Получение и биологические свойства бактериоциноподобных веществ, продуцируемых bacillus circulans
На правах рукописи
Калмантаев Тимур Ахмерович ПОЛУЧЕНИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИОЦИНОПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ BACILLUS CIRCULANS 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Оболенск – 2012
Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государствен ный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ Научные руководители:
д-р техн. наук, ст. научн. сотр. Похиленко Виктор Данилович;
канд. биол. наук, ст. научн. сотр. Перелыгин Владимир Владимирович
Официальные оппоненты:
Герасимов Владимир Николаевич, д-р биол. наук, ФБУН «Государственный на учный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора РФ, Оболенск, зав. лабораторией электронной микроскопии Самойленко Владимир Александрович, кандидат биологических наук, ФБУН «Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина» РАН, Пущино, руководитель сектора биотехнологических процессов
Ведущая организация:
ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микро биологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ
Защита состоится «15» мая 2012 г., в 12 часов на заседании диссертационного совета Д.350.002.01Д при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехно логии» Роспотребнадзора РФ по адресу: 142279, Московская обл., п. Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного уч реждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора РФ
Автореферат разослан “13” апреля 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Фурсова Надежда Константиновна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы За последние десятилетия в клиниках мира было выделено множество антибио тико-резистентных микроорганизмов, которые создают проблемы в лечении ряда заболе ваний инфекционной этиологии. Так, в 2011 году в Германии банальная кишечная инфек ция, вызванная устойчивым к антибиотикам геморрагическим штаммом E.coli О104:H4, унесла жизни более 50 человек, а несколько сотен человек остались инвалидами. В этой связи поиск новых средств антибактериального действия с меньшим, чем у антибиотиков, уровнем развития к ним микробной устойчивости, имеет как научное, так и практическое значение. В качестве таких средств биологического происхождения больший интерес представляют бактериоцины грамположительных бактерий, которые по своей природе являются низкомолекулярными пептидами и, по мнению большинства исследователей, не токсичны;
и микроорганизмы к ним, как правило, не привыкают. Известны примеры прак тического использования наиболее известных бактериоцинов лактобактерий – низина и педиоцина - в качестве биоконсервантов пищевых продуктов и кормов. Вместе с тем, к бактериоцинам лактобактерий чувствительны только филогенетически родственные виды микроорганизмов, и только в отдельных случаях – грамотрицательные бактерии. Поэтому выделение новых бактериоцинов, способных более эффективно ингибировать развитие возбудителей острых кишечных инфекций, а также микроорганизмов, вызывающих порчу пищевых продуктов, является актуальной задачей современной науки и ее прикладных направлений.
Перспективными источниками антимикробных соединений пептидной природы считаются некоторые виды аэробных спорообразующих бацилл. Представители этих ви дов являются продуцентами полимиксиновой группы антибиотиков – бацитрацина, бути розина, грамицидина С, полимиксина и др. Названные антибиотики востребованы до на стоящего времени благодаря своей высокой эффективности против грамотрицательных бактерий, однако их применение ограничено в связи с различными побочными эффектами на организм человека. А не так давно было обнаружено, что некоторые штаммы Paeniba cillus polymyxa и Bacillus circulans способны продуцировать бактериоцины и бактериоци ноподобные соединения (БПС) пептидной природы, обладающие антимикробным дейст вием [Puiri et al., 1998;
Svetoch, Stern et al., 2005;
Stern, Svetoch et al., 2006;
He et al, 2007].
По своему строению и спектру антимикробного действия эти соединения, как показано [Abriouel et al., 2011], близки к бактериоцинам классов I и IIа лактобактерий по принятой классификации [Klaenhammer, 1998], но дополнительно действуют и на грамотрицатель ные микроорганизмы.
Наибольший интерес представляет вид B. circulans, поскольку в 2001 году у штам ма NRRL B-30644 (депонирован в музее ARS USA) впервые был выявлен антимикробный пептид (бактериоцин 1580), который ингибировал сальмонеллы и кампилобактерии.
Представители этого вида практически безвредны, широко используются в биоиндустрии в качестве продуцентов ферментов, сурфактантов, полисахаридов, препаратов для маце рации кормов, бактериальных удобрений. Было высказано предположение о том, что они могут оказаться источниками новых бактериоцинов. Нами были выделены из окружаю щей среды и депонированы в коллекции микроорганизмов «ГКПМ – Оболенск» новые бактериоциногенные штаммы B. circulans с широким спектром антимикробного действия.
Потребность медицины, ветеринарии и пищевой промышленности в новых более эффек тивных средствах сдерживания вредных микроорганизмов явилась основанием для более глубокого изучения антимикробных веществ, продуцируемых штаммами B. circulans и для разработки лабораторной технологии их получения.
Цель исследования Выбрать наиболее антагонистически активные и продуктивные штаммы Bacillus circulans, разработать лабораторную технологию получения бактериоциноподобных со единений, изучить их биологические и физико-химические свойства, определить возмож ные сферы применения.
Основные задачи исследования 1. Найти и выбрать по результатам сравнительных исследований антагонисти чески активные штаммы B. circulans с практически значимыми выходами по действую щему началу бактериоциноподобных соединений.
2. Определить компонентный состав питательных сред и параметры культиви рования штаммов-продуцентов, обеспечивающих существенный выход бактериоцинопо добных соединений.
3. Найти и отработать способ эффективного извлечения бактериоциноподоб ных соединений из культуральной жидкости продуцентов, способ сравнительной оценки антимикробной активности.
Получить на основе отобранного штамма B. сirculans и разработанного спо 4.
соба выделения экспериментальные образцы бактериоциноподобного соединения для изучения его основных свойств.
5. Определить с использованием представительного набора индикаторных штаммов различных видов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов качественные и количественные показатели антимикробной активности эксперименталь ных образцов бактериоциноподобного соединения штамма B. circulans СК 2ч.
6. Изучить с использованием методов электрофореза и жидкостной хромато графии физико-химические и биохимические свойства экспериментальных образцов бак териоциноподобных соединений B. circulans.
Исследовать in vivo антимикробное действие экспериментальных образцов 7.
бактериоциноподобных соединений в опытах на цыплятах и оценить степень безвредно сти для белых мышей.
8. Разработать экспериментальные образцы, содержащие бактериоциноподоб ные соединения, и определить возможные области их практического применения.
