Сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генетических свойств холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в период седьмой пандемии холеры
На правах рукописи
НЕФЁДОВ Константин Сергеевич Сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генетических свойств холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в период седьмой пандемии холеры 03.00.07 - микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
САРАТОВ – 2009 2
Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Смирнова Нина Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Плотников Олег Петрович доктор медицинских наук, профессор Замараев Валерий Семенович
Ведущая организация: ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи РАМН»
Защита состоится «_» _ 2009 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».
Автореферат разослан «_» _ 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник А.А. Слудский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Механизм эволюции патогенных бактерий одна из центральных проблем медицинской микробиологии. Решение этой проблемы позволяет выяснить причины генетического разнообразия возбудителей инфекционных болезней и провести прогнозирование появления новых эпидемически опасных вариантов.
имеющий повышенную эпидемическую значимость, является Vibrio cholerae, возбудителем холеры, острого диарейного заболевания с массивной дегидратацией, унесшего миллионы человеческих жизней за семь известных пандемий. Распространение холеры во многих странах мира определяет реальную возможность ее завоза на территорию России. Непосредственным напоминанием об этой угрозе являются недавние эпидемические вспышки холеры в Дагестане (1994 г., 1998 г.), Дальнем Востоке и Приморье (1999 г.), Татарстане (2001 г.), Ростовской области (2005 г.), а также спорадические случаи заболевания (Челябинск, 2000 г.;
Калмыкия, 2002 г.;
Башкортостан, 2004 г., 2008 г;
Тверская область 2005 г.;
Мурманск, 2006 г.). Согласно современным представлениям, в пределах вида V.cholerae образовалось три эпидемически опасных варианта: холерные вибрионы O1-серогруппы классического биовара, вызвавшие, видимо, первые 6 пандемий азиатской холеры (1817-1923 гг.), холерные вибрионы O1-серогруппы биовара эльтор - возбудитель текущей, 7-ой, пандемии (с 1961 г. по настоящее время) и внезапно появившийся в 1992 г. высоковирулентный штамм V.cholerae O139-серогруппы, с которым связывали начало 8-ой пандемии холеры.
Поскольку в современный период продолжается 7-ая пандемия холеры, ее возбудитель остается в центре внимания многих исследователей. Секвенирование генома V.cholerae биовара эльтор (Heidelberg et al., 2000) позволило выявить следующие его основные особенности: а) в отличие от многих других патогенов в клетках V.cholerae имеется 2 кольцевые хромосомы, различающиеся по размеру и функции;
б) основные гены вирулентности возбудителя входят в состав различных мобильных генетических элементов (двух профагов и пяти геномных островов), локализованных в основном на большой хромосоме.
Мобильность этих элементов и нестабильность их геномов, а также изменение в настоящее время экологии и иммунного статуса человека во многих регионах мира, включая Россию, – все это создает предпосылки для образования штаммов с ранее неизвестными свойствами. Такая ситуация диктует необходимость выяснения основных направлений эволюции возбудителя холеры эльтор в современный период. Однако для получения такой информации необходимы полные сведения об эволюции генома этого возбудителя в недалеком прошлом. В этой связи очевидна актуальность исследований, направленных на решение этой проблемы. Несмотря на большой интерес исследователей к этому вопросу, пока нет единой точки зрения на происхождение возбудителя холеры эльтор. При анализе 2-х предпандемических и 3-х пандемических штаммов выявлены лишь особенности генетической организации этих изолятов (Dziejman et al., 2002).
