Адаптация микоплазм (mycoplasma gallisepticum s6) к неблагоприятным условиям
На правах рукописи
МУЗЫКАНТОВ Алексей Александрович АДАПТАЦИЯ МИКОПЛАЗМ (MYCOPLASMA GALLISEPTICUM S6) К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ УСЛОВИЯМ 03.00.04 - биохимия 03.00.07 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Казань-2008
Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ патогенеза Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук
Научный консультант: доктор биологических наук Чернова Ольга Александровна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Мелентьев Александр Иванович (Институт биологии РАН, г.Уфа) кандидат биологических наук, доцент Гимадутдинов Олег Александрович (Казанский Государственный Университет им. Ульянова-Ленина, г.Казань)
Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, г.Москва
Защита состоится "" октября 2008 года в "" часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул.
Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им.
Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета.
Автореферат разослан "_" сентября 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Абрамова З.И.
Актуальность проблемы. Выяснение механизмов, обеспечивающих выживание микоплазм (класс Mollicutes) в разных условиях среды, представляет значительный интерес как с точки зрения фундаментальных исследований, так и практических разработок, связанных с определением молекулярных основ формирования и эволюции системы "паразит-хозяин" и способов её контроля [Борхсениус и др., 2002;
Razin et al., 2006].
Большой объем экспериментальных и теоретических данных, полученных в разных лабораториях мира за последние годы, значительно расширил представления о биологии мельчайших бесстеночных бактерий, способных к самостоятельному воспроизведению. Однако в исследовании адаптации этих бактерий к биогенным и абиогенным стрессорам сделаны лишь первые шаги [Чернов и др., 2005, 2007;
Cecchini et al., 2007]. Было обнаружено, что адаптация "вездесущей" микоплазмы Acholeplasma laidlawii к неблагоприятным условиям (ограничению по субстрату и понижение температуры) связана с превращением вегетативных форм (ВФ) клеток микоплазмы в некультивируемые формы (НФ) и показано, что ВФ и НФ A. laidlawii существенно различаются по морфологии, ультраструктуре, экспрессии генома и патогенности [Чернов и др., 2004;
Chernov et al., 2007]. Изменения размеров, морфологии, ультраструктуры, пролиферации и вирулентности клеток, возникающих при неблагоприятных условиях роста у аспорогенных бактерий, описаны в ряде работ [Головлев и др., 1998;
Вайнштейн, Кудряшова, 2000;
Oliver, 2005]. Однако соответствующие процессы у разных видов микоплазм не изучены.
Уникальным видом микоплазм с точки зрения адаптивных способностей является Mycoplasma gallisepticum. Эта микоплазма, известная как возбудитель болезней птиц и контаминант создаваемых на основе куриных эмбрионов вирусных вакцин, встречается также у растений [Коромыслов и др., 1987;
McGarrity et al., 1992]. Контроль и подавление инфекций, вызываемых M. gallisepticum, представляют серьезную проблему, решение которой связывают с успехами изучения молекулярной и клеточной биологии микоплазмы, определяющей адаптацию бактерий к неблагоприятным условиям (НУ) среды и патогенность.
Цель данной работы - выяснить особенности адаптации M. gallisepticum S6 к неблагоприятным условиям среды.
Основные задачи исследования:
1. Провести сравнительный анализ морфологии, ультраструктуры и пролиферации клеток M. gallisepticum S6, образующихся на полноценной питательной среде и в неблагоприятных условиях (ограничение по субстрату и понижение температуры) культивирования.
2. Провести сравнительный анализ амплификации нуклеотидных последовательностей ряда генов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования.
3. Провести сравнительный анализ полипептидов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования.
4. Провести сравнительный анализ ДНК-повреждающего действия клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования.
5. Провести сравнительный анализ фитопатогенности клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования.
Научная новизна. Впервые установлено, что адаптация M. gallisepticum S к НУ сопровождается переходом ВФ клеток микоплазмы в НФ. ВФ и НФ M. gallisepticum S6 существенно различаются по морфологии и ультраструктуре.
Впервые показано, что ВФ клеток M. gallisepticum S6 проявляют генотоксичность в отношении тестерного штамма E. coli PQ37, тогда как НФ микоплазмы в отношении соответствующего штамма бактерии ДНК повреждающего действия не оказывают.
Впервые определена полная нуклеотидная последовательность гена pvpA, кодирующего фазовариабельный белок цитоадгезии M. gallisepticum S6, у ВФ и НФ микоплазмы.
Впервые показано, что переход ВФ в НФ M. gallisepticum S6 связан с изменением топологии, структуры ДНК и экспрессии белков в клетках микоплазмы. Идентифицировано 63 белка, участвующие в адаптации M. gallisepticum S6 к НУ и составлена схема возможных изменений метаболических путей в клетках микоплазмы при культивировании их в НУ среды.
Впервые установлено, что M. gallisepticum S6 обладает фитопатогенным потенциалом и показано, что адаптация к НУ сопровождается изменением вирулентных свойств микоплазмы.
Научно-практическая значимость. Полученные данные вносят вклад в понимание адаптации M. gallisepticum S6 к неблагоприятным условиям среды.
Результаты работы могут служить основой для развития новых подходов к определению молекулярных механизмов формирования и эволюции системы "паразит-хозяин", а также способов контроля микоплазменных инфекций.
Разработаны методы исследования процесса адаптации к НУ среды M. gallisepticum S6 in vitro. Предложен молекулярно-генетический зонд для дифференциальной диагностики ВФ и НФ M. gallisepticum S6 – высокопатогенной для птиц микоплазмы, являющейся контаминантом создаваемых на основе куриных эмбрионов вирусных вакцин, способной также инфицировать растения.
Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в медицинских, ветеринарных, сельскохозяйственных, биологических и биотехнологических учреждениях, занимающихся разработкой способов диагностики и контроля микоплазменных инфекций, а также в учебном процессе, в том числе курсах лекций по биохимии, молекулярной биологии, микробиологии, стрессологии и физиологии растений в ВУЗах.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследование. Работа в 2005-2008 гг. проводилась в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме "Взаимодействие микоплазм с высшими организмами на молекулярно-генетическом уровне" (№ гос. рег.
0120.0 603845). Исследования автора, как исполнителя данной темы, поддержаны грантами ГК № 02.512.11.2067 в рамках ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России" на 2007-2012 годы по приоритетным направлениям "Живые системы" по теме "Сравнительный протеомный анализ вегетативных форм и наноклеток Mycoplasma gallisepticum для создания технологии контроля микоплазменных инфекций" и РФФИ 08-04-01047-а "Молекулярные основы адаптации микоплазм (M. gallisepticum) к биогенным и абиогенным стрессорам:
белки наноформ и их гены", 2008-2010 гг., а также грантами ведущей научной школы (руководитель акад. И.А. Тарчевский) № НШ-6042;
№ НШ 5399,2008,4. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Синтез праймеров, секвенирование нуклеотидных последовательностей, двумерный электрофорез и идентификацию полипептидов проводили на базе ФГУ НИИ физико химической медицины Минздрава РФ;
оценку генотоксичности клеток M.
gallisepticum S6 и наноскопию молекул ДНК – на базе КГУ (биолого почвенный факультет, кафедра микробиологии и физический факультет, кафедра оптики и нанофотоники, соответственно).
Благодарности: Приношу глубокую благодарность научному руководителю д.б.н. О.А. Черновой за неоценимую помощь в выборе данного направления исследований, за внимательное и оперативное решение проблем, возникавших по ходу выполнения и написания диссертации, за постоянную заботу и поддержку;
приношу искреннюю благодарность д.б.н., проф. В.М.
Чернову заведующему лабораторией молекулярных основ патогенеза КИББ КазНЦ РАН и к.б.н. О.В. Горшкову за неоценимую помощь в выполнении исследований;
выражаю искреннюю благодарность к.б.н. М.В. Трушину, к.б.н.
Г.Ф. Шаймардановой, к.б.н. Т.Н. Нестеровой, к.б.н. А.А. Пономаревой КИББ КазНЦ РАН за всестороннюю помощь в проведении работ и анализе полученных данных;
выражаю искреннюю благодарность д.б.н., проф. О.Н.
Ильинской, к.б.н. А.Б. Маргулис, асп. А.Д. Пельникевич КГУ, а также д.б.н., проф. В.М. Говоруну, к.б.н. В.Н. Лазареву, к.б.н. И.А. Деминой, к.х.н. Т.А.
Акопиан, асп. Ю.И. Басовскому ФГУ НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ за предоставленные возможности проведения совместных работ и ценные советы при обсуждении результатов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Клетки M. gallisepticum S6, выращенные на полноценной питательной среде и в неблагоприятных условиях – при ограничении субстрата и понижении температуры, - имеют существенные различия по морфологии и ультраструктуре. Длительное культивирование M. gallisepticum S6 в неблагоприятных условиях приводит к превращению вегетативных форм (ВФ) клеток микоплазмы в некультивируемые формы (НФ).
2. Переход ВФ в НФ M. gallisepticum S6 связан с изменением топологии и структуры ДНК микоплазмы.
3. ВФ и НФ клеток M. gallisepticum S6 различаются по экспрессированным белкам.
4. Клетки M. gallisepticum S6 проявляют фитопатогенность в отношении специфичного и неспецифичного индикаторов фитомикоплазмозов.
5. Адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается изменениями генотоксичности, а также фитопатогенности микоплазмы.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 11-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология – наука XXI века" (Пущино, 2007), XII Всероссийской научно практической конференции, посвященной 150-летию со дня рождения В.М.
Бехтерева (Казань, 2007), Всероссийской конференции "Фундаментальные аспекты исследования симбиотических систем" (Саратов, 2007), Итоговой конференции Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (Казань, 2007), Итоговой конференции в рамках приоритетного направления "Живые системы" (Москва, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), I Всероссийском, с международным участием, конгрессе студентов и аспирантов - биологов "Симбиоз - Россия - 2008" (Казань, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста;
состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. В работе представлено 9 таблиц и 24 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 286 источников, из них 72 – в отечественных изданиях.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Материалы и методы исследований В работе был использован штамм Mycoplasma gallisepticum S6, полученный из коллекции микроорганизмов Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (РАМН, Москва). Культуру клеток M. gallisepticum S6 после музейного хранения выращивали при 37 С в жидкой питательной среде Эдварда, с модификациями [Борхсениус и др., 2002].
Для получения культуры M. gallisepticum S6, адаптированной к неблагоприятным условиям, и реверсии использовали методы индукции некультивируемого состояния у A. laidlawii PG8 и пробуждения клеток ахолеплазмы из некультивируемого состояния в активно пролиферирующую культуру [Чернов и др., 2004, 2005], соответственно.
Оценку числа жизнеспособных клеток в популяции M. gallisepticum S проводили путем подсчета количества колониеобразующих единиц (КОЕ) в 0,3% агаризованной питательной среде (метод Коха) и методом предельных разведений (МПР) в жидкой питательной среде [Пименова и др., 1983], с учетом особенностей культивирования микоплазмы [Борхсениус и др., 2002].
Целостность плазматической мембраны клеток M. gallisepticum S определяли по ее проницаемости для красителей: метиленового синего и бромистого этидия [Ильинская и др., 2006]. Препараты анализировали на конфокальном микроскопе LSM 510 META ("Carl Zeiss", ФРГ). Наблюдения проводили в 5 полях зрения для каждого образца.
Трансмиссивную электронную микроскопию проводили согласно Cole [1983]. Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-III (Швеция).
Образцы просматривали на электронном микроскопе JEM-1200EX (Япония).