Научная новизна работы Выделены, идентифицированы и охарактеризованы новые антагонистически ак тивные бактериоциногенные штаммы B. circulans, подавляющие рост различных видов грамположительных и грамотрицательных патогенных и условно патогенных бактерий, в том числе – штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.
Выявлена зависимость синтеза бактериоциноподобного соединения (БПС) от при роды источника азота, энергетической ценности питательной среды и параметров глубин ного культивирования продуцента.
Установлено, что временные параметры синтеза БПС B. circulans, спектр антимик робного действия, а также его молекулярная масса отличаются от других антимикробных соединений, продуцируемых данным микроорганизмом.
Обнаружено, что некоторые штаммы B. circulans продуцируют два бактериоцино подобных соединения разных типов: (1) выделяющееся в культуральную жидкость и ин гибирующее грамотрицательные микроорганизмы;
и (2) накапливающееся на поверхности клеток и активное в большей степени против грамположительных бактерий.
Теоретическая ценность и практическая значимость работы Создана коллекция антагонистически активных штаммов B. circulans, пригодных для использования в качестве источника новых бактериоцинов и бактериоциноподобных соединений.
Установлена зависимость синтеза бактерицидного вещества B. circulans от энерге тической ценности и доступности компонентов питательной среды, что может быть вкла дом в теорию и практику управляемого синтеза бактериоцинов на основе перспективных видов сапрофитных бактерий.
Разработан способ глубинного культивирования штаммов-продуцентов, обеспечи вающий малозатратное выделение БПС из культуральной жидкости B. circulans, который может быть использован для обнаружения и получения в препаративных количествах но вых биологически активных веществ антимикробного действия, в том числе и бактерио цинов, синтезируемых другими видами микроорганизмов.
Получен экспериментальный образец БПС, изучены его свойства, определен спектр областей возможного использования.
Разработаны «Методические рекомендации по применению бактерицидных ве ществ, синтезируемых Bacillus circulans, в составе полимерных пленок для продления сроков хранения пищевых продуктов» – учрежденческий уровень внедрения.
Разработан лабораторный регламент получения бактериоцина с обеззараживающи ми свойствами [ЛР 78095326-100-2011] – федеральный уровень внедрения.
Основные положения, выносимые на защиту Новые штаммы B. circulans, которые являются продуцентами бактериоци 1.
ноподобных веществ, подавляют рост и развитие широкого спектра бактериальных пато генов.
Выход и активность бактериоциноподобного соединения B. circulans зависят 2.
от природы источника азота, вида и концентрации углерода в питательной среде, а также параметров глубинного культивирования.
Бактериоциноподобное соединение штамма B. circulans Ск2ч представляет 3.
собой термостабильное, рН устойчивое, протеин-содержащее соединение с молекулярной массой около 6 кДа, ингибирующее рост ряда грамотрицательных и грамположительных патогенов бактериальной природы.
Бактерициноподобное соединение штамма B. circulans Ск2ч может быть ис 4.
пользовано в качестве добавки в корм цыплят - для контроля числа бактериальных пато генов в кишечнике, а также в составе полимерных пленок - для хранения продуктов, обес печивающего снижение микробной контаминации.
Работа выполнена в отделе биологических технологий ФБУН ГНЦ ПМБ Роспот ребнадзора в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химиче ской и биологической безопасности Российской Федерации 2009 – 2013 годы» (Государ ственные контракты № 122-Д от 11.06.2009 г. и № 55-Д от 22.07.2011 г.).
Личный вклад соискателя Автором лично выполнена вся экспериментальная работа по выбору штамма продуцента, выделению и очистке БПС, изучению свойств экспериментального образца, а также интерпретация полученных данных. Автор внес значительный вклад в составление «Методических рекомендаций по применению бактерицидных веществ, синтезируемых Bacillus circulans, в составе полимерных пленок для продления сроков хранения пищевых продуктов», а также в разработку Лабораторного регламента на получение бактериоцина с обеззараживающими свойствами.
Апробация работы Основные результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на: I-ой Оболенской школе-конференции «Биологическая безопасность в современном мире» [Оболенск, 2009], II научно-практической школе-конференции молодых ученых и специа листов «Биобезопасность в современном мире» [Оболенск, 2010], III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспе чения биологической безопасности» [Оболенск, 2011].
Публикации. Основное содержание работы
отражено в 10 публикациях, в том числе в 3 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и мето дов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 124 цитируемых работы, из которых 24 – оте чественных и 100 – иностранных авторов. Материалы диссертации изложены на 112 стра ницах машинописного текста, иллюстрированы 11 рисунками и 16 таблицами.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы Для выполнения работы использовали идентифицированные антагонистически ак тивные штаммы Bacillus circulans (C2/2, Ск2ч, 1580, КСП18, ППС2а), Paenibacillus po lymyxa Р602 и Bacillus subtilis ПС50, выделенные из образцов почвы, корневой системы растений, растительных остатков и водного настоя стеблей злаков. Данные штаммы депо нировали в качестве авторских штаммов в «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ. В каче стве контрольных штаммов использовали штаммы Bacillus circulans Jordan 1890 (B-222, B-1969) и Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835) B-436, полученные из Всероссийской коллек ции микроорганизмов (ИБФМ РАН, г. Пущино-на-Оке). В качестве индикаторных куль тур для оценки антагонистической активности исследуемых микроорганизмов использо вали грамотрицательные (Escherichia coli M15, Salmonella enteritidis 237, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa 468, Acinetobacter lwoffii 125, Shigella sonne, Klebsiella pneumoniae 114, Enterobacter cloacae 190, Haemophilus influence XAU1) и грамположительные (Listeria monocytogenes 766, Bacillus spp., Lactococcus spp., Staphylo coccus aureus 46) бактерии, полученные из коллекции микроорганизмов «ГКПМ Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ.
Штаммы бацилл культивировали на чашках с питательным (Nutrient Agar M001, HiMedia, Индия;
ГРМ-агар ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Россия), либо крахмальным агаром (Starch agar, Ref.1-283, Scharlau, ЕС) при температуре 30 °С в течение двух суток.
Для получения посевных материалов одиночные типовые колонии микроорганизмов сус пендировали в изотоническом растворе хлористого натрия (рН 7,0-7,2). Клеточными сус пензиями в количестве 1 % засевали качалочные (750 мл) колбы со 100 мл питательной среды. Инкубацию посевов осуществляли на качалке (28–30 °С, 130 об/мин). В качестве питательных сред использовали коммерческие (ГРМ-бульон, питательный бульон для листерий из ГНЦ ПМБ, Россия) и экспериментальные варианты на основе различных гид ролизатов белка с добавлением различных углеводов, экстракта дрожжей и минеральных солей.