Полученные ранее сведения о структуре и функции генома предпандемических штаммов явно недостаточны. Практически отсутствуют данные о функции островов пандемичности VSP-1 и VSP-2, имеющихся в геноме клинических штаммов, выделенных во время 7-ой пандемии холеры. Информация о геномных вариациях природных штаммов V.cholerae биовара эльтор, циркулирующих на разных территориях в период эпидемического неблагополучия по холере, является также неполной. Получение новых фундаментальных сведений о фенотипических и генетических особенностях штаммов, выделенных до и во время 7-ой пандемии холеры эльтор, позволит получить более полную картину об эволюции этого возбудителя и выяснить механизмы, лежащие в основе адаптации этого патогена к меняющимся условиям внешней среды. Эти сведения будут служить основой для решения такой важной прикладной задачи, как паспортизация штаммов Государственной коллекции патогенных бактерий Микроб, а также для разработки новых средств диагностики и дифференциации штаммов с разным эпидемическим потенциалом.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - выявление фенотипических и генетических особенностей предпандемических и пандемических штаммов V.cholerae биовара эльтор.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1.Провести сравнительный анализ различных фенотипических свойств предпандеми ческих и пандемических штаммов холерных вибрионов биовара эльтор.
распространенность профагов и геномных островов, связанных с 2.Изучить вирулентностью и персистентностью, среди предпандемических штаммов V.cholerae биовара эльтор.
3.Исследовать экспрессию генов вирулентности и персистенции, локализованных в геноме предпандемических штаммов.
4.Изучить распространенность островов пандемичности VSP-1 и VSP-2 среди различных пандемических изолятов;
определить роль последних в жизнеспособности этих штаммов.
5.Провести молекулярное типирование штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных до и в период 7-ой пандемии холеры, для определения их филогенетических связей.
6.Изучить генетическое разнообразие природных штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных на разных территориях во время эпидосложнений по холере.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА:
Показано, что предпандемические штаммы V.cholerae биовара эльтор, независимо от времени их выделения (1910 г. и 1937 г.) и вирулентности, не отличались от штаммов, изолированных во время 7-ой пандемии, по серологическим, биохимическим свойствам и резистентности к диагностическим холерным бактериофагам. Вместе с тем впервые выявлено, что предпандемические штаммы, в отличие от пандемических, не имели устойчивости к изученным антибиотикам.
При сравнительном анализе геномов предпандемических и пандемических штаммов обнаружено, что регуляторные гены toxR, luxX, luxS, hns и pepA, входящие в состав различных систем регуляции, являются наиболее древними. Впервые определено присутствие в геноме всех изученных предпандемических штаммов острова персистенции в окружающей среде EPI, что указывает на его древнее происхождение. Установлено наличие в геноме вирулентных предпандемических штаммов двух копий профага CTX и дефектного острова патогенности VPI-2, лишенного одного (rep1803) или двух (nanH, rep1803) тестируемых генов. Показано широкое распространение двух островов пандемичности VSP-1 и VSP-2 среди штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных во время 7-ой пандемии холеры, что подтверждает их важную роль в формировании пандемического потенциала у этого возбудителя. Новыми являются данные о генетическом разнообразии природных клинических штаммов, связанном с нестабильностью геномов VPI-2, а также VSP-1 и VSP-2. Впервые обнаружено, что риботипирование и позволяют дифференцировать RAPD-ПЦР-типирование предпандемические и пандемические штаммы V.cholerae биовара эльтор.
Приоритетное значение имеют результаты, полученные при анализе функций геномов мобильных элементов. Выявлен высокий уровень экспрессии генов msh, локализованных в составе EPI, что свидетельствует об участии этого геномного острова в образовании биопленки предпандемическими штаммами. Впервые экспериментально доказана более высокая жизнеспособность пандемических штаммов в водной среде по сравнению с предпандемическими изолятами, что с высокой вероятностью связано с присутствием в геноме первых островов пандемичности VSP-1 и VSP-2.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:
Создан комплекс мультиплексных ПЦР, предназначенных для выявления в геноме штаммов V.cholerae основных генов вирулентности и персистенции. На основе разработанных тест-систем оформлены методические рекомендации Мультиплексный ПЦР-анализ для изучения генетического разнообразия и выявления атипичных штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор, которые одобрены Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 10 от 18 декабря 2007 г.) и утверждены директором института декабря 2007 г.
