Биоремедиационные свойства фототрофных микроорганизмов из водоемов, загрязненных радиоактивными отходами

На правах рукописи

БАКЕЕВА АЛЬБИНА ВЛАДИМИРОВНА БИОРЕМЕДИАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА ФОТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ ВОДОЕМОВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ РАДИОАКТИВНЫМИ ОТХОДАМИ 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург – 2011

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Квитко Константин Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Никитина Валентина Николаевна Санкт-Петербургский государственный университет доктор биологических наук Янкевич Марина Ивановна Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет) Ведущее учреждение: Институт озероведения РАН

Защита состоится « » 2011 г. в на заседании объединенного совета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, Биолого-почвенный факультет, аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан « » 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е.И. Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Активное развитие атомной промышленности привело к накоплению огромного количества жидких низкоактивных отходов (НАО). На территории России жидкие НАО накапливались в емкостях накопителях исследовательских организаций, в бассейнах-накопителях, как на ФГУП «Горно-Химический Комбинат» (г. Железногорск, Красноярский край), в водоемах естественного происхождения, как на ФГУП ПО «Маяк» (г. Озерск, Челябинская обл.). К водоемам естественного происхождения относятся оз.

Карачай и Теченский каскад водоемов в районе заводов ФГУП ПО «Маяк». Ряд пресных озер этого региона попали под Восточно-Уральский радиоактивный след (ВУРС), возникший при взрыве емкости для хранения высокоактивных отходов на предприятии в 1957 г.

Попавшие в водоемы радионуклиды находятся в различных физико химических формах и могут мигрировать в воде водоема, переносятся за его пределы с грунтовыми водами, в результате чего радиоактивному загрязнению могут подвергаться обширные территории. Учитывая, что к настоящему времени основными загрязнителями жидких НАО являются долгоживущие радионуклиды Cs (T1/2 = 30,2 года) и 90Sr (T1/2 = 28,8 года) (Суслов и др., 2010), обеспечение охраны окружающей среды и радиационной безопасности населения от таких радионуклидов является важной проблемой.

На сегодняшний день методы биоремедиации (биологической очистки) являются наиболее перспективными методами очистки вод от широкого круга загрязняющих веществ (Alexander, 1994;

Lop, Tar, 2000;

Neu et al., 2002;

NABIR, 2003). Пресноводные организмы способны весьма сильно концентрировать большинство химических элементов, находящихся в воде в очень малых концентрациях (Тимофеева-Ресовская, 1960). При этом данные организмы обладают относительно высокой резистентностью к излучателям (Шевченко и др., 1992). Способность фототрофных микроорганизмов сорбировать/аккумулировать радионуклиды и тяжелые металлы отмечалась многими авторами (Giesy, Paine, 1976;

Nakajima, Sakaguchi, 1986;

Gadd, 1990). Широкое распространение фототрофов в озерах, особенно в теплые периоды года, позволяет рассматривать их биомассу как возможный биосорбент для избирательной сорбции радионуклидов (Parker et al., 1996).

В этом плане особый интерес представляют цианобактерии и микроводоросли, выделенные из биопленок обитателей водоемов жидких НАО ФГУП ПО «Маяк» и озер, расположенных на ВУРСе, которые находились под влиянием длительного радиационного воздействия.

Данная работа является частью систематических исследований и сбора штаммов фототрофных микроорганизмов в коллекции музея живых культур микроорганизмов CALU (Collection of Algae of Leningrad University, № 461 в Международном Реестре Микробных Коллекций) (Pinevich et al., 2002), имеющих значение для биоремедиации.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выделение штаммов фототрофных микроорганизмов (цианобактерий и микроводорослей) из биопленок водоемов, загрязненных жидкими низкоактивными отходами, изучение их адаптации к радиации, биосорбции радионуклидов биомассой штаммов, изучение их наиболее важных в экологическом плане свойств с перспективой использования в целях биоремедиации.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделение, очистка, идентификация и введение в коллекцию CALU фототрофных микроорганизмов из радиоактивно загрязненных ценозов.

2. Изучение устойчивости штаммов цианобактерий и микроводорослей к гамма- и ультрафиолетовому- облучениям, к сточной жидкости, нитратам, повышенной концентрации NaCl;

определение диапазона рН и температуры для культивирования штаммов;

изучение токсичности штаммов.

3. Оценка способности клеток к иммобилизации на капроновом носителе и восстановлению роста после высыхания.

4. Изучение биосорбции радионуклидов клетками штаммов цианобактерий и микроводорослей;

изучение влияния физико-химических условий на биосорбцию.

5. Исследование десорбции радионуклидов, связанных биомассой штаммов цианобактерий и микроводорослей.

Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое исследование фототрофных микроорганизмов из водоемов жидких НАО ФГУП ПО «Маяк» и озер, расположенных на ВУРСе. Экологически перспективные штаммы цианобактерий и микроводорослей, выделенные из вод, загрязненных радиоактивными отходами, сохранены в коллекции музея живых культур микроорганизмов СПбГУ CALU. Изучена устойчивость штаммов цианобактерий и микроводорослей к гамма- и ультрафиолетовому- (УФ) облучениям. По показателям радиорезистентности к гамма- и УФ- облучению штаммы, выделенные из загрязненных радионуклидами водоемов, сравнены с контрольными штаммами коллекции CALU, выделенными из нерадиоактивных мест обитания. Определены оптимальные значения температур и рН для роста штаммов. Показана устойчивость штаммов к различной концентрации нитратов, повышенной концентрации NaCl и сточной жидкости. Определена токсичность штаммов по отношению к тест-объекту Daphnia magna. Показана способность к иммобилизации клеток выделенных штаммов на капроновых субстратах с большой удельной поверхностью и способность штаммов к длительному хранению и последующему восстановлению роста разбавленной основной средой после высыхания – биотехнологически важные свойства при создании биофильтров и сухого препарата соответственно. Впервые выполнены исследования по изучению взаимодействия с радионуклидами фототрофных микроорганизмов из водоемов жидких НАО ФГУП ПО «Маяк» и озер, расположенных на ВУРСе. Определены штаммы цианобактерий и микроводорослей сорбирующие радионуклиды: 238Pu(IV), 233U(VI), 241Am(III) и Sr(II).

Научно-практическая значимость работы. Доказано, что штаммы, выделенные из районов с повышенным радиационным фоном облучения обладают более высоким уровнем устойчивости к гамма- и УФ- облучениям (радиоадаптацией), по сравнению с контрольными. Фототрофные микроорга низмы, выделенные из загрязненных водоемов, могут использоваться как эталон устойчивости фототрофных микроорганизмов к радиации, для мониторинга радиоактивно загрязненных территорий и как индикаторы антропогенного загрязнения окружающей среды радионуклидами: 238Pu(IV), 233U(VI), 241Am(III) и Sr(II). Знание физиологии фототрофных микроорганизмов и влияния физико химических условий на избирательную биосорбцию позволят оптимизировать процесс доочистки и очистки загрязненных вод. Штаммы микроводорослей и цианобактерий могут использоваться для разработки методов биоремедиации.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на VI Всероссийской школе по морской биологии (Мурманск, 2007);

Региональной молодежной научной конференции «Экологическая школа в г. Петергофе» (2007);

Международном симпозиуме «7th International Symposium for Subsurface Microbiology» (Shizuoka, Japan, 2008);

6-ой Российской конференции «Радиохимия-2009» (Москва, 2009);

Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009);

Московской Международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010);

на молодежной научной конференции, ПИЯФ им. Б.П.

Константинова (Гатчина, 2010).

Личный вклад соискателя состоял в проведении микробиологических, радиохимических исследований, обработке экспериментальных результатов.

Микробиологические эксперименты выполняли в лаб. микробиологии СПбГУ (зав. лаб., д.б.н., профессор А.В. Пиневич). Радиохимические исследования проводили в лаб. экологических проблем обращения с радиоактивными и токсичными отходами ИФХЭ РАН (зав. лаб., к.х.н. Е.В. Захарова), в ПИЯФ им.

Б.П. Константинова (гр. индуцибельных систем клетки, д.б.н. В.Н. Вербенко) и лаб. ИНМИ РАН (зав. лаб., д.б.н., профессор С.С. Беляев).

Публикации. Материалы диссертации представлены в 8 печатных изданиях, включая 3 статьи и 5 тезисах конференции.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста, включая 30 рисунков и 33 таблицы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, содержащей «Объекты и методы исследования», «Результаты исследований и их обсуждения», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», включающий отечественных и 123 зарубежных наименований.

1.ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика объектов исследования. В работе исследованы штаммы цианобактерий (одноклеточные Synechocystis sp., нитчатые Leptolyngbya sp. и Phormidium sp.) и микроводорослей (Scenedesmus quadricauda), выделенные из вод технологических водоемов ФГУП ПО «Маяк»: В-2 (оз. Кызыл-Таш), В-3, В-4, В-10 – хранилища жидких НАО, водоемов В-9 (оз. Карачай) и В-17 (оз. Старое Болото) – хранилища жидких среднеактивных отходов, оз. Алабуга (используется в качестве контрольного водоема (Смагин, 2008)) и оз. Большие Кирпичики, расположенных на территории ВУРСа. Характеристика водоемов дана в табл. 1.

Состав сред, условия культивирования микроорганизмов.

Культивирование штаммов цианобактерий и микроводорослей проводилось при температуре 23-250C и постоянном освещении 2000-2500 люкс на среде 6: (мг/л) KNO3 – 1000;

K2HPO4 – 200;

MgSO4 – 200, CaCl2 – 150;

NaHCO3 – 200 + микроэлементы (Громов, Титова, 1991).

Выделение штаммов проводилось методом истощающего мазка (Криг, 1983), путем изоляции клонов. Идентификация морфологически единообразных, аксеничных клонов сценедесмус проводилась по (Голлербах и др., 1953) и цианобактерий с учетом номенклатурных изменений (Anagnostidis, Komrek, 1988;

Определитель бактерии Берджи, том 1, стр. 375-426, 1997). В качестве контролей в опытах использовались штаммы цианобактерий и микроводорослей, изолированные из радиоактивно незагрязненных мест обитания, сохраняемые в коллекции CALU:

-13 и -1202 (Sc. obliquus), -435 (Sc. quadricauda), -157 (Chlorella vulgaris), -734 (Synechocystis sp.), -1226 (Leptolyngbya sp.), -899 (Phormidium sp.).