Микробиологические методы Идентификация изолятов. После первичной оценки морфо-культуральных призна ков, давших основание отнести выделенные изоляты к роду Bacillus, дальнейшую их ви довую принадлежность определяли с помощью стандартизованной системы биохимиче ских тестов API® 50 СН (BioMerieux, Франция) и программного обеспечения API 4.0. В случае спорной идентификации для уточнения вида бацилл привлекали дополнительные тесты, описанные в литературе [Logan, 1984].
Проверка на антагонистическую активность. Первичный скрининг антагонисти чески активных изолятов бацилл проводили методом нанесения образцов клеточной мас сы в виде агаровых блоков или пятен (spot-test) на поверхность свежих газонов индика торных штаммов. Уровень активности выделенных образцов бактерицидных веществ вы ражали в арбитражных единицах (АЕ/мл) путем нанесения спотов из серии двукратных разведений (по 10 мкл) на свежие газоны тест-культур. За одну АЕ принимали величину, обратную степени разведения образца, при которой отчетливо определялась минимальная зона ингибирования.
Определение молекулярной массы бактерицидного вещества проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). После окраски и отмывки гель помеща ли в стерильные чашки Петри и заливали агаровой суспензией индикаторного штамма ( мл взвеси клеток смешивали с 10–15 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С пита тельного агара M001 HiMedia). После инкубации чашек в термостате (37 °С) в течение 18– 20 ч отмечали наличие и расположение зоны подавления роста тест-культуры на агаре над полосой электрофореграммы, содержащей активный пептид. Сравнение с маркерами по зволяло определить молекулярную массу активного пептида.
Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) в отношении тест культур проводили методом двукратных серийных разведений препарата (от 128 до 0,06 мг/л) в 1 мл жидкой питательной среды, соответствующей по составу их потребно стям. Результаты учитывали после инкубации при 37 °С, отмечая изменение оптической плотности сред по сравнению с контролем.
Выбор среды культивирования осуществляли, используя в качестве основы пита тельную среду следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт – 5,0;
калия фосфат 2-х за мещенный, 3-х водный – 3,0;
натрия хлорид – 1,0;
калия хлорид – 1,0 и магния сульфат – 0,005. На первом этапе исследований к основе питательной среды добавляли по отдельно сти (0,3 – 0,5 %) различные источники аминного азота – виннокислый аммоний, сульфат аммония, хлористый и щавелевокислый аммоний, а также гидролизаты казеина (соляно кислый – СГК), рыбной муки (панкреатический – ПГРМ) и глутамат натрия (рН сред со ставляла 7,3 – 7,5 ед.). Во все варианты сред добавляли 0,5 % глюкозы. В качестве контро ля использовали коммерческий ГРМ-бульон (Оболенск, Россия).
На втором этапе исследований к питательной основе с выбранным по результатам первого этапа источником азота дополнительно вводили кроме глюкозы и другие источ ники углерода – различные моно-, ди-, три-, олиго- и полисахариды.
Биотехнологические методы Посевной материал готовили в колбах на термостатированных качалках, культиви рование микроорганизмов проводили в ферментерах, разделение культуральной жидкости (КЖ) на клеточную массу и супернатант осуществляли на центрифугах или фильтрацион ных аппаратах. В работе использовали термостаты ТС-80М (Россия), качалки NBS (New Brunswick Scientific, США), ферментеры АКА-210, 3У (Россия) или Bioflo 110 NBS (США). Для стерилизации питательных сред, растворов использовали установку стерили зующей фильтрации АСФ-011 и автоклав ВК-75 (Россия).
При выборе способа выделения из КЖ и частичной очистки бактериоциноподоб ных соединений использовали методы солевой преципитации, вакуумного выпаривания, сорбции на твердых носителях, фазовой сепарации органическими растворителями, а так же методы ультрафильтрации. Для разделения КЖ на клеточную массу и бесклеточный супернатант использовали центрифугу J2-21 Beckmann (Германия), фильтрационную ус тановку на полых волокнах (Россия) с отсечением по молекулярному весу в 100;
15;
и 5 кДа. Концентрирование целевых продуктов проводили на вакуум-выпарной установке Laboretta 4000 Heindolh (Германия). Для обезвоживания биоматериалов применяли лио филизатор Virtis BT-4k (США) и анализатор влажности MF-50 (Moisture Analyzer, Япо ния).
Биохимические методы Постановка трицин-ДСН-ПААГ-электрофореза. Пробы для исследования подвер гали предварительной очистке, используя патроны Bond Elut® С18 (Analytichem Intern., Habor City, CA, США), руководствуясь инструкцией производителя. Концентрацию про теинов в образцах определяли по методу Бредфорд [Bradford, 1976] на спектрофотометре Spekol 11 (Analytik Jena AG, Германия) при длине волны 595 нм.
Концентрация разделяющего полиакриламидного геля составляла 16,5 %, а кон центрирующего – 10 %. В лунки предварительно залитого геля наносили по 4 мкл иссле дуемых образцов и маркеры. В качестве молекулярных меток использовали маркеры фирм SpectraTM Multicolor Low Range Protein Ladder (1,7 – 40 кДа, Fermentas, ЕС), PageRulerTM Unstained Low Range Protein Ladder (3,4-100 кДа, Fermentas, ЕС), а также очищенные пеп тиды – инсулин (5,7 кДа) и лизоцим (14,5 кДа). Электрофорез проводили в катодном (100 мМ Трис-НСL,100 мМ, 0,1 % SDS, рН 8,25) и анодном (200 мМ Трис-НСL, рН 8,9) буферах в камере для вертикального электрофореза Hoefer (США) по методу [Shagger, 1987] для низкомолекулярных белков и пептидов. Разделение проводили при U = 125 В и I = 25 мА в течение 4 ч.
Фиксацию низкомолекулярных пептидов проводили в 5 % растворе глутарового альдегида в течение 30 мин с последующей промывкой в дистиллированной воде. Окраску пептида проводили в растворе, содержащем 25 % этанола,10 % уксусной кислоты, 0,001 % Кумасси G250 и 500 мл воды. Для определения молекулярной массы пептидной полосы, ответственной за антимикробную активность, гель отмывали в 10 % растворе уксусной кислоты при температуре 80 °C в течение 2 ч, затем еще 30 мин в дистиллированной воде и заливали агаровой суспензией индикаторного штамма, как было описано выше.