Выяснение токсичных и генотоксичных эффектов клеток M. gallisepticum S6 и их культуральной жидкости проводили по Quillardet et al.
[1982].
Выделение ДНК из клеток микоплазм и тканей растений осуществляли с помощью метода фенольной экстракции [Маниатис и др., 1984].
Дополнительно препараты ДНК обрабатывали РНКазой ("Serva", ФРГ) и протеиназой К ("Sigma", США).
Атомно-силовую микроскопию образцов ДНК M. gallisepticum S проводили по Braga, Ricci [2004]. Исследование образцов ДНК проводили на атомно-силовом микроскопе Solver P47H ("НТ-МДТ", Россия). Для обработки данных использовали программу Nova 1.0.26 RC1 (разработчик - НТ-МДТ, Россия).
Направленную амплификацию фрагментов ДНК M. gallisepticum S посредством ПЦР проводили с использованием праймеров, синтезированных на основе известных нуклеотидных последовательностей генов (himA/hup, pvpA, rpoD, recA, dnaB) M. gallisepticum Rlow [Papazisi et al., 2003]. Олигонуклеотиды синтезировали в НПО "ЛИТЕХ" (г. Москва). Анализ продуктов ПЦР проводили с помощью электрофоретического разделения фрагментов ДНК в 2% агарозном геле ("Helicon", Россия) с последующим окрашиванием бромистым этидием ( мг/мл).
Клонирование фрагментов ДНК M. gallisepticum S6 в плазмиде pGEM-T Easy Vector ("Promega", США) осуществляли согласно инструкции изготовителя. Трансформацию проводили с помощью электропорации в ампициллин-резистентный штамм E. coli DH5.
Секвенирование фрагментов ДНК осуществляли с помощью автоматического секвенатора ABI 3130 ("Applied Biosystems", США), согласно инструкции изготовителя на базе лаборатории протеомного анализа ФГУ НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ (г. Москва).
Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с использованием пакетов программ Informax Vector NTI Suite 9 и DNAMAN 4.0. Поиск доменов проводили в BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi), SwissProt (http://cn.expasy.org/), BLOCKs (http://blocks.fhcrc.org/), Prosite (http://cn.expasy.org/prosite/), Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/), SMART (http://smart.embl heidelberg.de/).
Подготовку препаратов, двумерный электрофорез и идентификацию белков проводили по Говоруну и др. [2003], Blum et al. [1987] и Grg et al.
[2000] на базе лаборатории протеомного анализа ФГУ НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ (г. Москва).
Белки, выделенные из ВФ и НФ клеток M. gallisepticum S6, составляли контрольную и опытную группы, соответственно. Белки идентифицировали по массам протеолитических фрагментов с использованием программы Mascott Peptide Fingerprint (Matrix Science, США) и базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank), содержащей полную последовательность генома M. gallisepticum Rlow [Papazisi et al., 2003].
Инфицирование растений (Vinca minor L. и Vigna radiata L.) клетками М. gallisepticum S6 проводили по Чернову и др. [2007] спонтанным заражением 3-х дневных проростков растений через корневую систему посредством инкубирования корешков растений в течение 24 часов в растворах фосфатно солевого буфера, содержащих и не содержащих клетки М. gallisepticum S6, для опытных и контрольных растений, соответственно.
Статистический анализ данных проводили с применением стандартных математических методов расчета среднеквадратичного отклонения и сравнения средних по критерию Стъюдента в программе Microsoft Excel 2002. Критерий вероятности P0,05 принимали достаточным для достоверной разницы опытной и контрольной групп данных [Лакин, 1990].
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Особенности морфологии, ультраструктуры и пролиферации клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования В результате сравнительного анализа трансмиссивных микрографий было обнаружено, что морфология и ультраструктура клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования, различаются. На полноценной питательной среде Эдварда (ППСЭ) M. gallisepticum S6 образует грушевидные клетки (длина 0,6-1 мкм), которые имеют четкие цитоскелетоподобные образования и терминальную структуру "bleb". Эти клетки образуют на твердых питательных средах характерные колонии ("fried eggs") и соответствуют типичным вегетативным (пролиферирующим) формам (ВФ) клеток микоплазмы.
Рис. 1. Трансмиссивные микрографии ВФ (А) и НФ (Б) клеток M. gallisepticum S Т – тубулиноподобные структуры, В – терминальная структура "bleb", М – клеточная мембрана, КПС – капсулоподобная структура.
На среде с ограничением субстрата и при понижении температуры культивирования M. gallisepticum S6 образует кокковидные клетки (диаметр 0,2-0,8 мкм), лишенные полярных образований. Такие клетки имеют конденсированный нуклеоид и электронно-плотную структуру мембран.
Цитоскелетоподобные структуры в кокковидных клетках M. gallisepticum S6 не визуализируются. При этом некоторые клетки оказываются окруженными капсулоподобными образованиями (рис. 1Б).
На основании данных МПР и определения КОЕ было установлено, что клетки M. gallisepticum S6 при статическом культивировании на ППСЭ и в НУ теряют способность к пролиферации и образованию колоний через 15 и 8 суток, соответственно. Однако, по данным ПЦР, а также цитохимических методов и электронной микроскопии, интактность ДНК M. gallisepticum S6, а также целостность мембраны клеток микоплазмы при культивировании их в НУ сохраняются на протяжении всего срока наблюдения (180 суток). При этом было обнаружено, что при увеличении срока статического культивирования клеток микоплазмы в НУ происходит уменьшение клеточных размеров и исчезновение класса клеток с линейными размерами 0,8-1 мкм (рис. 2).
Подобные уменьшения размера клеток характерны для аспорогенных бактерий, в том числе A. laidlawii PG8, при адаптации бактерий к НУ среды, связанной с переходом ВФ клеток в НФ [Головлев, 1998;
Чернов и др., 2005].