Метод гамма-облучения. Облучение проб по 5 мл суспензии клеток густотой 1-2 х106 клеток/мл (выровненных по оптической плотности, ОП в полосе 480 нм до 0,2 ед.), проводилось -лучами 60Со с энергией -квантов 1,3 МэВ на установке «Исследователь» (РХ--30, ПИЯФ, г. Гатчина) с мощностью дозы Гр/мин в трех повторах. После облучения и экспозиции в стандартных условиях освещения была измерена динамика ОП на 2-е, 9-е, 13-е и 17-е сутки. Кривые динамики ОП в 3-х опытах с 3-мя повторами аппроксимировали линейным трендом и уравнением регрессии y = -ax+b, R2, где a – суточный прирост ОП;

b – экстраполяционное число на нулевой момент, R2 – коэффициент детерминации, отражающий достоверность линии тренда. После построения графиков зависимости прироста ОП в сутки от дозы гамма-облучения получившуюся кривую было возможно разбить на отрезки доз. Сравнивая соответствующие суточные приросты штамма для каждого отрезка доз, возможно более наглядно показать различие в росте ОП штаммов при разных дозах гамма-облучения (а характеризует устойчивость и а0 – уменьшение устойчивости штамма к гамма облучению).

Метод УФ-облучения. Источником УФ излучения служила ртутная лампа низкого давления (Philips Ultraviolet TUV 30W/G30T8, UVC). Суспензия клеток густотой 1-2х106 клеток/мл разводилась в пропорции 1/10 четыре раза в матрице репликатора с 25 лунками объемом по 200 мкл, т.е. по 5 повторов ячеек.

Расстояние от УФ лампы до облучаемой матрицы – 10 см. Время облучения составляло 5, 10, 15 и 20 мин. В каждый из интервалов репликатором микрокапли (объемом по 20 мкл) суспензии клеток (т.е. густотой от 2104 до 20 клеток на каплю) переносились на плотный агар со средой 6. Для предотвращения фотореактивации чашки с посевами облученных клеток сутки хранили в темноте, после чего выставлялись на свет в стандартных условиях. Число колоний учитывали на 7 сутки роста на свету и строили кривые выживаемости ценобий, клеток, фрагментов нитей штаммов, по оси абсцисс откладывая время УФ облучения (мин), по оси ординат выживаемость, как log N/N0, где N – число колоний от живых ценобиев, клеток, фрагментов нитей после определенной дозы УФ-облучения, N0 – число живых клеток в необлученном контроле.

Изучение влияния физико-химических факторов на рост штаммов.

Штаммы выращивали в стандартных условиях, при разных модификациях среды 6. Контролем служила суспензия штаммов в минеральной среде 6. Для определения чувствительности штаммов к различной концентрации нитратов в основную жидкую среду 6 добавлялся KNO3 до 4, 8, 10, 20, 30 и 50 г/л. Для выявления резистентности к NaCl, использовались модификации среды 6 с концентрацией соли – 0,2, 0,4, 0,8, 1,6 и 3,2%. Для выявления резистентности к кислотности, в среду 6 добавляли буферные смеси, обеспечившие 7 уровней рН среды: от 5 до 11. Выявляя отношения штаммов к температуре, суспензии их клеток культивировали на среде 6, в световых термостатах при температурах: 10, 23, 32 и 600С. Регистрация роста проводилась путем измерения ОП, подсчетом клеток в камере Горяева и учетом колониеобразующих единиц (КОЕ).

При изучении влияния токсичной сточной жидкости (СЖ) (64-й карт полигона «Красный Бор», Санкт-Петербург) на рост штаммов в жидкую питательную среду 6 добавляли сточную жидкость до 10 и 20% и засевали клетки цианобактерий и микроводорослей. Эффект токсичного воздействия 100% СЖ выявлялся при диффузии ее из цилиндрика диаметром 6мм, помещенного в центр чашки Петри с газоном испытуемых штаммов на плотной среде 6 ( см. рис. 2).

Токсикологические исследования. Токсичность штаммов цианобактерий исследовалась на тест-объекте Daphnia magna Straus (Биологические методы контроля, ФР.1.39.2001.00283, 2001). Критерием острой токсичности служила гибель 50% и более дафний за 96 ч в исследуемой суспензии, при условии, что в контроле гибель не превышала 10%.

Способность клеток к иммобилизации на носителе. Иммобилизация клеток исследуемых штаммов выполнена на капроновой сетке (площадь 25 см2), нити которой сплетены из трех пучков по 20 волокон (3х20), каждое диаметром 0,05 мм. Это на порядки увеличивало поверхность носителя пригодную для обрастания волокон сетки клетками водорослей в процессе культивирования на жидкой среде 6 (см. рис. 5).

Способность клеток к восстановлению роста после высыхания. Штаммы высушивались при температуре 23-250C. Способность к восстановлению роста после высыхания определялась по образованию сине-зеленых и зеленых нитей и осадков в жидкой среде и микроскопированием.

