательности гена 16S рРНК выделенных из шлама изолятов внесены в базу данных GeneBank (http://ncbi.hlm.nih.gov/Bankit/nph-bankit.cgi).
Азотфиксирующую активность образцов шлама и выделенных изолятов определяли с помощью газовой хроматографии, ацетиленовым методом (Гарусов с соавт., 1999).
Скрининг перспективных для фиторемедиации диазотрофных микроорганизмов был основан на оценке их азотфиксирующей активности, способности утилизировать компоненты шлама, повышать растворимость труднодоступных соединений фосфора, продуцировать фитогормон (индолилуксусную кислоту) и проявлять антагонистическую активность по отношению к фитопатогенам. Скрининг проводили среди изолятов, выделенных на твёрдой среде Эшби при посеве образцов ризосферы устойчивых растений при росте последних в подготовленном шламе.
Способность изолятов утилизировать компоненты шлама оценивали качественно, по росту на модифицированных средах Эшби с использованием гексадекана, полиэтиленгликоля, нафталина и непосредственно шлама в качестве источников углерода и энергии.
Продукцию индолилуксусной кислоты (ИУК) изолятами оценивали фотоколориметрически, с использованием реагента Сальковского на среде, содержащей в качестве предшественника ИУК L-триптофан (Husen, 2003).
Способность изолятов к солюбилизации фосфатов оценивали по просветлению зон вокруг колоний при росте на твёрдой среде, содержащей нерастворимую соль фосфорной кислоты (Beneduzi et al., 2008).
диазотрофных изолятов в Антагонистическую активность отношении фитопатогенных микромицетов (Aspergillus niger, Aspergillus sp, Fusarium sp., Alternaria sp.) и бактерий (Pseudomonas syringae, Ervinia caratovora (SCRI), Xantomonas solunocerum (9049)) оценивали по подавлению роста патогенов при совместном культивировании на картофельно глюкозном агаре (КГА). Бактериальные фитопатогены были взяты из коллекции Казанского института биофизики и биохимии РАН, грибные патогены выделены из посевного материала растений (овес Avena sativa L.), используемых для фиторемедиации шлама.
Эффекты интродукции отобранных в ходе скрининга диазотрофных изолятов оценивали в лабораторном эксперименте при выращивании гороха (Pisum sativum) и овса (Avena sativa L.) в подготовленном химическом шламе КОС. Семена растений обрабатывали разбавленной суточной культуральной жидкостью изолятов, выросших на мясо-пептонном бульоне, с титром кл/мл. Эффекты бактеризации оценивали по снижению уровня зараженности семян грибными фитопатогенами (методом анализа семян на питательных средах по ГОСТ 12044-93) и увеличению накопления биомассы растений при их выращивании в подготовленном химическом шламе КОС.
Моделирование фиторемедиации химического шлама проводили в 6-и месячном лабораторном эксперименте. Оценивали динамику азотфиксирующей активности, урожай растения-мелиоранта и уровень остаточного загрязнения в следующих вариантах опыта: шл;
шл+поч;
шл+уд;
шл+поч+уд;
шл+поч+раст;
шл+поч+уд+раст, где шл – химический шлам КОС, специально подготовленный к фиторемедиации;
поч – почва (20% от объема шлама);
уд - NH4NO3 (0,35 гN/кг сухого веса шлама);
раст – растение фитомелиорант (плевел Lollium perenne L.) (90 г/м2).
Содержание хлороформ-экстрагируемых веществ определяли гравиметрически после экстракции образца хлороформом в аппарате Сокслета (Versan et al., 1998).
Общее содержание органического углерода и азота определяли по классическим методикам Тюрина и Къельдаля, соответственно (Аринушкина, 1970). Валовое содержание фосфора определяли фотоколориметрически по образованию фосфорно-молибденового комплекса в соответствии с ГОСТ 26207 (1992) pH образцов определяли с помощью иономера в водном экстракте, приготовленном в соотношении образец:вода 1:5.
Плотность образцов оценивали согласно ISO 11272:1998.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выявление азотфиксирующих микроорганизмов в промышленных углеводородных шламах Выделение тотальной ДНК из проб шламов и амплификация маркерного гена азотфиксации (nifH) с этой матрицы (рисунок 1А, Б) впервые позволили установить наличие в исследуемых отходах микроорганизмов, потенциально способных к фиксации атмосферного азота.