Создана коллекция, состоящая из 18 авторских штаммов V.cholerae биовара эльтор, которая включает штаммы с различным набором генов вирулентности и пандемичности. Эти штаммы могут быть использованы для выяснения и уточнения роли мобильных элементов в проявлении вирулентных свойств штаммов и их адаптации к меняющимся условиям окружающей среды. Штаммы коллекции депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб".
Полученная информация о наличии или отсутствии в геноме 124 природных штаммов 20-25 различных генов будет использована для геномной паспортизации штаммов из Государственной коллекции патогенных бактерий Микроб.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1.Штаммы V.cholerae биовара эльтор, выделенные до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры, не различаются по продукции O1-антигена, термолабильного гемолизина, растворимой гемагглютинин/протеазы, белков внешней мембраны OmpU и OmpT, а также чувствительности к холерным диагностическим эльтор и классическим бактериофагам. Вместе с тем предпандемические штаммы имеют выраженные отличия от пандемических относительно их резистентности к изученным антибиотикам.
2.В геноме авирулентных и вирулентных предпандемических штаммов присутствуют общие структурные (hapA, rtxA, attRS) и регуляторные (toxR, luxO, luxS, hns, pepA) гены, а также остров персистенции в окружающей среде EPI. Предпандемические штаммы способны образовывать биопленку, что связано с эффективной экспрессией генов, контролирующих подвижность (mot), биосинтез экзополисахарида (eps) и маннозочувствительных пилей адгезии (msh), последние из которых входят в состав EPI.
3.Геном вирулентных предпандемических штаммов содержит две копии профага CTX, а также два острова патогенности VPI-1 и VPI-2, из которых последний является дефектным. Ключевые гены вирулентности ctxAB и tcpA-F, входящие в состав CTX и VPI-1, эффективно экспрессируются у предпандемических штаммов, что обеспечивает развитие экспериментальной холерной инфекции у модельных инфицированных животных.
4.Вирулентные штаммы, выделенные во время 7-ой пандемии холеры, имеют характерные генетические особенности, связанные с присутствием в их геноме дополнительных мобильных элементов - профага RS1 и двух островов пандемичности VSP-1 и VSP-2. Уровень выживаемости в водной среде вирулентных пандемических штаммов, содержащих в геноме VSP-1 и VSP-2, значительно выше по сравнению с таковым у вирулентных штаммов, изолированных до начала текущей пандемии и не имеющих этих геномных островов.
5.Пандемические штаммы V.cholerae биовара эльтор, выделенные из разных источников (больные, носители, внешняя среда) на различных территориях в эпидемически опасные периоды, являются генетически неоднородными вследствие утраты геномов мобильных элементов (CTX, RS1, VSP-1 и VSP-2) или их отдельных генов (CTX и VPI-2), а также в результате полиморфизма гена tcpA, входящего в состав VPI-1. Вариабельность генома профага CTX лежит в основе изменения вирулентных свойств различных штаммов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:
Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практических конференциях РосНИПЧИ Микроб Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте Микроб (Саратов, 2004, 2005, 2007 гг.), а также на Всероссийской научно-практической конференции молодых учных и специалистов Окружающая среда и здоровье (Суздаль, 2005 г.) и Всероссийской конференции Фундаментальная наука и клиническая медицина (Санкт-Петербург, 2007 г.).
ПУБЛИКАЦИИ:
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ:
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 219 цитируемые работы, из них 54 отечественных и зарубежных. Общий объем диссертации составляет 153 страниц. Текст иллюстрирован таблицами и 15 рисунками.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Обзор литературы. В обзоре представлен анализ публикаций о различных мобильных генетических элементах связанных с вирулентностью, V.cholerae, пандемичностью и устойчивостью к лекарственным препаратам – бактериофагах, геномных островах, а также интегронах. Рассмотрены известные данные об эволюции генома этого патогена.
Материалы и методы. В работе использовали 140 штаммов V.cholerae эльтор и классического биоваров, включая изоляты, выделенные до начала 7–ой пандемии холеры.