Определение сорбционной способности штаммов. В работе использовали растворы, содержащие (моль/л): плутоний [238Pu (IV), 5·10-10 M], америций [241Am(III), 10-9 M], стронций [90Sr(II), 10-10 M] и уран [233U(VI), 10-7 M], которые нейтрализовали до величины pH 5-6 с помощью 0,1N растворов HCl и NaOH. В опыте по влиянию рН на биосорбцию урана использовали уран 233U(VI), 1,5·10- М. В тефлоновые флаконы вносили 20 мг сухой биомассы штаммов или суспензию клеток определенной ОП (в полосе 660 нм), в 10 мл физиологического раствора с известным содержанием радионуклида. Контролем служил физиологический раствор (10 мл), содержащий только радионуклид. Эксперимент выполняли при комнатной температуре и постоянном перемешивании на шейкере (250 об/мин, 3 ч). После этого биомассу отделяли центрифугированием ( об/мин, 0,25 ч). Активность радионуклидов, оставшихся в жидкой фазе, определяли методом жидкостной сцинтилляционной (ЖС) спектрометрии (сцинтиллятор OptiFase “HiSafe” 3, Fin.) (Nazina et al., 2010). Измерения проводили на ЖС спектрометре СКС-07П-Б11 (Россия), точность измерения составляла 3%. Сорбцию радионуклидов микробной биомассой выражали в процентах по отношению к исходной концентрации радионуклида в растворе.

Исследование десорбции. Эксперименты по биосорбции выполняли, как указано выше. После этого биомассу отделяли центрифугированием (8000 об/мин, 0,25 ч) и определяли остаточную активность раствора. В качестве десорбирующих растворов использовали 0,1M растворы HCl и Na2CO3 и физиологический раствор, которые добавляли по 10 мл во флакон с биомассой.

Пробирки с десорбирующим раствором перемешивали на шейкере (250 об/мин, ч). Биомассу отделяли центрифугированием и рассчитывали степень десорбции.

Определение связывания 90Sr клетками штаммов в долговременном эксперименте. Для определения связывания радиоактивного стронция 90Sr свободными клетками штаммов, биомассу микроводорослей и цианобактерий наращивали до стационарной фазы роста. Затем клетки переносили в свежую питательную среду, разбавляя суспензию в 100 раз, и добавляли 10 мкл раствора радиоактивного стронция азотнокислого (0,2 мкКи/мл). По мере роста из каждой культуры отбирали параллельно две равные по объему (0,2 мл) пробы, переносили их в пробирки объемом 1,5 мл и осаждали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Количество 90Sr в осадке и надосадочной жидкости определяли на счетчике Beckman LS 6500 (США) (LS 6500, 1999). Эффективность связывания Sr клетками определяли в процентах по отношению радиоактивности, содержащейся в осадке, к суммарной радиоактивности пробы.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Характеристика штаммов цианобактерий и микроводорослей Изучаемые штаммы представлены зелеными протококковыми водорослями Scenedesmus quadricauda и цианобактериями: одноклеточными Synechocystis sp., нитчатыми Leptolyngbya sp. и Phormidium sp. В коллекции CALU сохранено штаммов. Штаммы первоначально выделены из водоемов различной степени загрязненности. В табл. 1 штаммы расположены в группах по уменьшению суммарной бета-излучающей активности воды водоема, измеряемой в килоКюри (кКи), тем самым, дана характеристика условий обитания исходных биопленок.

Таблица 1. Характеристика мест происхождения штаммов цианобактерий и микроводорослей, сохраненных в CALU. Дано по (Корсаков, Ерофеева, 1996) № штамма Систематическое Место сбора проб и суммарная бета- Основные CALU положение радионуклиды излучающая активность воды, кКи 1318 Synechocystis sp. Sr, Cs, Am, Cm, Pu оз. Карачай (вод. В-9) (120000) Scenedesmus quadricauda 1312, 1322 Sr, Pu, тритий оз. Старое Болото (вод. В-17) (1200) 1311 Phormidium sp. вод. В-10 (260) 1323 Leptolyngbya sp.

1314 Phormidium sp. вод. В-2 (оз. Кызыл-Таш) (110) 1316 Phormidium sp.

1320 Phormidium sp.

Sr, Cs Scenedesmus quadricauda 1330 вод. В-3, сапропель (-) 1315 Leptolyngbya sp.

1327 Phormidium sp. вод. В-3 (20) 1328 Phormidium sp.

1329 Phormidium sp.

1324 Phormidium sp.

1325 Phormidium sp. вод. В-4 (14) 1326 Phormidium sp.

1310 Leptolyngbya sp. оз. Алабуга (0) 1307 Synechocystis sp. оз. Большие Кирпичики (0) 2.2. Устойчивость штаммов к гамма-облучению Выживаемость при остром гамма-облучении (рис. 1) 4-х клеточных ценобий штаммов Sc. quadricauda 1312 и 1330 и клеток цианобактерии Synechocystis sp.

1318, выделенных из водоемов жидких НАО, больше, чем штаммов-контролей из нерадиоактивных мест обитания Sc. quadricauda 435 и цианобактерий Synechocystis sp. 734. Судя по углу наклона уравнений регрессии, Sc. quadricauda 1330 (а= -0,0040) наиболее радиоустойчив, чем Sc. quadricauda 1312 (а= -0,0049) и контрольный штамм 435 (а= -0,0061).