Рис. 1 Выявление nifH гена в составе тотальной ДНК, выделенной из образцов шламов и почвы. А – тотальная ДНК;
Б – амплификация nifH гена с тотальной ДНК. 1 –нефтехимический шлам (НКНХ);
2 – химический шлам (КОС);
3 – шлам нефтепереработки (УНПЗ);
4 – почва;
5 – ДНК маркер (1кб) На безазотистой твердой среде Эшби (рис 2А) выявлено высокое содержание свободноживущих диазотрофных бактерий во всех исследуемых шламах (на уровне 105-106 КОЕ/г) по сравнению с черноземной почвой ( КОЕ/г). Однако, азотфиксирующая активность исследуемых образцов шламов (0,2-0,4 мг N2/кг*ч) оказалась существенно ниже, чем в почве (0,7 мг N2/кг*ч) (рис. 2Б).
6, Численность диазотрофов, log КОЕ/г 5, 5, 5, 5, 4, 4, 4, 4, 0, 2/кг*ч 0, Азотфиксирующая активность, мг N 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, нефтехимический химический шлам шлам почва шлам НКНХ КОС нефтепеработки УНПЗ Рис.2 Численность диазотрофных организмов (А) и азотфиксирующая активность (Б) в различных шламах по сравнению с почвой Таким образом, сопоставление численности диазотрофов и нитрогеназной активности шламов, извлеченных из шламонакопителя, свидетельствует о выживании в шламах азотфиксирующей микрофлоры, потенциал которой не реализуется в полной мере. Это может быть связано как с токсическими, так и с неблагоприятными физическими свойствами углеводородных отходов, обуславливающими гипометаболическое состояние микрофлоры (Nikitina et al., 2003;
Наумова с соавт., 2008).
Диазотрофные бактерии химического шлама КОС Для характеристики сообщества истинных азотфиксирующих микроорганизмов использовали сочетание классических микробиологических методов с методами молекулярной биологии.
Принадлежность к группе азотфиксирующих микроорганизмов оценивали по наличию nifH гена в геноме изолятов, выделенных из нативного химического шлама КОС на богатой среде (МПА).
Численность аэробных гетеротрофных микроорганизмов, выделенных на МПА, в шламе оказалась относительно невысокой – до 107 КОЕ/г (табл. 1).
Оказалось, что для шлама характерно относительно низкое микробное разнообразие (нам удалось выявить только 12 различных морфотипов колоний) и доминирование двух представителей в сообществе (до 85%) (рис.
3).
Удивительным оказалось высокое содержание (до 95%) потенциальных азотфиксаторов, содержащих в составе геномной ДНК nifH ген, в сообществе аэробных гетеротрофов химического шлама КОС (рис. 3). Вероятно, на стадии изначального формирования шлама как твердой фракции сточных вод, перегруженной углеродом и характеризующейся недостатком доступного азота, диазотрофные микроорганизмы получают селективное преимущество и накапливаются в сообществе.
Рис. 3 Структура сообщества аэробных гетеротрофных микроорганизмов химического шлама КОС и распределение способности к азотфиксации (наличие в геноме изолятов nifH гена) среди его представителей Филогенетический анализ двух доминирующих представителей исследуемого нами сообщества, проведенный на основании последовательности гена малой субъединицы рРНК, позволил отнести их к Proteobacteria, роду Stenotrophomonas. Бактерии рода Stenotrophomonas являются близкородственными по отношению к роду Pseudomonas. Помимо недавно установленной способности некоторых представителей рода Stenotrophomonas к азотфиксации (Reinhard et al., 2008), они представляют биотехнологический интерес в связи с защитой растений от фитопатогенов (Wolf et al., 2002) и биоремедиацией загрязненных почв (Binks et al., 1995).