Компонентный состав образцов БПС изучали методом высокоэффективной жид костной хроматографии (ВЭЖХ) на микроколоночном жидкостном хроматографе Мили хром-6 (ЗАО «Научприбор», Россия) с использованием обращенно-фазовой аналитиче ской колонки (КАХ-6-80-4), заполненной сорбентом Сепарон-С18. Образцы БПС предва рительно готовили, используя патроны Bond Elut® С18. Элюцию проб с аналитической колонки проводили в градиенте концентрации водного раствора ацетонитрила от 0 до 30 % с добавлением 0,1 % трифторуксусной кислоты с регистрацией оптической плотно сти при двух длинах волн: 220 и 280 нм. Полученные данные обрабатывали в программе UniChrom® указанного хроматографа. Выявление «биоактивных» пиков проводили нане сением элюатов на свежие газоны тестовых культур. Для этого пробы элюатов высушива ли при 105 °С и отдельно разводили в 50 мкл дистиллированной воды.
В отдельных случаях для идентификации биоактивных фракций в образцах БПС использовали метод тонкослойной хроматографии на алюминиевых силикагельных пла стинах Silufol UV254 (Чехия) в системе: бутанол/ледяная уксусная кислота/вода.
Методы in vivo. Полученные образцы антимикробных веществ исследовали в опы тах на цыплятах и белых мышах. Цыплятам в течение 3 дней давали стандартный коммер ческий корм (контроль) и такой же сухой корм, но предварительно насыщенный бескле точным супернатантом B. circulans Ск2ч с активностью 100 АЕ/мл в отношении E. сoli (опытная группа). В опытах на мышах кроме варианта кормления стандартным сухим кормом, содержащим концентрат БПС, изучили вариант его введения внутрибрюшинно (до 100 мг на особь), используя стерильные растворы. В ходе 7 суточного эксперимента, наблюдали за активностью животных, отбирали фекальную массу для анализа микрофло ры, а в конце опыта проводили их вскрытие и визуальную оценку состояния внутренних органов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 2 посвящена сравнительной характеристике новых штаммов антагонистиче ски активных бацилл, вопросам идентификации, а также обоснованию выбора некоторых из них в качестве продуцентов бактерицидных веществ. При отборе изолятов из окру жающей среды обращали внимание на их активность в отношении грамположительных (Гр+) и грамотрицательных (Гр–) бактерий, в большей части на примере Listeria monocy togenes и Escherichia coli, соответственно. В таблице 1 приведены краткие данные о штаммах бацилл, использованных в работе на первоначальном этапе исследований. Пять из них с наиболее выраженной антагонистической активностью и по совокупности морфо культуральных, биохимических свойств идентифицированые как B. сirculans, были депо нированы в «ГКПМ – Оболенск».
Таблица 1 - Основные сведения о штаммах бацилл, используемых в работе Рабочее Источник выделения Музейные параметры штамма Антагонистическая обозначение или получения активности в отноше Название № в коллекции нии:
B.circulans C2/ С2/2 Настой соломы 5223 ГНЦПМБ Гр (+) и Гр(–) бактерий B.circulans С22- Ск22 Настой соломы 6516 ГНЦПМБ То же B.circulans КСП- 1К Корневая система 6853 ГНЦПМБ То же овощной культуры B.circulans ППС2а 2а Растительные остатки 6854 ГНЦПМБ То же B.subtilis ПС-50° В-50 Воздушная среда 6855 ГНЦПМБ Гр (+) бактерий B.circulans Ск2ч Ск2ч Настой соломы 6861 ГНЦПМБ Гр (+) и Гр(–) бактерий B.circulans 1580 Музей ГНЦПМБ 1580 ГНЦПМБ В основном Гр(–) бак терий P.polymyxa Рр602 Музей ГНЦПМБ 602 ГНЦПМБ Гр (–) бактерий B.circulans Jordan 1969 ВКМ, ИБФМ РАН B-1969 ВКМ В основном Гр(–) бак var.halophilus терий B.circulans Jordan 222 ВКМ, ИБФМ РАН B-222 ВКМ Гр (+) бактерий B.subtilis Cohn 436 ВКМ, ИБФМ РАН В-436 ВКМ Гр (+) бактерий На рис. 1 представлены фотоизображения колоний, клеток и спор, типичных для отобранных штаммов B. circulans. Характерным признаком молодых колоний являются выросты, часто направленные циркулярно, а также подвижные палочковидные клетки.
Споры обычно образуются на 3-4 сутки, имеют терминальное расположение и шире мате ринской клетки.
Рисунок 1 - Типичная морфология колоний, вегетативных клеток и спор штаммов B. circulans В опытах по отработке условий получения бактериоциноподобных веществ были использованы в основном два штамма – B. circulans C2/2 и B.circulans Ск2ч, которые да вали наибольшие по диаметру зоны ингибирования (до 20 мм) Гр(–) бактерий. Другие, указанные в таблице 1 штаммы, использовали для проведения сравнительных исследова ний. Так, B. circulans 1580 является продуцентом бактериоцина, P. polymyxa 602 не только бактериоцина, но и, возможно, антибиотика полимиксина, тогда как штаммы B. circulans Jordan 1890 и B.subtilis Cohn 1872 не описаны как бактериоциногенные.
В главе 3 представлены результаты по экспериментальному обоснованию выбора компонентного состава питательных сред, условий глубинного культивирования B. circulans, способов выделения бактериоциноподобной субстанции и оценки антагони стической активности образцов. В табл. 2 представлены данные о зависимости антагони стической активности супернатантов B. сirculans Ск2ч от состава среды культивирования.