Применяли традиционные и современные микробиологические, биохимические, серологические, генетические и молекулярно-биологические методы.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Сравнительный фенотипический анализ штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры. Не имея полных сведений о биологическом разнообразии штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных до начала текущей пандемии холеры, трудно выяснить направление эволюции генома этого патогена в современный период. В этой связи на первом этапе работы был проведен сравнительный анализ фенотипических свойств пяти предпандемических и 38 пандемических штаммов. Согласно ранее известным свойствам пять взятых предпандемических штаммов относятся к двум разным группам. В первую входит штамм V.cholerae ATCC14033, изолированный в 1910 г. на карантинной станции Эль Тор (Синайский полуостров), который может рассматриваться в качестве представителя эльтор вибрионов, впервые обнаруженных в 1905 г. в фекалиях паломников F. Gottschlich (Бароян О.В., 1971;
Тудор В. и др. 1981;
Chastel C., 2007). Вторая группа состоит из четырех клинических штаммов (Celebes30, MAK97, MAK676 и МAK757), выделенных в 1937 г. на острове Сулавеси или Целебес (Индонезия) во время локальной эпидемической вспышки холеры. Пандемические штаммы были представлены изолятами, выделенными в различные периоды 7-ой пандемии холеры: начальный (1961-1969 гг.), через 10-15 лет после начала пандемии (1970-1975 гг.) и в современный (1993-2005 гг.).
Фенотипический анализ был начат с определения у штаммов основных диагностически значимых свойства – способности к синтезу соматического О1-антигена (с выяснением серовара) и чувствительность к холерным фагам эльтор и классическому.
Оказалось, что независимо от периода выделения все исследованные штаммы продуцировали полноценный О1-антиген серовара Огава или Инаба. Следует лишь отметить тот факт, что все вирулентные штаммы, выделенные до начала пандемии холеры эльтор, относились к серовару Огава. Вместе с тем в 26,3% случаев пандемические штаммы имели серовар Инаба. Что касается чувствительности к холерным диагностическим бактериофагам, то, независимо от вирулентности и пандемического потенциала, все изученные штаммы лизировались в ДРТ бактериофагом эльтор, но были резистентны к классическому бактериофагу.
Затем был проведен сравнительный анализ продукции гемолизина предпандемическими и пандемическими штаммами, так как вопрос о времени возникновения первых гемолитически неактивных штаммов остается до конца неизученным. В результате установлено, что большинство предмандемических штаммов, включая и авирулентный изолят АТСС14033, действительно продуцируют значительное количество термолабильного гемолизина. Вместе с тем среди них был обнаружен вирулентный штамм МАК757, не способный к биосинтезу этого белка. Что касается изученных клинических штаммов, изолированных в период пандемии, то они представляли собой гетерогенную группу, в которой гемолитически активными были в основном штаммы, выделенные в первые годы пандемии.
Кроме того, у штаммов была определена продукция растворимой гемагглютинин/протеазы (РГА/П), поскольку этот фермент наиболее важен для проявления вирулентных свойств холерного вибриона. Оказалось, что все предпандемические штаммы независимо от их вирулентности продуцировали эту протеазу, в целом не отличаясь по уровню ее биосинтеза от штаммов, выделенных в период пандемии. Далее, предпандемические и пандемические штаммы были исследованы относительно продукции ими двух белков внешней мембраны OmpU и OmpT, которые защищают клетку от действия неблагоприятных факторов среды.
Сравнение профиля белков внешней мембраны у изучаемых штаммов показало, что четыре (ATCC14033, МАК757) из пяти исследуемых MAK97, MAK676, предпандемических изолятов имели выраженную продукцию белка OmpU (мол. масса 38,0 кДа) и наличие лишь следов белка OmpT с молекулярной массой 40,0 кДа, что характерно и для пандемических штаммов (рис.1).