Азотфиксация в ходе моделирования фиторемедиации шлама Исходный шлам, извлеченный из накопителя, в связи с его специфическими физическими и химическими свойствами, проявляет 100% фитотоксичность, поэтому технология фиторемедиации не применима непосредственно для таких шламов (Наумова с соавт., 2008a). В связи с этим, А.А. Несмеловым была осуществлена подготовка химического шлама КОС по оригинальному методу (Наумова с соавт., 2009), в условиях которой происходит значительное снижение уровня загрязнений и токсичности, а также оптимизация структуры шлама до уровня, совместимого с ростом растений. В лабораторном эксперименте с подготовленным химическим шламом мы моделировали основные агротехнические приемы, применяемые в технологии фиторемедиации. Удалось выявить некоторые факторы, влияющие на уровень азотфиксирующей активности шлама и оценить ее потенциал и вклад в поддержание роста растений и деградацию углеводородного загрязнения.
Выраженный стимулирующий эффект на активность азотфиксирующей микрофлоры оказывает участие растения-фитомелиоранта и улучшение структуры шлама, связанное с внесением почвы в качестве наполнителя (рис.
4). При этом величина азотфиксирующей активности в вариантах с растениями увеличивалась восьмикратно и достигала уровня более 3 мг N2/кг*ч, что превышает потенциал азотфиксации в сельскохозяйственных почвах (Шурхно с соавт., 2004).
Азотфиксирующая активность, мг N2/кг*ч 3, 2, 1, 0, 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Время, нед.
шл шл+почва - посев шл+уд шл+почва+уд растений шл+поч+раст шл+поч+уд+раст Рис.4 Динамика азотфиксирующей активности в ходе моделирования фиторемедиации химического шлама КОС 16 Высота зеленых побегов, см Общий урожай растений, г сухой 10 биомассы 0 0 10 20 30 40 сутки 1 посев 2 посев шл+почв+раст шл+почв+уд+раст шл+почв+раст шл+почв+уд+раст Рис. 5 Характеристика роста растения-мелиоранта (плевел Lollium perenne L.) (А) и общего урожая растений в ходе моделирования фиторемедиации химического шлама КОС Минеральные азотные удобрения (в виде NH4NO3 1,3 г/кг - половинная доза азота от его необходимого количества для микробной биодеградации загрязнений и корректировки соотношения C:N в шламе до 30:1) ингибировали как азотфиксирующую активность, так и рост растения мелиоранта (рис. 5А). Общий урожай биомассы растений после первого и второго посевов в варианте с удобрениями был ниже на 30 и 20%, соответственно, по сравнению с вариантом без внесения азота (рис. 5Б).
Таким образом, даже сниженное количество удобрений сопоставимое с рекомендуемым для почв, приводит к угнетению роста растений на фоне токсичности самого шлама.
извлекаемых веществ, % Убыль хлороформ Рис. 6 Убыль углеводородного загрязнения химического шлама КОС в вариантах эксперимента по моделированию фиторемедиации Сопоставление остаточного уровня загрязнений в вариантах с удобрениями и без них позволило оценить вклад сообщества аборигенных азотфиксаторов в обеспечение растения-фитомелиоранта и микроорганизмов-деструкторов доступным азотом. В варианте с растениями без внесения дополнительного азота (шл+поч+раст), в котором выявили наивысшую азотфиксирующую активность, темпы разложения углеводородного загрязнения практически сопоставимы с аналогичным вариантом на фоне азотных удобрений (шл+поч+уд+раст) (рис. 6). Таким образом, мы впервые продемонстрировали возможность замены коммерческих удобрений биологическим процессом фиксации азота.
Скрининг перспективных для фиторемедиации диазотрофных микроорганизмов В связи с тем, что в технологии фиторемедиации интенсивность всех биологических процессов, в том числе и биодеградации загрязнений, во многом зависит от состояния растения-мелиоранта, в последнее время широко исследуют возможности ризобактерий, способных увеличивать рост растений (PGPR) на фоне различных загрязнений. Применительно к шламам в литературе такие данные отсутствуют, но на примере углеводород загрязненных почв показано положительное влияние таких бактерий на рост растений и темпы фиторемедиации в целом (Hutchinson et al., 2001;
Huang et al., 2007).
С целью выявления наиболее биотехнологически перспективных азотфиксаторов для фиторемедиации шлама провели первоначальный скрининг по величине нитрогеназной активности среди изолятов, выделенных нами из различных углеводородных шламов, и отобрали десять наиболее активных (Табл. 1). Дальнейший скрининг среди десяти отобранных изолятов включал оценку их способности к утилизации компонентов шлама и рост-стимулирующих свойств в отношении растений фитомелиорантов.