Рис. 2. Изменение основных модальных классов клеток M. gallisepticum S6, при культивировании в разных условиях – на ППСЭ (А) и в НУ в течение (Б), 12 (В), 16 (Г) и 20 (Д) недель По оси ординат – среднее значение длины клеток (нм) ± стандартное отклонение Полученные нами данные позволяют заключить, что адаптация M.
gallisepticum S6 к НУ среды, как и ряда аспорогенных бактерий, в том числе A. laidlawii PG8, связана с переходом ВФ микоплазмы в НФ. Однако, по данным Чернова с соавт. (2005), клетки A. laidlawii PG8 на ППСЭ теряют способность к образованию колоний через 21 сутки, а в НУ среды у части (менее 0,1 %) популяции клеток микоплазмы способность формировать колонии сохраняется на протяжении 380 суток. При этом преобладающим классом популяции адаптированных к НУ среды клеток A. laidlawii PG является класс кокковидных клеток размером 0,2 мкм и менее (наноклетки и наноформы). Между тем появление клеток размером 0,2 мкм и менее связывают с промежуточной стадией формирования НС у бактерий [Kaprelyants et al., 1993]. В наших исследованиях такой класс клеток M. gallisepticum S появлялся на 16 неделе культивирования микоплазмы в НУ среды, составлял только 19% клеточной популяции и исчезал к 20 неделе статического культивирования бактерий в соответствующих условиях. Полученные нами данные могут свидетельствовать о существенных различиях реактивности клеточных популяций A. laidlawii PG8 и M. gallisepticum S6 в отношении соответствующих условий среды.
Применение метода "пробуждения" НФ клеток A. laidlawii PG8 оказался неэффективным для реверсии НФ M. gallisepticum S6 – превращение НФ в типичные ВФ клеток микоплазмы. Известно, что условия пробуждения из некультивируемого в активно пролиферирующее состояние у различных бактерий весьма различаются [Головлев, 1998]. Для НФ некоторых бактерий единственным эффективным способом реверсии является пассаж через восприимчивый организм [Романова, Гинцбург, 1998]. Вероятно, реверсия M. gallisepticum S6 требует специфичных факторов, которые еще предстоит определить.
2.2. Особенности амплификации нуклеотидных последовательностей ряда генов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования Изменения топологии ДНК бактерий в НУ, ассоциированные в том числе с конденсацией нуклеоида, могут приводить к дифференциальной амплификации нуклеотидных последовательностей некоторых генов клеток микроорганизмов, образующихся в соответствующих условиях среды [Warner, Oliver, 1998]. Этот эффект может вызываться ДНК-связанными белками и проявляться аттенуацией ПЦР-сигнала при использовании матричной ДНК без специальной очистки [Зигангирова и др., 1995].
В наших исследованиях дифференциальная амплификация была установлена при использовании в ПЦР специфичных праймеров для амплификации полной нуклеотидной последовательности pvpA-гена микоплазмы (рис. 3). Этот эффект был связан, в частности, с появлением у НФ M. gallisepticum S6 дополнительного ампликона (рис. 3, дор. 4). Специфичные Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации нуклеотидных последовательностей ДНК ВФ (1, 2), НФ (3, 4), а также адаптированных клеток M.
gallisepticum S6 при отмене НУ (5), обработанных (2, 4) и необработанных (1, 3, 5) протеиназой K, М – маркер длины фрагментов.
праймеры для амплификации нуклеотидной последовательности гена pvpA M. gallisepticum S6 позволяют определять с помощью ПЦР в тестируемых образцах клетки микоплазмы, образующиеся в разных условиях, – ВФ и НФ.
Образование дополнительного ПЦР-продукта размером 582 н.п.о. при амплификации ДНК НФ M. gallisepticum S6 и клеток адаптированной культуры при отмене НУ может свидетельствовать как о появлении дополнительных сайтов отжига праймеров, так и рекомбинационных процессах, связанных с нуклеотидной последовательностью гена pvpA, при культивировании клеток микоплазмы в новых условиях. PvpA M. gallisepticum является фазовариабельным белком цитоадгезии, подверженным высокочастотным перестройкам [Boguslavsky et al., 2000]. Вариабельность антигенных детерминант белков клеточной поверхности является способом преодоления микоплазмами иммунного контроля организма-хозяина [Yogev et al., 2002].
Вариации обусловливаются структурными перестройками генов соответствующих белков. Такие данные были получены нами в отношении vaa генов клинических изолятов M. hominis при сравнительном анализе их нуклеотидных последовательностей [Chernov et al., 2005].
В этой связи нами были определены первичные нуклеотидные последовательности основных и дополнительных ампликонов, возникающих при использовании в ПЦР ДНК клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях (рис. 4). В нуклеотидных последовательностях основных Рис. 4. Ампликоны ДНК клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях, полученные в ПЦР с праймерами для амплификации pvpA-гена микоплазмы (А) и нуклеотидные последовательности соответствующих ПЦР продуктов (Б, В, Г).
На электрофореграмме представлены ампликоны ВФ (1), НФ (2,3), образующихся при статическом культивировании в НУ в течение 8 и 20 недель, соответственно, и адаптированных клеток микоплазмы при отмене НУ (4).
pvpA-ампликонов размером 1150 н.п.о. ВФ и НФ M. gallisepticum S6 была выявлена ОРС размером 1086 н.п.о., которая на 97% оказалась гомологичной нуклеотидным последовательностям pvpA-генов штаммов R и Pendik M. gallisepticum. Первичная структура гена pvpA клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования (ВФ и НФ), оказалась идентичной.