1 2 3 4 5 6 OmpT, 40 кДа OmpU, 38 кДа 1 – ATCC14033, авирулентный штамм, выделенный в 1910 г.;
2,3,4,5 – MAK97, MAK676, MAK757, Celebes30 соответственно – клинические штаммы, выделенные во время локальной вспышки холеры в 1937 г.;
6, 7 – B1654, Malacca1 соответственно – штаммы с пандемическим потенциалом, выделенные от больных во время 7-ой пандемии холеры.
Рисунок 1. Электрофорез в 11% SDS-ПААГ лизатов клеток штаммов V.cholerae биовара эльтор с различным пандемическим потенциалом.
Особый интерес представляет вопрос о том, на каком этапе эволюции возбудителя холеры начали формироваться штаммы, устойчивые к антибиотикам. В этой связи мы провели сравнительный анализ резистентности к антибиотикам изучаемых штаммов. Полученные данные показывают, что авирулентный и вирулентный штаммы, выделенные до начала текущей пандемии холеры, были чувствительны к изучаемым лекарственным препаратам (табл. 1). Чувствительными к ним оказались также исследуемые штаммы, изолированные в начале пандемии холеры (1961 - 1966 гг.). Однако штаммы, изолированные в более поздние годы пандемии, характеризовались уже множественной лекарственной устойчивостью (табл. 1).
Таблица 1. Резистентность к антибиотикам предпандемических и пандемических штаммов V.cholerae биовара эльтор.
Штамм Год выделения Km Ap Tp Cm Tc Rif Предпандемические штаммы ATCC14033 1910 s s s s s s MAK97 1937 s s s s s s MAK676 1937 s s s s s s MAK757 1937 s s s s s s Celebes30 1937 s s s s s s Пандемические штаммы 31 1961 s s s s s s 34 Филип. 1961 s s s s s s М-537 1961 s s s s s s М-538 1961 s s s s s s 28Афг. 1965 s s s s s s М-309 1965 s s s s s s 34 Каюм 1966 s s s s s s M 1275 1993 s s r r s s M 1286 1994 s s r s s s M 1292 1994 s s r r s s M 1321 1998 s s r r s s M 1326 1998 s s r s s s M 1328 1998 s s r r s s M 1347 2001 s s r s s s M 1380 2001 s s r s s s M 1429 2004 r s r r r s Примечание: r или s – резистентность или чувствительность к антибиотикам;
Кm – канамицин, Am – ампициллин, Tp – триметоприм, Cm - хлорамфеникол, Tc – тетрациклин, Rif – рифампицин.
Итак, в результате впервые проведенного сравнительного анализа фенотипических свойств предпандемических и пандемических штаммов V.cholerae биовара эльтор показано, что сравниваемые штаммы имели следующие идентичные фенотипические свойства: продуцировали О1 антиген, термолабильный гемолизин, РГА/П, а также белки внешней мембраны. Из этого следует, что у исследуемых штаммов гены, определяющие эти свойства, имеют древнее происхождение. Вместе с тем впервые выявленные различия в устойчивости к изучаемым антибиотикам между предпандемическими и пандемическими штаммами свидетельствуют о том, что появление резистентных штаммов произошло после приобретения V. cholerae биовара эльтор пандемического потенциала.
2. Структурный и функциональный анализ генома предпандемических штаммов холерных вибрионов эльтор. Для проявления вирулентности возбудителю холеры абсолютно необходимы гены ctxAB, ответственные за продукцию холерного токсина (СТ), а также tcpA-F, кодирующие биосинтез токсинкорегулируемых пилей адгезии (TCP) — основного фактора колонизации. Поскольку указанные гены входят соответственно в состав профага CTX и острова патогенности VPI-1, то была изучена распространенность этих мобильных элементов среди предпандемических штаммов.