Таблица Характеристика азотфиксирующих изолятов, выделенных из шламов Изолят Источник выделения Нитрогеназная активность, нмоль С2Н4/мл*ч G1 Ризосфера рогоза в шламе НКНХ 14,2±0, G9 Ризосфера плевела в шламе КОС 8,5±0, G10 Ризосфера плевела в шламе КОС 13,6±0, G11 Предобработанный шлам КОС 5,8±0, G12 Исходный шлам НКНХ 5,1±0, G17 Предобработанный шлам НКНХ 13,2±0, G20 Предобработанный шлам НКНХ 11,4±0, G22 Исходный шлам УНПЗ 4,9±0, S1 Исходный шлам КОС 4,0±0, S2 Исходный шлам КОС 4,3±0, Все десять исследуемых изолятов являлись истинными азотфиксаторами, с активностью восстановления азота на уровне 4-15 нмоль С2Н4/мл*ч (Табл. 1) сопоставимой с таковой известных свободноживущих азотфиксаторов из рода Azotobacter (Ravikumar et al., 2004). Более того, установили наличие в их геноме генов азотфиксации (nifH) (рис. 7).
Рис. 7 ПЦР амплификация фрагмента nifH гена с геномной ДНК коллекционных изолятов.
М – маркер;
1-10 – индивидуальные изоляты Удивительным является сочетание диазотрофии с деструкторскими способностями в отношении широкого спектра специфических загрязнений, что впервые показано в нашей работе на примере аборигенных азотфиксаторов шламов. Выявленная нами способность десяти отобранных изолятов расти на среде с добавлением индивидуальных загрязнений или непосредственно шлама свидетельствует об адаптации азотфиксаторов к условиям шлама и демонстрирует их реальное участие в разложении загрязнений отхода. Недавно способность к деградации нефтяных углеводородов была обнаружена у некоторых представителей рода Azospirillum (Муратова с соавт., 2005).
С точки зрения увеличения доступности для растений других биогенных элементов оценивали способность растворять труднодоступные соединения фосфора, которая достаточно широко распространена среди исследуемых в нашей работе азотфиксирующих бактерий: 6 из 10 изолятов обладали данным свойством. В свою очередь, в работе Хьюзена было показано, что солюбилизация труднодоступных соединений фосфора – достаточно редкое явление среди бактериальных изолятов из категории PGPR: при скрининге было выявлено всего 4 положительных по данному признаку изолята из 14 (Husen, 2003).
Способность к синтезу фитогормонов, чаще всего ауксина – индолил 3-уксусной кислоты (ИУК), является одним из основных рост стимулирующих свойств PGPR. Индольные соединения выявлены нами в культуральной жидкости всех исследуемых изолятов на уровне от 0,5 до 9, мкг/мл (рис. 8). Для представителей рода Azotobacter, выделенных из местообитания мангровых зарослей и рекомендованных в качестве основы морских биоудобрений, продукция ИУК в среднем составляла 11,5 мкг/мл (Ravikumar et al., 2004), в свою очередь для Pseudomonas, стимулирующих рост растений, характерен синтез ИУК на уровне 3-5 мкг/мл (Боронин, 1998).
Таким образом, многие коллекционные изоляты, выделенные из шламов, рассматриваются нами как потенциальные стимуляторы роста растений.
Продукция ИУК, мкг/мл Рис. 8 Продукция индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) азотфиксирующими изолятами G1 G9 G10 G11 G12 G17 G20 G22 S1 S изоляты Еще одним механизмом положительного влияния микроорганизмов на растения является способность подавлять рост фитопатогенов.
Совместное культивирование на твердой питательной среде изучаемых азотфиксаторов с различными фитопатогенными микромицетами и бактериями позволило выявить неспецифическое и специфическое в отношении отдельных фитопатогенов антагонистическое воздействие некоторых азотфиксирующих изолятов (табл. 2). Видоспецифичный антагонизм скорее всего связан с выделением в среду тех или иных антибиотиков, тогда как угнетающее действие на широкий спектр фитопатогенов может быть опосредовано продукцией сидерофоров (Боронин, 1998;
Husen, 2003).