Рис. 1. Выживаемость при остром гамма-облучении 4-х клеточных ценобий штаммов Sc. quadricauda 1312, 1330, 435 (контр.) и клеток штаммов Synechocystis sp. 1318, 734 (контр.) Рост в течение длительного времени в среде с повышенным радиационным фоном приводит к появлению у популяции устойчивости к радиационным воздействиям или к радиоадаптации. Штаммы Synechocystis sp. 1318 и Sc.

quadricauda 1312, клоны культур из наиболее загрязненных водоемов наиболее устойчивы к действию гамма-облучения.

Для нитчатых штаммов цианобактерий после построения графиков зависимости прироста ОП в сутки от дозы гамма-облучения и разбиения получившихся кривых на отрезки доз, были выделены следующие группы: 1-я– штаммы устойчивые к гамма-облучению до 800-900 Гр (расположены в порядке уменьшения гамма устойчивости): Leptolyngbya sp.1315Leptolyngbya sp.

1310Phormidium sp.1325Phormidium sp.1327Phormidium sp.1316Phormidium sp.1314Phormidium sp.1324;

2-я–до 400-600 Гр: Leptolyngbya sp.1323Phormidium sp. 1326131113291328;

3-я–до 200 Гр: Phormidium sp.1314. Штаммы Phormidium sp. 1314 и 1316 из водоема В-2 (оз. Кызыл-Таш) с уровнем загрязнения 110 кКи, устойчивы к большей дозе гамма-облучения, чем другие штаммы Phormidium sp. из водоемов В-3 (20 кКи) и В-4 (14 кКи). В области высоких доз гамма-облучения характерен максимум радиоустойчивости для штаммов Leptolyngbya sp. 1323 и Phormidium sp. 1311, клонов культур из водоемов с наибольшей техногенной нагрузкой.

2.3. Устойчивость штаммов к УФ-облучению Штаммы, выделенные из водоемов жидких НАО, обладают большей устойчивостью к действию УФ, чем штаммы-контроли. Общий ряд сравнения устойчивости изучаемых штаммов к УФ-облучению:131213301322(Sc.

quadricauda)1318(Synechocystis sp.)1311(Phormidium sp.)1307(Synechocystis sp.)1310(Leptolyngbya sp.)1323 (Leptolyngbya sp.)1325, 1328(Phormidium sp.)1327, 1329 (Phormidium sp.)1326 (Phormidium sp.)1320(Phormidium sp.)1324 (Phormidium sp.)1315 (Leptolyngbya sp.) 1316(Phormidium sp.)1314(Phormidium sp.). Для Phormidium sp. показано, что клоны культур, выделенные из наиболее загрязненных водоемов, являются наиболее УФ устойчивыми. Штаммы микроводоросли Sc. quadricauda 1312, 1322, выделенные из водоема с загрязнением до 1200 кКи, наиболее устойчивы к действию УФ облучения. Характерен максимум устойчивости клонов культур, выделенных из наиболее загрязненных водоемов.

2.4. Тестирование устойчивости штаммов к сточной жидкости СЖ полигона «Красный Бор», в состав которой входили АПАВ, свинец, стронций, ртуть, мышьяк и др., не только ингибировала рост изучаемых штаммов, но также и стимулировала их рост. Устойчивость к 10% СЖ имели Sс. quadricauda 1312, 1322, Synechocystis sp. 1318 – клоны культур из наиболее загрязненных водоемов, а также Synechocystis sp. 1307, Leptolyngbya sp. 1310 и Phormidium sp.

1329 (рис. 2) – клоны культур из водоемов с наименьшей техногенной нагрузкой.

Все остальные штаммы оказались чувствительными к СЖ.

Рис. 2. Рост нитей на плотной среде штамма Phormidium sp. 1329, устойчивого к 100% СЖ, и отсутствие роста нитей штамма Phormidium sp., не устойчивого к 100% сточной жидкости.

2.5. Устойчивость штаммов к различной концентрации нитратов Два штамма Synechocystis sp. 1318 и Sc. quadricauda 1330 устойчивы к концентрации нитратов до 8 г/л в жидкой среде, все остальные штаммы (в том числе и контрольные) устойчивы к концентрации нитратов до 10 г/л.

На рис. 3 дана динамика ОП штамма Sc. quadricauda 1312. Из графика кривой падения ОП видно, что концентрация нитратов 20 и г/л была ингибирующей.

Рис. 3. Динамика ОП клеток Sc. quadricauda 1312 при различных концентрациях KNO3 (г/л) 2.6. Рост на средах с различной концентрацией NaCl Штаммы Synechocystis sp. 1318, Sc. quadricauda 1312, 1322 и Leptolyngbya sp. 1323, выделенные из вод с повышенной минерализацией, являются (табл.2) устойчивыми к концентрации NaCl 3,2%, что близко к средней солености вод мирового океана (3,5%). Таким образом, изучаемые нами штаммы, могут быть использованы для очистки морских вод.