Таблица 2 - Зависимость антимикробной активности супернатантов B. сirculans Ск2ч от источника азота и концентрации глюкозы в жидкой питательной среде Антагонистическая активность (АЕ/мл) проб* при одном источнике энергии (глюкоза – 0,5 %) и различных источниках азота (0,5%) Сульфат Тартрат Глутамат Гидроли- Щавелевокислый Хлористый Гидролизат аммония аммония натрия зат казеина аммоний аммоний рыбный 60± 20 40±6 60± 20 0** 0** 20±6 0** Антагонистическая активность (АЕ/мл) проб при одном источнике азота (сульфат аммо ния - 0,5%) и различных источниках энергии Галактоза, Мальтоза, Манноза, Лактоза, Сахароза, Глице- Глюкоза, Глюкоза, 0,5% 0,5% 0,5% 0,5% 0,5% рин, 0,1% 0,5% 1,0% 30±10 15±5 60± 20 40±10 40±10 30±10 60± 20 30± *активность рассчитана для супернатантов, сконцентрированных в 10 раз, 0** - отсутст вие зоны ингибирования в данных условиях.
Синтез бактериоциноподобных соединений четко фиксировали в случае использо вания в питательной среде азота минерального происхождения и практически отсутство вал при культивировании в среде на основе азота органического происхождения. Опреде ленное влияние на продукцию БПС оказывали также тип и концентрация источника энер гии в составе питательной среды – концентрация глюкозы не должна превышать 1,0 %.
Удовлетворительную воспроизводимость результатов по уровню продукции БПС достигали при температуре 28–30 °С, вращении качалки 120–130 об/мин и культивирова нии в течение не более 50 ч. Полноценность состава питательных сред и выбранный ре жим культивирования позволяли поддерживать вегетативный рост клетки B. circulans без перехода к стадии споруляции.
Таким образом, уже на стадии предварительных исследований установили сущест венную зависимость выхода БПС от природы источника азота, вида и концентрации угле рода в питательной среде, а также условий глубинного культивирования.
При получении бактериоцинов их выход зависит не только от штамма продуцента, условий его культивирования, но и способа выделения. Молекулы бактериоцинов и по добные им пептиды, как известно, обладают амфифильными свойствами и склонностью к агрегации, как между собой, так и с бактериальными клетками, их дебрисом, что приводит к снижению удельной активности [Pingitore et al., 2007]. В этой связи провели экспери менты с целью определения оптимальных путей извлечения БПС из супернатантов. В табл. 3 представлены результаты сравнительных исследований по эффективности выделе ния бактериоциноподобных соединений при использовании различных способов обработ ки супернатанта штамма B. сirculans Ск2ч.
Таблица 3 - Сравнение выхода бактериоциноподобных соединений в зависимости от способа обработки супернатанта КЖ штамма B. circulans Ск2ч Арбитражные единицы активности в 100 мл супернатанта* Способ выделения и действующее начало АЕ** Выход, % Солевая преципитация Сульфат аммония, 60% 48000 ± 17000 Уголь активированный 54000 ± 8000 Сорбция на твердых Силикагель 100/250 72000 ± 12000 носителях Окись алюминия 16000 ± 4000 Аэросил А-300 43000 ± 9000 Хлороформ 93000 ± 15000 Разделение в двухфаз Дихлорметан 95000 ± 11000 ной системе Толуол 75000 ± 6000 * исходный супернатант имел активность 100 АЕ/мл, общее количество АЕ в 100 мл принято за 100%, **представлены средние показатели суммарных значений активности из 3 опытов.
Представленные в табл. 3 данные свидетельствуют о том, что при использовании двухфазной системы выделения с хлороформом или дихлорметаном выход бактериоцино подобных соединений из супернатанта КЖ штамма B. circulans Ск2ч составляет 93–95%.
Таким образом, подобранные условия культивирования штамма-продуцента и ре жимы получения антимикробных соединений из супернатантов КЖ дали основание для разработки лабораторной технологии получения БПС, продуцируемых B. circulans.
В главе 4 представлены результаты разработки лабораторной технологии получе ния препарата БПС на основе штамма B. circulans Ск2ч на ферментационных аппаратах объемом 10 л, с использованием аппаратов мембранного и гравитационного разделения КЖ, методов выделения и грубой очистки бактериоциноподобных соединений с помощью органического растворителя, а также приготовления готовой формы препарата методом лиофильного высушивания.
Принципиальная схема получения экспериментальных образцов БПС представлена на рис. 2.
Рисунок 2 - Технологическая схема получения препаративных образцов бактерицидного вещества на основе B.circulans Cк2ч Ключевой стадией технологии является получение КЖ вегетативных клеток B.circulans в условиях, которые обеспечивают продукцию БПС на уровне как минимум 100 АЕ/мл. Типовую динамику роста клеток в ферментере и продукции бактерицидных веществ иллюстрируют данные представленные на рисунке 3. Как показали опыты с вы ращиванием штамма - продуцента БПС в среде выбранного состава при наблюдении в те чение 5 суток, рост клеток был наиболее интенсивен в срок до 48 – 50 часов, после чего намечается тенденция падения оптической плотности и, соответственно, снижения числа клеток, что свидетельствует о переходе клеток в состояние спор. Известно, что у некото рых бацилл максимальный уровень синтеза антибиотиков, например, бутирозина, совпа дает с активной стадией процесса спорообразования [Schaeffer, 1969, Nam and Ryu,1985].
Обычно процесс спорообразования начинается на 3–5 сутки культивирования штаммов-продуцентов. Как следует из результатов наших опытов, приведенных на рисун ке 3, синтез БПС штаммом B.circulans Ск2ч начинается уже на стадии логарифмического роста (16–20 ч) и достигает максимума к 40 – 50 ч, когда еще в КЖ отсутствуют признаки спорообразования. Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод, что время культивирования штамма B.circulans Ск2ч, достаточное для накопления БПС, со ставляет 48–50 часов.
Рисунок 3 - Динамика роста клеток, изменения рН, ОП и накопления БПС при культивировании B. circulans Ск2ч в ферментере объемом до 10 л.
Обозначения: рН – показатель кислотности среды, ед. рН;
ОП – оптическая плот ность при 600 нм;
КОЕ – колониеобразующие единицы, log/ml;
АА – антагонистическая активность, измеренная по отношению к тест-штамму E.coli, х100 АЕ/мл.
Стадия концентрирования БПС, находящегося в КЖ в достаточно разбавленном состоянии (мкг/л), имеет решающее значение для получения его в практически значимых количествах. В процессе концентрирования супернатанта необходимо уменьшить количе ство примесных соединений, солей и воды, при этом повысить концентрацию низкомоле кулярного бактериоциноподобного соединения. Для решения этой задачи использовали принципы мембранного разделения КЖ с применением ультрафильтрационных половоло конных мембран с отсечением, обеспечивающим отделение клеток и низкомолекулярного пептида (100 и 5 кДа, соответственно). Такой подход существенно повышает производи тельность процесса переработки бактериоцинсодержащего супернатанта и, по сравнению с другими методами, уменьшает временные и материальные затраты, связанные с после дующей обработкой концентратов БПС дорогостоящими реагентами (растворителями, сорбентами и др.).