Таблица Антагонистическая активность изолятов по отношению к фитопатогенным микромицетам и бактериям (по зоне ингибирования роста фитопатогена, мм) изолят G1 G9 G10 G11 G12 G17 G20 G22 S1 S патоген Aspergillus - - - - - 5 12 - - niger Aspergillus 7 10 - - - 11 11 - - sp.
Fusarium sp.
- - - - - 13 14 - - Alternaria sp.
7 8 7 5 4 11 22 - - Ervinia 13 5 - - - 16 7 - - caratovora Xantomonas 20 7 9 - 15 25 19 - - solunocerum Pseudomonas - - - - - - - 3 - syringae Изоляты G17 и G20 проявили широкий спектр антигрибной активности на примере четырех наиболее распространенных видов фитопатогенных микромицетов (рис. 9).
а б в Рис. 9 Подавление роста фитопатогенных микромицетов Alternaria sp (а, б) и Aspergillus niger (в) изолятами G17 и G В опыте с бактериальными фитопатогенами наибольшая антагонистическая активность изолятов выявлена в отношении Xantomonas solunocerum. Наибольшей антибактериальной активностью обладал изолят G17 (рис. 10).
Рис. 10 Подавление роста фитопатогенных бактерий изолятом Erwinia G17:
caratovora (a), Xantomonas solunocerum (б).
а б Сравнивая полученные данные по величине зон подавления роста фитопатогенов с данными патентной литературы, можно сделать вывод, что некоторые исследуемые изоляты обладают высокой антагонистической активностью и могут играть роль в биоконтроле ряда заболеваний растений.
По интенсивности и спектру антагонистической активности в отношении грибных фитопатогенов изоляты G1, G9, G17 и G20 сопоставимы со штаммами бактерий Azotobacter vinelandii ИБ4 (Логинов с соавт., 2005) и Azotobacter chroococcum (Кандыба, Назаров, 2006), состоящих в основе запатентованных биологических препаратов для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям.
Эффекты бактеризации семян растений Бактеризация семян в сочетании с фитопатологической экспертизой позволила выявить влияние исследуемых азотфиксирующих изолятов на возбудители семенных инфекций, а также на прорастание семян растений.
По итогам анализа антагонистических свойств исследуемых диазотрофов (Табл. 2) были отобраны четыре наиболее активных изолята (G1, G9, G17 и G20) для оценки их потенциала в защите растений.
Предварительная фитоэкспертиза семян овса (Avena sativa L.) показала, что посевной материал в разной степени инфицирован следующими патогенами: Alternaria sp., Fusarium sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. (рис.
11). Представители данных родов широко распространены в почвенных экосистемах (Шурхно с соавт., 2004) Рис. 11 Фитоэкспертиза семян овса В нашем эксперименте обработка семян смесью четырех отобранных изолятов позволила на 90% снизить зараженность семян и на 20% повысить их прорастание (табл. 3), что подтверждает их антагонистический потенциал.
Таблица Эффект бактеризации семян овса смесью изолятов G1, G9, G17, G Вариант опыта Зараженные семена, % Проросшие семена, % С бактеризацией 5±3 99± Без бактеризации 67±8 85± Совокупный рост-стимулирующий потенциал изолятов азотфиксаторов мы оценили в лабораторном эксперименте при бактеризации семян растений и посеве их непосредственно в шлам.
В качестве наиболее устойчивых к шламу КОС растений ранее уже были отобраны овес (Avena sativa L.) и горох (Pisum sativum L.). Эффекты интродукции азотфиксаторов наиболее ярко выражены на горохе (Pisum sativum): продемонстрировано увеличение общей биомассы растений от 1, до 2,5 раз (рис. 12), при этом некоторые изоляты способствовали развитию корневой системы, стимулировали образование клубеньков.
Повышение общего урожая растений, % ль S S G G о G G G G G G тр Изоляты диазотрофов н ко горох овес Рис. 12 Влияние бактеризации семян на рост гороха (Pisum sativum L.) и овса (Avena sativa L.) в химическом шламе Таким образом, расширенный скрининг на основании биохимических исследований и оценкой непосредственного влияния на рост растений в шламе позволили выявить пять биотехнологически перспективных изолятов G1, G9, G10, G17 и G20, среди азотфиксаторов, выделенных из шламов.