В нуклеотидной последовательности дополнительного ампликона ( н.п.о.), возникающего у НФ микоплазмы, были выявлены две ОРС, не зарегистрированные в геноме ВФ M. gallisepticum Rlow. Высокая степень гомологии нуклеотидной последовательности соответствующего ампликона с геном pvpA (54%) при отсутствии других протяженных гомологичных участков на хромосоме M. gallisepticum R позволяет предполагать, что pvpA-ген может быть основой для формирования новых участков в геноме микоплазмы.
В литературе имеются данные, что адаптация организмов (про- и эукариот) к новым условиям окружающей среды может быть связана с внутригеномными рекомбинационными перестройками, определяющими образование новых нуклеотидных последовательностей, а также генов [Гогвадзе, Буздин, 2005;
Гогвадзе и др., 2005;
Torkelson et al., 1997;
Esnault et al., 2000]. Однако молекулярные механизмы соответствующего явления у M. gallisepticum S6 еще предстоит выяснить.
2.3. Сравнительный анализ полипептидов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования В результате сравнительного анализа полипептидов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования, было установлено, что адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается существенным изменением экспрессии белков в клетках микоплазмы (табл. 1). Количественный и качественный состав полипептидных пулов ВФ и НФ M. gallisepticum S6 весьма различается. Различия связаны как с редукцией, так и индукцией экспрессии продуктов ряда генов, а также появлением в клетках НФ микоплазмы изоформ белков. У НФ микоплазмы наблюдается тенденция к смещению значительного количества белков в кислую область.
Всего в результате сравнительного анализа полипептидных спектров ВФ и НФ M. gallisepticum S6 было идентифицировано 63 белка, участвующие в адаптации клеток микоплазмы к НУ.
Образование изоферментов, участвующих в энергетическом метаболизме в НФ клеток, может способствовать оптимизации катализа реакций в клетках бактерий в НУ среды [Хочачка, Сомеро, 1988]. При этом чрезвычайно высокое в НФ M. gallisepticum S6 разнообразие изоформ адгезинов (в том числе PvpA), отличающихся не только по рН, но и по массе, может быть универсальной защитной реакцией микоплазм, связанной с усилением адгезии бактерий к клеткам хозяина под действием стрессовых факторов [Wasinger et al., 2000].
Полученные нами данные свидетельствовали, что в НФ клеток M. gallisepticum S6 сохраняется значительная часть ферментов гликолитического пути. При этом наличие изоформ соответствующих ферментов позволяет предполагать, что одним из путей, активирующихся в клетках M. gallisepticum S6 при культивировании их в НУ среды, является Табл. 1.
Идентифицированные белки, экспрессия которых значительно изменяется при адаптации M. gallisepticum S6 к НУ Локус ОРС на Локус ОРС на Белок Белок хромосоме хромосоме ch_1510 MGA_0123 ch_1066 MGA_ PykF * MGA_0156 ch_1080 MGA_ AcoB * MGA_0164 ch_1080 (N-конец) MGA_ AcoA * MGA_0165 PstS MGA_ ch_1566 MGA_0226 Tsf * MGA_ uh_1572 MGA_0241 NusA MGA_ uh_1579 * MGA_0252 PutA * MGA_ PvpA * MGAL_0256_0258 ch_1190 MGA_ EF-G MGA_0260 ch_1200 MGA_ DnaK * MGA_0279 Smc-like * MGA_ ch_1601 MGA_0306 MGC3 * MGA_ GAPDH* MGA_0330 GreA MGA_ VlhA 3.03 * MGA_0380 TufB * MGA_ MALLP * MGA_0398 ch_1301 MGA_ ch_1660 MGA_0416 ch_1316 MGA_ ch_1670 MGA_0431 Pgk * MGA_ RpoA * MGA_0443 ch_1369 MGA_ ch_1709 MGA_0495 ch_1371 MGA_ Fba MGA_0498 ch_1381 MGA_ GTPase MGA_0500 GrpE MGA_ PtsA * MGA_0508 DnaJ MGA_1324d - экспрессирован у НФ, но не у ВФ;
- не экспрессирован у НФ, или экспрессия понижается;
* - белок представлен изоформами у НФ;
ch / uh – консервативный/уникальный гипотетический белок глюконеогенез. Неуглеводными компонентами, определяющими функционирование этого пути, могут быть аминокислоты и, в меньшей степени, липиды, высвобождающиеся при лизисе части клеток популяции.
Интенсификация глюконеогенеза обеспечивает синтез необходимого пула сахаров, в том числе для формирования капсулоподобных структур M. gallisepticum S6 (рис. 1Б), способствующих выживанию клеток бактерий в НУ [Степанова и др., 2001]. На основании полученных экспериментальных данных и анализе их in silico составлена схема возможных перестроек метаболических путей в клетках M. gallisepticum S6 при адаптации к НУ.
2.4. Особенности генотоксичности клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования Адаптация микроорганизмов к действию различных стрессорных факторов может определять значительные изменения метаболизма и вирулентности бактериальных клеток [Хмель, 2005;
Чернов и др., 2007], в том числе связанные с секрецией специфических метаболитов, обладающих мутагенной [Ильинская и др., 2002] или антимутагенной активностью [Воробьева и др., 1993].
В результате наших исследований было обнаружено, что адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается изменением генотоксичных свойств клеток микоплазмы и их культуральной жидкости (рис. 5).
Рис. 5. Индукция SOS-ответа тестерного штамма E. coli PQ37 при воздействии ВФ и НФ клеток M.
gallisepticum S6 и их культуральной жидкости Клетки M. gallisepticum S6, образующиеся на полноценной питательной среде, а также их культуральная жидкость индуцируют SOS-ответ у клеток тестерного штамма E. coli PQ37. Клетки M. gallisepticum S6, образующиеся в НУ, а также их культуральная жидкость генотоксичных эффектов не проявляют.