Кроме того определяли присутствие в их геноме профага RS1, а также второго острова патогенности VPI-2, которые несут дополнительные гены вирулентности. Использовали моно- и мультилокусные ПЦР с 19 парами специфических праймеров, а также ДНК-ДНК гибридизацию. В результате установлено, что геном авирулентного штамма ATCC был лишен всех 10 тестируемых генов, входящих в состав двух профагов CTX и RS1 и двух ОП VPI-1 и VPI-2. Отсутствие в геноме штамма ATCC14033 всех известных МГЭ с ключевыми генами патогенности подтверждает неспособность выделяемых в тот период вибрионов эльтор вызывать холеру. Вместе с тем наличие в хромосоме attRS последовательности свидетельствует о возможности внедрения в этот сайт бактериофага CTX. Кроме того, было установлено присутствие в геноме структурных генов hapA и rtxA, кодирующих биосинтез гемагглютинин/протеазы и токсина RTX (табл. 2).
Следующий этап работы состоял в исследовании генома четырех клинических штаммов, изолированных в 1937 г. на о. Целебес. Оказалось, что геномы этих штаммов (Celebes30, MAK97, MAK676, MAK757) имеют не только сходство с геномом ATCC (наличие нуклеотидной последовательности attRS, генов hapA и rtxA), но и значительные отличия. В хромосомах трех штаммов (Celebes30, MAK676 и MAK757) обнаружен профаг CTX и ОП VPI-1. Вместе с тем геном штамма MAK97 был лишен профага CTX, о чем судили по отсутствию генов ctxA, zot и ace (табл. 2). Наличие или отсутствие профага CTX в геноме штаммов было подтверждено ДНК-ДНК гибридизацией с молекулярным СТ-зондом. Полученные данные позволили заключить, что в геноме штаммов MAK757, Celebes30 и MAK676 находятся по две копии профага CTX (рис. 2, дорожка 1, 2, 4).
Вместе с тем изучаемые штаммы не имели второго профага RS1, присутствующего в геноме пандемических штаммов (табл. 2).
Появление в геномах изучаемых штаммов генов tcpA и ctxA в составе ОП VPI и профага CTX соответственно указывает на формирование клона, способного вызывать развитие холерной инфекции, что согласуется с данными других исследователей. Вместе с тем впервые установлено, что геномы этих штаммов содержали неполноценный ОП VPI 2, лишенный ряда генов (табл. 2). Эти данные свидетельствуют о нестабильной структуре генома ОП VPI-2. Таким образом, предпандемические штаммы были вирулентны, но их геномам, в отличие от пандемических, были присущи две специфические особенности наличие дефектного ОП VPI-2 и отсутствие профага RS1.
Таблица 2. Результаты изучения геномов предпандемических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор с помощью моно и мультилокусной ПЦР со специфическими праймерами Штаммы Тестируемые гены ATCC14033* Celebes30** MAK97** MAK676** MAK757** 1910 1937 1937 1937 – – ctxA + + + Профаг CTX – – ace + + + – – zot + + + Профаг RS1 – – – – – rstC – tcpA + + + + – VPI-1 aldA + + + + – mop + + + + – hel1760 + + + + – – VPI-2 nanH + + + – – – – – rep – – – – – deo VSP- – – – – – tnp – – – – – pro VSP- – – – – – pro mshA, EPI + + + + + mshQ Гены коровой hapA + + + + + области attRS + + + + + хромосомы rtxA + + + + + Примечание: * - авирулентный штамм (Синайский п/о, 1910 г.);
** - клинические штаммы (о.Целебес, 1937 г.).
1 – MAK757;
2 – Celebes30;
3 – MAK97;
4 – MAK676;
M – ДНК фага, рестрицированное EcoRI/HindIII (указаны размеры рестриктов) Рисунок 2. Блот-гибридизация по Саузерну хромосомных ДНК предпандемических штаммов, рестрицированных эндонуклеазой PstI, с молекулярным зондом CT (амплифицированный фрагмент гена ctxA из профага CTX).