Филогенетический анализ этих изолятов, основанный на последовательности гена 16S рРНК, позволил установить их систематическое положение и выявить родство с родами Pseudomonas и Enterobacter (рис. 13).
Рис. 13 Филогенетическое родство исследуемых изолятов (G1, G9, G10, G17, G20), основанное на гомологии фрагмента гена 16S рРНК с имеющимися в базе данных организмами Известны примеры биоремедиации органических згрязнений в почве при интродукции PGPR из родов Pseudomonas и Enterobacter, при этом они играли роль в повышении устойчивости растений и увеличении роста последних при углеводородном загрязнении почвы (Huang et al., 2005) и в присутствии полиароматических углеводородов (Huang et al., 2004).
Рис. 14 Филогенетическое дерево на основе последовательности гена 16S рРНК, включающее последовательности 14 азотфиксирующих микроорганизмов, выбранных из базы данных как представителей различных систематических групп, и экспериментально полученные последовательности гена 16S рРНК диазотрофных изолятов шлама (в рамке).
Экспериментальные последовательности внесены в базу данных Gene Bank, их номера приведены после обозначения изолята.
Несмотря на широкие метаболические способности азотфиксаторы, выделенные из шламов представлены достаточно узкой группой близкородственных организмов, относящихся -Proteobacteria, на филогенетическом дереве, отражающем многообразие азотфиксирующих микроорганизмов (Рис. 14).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Впервые выявленные нами в промышленных углеводородных шламах азотфиксирующие микроорганизмы, оценка их таксономической принадлежности и физиолого-биохимических свойств, позволяют рассматривать данные отходы как уникальную экологическую нишу для сохранения узкого круга диазотрофных микроорганизмов, которые, как оказалось, играют важную роль в процессе фиторемедиации шлама путем снабжения биоценоза доступным азотом, участия в деградации загрязнений и поддержания роста растений в экстремальных условиях углеводородного отхода. Полученные результаты следует рассматривать с позиций новой концепции диазотрофии в антропогенной экосистеме, ключевые параметры которой принципиально отличаются от таковых природных экосистем и агроэкосистем. Выявленные закономерности выживания диазотрофов, их видового разнообразия, взаимодействия с растениями-фитомелиорантами положены в основу новой технологии фиторемедиации углеводородных шламов, частью которой является данная работа.
ВЫВОДЫ 1. В твердых отходах (шламах) нефтепереработки, нефтехимии и органического синтеза впервые обнаружены генетические детерминанты процесса азотфиксации (фрагменты nifH гена), а также жизнеспособные азотфиксирующие микроорганизмы на уровне 105-106 КОЕ/г, активность которых не превышала 0,5 мг N2/кг шлама*ч;
2. В сообществе аэробных гетеротрофных микроорганизмов химического шлама до 85% представителей содержат в своем геноме nifH ген, при этом до 95% этих микроорганизмов представлены родом Stenotrophomonas;
3. При добавлении к химическому шламу почвы и выращивании устойчивых растений в отсутствие удобрений уровень азотфиксирующей активности возрастает пятикратно, при этом темпы разложения углеводородного загрязнения сопоставимы с аналогичным вариантом, включающим применение азотных удобрений;
4. Создана коллекция азотфиксирующих изолятов, выделенных из шламов, сочетающих способность к утилизации компонентов шлама (многоатомные спирты, алканы, ПАУ) с рост-стимулирующим потенциалом в отношении растений (растворение труднодоступных соединений фосфора, синтез фитогормонов (индолилуксусная кислота), антагонистическая активность против бактериальных и грибных фитопатогенов);
5. При бактеризации семян азотфиксаторами, выделенными из углеводородных шламов, на 90% снижается количество зараженных семян фитопатогенными микромицетами, и до 2,5 раз увеличивается биомасса растений при выращивании их в условиях химического шлама;
6. На основании анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК установлено, что наиболее перспективные с точки зрения фиторемедиации штаммы азотфиксаторов относятся к родам Pseudomonas и Enterobacter, входящим в группу -протеобактерий.
РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Наумова Р.П. Предобработка твердого химического отхода перед его биоремедиацией [Текст] / Р.П. Наумова, В.Н. Кудряшов, А.А. Несмелов, Р.Р. Гафуров, И.Р. Мухаметшин, Р.Р. Баширов, Т.В. Григорьева // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе.- 2008.- №4.- С. 29-31.