Выделение БПС из водных растворов (супернатантов/фильтратов) проводится различными приемами – от часто используемой солевой преципитации (сульфат аммония) до одно- или двухэтапных методов хроматографического разделения на колонках со смо лами ионного и гидрофобного взаимодействия [Pingitore et al., 2007]. Однако эти методы в одних случаях не избирательны, а в других – являются высокозатратными. Наши исследо вания показали, что более предпочтительным является метод фазовой сепарации БПС с использованием безводного гидрофобного растворителя. Теоретической предпосылкой для выбора указанного метода явилось свойство аффинности бактериоцинов к гидрофоб ным растворителям, что предполагает возможность их сбора на границе раздела фаз (во да/растворитель). Практическое доказательство возможности использования такого спо соба для выделения бактериоцинов получили сотрудники Университета штата Огайо [Burianek and Yousef, 2000], которые использовали в качестве растворителя хлороформ.
Поскольку это соединение обладает относительно высокой токсичностью и сильным нар котическим действием мы модифицировали этот метод, заменив хлороформ менее ток сичным растворителем – дихлорметаном (ДХМ). Кроме того, ДХМ отличался от хлоро форма меньшей плотностью (1,32 против 1,48 г/см3) и температурой кипения (40 °С про тив 61 °С), что существенным образом облегчает его возгонку из водных растворов и дает возможность повторного использования.
Суть метода заключается в том, что бактериоцинсодержащая жидкость смешивали с эквивалентным объемом ДХМ и подвергали скоростному гомогенизированию для полу чения эмульсии. После центрифугирования в результате сепарации формируется верхняя фаза (водная), промежуточная фаза (интерфаза) и нижняя фаза – ДХМ. Данные типичного эксперимента по приготовлению БПС методом фазовой сепарации приведены в табл. 4. Из представленных данных следует, что обработка супернатанта ДХМ позволяет выделить из него до 94,6 % от активности целевой субстанции с одновременным снижением на 86,2 % массы сухих веществ.
Таблица 4 – Количественные показатели фракционирования супернатанта B. circu lans Ск2ч с использованием дихлорметана Активность против E.coli, АЕ* Образцы Содержание сухих веществ, мг % АЕ /мг Суммарная % АЕ Супернатант 850 100,0 3,94 3349 100, Верхняя фаза 740 86,2 0,20 148 4, Промежуточная фаза 108 12,7 29,60 3200 94, Нижняя фаза 10 1,0 1,00 10 1, (*) АЕ, арбитражная единица – минимальное количество вещества, дающего эффект Таким образом, результаты исследований по отработке элементов технологической схемы показали возможность получения препаративных образцов бактериоциноподобного соединения B. circulans в количестве, достаточном для всесторонней оценки их биологи ческих и физико-химических свойств.
В главе 5 описаны результаты исследований основных биологических и физико химических свойств образцов БПС штаммов B. сirculans С2/2 и B. сirculans Ск2ч.
Активность образцов БПС наблюдали в отношении штаммов эшерихий, сальмо нелл, листерий, некоторых бацилл и вакцинного штамма сибиреязвенного микроба. В то же время при тестировании штаммов B. сirculans С2/2 и B. сirculans Ск2ч друг против друга зон ингибирования не наблюдали, что свидетельствует об иммунности этих штам мов к собственным метаболитам.
Выполненные эксперименты показали, что при действии органических растворите лей – ацетона, бутанола, метанола, хлороформа, дихлорметана, ацетонитрила, а также по сле высушивания при 105° C антимикробная активность образцов БПС полностью сохра нялась, но частично терялась после автоклавирования при 121 °C (15 мин) в щелочной зо не (рН 10 – 11). Полная потеря активности происходила при нагревании сухих проб до 150° C. Лиофилизированные препараты БПС сохраняют активность при хранении в тече ние 1 года (срок наблюдения) в условиях комнатной температуры (24 ± 3 °C) и полностью восстанавливаются при регидратации. Отметили также, что высушивание при 105 °C при водит к частичному снижению растворимости препарата БПС, которая, однако, восста навливается при суспендировании порошка в щелочной среде (рН 10) с последующим до ведением рН суспензии до физиологических значений (рН 6 – 7).
В отличие от бактериоцинов лактобактерий класса 1 и 2а образцы БПС оказались устойчивы к некоторым протеазным и гидролазным ферментам – химотрипсину (10 мг/мл), папаину (30 мг/мл), протеиназе К (10 мг/мл), лизоциму (10 мг/мл). Частичная инактивация БПС происходила лишь под воздействием панкреатического комплекса фер ментов (30 мг/мл). Из данных литературы известно [Takeuchi Y, et al., 1979], что устойчи вость такого рода соединений микробного происхождения может быть связана с наличием в их структуре - диаминобутириковых кислот, которые способствуют формированию циклических молекул, устойчивых к внешним воздействиям.
Исследование компонентного состава БПС.
На рис. 5 приведены данные по хроматографическому анализу грубо очищенного препаративного образца БПС B. circulans Ск2ч с использованием обращено-фазовой ко лонки.
е.о.п.
0, 0, 0, 0, 280 nm -0, мин 0 5 Рисунок 5 - Типовой профиль элюирования БПС B. circulans Ск2ч на колонке КАХ-6-80-4, заполненной сорбентом Сепарон-С Как показали результаты тестирования на культуре Е. coli «биоактивным» было только вещество пика, выходящего на 5–6 мин после начала элюирования. При этом дан ный пик регистрировали и при длине волны 280 нм (ароматические аминокислоты), и при длине волны 220 нм (пептидная связь). Пики, регистрируемые при этих двух длинах волн, полностью совпадали по времени выхода.
Таким образом, установили, что экспериментальный препарат БПС состоит из не скольких компонентов с различным временем удержания, но только один из них, выде ляющийся на 5–6 мин, обладает антагонистической активностью по отношению к культу ре Е. coli.
Для оценки молекулярной массы компонентов БПС провели трицин-ДСН-ПААГ электрофорез проб с использованием пептидных маркеров: лизоцима (14,3 кДа) и инсули на (5,7 кДа). Данные электрофоретического разделения образцов БПС, полученных из бесклеточных ферментатов B. circulans Ск2ч и B. circulans С2/2, приведены на рис. 6.