Проявление вирулентности возбудителя контролируют не только структурные, но и различные регуляторные гены, в связи с чем была изучена их распространенность среди предпандемических штаммов. Использовали ПЦР-анализ с применением 8 пар специфических праймеров для тестирования в геноме изучаемых штаммов трх групп регуляторных генов. Первая группа состояла из 4 ключевых генов, участвующих в позитивном многокаскадном процессе регуляции активности генов, входящих в ToxR регулон: toxR, toxT, tcpP, tcpH. Вторая включала основные гены регуляторной системы quorum sensing (QS) luxS и luxO. В третью входили гены pepA и hns, осуществляющие негативную регуляцию экспрессии генов вирулентности ctxAB и tcpA. Результаты ПЦР тестирования авирулентного предпандемического штамма ATCC14033 показали, что в его геноме из изученных генов, контролирующих экспрессию ToxR-регулона, имеется лишь глобальный регуляторный ген toxR. Гены toxT, tcpH и tcpP отсутствуют. Вместе с тем хромосома ATCC14033 содержит гены luxS и luxO, которые у пандемических штаммов контролируют экспрессию как генов вирулентности, так и генов, участвующих в образовании биоплнки, а также гены pepA и hns. Поскольку геном ATCC14033 лишн основных структурных генов патогенности (ctxA, tcpA), присутствие регуляторных генов toxR, pepA, hns, luxS и luxO может свидетельствовать о выполнении ими других функции в клетке, связанных, видимо, с обеспечением их жизнедеятельности.
ПЦР-тестирование клинических штаммов показало, что в отличие от авирулентного штамма ATCC14033, в геномах трх штаммов (МАК97, МАК676 и МАК757) были обнаружены регуляторные гены toxT, tcpP и tcpH из ОП VPI-1. В то же время хромосома штамма Celebes30 была лишена гена tcpP, что может указывать на нестабильную структуру ОП VPI-1 у предпандемических вирулентных штаммов. Изоляты B1654, Malacca1, выделенные во время 7-ой пандемии холеры и взятые для сравнения, не отличались от вирулентных предпандемических штаммов по составу изученных регуляторных генов. Отсутствие различий в составе регуляторных генов между вирулентными предпандемическими и пандемическими штаммами показывает и подтверждает тот факт, что эволюционные преобразования генома авирулентных предпандемических штаммов были связаны не с приобретением новых регуляторных систем. Вполне очевидно, что у древних генов-регуляторов появились новые функции, связанные с контролем экспрессии чужеродных генов вирулентности, полученных авирулентным штаммом в процессе эволюции.
Для изучения у предпандемических штаммов уровня экспрессии генов ctxAB, входящих в состав CTX, была определена продукция ими холерного токсина (в условиях in vitro) с помощью иммуноферментного метода GM1 ELISA. Оказалось, что авирулентный штамм ATCC14033 действительно не продуцирует токсин, поскольку не имеет генов ctxAB. Что касается вирулентных штаммов, то из 3-х изученных 2 изолята MAK676 и MAK757 синтезируют соответственно 0,18 и 0,13 мкг/мл CT. Вместе с тем, у клинического штамма Celebes30 продукция токсина не выявлена, что может быть связано с отсутствием в его геноме одного из регуляторных генов - tcpP. Взятые для сравнения пандемические штаммы в целом не отличались по биосинтезу этого белка от токсигенных предпандемических изолятов, что указывает на одинаковый уровень экспрессии у них генов ctxAB.
Далее, для сопоставления вирулентных свойств взятых штаммов мы провели внутрикишечное заражение крольчат-сосунков клетками предпандемических и пандемических изолятов. В результате установлено, что среди четырх предпандемических штаммов лишь MAK97 оказался авирулентным из-за отсутствия в его геноме профага CTX. Три предпандемических штамма MAK757, MAK676 и Celebes30, имеющие ключевые структурные и регуляторные гены вирулентности, также как и пандемический штамм эффективно колонизировали тонкий кишечник и вызывали через 24-48 ч развитие типичного холерогенного синдрома, который выражался в сильном растяжении петель тонкого и толстого кишечника за счт наполнения их прозрачной жидкостью. Эти данные указывают на отсутствие различий между предпандемическими и пандемическими штаммами в проявлении вирулентных свойств.