Таблица 2.Характеристика устойчивости штаммов к различной концентрации NaCl. Характеристика места сбора биопленок дана по (Корсаков, Ерофеева, 1996) Систематическое Концентрация NaCl, % Характеристика места сбора проб положение предельно ингиби Место сбора проб и минера рН оптимальная рующая суммарная бета-излучающая лизация, активность воды, кКи г/л Synechocystis sp.1318 3,2 оз. Карачай (В-9) (120000) 10-20 7,3-8, Sc. quadricauda 1312 3,2 оз.СтароеБолото(В-17)(1200) 1,10- 8,2-8, Sc. quadricauda 1322 3,2 1, Phormidium sp. 1311 0,2 0,4-3,2 вод. В-10 (260) 1,10- 8,0-8, 1, Leptolyngbya sp. 1323 3, Phormidium sp. 1314 0,2 0,4-3,2 В-2 (оз. Кызыл-Таш) (110) 0,45- 8,2-8, Phormidium sp. 1316 0,4 0,8 0, Phormidium sp.1320 0,8 1, Sc. quadricauda 1330 3,2 В-3 сапропель - Leptolyngbya sp. 1315 0,2 0, Phormidium sp. 1327 0,2 0,4 вод. В-3 (20) 0,60- 7,9-8, Phormidium sp. 1328 0,4 0,8 0, Phormidium sp. 1329 0,4 0, Phormidium sp. 1324 1,6 3, Phormidium sp. 1325 0,4 0,8 вод. В-4 (14) 0,50- 7,9-8, Phormidium sp. 1326 0,4 0,8 0, Leptolyngbya sp. 1310 0,8 3,2 оз. Алабуга (0) 0,60 н.д.* Synechocystis sp.1307 3,2 оз. Большие Кирпичики (0) н.д. н.д.

*н.д. – нет данных 2.7. Определения значений рН и температур для культивирования штаммов Все выделенные штаммы цианобактерий и микроводорослей (в том числе и контрольные) росли в интервале рН от 7 до 10. На рис. 4(а) дана динамика ОП Sc.

quadricauda 1312 при различных значениях рН. При рН 5, 6, 11 наблюдается падение ОП, при рН 7-10 – увеличение ОП. Штамм относится к алкалифильному типу. Гидрохимические показатели водоемов (табл. 2), из которых выделены биопленки цианобактерий, существенно различаются: рН варьируется от 7,3 до 8,6. Изучаемые штаммы устойчивы к рН первоначального их места роста, а также могут расти и в более жестких условиях.

Изучаемые штаммы (в том числе и контрольные) росли при температурах 10, 23 и 320С. На рис. 4(б) представлен пример динамики ОП Sc. quadricauda при температурах 10, 23, 32, 600С. При повышенной температуре 600С наблюдается уменьшение ОП, роста нет;

при температурах 10, 23, 320С – увеличение ОП, рост штамма. Это позволяет считать, что штамм относятся к мезофильному типу.

Рис. 4. Динамика ОП Sc. quadricauda 1312 при различных а) значениях рН б) температурах 10, 23, 32, 600С 2.8. Иммобилизация клеток штаммов на капроновом носителе Нитчатые штаммы цианобактерий Phormidium sp. и Leptolyngbya sp.

иммобилизовались (рис. 5), формируя кожистые или волокнистые биопленки на поверхности волокон сеток. Клетки одноклеточных штаммов Sc. quadricauda и цианобактерий Synechocystis sp., которые образовывали суспензии в жидкой среде культивирования, покрывали всю сетку равномерно, образуя гладкую поверхность.

Рис. 5. Иммобилизация клеток штаммов Phormidium sp. на капроновых сетках, нити которой состоят из 60 волокон диаметром 0,05 мм.

Рядом фрагмент единичного волокна с иммобилизованными клетками Stichococcus sp., из диссертации Е.Ф. Сафоновой (2004), увеличение x 2.9. Токсичность штаммов По отношению к тест-объекту Daphnia magna Straus суспензии клеток цианобактерий и суспензии без клеток цианобактерий показали аналогичные результаты. Одноклеточные цианобактерии Synechocystis sp. были не токсичными – штамм 1307 и токсичными – штамм 1318. Два штамма рода Leptolyngbya sp.

1310 и 1315 проявили токсигенность в отношении тест-объекта, штамм 1323 был не токсичным. Штамм Phormidium sp. 1316 был нетоксичным, 1324, 1325, 1326, 1327, 1329 – среднетоксичные (гибель менее 50% дафний) и 1311, 1320, 1328 – токсичные. Не токсичные штаммы цианобактерий могут рассматриваться как наиболее перспективные биосорбенты при очистке загрязненных вод.

2.10. Биосорбция радионуклидов клетками штаммов 2.10.1. Определение кинетики сорбции Для определения оптимального времени взаимодействия биомассы с радионуклидами исследована биосорбция 233U(VI) штаммами в динамике. Максимум сорбции U(VI) наблюдался через 3- часа (рис. 6).

Рис. 6. Биосорбция 233U(VI) биомассой Synechocystis sp.

1318 и Sc. quadricauda 1330 в зависимости от продолжительности контакта с радионуклидом Для 4-х штаммов Leptolyngbya sp. 1310, 1323, Phormidium sp. 1324, 1327 и Sc. quadricauda 1312 максимум сорбции 233U(VI) также наблюдался через 3-4 часа. Сухая биомасса штаммов характеризуется быстрой скоростью сорбции – 3-4 часа.

2.10.2. Определение сорбционной способности штаммов Для определения сорбции 238Pu(IV), 233U(VI), 241Am(III) и 90Sr(II) была использована суспензия (OП660 0,02-0,1) сырой биомассы 7-суточных штаммов (табл. 3) и сухая биомасса (табл. 4) штаммов. При сорбции 90Sr(II) сорбция осуществлялась из воды, взятой с ФГУП ПО «Маяк» (рН 7,62).