14,3 кДа 5,7 кДа Рисунок 6 - Оценка молекулярного веса антимикробных фракций штаммов B. circu lans с помощью трицин-ДСН-ПААГ - электрофореза и заливки геля агаром с E. coli М Как следует из представленных данных на рис. 6, БПС штамма B. circulans Ск2ч имеет молекулярную массу около 6 кДа, а БПС штамма С2/2 около 7 кДа. Эти образцы БПС показали одинаковую устойчивость к действию протеолитических ферментов, вы держивали нагревание при 105 °С, но теряли активность после автоклавирования при рН 10–11. Описанные свойства отличают БПС штаммов B. circulans Ск2ч и B. circulans С2/2 от бактериоцина, продуцируемого штаммом B. circulans 1580, который имел молеку лярную массу 3,5 кДа и был чувствителен к протеазам [Svetoch, et al., 2005].
Таким образом, образцы БПС штаммов Ск2ч и С2/2 B. circulans по основным био логическим и физико-химическим свойствам практически не отличаются друг от друга.
При этом, по молекулярному весу они значительно отличаются от антибиотиков, проду цируемых представителями этого же вида бацилл – полимиксина М (1157 Да), бутирозина (1050 Да) и циркулина (854 Да).
Исследование спектра и величины антимикробной активности. Образцы БПС штаммов Ск2ч и С2/2 B. circulans имели выраженную ингибирующую активность в от ношении ряда грамотрицательных бактерий, в том числе обладающих резистентностью к антибиотикам. Так, если для Escherichia coli (штаммы M17, 3R, O157:H7, 4/10R) по мето ду «spot-test» размер зоны ингибирования составил – 15–17 мм, для Salmonella Enteritidis (штаммы 237, 92 rif100, 204) – 11–12 мм, для Yersinia pseudotuberculosis 699 – 15 мм и Klebsiela pneumonia 964R – 13 мм, то для Listeria monocytogenes 776 и Staphylococcus aureus MR 218, всего 2–3 мм. Данные по оценке величины минимальных ингибирующих концентраций препаративного образца БПС B. circulans Ск2ч в отношении антибиотико резистентных клинических изолятов микроорганизмов представлены в табл. 5.
Таблица 5 – Минимальные подавляющие концентрации (МПК) образца БПС штамма B. circulans Ск2ч в отношении антибиотикорезистентных клинических изолятов микроорганизмов Величина МПК Тестируемый штамм по протеину,*мкг/мл по растворимой субстанции, мг Acinetobacter lwoffii 125 0,425 0, Pseudomonas aeruginosa 468 6,800 6, Staphylococcus aureus 46 0,425 0, Klebsiella pneumoniae 114 0,200 0, Enterobacter cloacae 190 0,200 0, Candida albicans 1710 0,850 0, Salmonella enteritidis 237 0,200 0, Shigella sonne 1/2 0,200 0, Campylobacter jejuni 1,700 0, Haemophilus influence XAU1 1,700 0, (*) определяли по методу [Bradford, 1976]. Исходная концентрация протеина – 27,2 мкг/мл;
растворимой части – 25 мг/мл.
Как следует из представленных данных, образцы препаратов БПС штаммов Ск2ч и С2/2 B. circulans, полученные по разработанной технологии, ингибируют рост ряда бакте риальных патогенов, в том числе представителей родов Salmonella, Campylobacter и Es cherichia, включая штаммы, резистентные к антибиотикам.
Глава 6 посвящена изучению возможностей практического применения антимик робных продуктов B. circulans в опытах на мелких животных и цыплятах с оценкой пере носимости ими БПС, а также по защите пищевой продукции в составе полимерных по крытий. В опытах на мышах после 7 дней кормления сухим кормом, пропитанным БПС, не отмечали изменений в поведенческой активности животных и не наблюдали заметных изменений в составе аэробной микрофлоры кишечника. Сделали вывод о том, что препа рат БПС, инкорпорированный в состав стандартного корма в количестве 100 мг на 1 гранулу (700 мг) из расчета на одну мышь, хорошо и без последствий переносится жи вотными. В опытах по оценке токсичности на мышах при внутрибрюшинной инъекции стерильной суспензии, приготовленной на основе сухой субстанции БПС в концентрациях до 100 мг/мл, величина LD50 составила 5000 мг/кг, что соответствует категории малоток сичных препаратов.
В табл. 6 приведены результаты опыта по оценке лечебной эффективности сухого корма, приготовленного с добавлением бесклеточного супернатанта B. circulans Ск2ч, для экспериментальной группы бройлеров, которые естественным образом были инфицирова ны патогенным для человека возбудителем кампилобактериоза – Campylobacter jejuni.
Таблица 6 – Лечебное действие корма, содержащего супернатант культуры B. circulans Ск2ч при трехдневном кормлении 35- суточной бройлерной птицы Концентрация Campylobacter jejuni (log КОЕ/г) в Группа цыплят №№ кур слепом отростке кишечника По особям Среднее 1 8, 2 7, Контрольная:
стандартный грану- 3 7, 7,34±0, лированныйо корм 4 7, «ПК-6» 5 6, 6 7, 31 3, Опытная:
32 3, корм «ПК-6», со 3,85±0, 33 4, держащий суперна 34 3, тант B.circulans * 35 3, Разница с контролем: 3, (*) получали смешиванием стандартного сухого корма ПК-6 с бесклеточным супернатантом 48 ч бульонной культуры B.circulans Ск2ч и последующим высушиванием корма конвективным методом Из представленных в табл. 6 данных следует, что кормление цыплят кормом, со держащим продукты ферментации B. circulans Ск2ч, приводит к достоверно значимому уровню падения (на 3,5 log) концентрации кампилобактерий в кишечнике птицы.
Известны попытки использования бактериоцинов, в частности низина, в составе полимерных пленок для защиты мясных продуктов от микробной порчи и ослизнения, од нако этот бактериоцин активен только против узкого спектра грамположительных бакте рий. На основе поливинилового спирта и БПС штаммов B. circulans и Р.polymyxa 602 из готовили защитные пленки и провели опыты для оценки возможности их нанесения на пищевые продукты в качестве биологического средства бактериальной деконтаминации.