2. Наумова Р.П. Предварительная оценка потенциала фиторемедиации твердых химических отходов [Текст] / Р.П. Наумова, В.Н. Кудряшов, Т.В. Григорьева, Р.Р. Гафуров, И.Р. Мухаметшин, Р.Х. Хузаянов, А.А.
Несмелов // Ученые записки Казанского государственного университета.
Естественные науки.- 2008.- Т. 150.- кн. 2.- С. 155-166.
3. Naumova R.P. Diazotrophs originated from petrochemical sludge as a potential resource for waste remediation [Text] / R.P. Namova, T.V. Grigoreva, A.A. Rizvanov, V.Y. Gorshkov, N.V. Kudrjashova, A.V. Laikov // World Applied Science Journal.- 2009.- V.6, N. 2.- P. 154-157.
4. Якушева О.И. Новый подход к обезвреживанию нефтешлама с целью последующей фиторемедиации [Текст] / О.И. Якушева, Т.В. Григорьева, Р.А. Галиев, А.А. Несмелов, Р.З. Юсупов, Р.П. Наумова;
Казан. гос. ун-т. Казань, 2006.- 16 с.- Деп. в ВИНИТИ 11.01.2007, № 17-B2007.
5. Галиев Р.А. Токсикорезистентные растения для ремедиации твердых отходов (шламов) нефтехимического производства [Текст] / Р.А. Галиев, О.И. Якушева, Т.В. Григорьева, А.Р. Якупов, Д.К. Мустафин // 9-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: Сб. тезисов.- Пущино, 2005.- С. 341.
6. Григорьева Т.В., Биотехнологическое обезвреживание опасных твёрдых отходов нефтехимии [Текст] / Т.В. Григорьева, Р.А. Галиев, Р.П.
Наумова // Всероссийская выставка научно-технического творчества молодёжи: Сб. материалов.- Москва, 2005.- С.204-205.
7. Григорьева Т.В. Оценка потенциала ремедиации нефтешлама при варьировании дозы минеральных удобрений и почвы [Текст] / Т.В.
Григорьева, Г.А. Ситдикова, Р.П. Наумова // 10-я Пущинская школа конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: Сб. тезисов. Пущино, 2006.- С. 365.
8. Григорьева Т.В. Оценка потенциала биоремедиации твердых отходов нефтехимии [Текст] / Т.В. Григорьева, Р.А. Галиев, А.А. Несмелов, Р.З.
Юсупов, О.И. Якушева, Р.П. Наумова // Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии»: Сб. статей.- Пущино-Тула, 2006.- С. 90.
9. Григорьева Т.В. Отбор свободноживущих диазотрофов для защиты растений [Текст] / Т.В. Григорьева, Е.Г. Иванова // Всероссийская научно практическая конференция с международным участием «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития»: Сб. материалов. Киров, 2007.- С. 187-189.
10. Григорьева Т.В. Азотфиксирующие аборигены химических шламов – перспективный ресурс экологической биотехнологии [Текст] / Т.В.
Григорьева, А.А. Ризванов, Ю.В. Гоголев, А.В. Лайков, Р.П. Наумова // 12-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: Сб. тезисов.- Пущино, 2008.- С. 260.
11. Grigoryeva T.V. Nitrogen fixing bacteria inhabiting hazardous industrial wastes [Text] / T.V. Grigoryeva, A.A. Rizvanov, Y.V. Gogolev, A.V. Laikov, R.P.
Naumova // Proceedings of the First interuniversity conference on modern biology «Bio-news».- Kazan, 2008.- P. 25.
12. Naumova R.P. Development of biotechnologies for industrial toxic wastes remediation [Text] / R.P. Naumova, O.I. Yakusheva, T.V. Grigoryeva, A.A.
Rizvanov, A.A. Nesmelov, A.V. Laikov // Abstracts of the XIV international conference «Microbial enzymes in biotechnology and medicine».- Kazan, 2009. P. 28-29.
Отзывы на автореферат просьба отправлять по адресу:
420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18.
Отдел аспирантуры, диссертационный совет Д212.081.08.