Отсутствие SOS-ответа у клеток тестерного штамма E. coli PQ37 при воздействии НФ и их культуральной жидкости может свидетельствовать, что у M. gallisepticum S6, как и у ряда других аспорогенных бактерий, при адаптации к НУ происходит аттенуация вирулентных свойств, связанных с генотоксичными эффектами. Проявление генотоксичных эффектов как у ВФ, так и у культуральной жидкости этих клеток в отношении E. coli PQ37, позволяет предположить секрецию генотоксичных метаболитов из клеток микоплазмы в окружающую среду и/или изменения компонентов культуральной среды под действием секретируемых метаболитов ВФ M.
gallisepticum S6. Природа этих метаболитов представляет особенный интерес с точки зрения патогенного потенциала этой широко распространенной микоплазмы в отношении инфицированных клеток хозяина и микроорганизмов в микробиоценозах [Hudson et al., 2006].
2.5. Фитопатогенность M. gallisepticum S6 и ее особенности у клеток микоплазмы, образующихся в разных условиях культивирования M. gallisepticum – широко распространенный возбудитель респираторных микоплазмозов птиц, контаминант создаваемых на основе куриных эмбрионов вирусных вакцин [McGarrity et al., 1992]. Вместе с тем в литературе имеются данные о выявлении M. gallisepticum у растений [Коромыслов и др., 1987].
Однако сообщения об исследованиях влияния инфекции M. gallisepticum на развитие деструктивных процессов в тканях растений в литературе отсутствуют. В этой связи выяснение способности клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования (ВФ и НФ), инфицировать растения специфичного и неспецифичного индикаторов фитомикоплазмозов – барвинка малого (Vinca minor L.) и фасоли золотистой (Vigna radiata L.), соответственно, и вызывать у них морфофизиологические и ультрацитоструктурные изменения явилось задачей наших исследований.
Определение фитопатогенности у M. gallisepticum S6 выполняли с использованием алгоритма, разработанного для проведения соответствующих исследований в отношении A. laidlawii PG8 [Чернов, 1998;
Чернов и др., 2007].
Для выявления ВФ и НФ M. gallisepticum S6 в тканях растений использовали методы трансмиссивной микроскопии [Чернов и др., 1996], а также полимеразной цепной реакции [Чернов и др., 2007] с праймерами, сконструированными на основе нуклеотидной последовательности гена himA/hup, кодирующего HU-белок (heat-unstable nucleoid protein) штамма M.
gallisepticum, для которого нами было установлено отсутствие аттенуации ПЦР сигнала при адаптации клеток микоплазмы к НУ среды.
В результате наших экспериментов было обнаружено, что заражение V. minor L. клетками M. gallisepticum S6 вызывает у 100 % опытных растений аппарантную инфекцию с типичной картиной морфозов, возникающих у растений при инфицирование их фитопатогенными микоплазмами.
Заражение V. radiata L. клетками M. gallisepticum S6 приводило к развитию латентной микоплазменной инфекции. В результате анализа 90 образцов 18-ти дневных проростков растений (V. radiata L.) выраженные морфологические аномалии, характерные для фитомикоплазмозов (апикальный некроз, карликовость, скручивание листьев, развитие боковых побегов), не были обнаружены. Только у единичных растений был отмечен некроз краевой пластинки листа и слабые проявления хлороза. Однако результаты ПЦР анализа свидетельствовали о присутствии ДНК M. gallisepticum S6 в клетках тканей (корень, стебель, лист) всех растений опытной группы. В результате исследования трансмиссивных микрографий было установлено, что инфицирование V. radiata L. клетками НФ M. gallisepticum S6 вызывает характерные для фитомикоплазмозов изменения в тканях растений. При этом выраженность деструктивных процессов у растений, инфицированных ВФ и НФ микоплазмы, различается.
В растениях, зараженных ВФ микоплазмы, наблюдаются изменения в ультраструктуре клеток околососудистой паренхимы (рис. 6А, Б). Хлоропласты в клетках паренхимы имеют светлый матрикс, тилакоиды расположены рыхло, Рис. 6. Трансмиссивные микрографии клеток растений (V. radiata L.), инфицированных ВФ (А, Б) и НФ (В, Г) M. gallisepticum S Кз – крахмальные зерна, Мк – микоплазмы, М – митохондрии, Т – тилакоиды, Хл хлоропласты образуют стопки из 3-5 гран, между которыми локализованы небольшие крахмальные зерна (рис. 6А). Митохондрии имеют извилистую форму и светлую, лишенную крист, область матрикса. В трахеидах обнаруживаются единичные клетки микоплазмы размером 0,6-0,8 мкм (рис. 6Б).
В растениях, зараженных НФ M. gallisepticum S6, ультраструктура клеток проводящего пучка полностью нарушена и наблюдается деградация всех органелл (рис. 6В, Г). В зараженных клетках не просматривается плазматическая мембрана, нарушена плотность цитоплазмы. Ядро в зараженных микоплазмой клетках паренхимы имеет очень рыхлую гиалоплазму. В хлоропластах отсутствуют крахмальные зерна, упаковка тилакоидов рыхлая, а строма светлая (рис. 6В). Подобная ультраструктура хлоропластов отражает снижение их функциональной активности при развитии хлороза, характерного для фитомикоплазмозов [Christensen et al., 2005]. Клетки губчатой паренхимы листа еще сохраняют свою ультраструктурную организацию, тогда как граничащие с ними паренхимные клетки обкладки пучка полностью разрушены. По краю клеточной стенки обнаруживается большое количество мелких кокковидных клеток микоплазмы, в том числе размером 0,1-0,15 мкм (рис 6В, Г), характерным для наноформ бактерий [Чернов и др., 2007]. Полученные нами результаты позволяют заключить, что M. gallisepticum S6 обладает фитопатогенным потенциалом. При этом адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается усилением вирулентности микоплазмы в отношении растений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Большой интерес к молекулярным основам адаптации микоплазм связан, с одной стороны, с уникальностью биологии мельчайших прокариот, а с другой – диктуется практической необходимостью. Микоплазмы – возбудители заболеваний человека, животных, растений, основные контаминанты клеточных культур, в том числе используемых в биотехнологии для производства вирусных вакцин [Борхсениус и др., 2002;
Razin, 2006].