На примере покрытия мясных изделий (нарезок сосисок) полимерами, содержащие бес клеточные стерильные супернатанты бактериоцинпродуцирующих бацилл, показана ре альная возможность существенного снижения уровня их естественной контаминации.
Таким образом, результаты опытов с использованием бройлерных цыплят кампилоносителей и скоропортящихся мясных изделий дают основание для практическо го применения БПС штаммов B. circulans при создании новых средств с обеззараживаю щими и деконтаминирующими свойствами.
ВЫВОДЫ 1. Из природных источников выделили, изучили и депонировали в Государственной коллекции микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск» пять новых штаммов B. circulans, кото рые являются источниками антимикробных соединений пептидной природы.
2. Изучили питательные потребности новых штаммов B. circulans, разработали ус ловия и режимы приготовления КЖ, обеспечивающие уровень выхода антимикробных соединений, приемлемый для создания лабораторных технологий.
3. Разработали лабораторную технологию приготовления препаратов БПС штамма B. circulans, включающую стадии культивирования, концентрирования КЖ и получения препаратов БПС в количестве, достаточном для всесторонней оценки их биологических и физико-химических свойств.
4. БПС штамма B. circulans Ск2ч имеет, по данным трицин-ДСН-ПААГ электрофореза, молекулярную массу около 6 кДа. Соединение устойчиво к действию про теолитических ферментов, выдерживает нагревание при 121 °С в течение 15 мин, разру шается при автоклавировании в щелочных зонах рН (10 – 11), и по этим свойствам отли чается как от ранее описанного бактериоцина штамма B. circulans 1580, так и от антибио тиков группы полимиксинов.
5. Экспериментальные образцы препаратов БПС штамма B. circulans Ск2ч ингиби руют рост ряда бактериальных грамотрицательных и грамположительных патогенов, в том числе представителей родов Salmonella, Campylobacter и Escherichia, включая их ва рианты, резистентные к антибиотикам.
6. Экспериментальные образцы БПС штамма Ск2ч безвредны для мышей и цыплят при пероральном способе введении в составе сухих кормов, а, по данным внутрибрюшин ного введения белым мышам, относятся к группе слаботоксичных веществ (LD50 = 5000 мг/кг).
7. Результаты опытов с использованием бройлерных цыплят и вареных мясных про дуктов показывают возможность использования БПС в составе лечебных кормов, защит ных полимерных покрытий, а также при разработке обеззараживающих и деконтамини рующих биологических средств нового поколения.
Список публикаций по теме диссертации А) Статьи в рецензируемых журналах:
1. Похиленко В. Д., Перелыгин В.В., Калмантаев Т.А., Садикова Г.Т., Храмов В.М.
Культуральные особенности бацилл группы circulans-subtilis-polymyxa как проду центов бактерицидных веществ широкого спектра действия. // В мире научных открытий. – 2010. - № 5 (11). – Часть 1. – С. 64–72.
2. Храмов В.М., Калмантаев Т.А., Чукина И.А., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В.
Поиск антагонистически активных энтерококков, получение и свойства синтези руемых ими бактерицидных веществ // В мире научных открытий. – 2010. – № (11). – Часть 4. – С. 41–46.
3. Калмантаев Т.А., Садикова Г.Т., Перелыгин В.В., Похиленко В.Д. Получение и оценка эффективности антимикробных полимерных покрытий на основе бактери цидных веществ Bacillus circulans и Paenibacillus polymyxa // Биомедицинский журнал «Medline.ru». – 2011. – Том 12 (121). – Микробиология. – С. 1478–1486.
Б) Статьи в иных изданиях:
4. Калмантаев Т.А., Храмов В.М., Перелыгин В.В., Похиленко В.Д. Новые сферы применения некоторых антагонистически активных штаммов бацилл // Наука Красноярья. – 2012. – №1. – С. 29–38.
В) Тезисы докладов:
5. Калмантаев Т.А., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Разработка способа получения антимикробных веществ Bacillus circulans: влияние состава питательной среды и условий культивирования продуцента. //. Тезисы из материалов І школы - конфе ренции молодых ученых и специалистов. – 2009. – С. 183–184.
6. Храмов В.М., Калмантаев Т.А.,Чукина И.А., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Но вый штамм Streptococcus faecium 3322 и бактериоцин Е-3322, обладающий анти листериозной активностью. // Тезисы из материалов ІІ школы - конференции моло дых ученых и специалистов. – 2010. – С. 338–340.
7. Калмантаев Т.А., Садикова Г.Т., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Новые бакте риоциноподобные вещества антагонистически активной группы бацилл. // Тезисы из материалов ІІ школы-конференции молодых ученых и специалистов. – 2010. – С. 324–325.
8. Калмантаев Т.А., Храмов В.М., Садикова Г.Т., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В.
Получение и исследование бактериоциноподобных субстанций из культуральной жидкости штамма продуцента Bacillus circulans Cк2ч. // Тезисы из материалов на учно-практической школы - конференции молодых ученых и специалистов. – 2011.
– С. 263–265.
9. Калмантаев Т.А., Чукина И.А., Садикова Г.Т., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В.
Антимикробные полимерные покрытия: пример использования бактерицидных веществ, продуцируемых группой Bacillus circulans. // Тезисы из материалов науч но-практической школы- конференции молодых ученых и специалистов. – 2011. – С. 265–266.
10. Храмов В.М., Калмантаев Т.А., Чукина И.А., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В.
Оценка возможности использования концентратов бактериоцинов в качестве кор мовой добавки // Журнал Гастроэнтерология Санкт-Петербурга, 2011. – № 4. Мате риалы 8-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии (Санкт Петербург, 24–25 ноября 2011 г.). – М40 – М41.
Выражаю искреннюю благодарность:
моим руководителям – д.т.н. Похиленко В.Д и к.б.н. Перелыгину В.В. за ценные консультации и оказанную помощь при выполнении диссертации;
профессору Светочу Э.А. за помощь в организации проведения экспериментов и ценные консультации;
сотрудникам отдела биологических технологий Садиковой Г.Т., Чукиной И.А., со трудникам отдела молекулярной биологии к.м.н. Мицевичу Е.В., Мицевич И.П. за помощь и содействие в работе;
ФБУН ГНЦ ПМБ, в лице директора чл.-корр. РАМН, д.м.н., проф. Дятлова И.А., за предоставленную возможность провести необходимые эксперименты и выполнить дан ную работу.