Таблица 3. Сорбция (%) радионуклидов сырой биомассой штаммов Штамм OП660 pH Сорбция, % 238 90 241 Pu(IV) Sr(II) Am(III) U(VI) Chlorella vulgaris 157 0,04 6,50 22 6 46 Merismopedia sp. 0,03 6,27 1 3 12 S. quadricauda 1330 0,04 6,43 3 8 42 Synechocystis sp. 1318 0,04 6,46 10 18 56 Leptolyngbya sp. 1310 * 6,35 10 4 25 Phormidium sp. 1325 * 6,35 10 12 47 * вносили 0,1 мл суспензии сырой биомассы нитчатых штаммов на 10 мл физраствора Сухая биомасса обладала более высокой сорбционной способностью, по сравнению с использованием суспензии. И сырой, и сухой биомассой штаммов лучше сорбировались 241Am(III) и 233U(VI). 238Pu(IV) не сорбировался на сухой биомассе некоторых штаммов. Сырая и сухая биомасса штамма Synechocystis sp.

1318 – клона культуры из наиболее загрязненного оз. Карачай (В-9) отличалась высоким процентом сорбции всех радионуклидов.

2.10.3. Сорбция радионуклидов при различном значении рН Максимум биосорбции 241Am(III) был в слабокислой среде. Для штаммов Sc.

quadricauda 1330, Chlorella vulgaris 157 и Synechocystis sp. 1318 уровень сорбции U(VI) был выше в слабокислой и нейтральной среде, для Sc. quadricauda 1312, Leptolyngbya sp. 1310 и Phormidium sp. 1324 – в кислой (табл. 4).

Таблица 4. Сорбция (%) радионуклидов сухой биомассой штаммов Штамм, Биосорбция радионуклидов 238 90 241 номер CALU Pu(IV) % Sr(II)% Am(III) U(VI) рН % рН мкг U/г сухой % биомассы Chlorella vulgaris 157 89 31 3,02 7 6,5 90 6,43 6 Scenedesmus quadricauda 0 19 2,95 55 3,07 6 1312 6,63 2 9,20 40 8,52 5 Scenedesmus quadricauda 86 24 3,09 7 1330 6,5 86 6,41 6 8,61 7 Synechocystis sp. 1318 90 27 5,84 8 6,5 87 7,09 6 8,79 5 Leptolyngbya sp. 1323 0 16 2,98 68 3,21 6 6,86 2 8,70 55 8,53 4 Phormidium sp. 1324 0 15 3,17 77 3,09 9 6,39 3 8,24 42 8,37 2 Phormidium sp. 1327 0 14 2,94 91 3,04 4 6,27 3 7,87 40 8,19 5 2.10.4. Определение эффективности связывания 90Sr биомассой штаммов в долговременном эксперименте Эффективность связывания 90Sr клетками всех исследованных штаммов, как контрольных, так и изолятов водоемов жидких НАО была высока и составляла 90% (рис. 7). Штаммы, изоляты культур из загрязненных водоемов, отличались более медленной скоростью десорбции 90Sr с их биомассы. Показано, что радиорезистентность не определяет способность клеток к связыванию 90Sr.

Однако, штаммы, устойчивые к высоким дозам радиоактивного облучения, являются более предпочтительными при использовании их в целях биоремедиации, как адаптированные к условиям их среды обитания.

Рис. 7. Эффективность связывания 90Sr биомассой Synechocystis sp.

734(контр.), 1318 и Sc.

quadricauda 1202 (контр.), 1312, 1322 и 2.11. Определение десорбции радионуклидов связанных биомассой штаммов За 4 часа 233U(VI) полностью десорбировался растворами 0,1N HCl и 0,1М Na2CO3 с биомассы штаммов Synechocystis sp. 1318 и Sc. quadricauda 1330, тогда как раствором 0,9% NaCl извлекалось 18 и 13% 233U(VI), соответственно (табл. 5).

Таблица 5. Десорбция 233U(VI) (%) растворами 0,9% NaCl, 0,1N HCl и 0,1М Na2CO3 с сухой биомассы штаммов Synechocystis sp. и Sc. quadricauda Десорбция 233U(VI), % Штамм NaCl HCl Na2CО 2 часа 4 часа Synechocystis sp. 1318 20 18 100 Sc. quadricauda 1330 12 13 100 Больше всего 233U(VI) десорбировалось с биомассы 0,1М раствором Na2CO3 при рН 6,0. Для десорбции 241Am(III) предпочтительнее были щелочные условия (табл. 6).

Таблица 6. Десорбция 233U(VI) и 241Am(III) с сухой биомассы штаммов раствором 0,1М Na2CO3 при различном значении рН Десорбция 233U(VI), % Десорбция 241Am(III), % Штамм рН 3 рН 6 рН 9 рН 3 рН Sс. quadricauda 1312 70 100 80 59 Leptolyngbya sp. 1310 82 100 94 29 Leptolyngbya sp. 1323 75 100 83 75 Phormidium sp. 1324 76 100 100 37 Phormidium sp. 1327 84 100 100 61 3. ВЫВОДЫ 1. Выделенные из водоемов, загрязненных радиоактивными отходами, очищенные и идентифицированные фототрофные микроорганизмы представлены зелеными протококковыми водорослями Scenedesmus quadricauda (Chlorophyta) и цианобактериями – одноклеточными Synechocystis sp., нитчатыми Leptolyngbya sp.