Сравнительно недавно были получены данные об особенностях адаптации к НУ A. laidlawii PG8 (сем. Acholeplasmataceae, кл. Mollicutes) [Чернов и др., 2004, 2005, 2007;
Chernov et al., 2007]. В результате нашей работы были выявлены особенности адаптации к НУ представителя другой филогенетической группы молликут – M. gallisepticum S6 (сем.
Mycoplasmataceae, кл. Mollicutes). Полученные нами данные могут свидетельствовать, что выживание в новых условиях клеток M. gallisepticum S связано с репрограммированием клеточной и молекулярной биологии микоплазмы. Адаптация M. gallisepticum S6, как и A. laidlawii, а также ряда аспорогенных бактерий, связана с переходом ВФ клеток микоплазмы в НФ.
Однако реактивность клеток A. laidlawii PG8 и M. gallisepticum S6 в отношении НУ различается. Одной из причин этого могут быть существенные различия биологии M. gallisepticum и A. laidlawii, - микоплазм, принадлежащим к разным филогенетическим группам молликут [Oshima, Nishida, 2007].
M. gallisepticum способна успешно преодолевать защитные системы высших организмов и выживать в разных условиях среды [Nagatomo et al., 2001;
Collett, 2005]. Эта микоплазма, известная как возбудитель заболеваний птиц и контаминант вирусных вакцин, создаваемых на основе куриных эмбрионов, встречается также у растений. Однако данные о фитопатогенности этой микоплазмы в литературе отсутствуют.
В нашей работе впервые с точки зрения критериев вирулентности (инфекционность, инвазивность, токсигенность и персистенция) было показано, что M. gallisepticum S6 способна проявлять фитопатогенность в отношении как специфичного, так и неспецифичного индикаторов фитомикоплазмозов.
M. gallisepticum S6 может проникать через корневую систему растений, распространяться по разным тканям, персистировать в них и вызывать деструктивные процессы, характерные для фитомикоплазмозов, возникающих спонтанно [Скрипаль, 1988]. При этом было обнаружено, что НФ M. gallisepticum S6, не вызывающие (в отличие от ВФ микоплазмы) токсичных и мутагенных эффектов в отношении тестерного штамма E. coli PQ37, являются более фитопатогенными, чем ВФ клеток бактерии.
Наличие у M. gallisepticum S6 механизмов смены программ жизни, определяющих адаптацию микоплазмы к разным условиям среды и изменение вирулентных свойств, диктует необходимость разработки новых подходов для исследования формирования и эволюции системы "патоген-хозяин", а также способов ее контроля.
В результате наших исследований предложен способ выявления ВФ и НФ клеток M. gallisepticum S6 с помощью ПЦР при использовании праймеров для амплификации нуклеотидной последовательности гена pvpA микоплазмы. Этот способ может быть эффективным средством дифференциальной детекции ВФ и НФ M. gallisepticum в природных источниках. Однако решение проблемы контроля микоплазменных инфекций, вероятно, лежит на пути геномно протеомного профилирования микоплазм и клеток эукариот при их взаимодействии. Реализация таких проектов уже началась как за рубежом, так и в России [Чернов, 2007, 2008;
Wang et al., 2006;
Cecchini et al., 2007;
Madsen et al., 2008].
ВЫВОДЫ 1. Адаптация M. gallisepticum S6 к неблагоприятным условиям (НУ) сопровождается изменениями морфологии, ультраструктуры, а также пролиферации клеток микоплазмы. На полноценной питательной среде Эдварда M. gallisepticum S6 образует грушевидные клетки (длина 0,6-1 мкм), имеющие терминальную структуру "bleb", а на среде с ограничением субстрата, при понижении температуры культивирования – кокковидные клетки (диаметр 0,2-0,8 мкм), лишенные полярных образований. Длительное культивирование M. gallisepticum S6 в НУ приводит к превращению вегетативных форм (ВФ) клеток микоплазмы в некультивируемые формы (НФ).
2. При адаптации клеток M. gallisepticum S6 к НУ в структуре ДНК микоплазмы возникают изменения. У НФ определяется нуклеотидная последовательность (582 н.п.о.) с двумя ОРС, не регистрируемая у ВФ микоплазмы.
3. ДНК-связанные белки НФ клеток M. gallisepticum S6 могут обусловливать аттенуацию амплификации нуклеотидной последовательности (582 н.п.о.) при использовании в ПЦР со специфичными праймерами для выявления pvpA-гена микоплазмы матричной ДНК без специальной очистки.
4. Клетки M. gallisepticum S6, образующиеся в разных условиях культивирования, существенно различаются по экспрессированным белкам.
Идентифицировано 63 белка, участвующие в адаптации клеток микоплазмы к НУ. На основании полученных данных представлены возможные схемы изменения метаболических путей в клетках НФ микоплазмы.
5. Адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается изменением генотоксичных свойств клеток микоплазмы и их культуральной жидкости. ВФ клеток M. gallisepticum S6, а также их культуральная жидкость индуцируют SOS-ответ у клеток тестерного штамма E. coli PQ37. НФ клеток микоплазмы, а также их культуральная жидкость генотоксичных эффектов не проявляют.
6. M. gallisepticum S6 обладает фитопатогенным потенциалом. Клетки микоплазмы способны инфицировать растения через корневую систему, проникать в разные ткани растений, персистировать в них и вызывать деструктивные процессы, характерные для фитомикоплазмозов. При этом заражение клетками M. gallisepticum S6 V. minor L. (специфичный индикатор фитомикоплазмозов) вызывает у растений аппарантную инфекцию, а заражение V. radiata L. (неспецифичный индикатор фитомикоплазмозов) приводит к развитию латентной инфекции.
7. Адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается изменением вирулентности микоплазмы в отношении растений. НФ M. gallisepticum S индуцируют более выраженные нарушения ультраструктуры тканей растений (V. radiata L.), чем ВФ микоплазмы.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Баранова Н.Б. Персистенция микоплазм у человека: полиморфизм генов адгезии (vaa) Mycoplasma hominis и цитокинов (IL-1, IL-10) у носителей микоплазмы / Н.Б.Баранова, А.А.Музыкантов, О.В.Горшков, Г.Ф.Шаймарданова // "Молодые ученые в медицине" XII Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 150-летию со дня рождения В.М. Бехтерева: Тез. докл. – Казань: Отечество, 2007 – С.275-276.
2. Баранова Н.Б. Молекулярные основы персистенции микоплазм у человека: гены vaa у клинических изолятов Mycoplasma hominis и IL (1, 10) у носителей микоплазмы / Н.Б.Баранова, А.А.Музыкантов, Г.Ф.Шаймарданова, О.В.Горшков // "Фундаментальные аспекты исследования симбиотических систем", Всероссийская конференция с международным участием: Тез. докл. – Саратов, 2007. – С.35.
3. Музыкантов А.А Молекулярно-генетические и морфофизиологические особенности клеток микоплазм (Mycoplasma gallisepticum) при использовании различных источников энергии / А.А.Музыкантов, Г.Ф.Шаймарданова, О.В.Горшков // "Биология – наука XXI века" 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых:
Сб. тез. – Пущино: Изд-во Пущинского научного центра, 2007. – С.102.
4. Баранова Н.Б. Особенности вариабельности генов vaa у клинических изолятов Mycoplasma hominis и IL (1, 10) у носителей микоплазмы / Н.Б.Баранова, А.А.Музыкантов, Г.Ф.Шаймарданова, О.В.Горшков // "Биология – наука XXI века" 11-я Международная Пущинская школа конференция молодых ученых. Сб. тез. – Пущино: Изд-во Пущинского научного центра, 2007. – С.69-70.
5. Чернов В.М. Сравнительный протеомный анализ вегетативных форм клеток и наноформ микоплазм (Mycoplasma gallisepticum S6 и Acholeplasma laidlawii PG8) / В.М.Чернов, В.М.Говорун, И.А.Демина, О.В.Горшков, А.А.Музыкантов и др. // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Сб. тез. – Новосибирск: Арта, 2008. – С.255.
6. Чернов В.М. Адаптация микоплазм к неблагоприятным условиям роста связана с превращением вегетативных форм клеток в наноформы / В.М.Чернов, О.А.Чернова, О.В.Горшков, Г.Ф.Шаймарданова, А.А.Музыкантов и др. // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Сб. тез. – Новосибирск: Арта, 2008. – С.144.
7. Чернов В.М. Сравнительный протеомный анализ вегетативных форм и наноклеток Mycoplasma gallisepticum для создания технологии контроля микоплазменных инфекций / В.М.Чернов, О.А.Чернова, М.Н.Давыдова, О.В.Горшков, М.В.Трушин, Г.Ф.Шаймарданова, А.А.Музыкантов и др. // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы". Сб. тез. – Москва, 2007.
– С.87-88.
8. Музыкантов А.А. Феноменология микоплазменных инфекций растений: особенности ультраструктуры клеток Vigna radiata L., инфицированных Mycoplasma gallisepticum S6 / А.А.Музыкантов, Е.Н.Антуфьева, А.А.Пономарева // "Биология: традиции и инновации в XXI веке": Материалы I Всероссийского конгресса студентов и аспирантов биологов "Симбиоз Россия-2008" с международным участием. / Под научной редакцией Т.В. Балтиной. – Казань: Изд-во КГУ, 2008. – С.21.
9. Музыкантов А.А. Изменение вирулентных свойств микоплазм (Mycoplasma gallisepticum S6) при адаптации к стрессорам / А.А.Музыкантов, А.Д.Пельникевич // "Биология: традиции и инновации в XXI веке: Материалы I Всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз Россия 2008" с международным участием. 6-10 июля 2008 г. / Под научной редакцией Т.В. Балтиной. – Казань: Изд-во КГУ, 2008. – С.67-71.
10. Чернов В.М. Адаптация микоплазм к неблагоприятным условиям роста: морфология, ультраструктура и экспрессия генома клеток Mycoplasma gallisepticum S6 / В.М.Чернов, В.М.Говорун, И.А.Дёмина, О.В.Горшков, А.А.Музыкантов и др. // ДАН. – 2008. – Т. 421. – С.701-704.
11. Чернов В.М. Адаптация Mycoplasma gallisepticum к неблагоприятным условиям роста: изменение морфологических и физиологических свойств / В.М.Чернов, О.А.Чернова, О.В.Горшков, А.А.Музыкантов и др. // Микробиол.
– 2008. – Т. 77. – № 6.
12. Chernova O.A. Mycoplasma gallisepticum strain S6 surface cytadhesin (pvpA) gene, complete cds. ACCESSION EU847585. / O.A.Chernova, O.V.Gorshkov, A.A.Mouzykantov, V.M.Chernov // Режим доступа:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/viewer.fcgi?val=EU847585, свободный. – Проверено 25.08.2008.
Список сокращений и условных обозначений ВФ – вегетативные формы ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота КОЕ – колониеобразующие единицы мкм – микрометр МПР – метод предельных разведений н.п.о. – нуклеотидные пары оснований НУ – неблагоприятные условия НФ – некультивируемые формы ОРС – открытая рамка считывания ППСЭ – полноценная питательная среда Эдварда ПЦР – полимеразная цепная реакция PvpA – фазовариабельный белок А (phase variable protein A) Vaa – вариабельный антиген, участвующий в адгезии (variable adherence- associated antigen)