и Phormidium sp. (Cyanobacteria).

2. Изученные штаммы обладают большей устойчивостью к гамма- и УФ облучениям (радиоадаптацией) по сравнению с контрольными. Аналогичная адаптация к повышенной солености и к другим загрязнениям выявлена для штаммов, изолятов водоемов с повышенной минерализацией. Установлено, что штаммы характеризуются широким диапазоном устойчивости к варьированию температур, от 10 до 320С, рН (7,0-10,0), концентрации нитратов (до 10 г/л).

Штаммы Synechocystis sp. 1307, Leptolyngbya sp. 1323, Phormidium sp. 1316 не токсичны в тестах на дафниях.

3. Клетки выделенных штаммов иммобилизуются на капроновом носителе и способны к восстановлению роста после длительного хранения и высыхания, что повышает их биоремедиационные характеристики.

4. Сорбция клетками сырой и сухой биомассой штаммов 238Pu(IV) контрастно различны. Для 233U(VI), 241Am(III) и 90Sr(II) такие различия не выявлены.

Максимум сорбции радионуклидов клетками наблюдается через 3-4 часа.

Максимум биосорбции 241Am(III) наблюдается при pH 3-6, рН сорбции 233U(VI) для каждого штамма различен. Длительное культивирование штаммов со 90Sr выявило максимум сорбции в интервале от 168-240 часов, после чего у контрольных (не радиоустойчивых) Scenedesmus quadricauda и Synechocystis sp.

наблюдается десорбция связанного радионуклида на 30-50%.

5. Растворы 0,1М Na2CO3 и 0,1N HCl наиболее эффективно десорбируют U(VI) с биомассы Synechocystis sp. 1318 и Scenedesmus quadricauda 1330 (100% десорбция).

6. Фототрофные микроорганизмы (цианобактерии и микроводоросли), выделенные из загрязненных радиоактивными отходами водоемов, могут быть использованы для разработки методов биотехнологической очистки этих водоемов от 238Pu(IV), 233U(VI), 241Am(III) и 90Sr(II).

Список работ в статьях, рекомендованных ВАК 1. А.В. Бакеева, Н.Н. Титова, В.В. Исакова, А.О. Тюкова, К.В. Квитко.

Свойства цианобактерий и микроводорослей из загрязненных радионуклидами водоемов ВУРСа // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2011. Вып. 1. С. 72-87.

В других изданиях 2. Бакеева А.В., Титова Н.Н., Волошко Л.Н., Меньших Т.Б., Квитко К.В.

Цианобактерии, выделенные из водоемов, загрязненных жидкими радиоактивными отходами // VI Всероссийская школа по морской биологии «Биоразнообразие сообществ морских и пресноводных экосистем России».

Россия, Мурманск, 1-2 ноября 2007 г. С. 26-30.

3. Бакеева А.В., Титова Н.Н., Волошко Л.Н., Меньших Т.Б., Квитко К.В.

Биоразнообразие цианобактерий, обитателей водоемов Восточно-Уральского радиоактивно следа (ВУРС) // Региональная молодежная научная конференция.

«Экологическая школа в г. Петергофе – наукограде Российской Федерации:

проблемы национального сектора Балтийского региона и пути их решения».

Россия, Старый Петергоф, 28-29 ноября 2007 г. С. 30-39.

4. A. Bakeeva, N. Titova, L. Voloshko, K. Kvitko. Cyanobacteria of some water basins on the east Urals radioactive trace (EURT) // Abstract. 7th International Symposium for Subsurface Microbiology. Shizuoka, Japan, November 16-21, 2008. P.

42.

5. Т.Н. Назина, А.В. Бакеева, Л.И. Константинова, Т.Л. Бабич, Е.В. Захарова, К.В. Квитко Фототрофные микроорганизмы водоемов жидких низкоактивных отходов и взаимодействие их с радионуклидами // Шестая Российская конференция по радиохимии. РАДИОХИМИЯ – 2009. Тезисы докладов. Россия, Москва, 12-16 октября 2009 г. С. 339.

6. А.В. Бакеева, Н.Н. Титова, В.В. Исакова, А.О. Тюкова, К.В. Квитко.

Изучение физиолого-биохимических свойств цианобактерий и микроводорослей из загрязненных радионуклидами водоемов // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов. Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 24-27 декабря 2009 г. С. 20.

7. А.В. Бакеева, И.Н. Суслова, А.В. Суслов, К.В. Квитко. Устойчивость цианобактерий и микроводорослей к -облучению // Московская Международная научно-практическая конференция «Биотехнология: экология крупных городов».

Тезисы докладов. Россия, Москва, 15-17 марта 2010 г. С. 68.

8. А.В. Бакеева, И.Н. Суслова. Биосорбция стронция и радио чувствительность культур фототрофных микроорганизмов из водоемов жидких низкоактивных отходов // Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.

Константинова. Доклад на молодежной научной конференции. Россия, Гатчина, 26-27 мая 2010 г.