Поскольку эволюция патогенных бактерий связана не только с приобретением ими вирулентных свойств, но и с повышением их уровня адаптации к окружающей среде, возник вопрос о том, имеется ли в геноме предпандемических штаммов остров персистенции EPI. ПЦР-анализ показал, что геном авирулентного штамма ATCC содержит EPI. Этот мобильный элемент имелся также в хромосоме всех 4-х вирулентных штаммов, выделенных в 1937 г. Вместе с тем геномы всех изученных штаммов были лишены островов пандемичности VSP-1 и VSP-2 (табл. 2). Обнаружение EPI в геноме самого древнего из изученных вибрионов свидетельствует в пользу предположения, что этот остров является одним из «старейших».
Обнаружение острова персистенции в геноме предпандемических штаммов ставит вопрос о способности этих изолятов образовывать биопленку в условиях in vitro, которая защищает индивидуальные клетки от воздействия различных повреждающих факторов внешней среды. Поскольку для формирования биопленки необходим биосинтез не только маннозочувствительных пилей адгезии (MSHA), определяемый генами msh, локализованными на EPI, но и продукция экзополисахарида, а также подвижность вибрионов, то вначале была дана оценка экспрессии генов, контролирующих проявление этих свойств. В результате установлено, что все проверенные штаммы были подвижны, а также продуцировали MSHA и экзополисахарид. Затем мы провели моделирование процесса образования биопленки на абиотической поверхности - 96-луночной полистироловой панели. Оказалось, что как предпандемические так и пандемические штаммы были способны формировать биопленку на абиотической поверхности, практически не отличаясь друг от друга по этому свойству (рис. 3). Поскольку биопленка является идеальным местом для горизонтального переноса генов от одних бактерий к другим, можно предположить, что именно в ее составе происходили дальнейшие преобразования генома этого патогена.
ОП 1, Длина волны 530 нм 1, 1, 1, 0, 0, 0, 0, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Предпандемические Пандемические Обозначения: 1 – ATCC14033, 2 MAK97, 3 - MAK676, 4 – MAK757, 5 – Celebes30, 6 – C418, 7 – C443, 8 – M1292, 9 – M1326, 10 – M1328, 11 – M1347, 12 – M1380, 13 – 74, 14 – M8, 15 – 641/67 CRC IDH;
ОП – оптическая плотность, измеренная на спектрофотометре.
Рисунок 3. Образование биопленки штаммами V. cholerae.
3. Молекулярно-генетические особенности штаммов V.cholerae биовара эльтор, вызвавших 7-ю пандемию холеры. В 2002 г. Dziejman et al., изучив геномы трех штаммов, выделенных в Гонконге (1961 г.), Бангладеш (1971 г.) и Перу (1991 г.), высказали предположение о том, что их пандемический потенциал связан с присутствием в их хромосоме двух дополнительных геномных островов VSP-1 и VSP-2. Между тем до сих пор отсутствуют полные сведения о распространенности этих островов пандемичности среди других штаммов, изолированных на разных территориях и в различные периоды седьмой пандемии. Для решения этиого вопроса был проведен ПЦР анализ геномов 20 клинических штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных на различных географически удаленных территориях и в разные периоды 7-ой пандемии холеры, в геноме которых, согласно нашим данным, имелись профаг CTX и ОП VPI- (рис. 4 А). Кроме того, нами было установлено, что в их геноме присутствует дополнительный профаг RS1. При этом, по данным ДНК-гибридизации с молекулярным зондом RS, в хромосоме 5 штаммов из 6 исследуемых имеется по две копии профага RS (рис. 4 Б). Что касается островов пандемичности, то их имели все исследованные штаммы независимо от времени их выделения.
Присутствие в геноме всех исследованных штаммов VSP-1 и VSP-2 показывает и подтверждает ранее полученные данные о том, что процесс формирования возбудителя 7 ой пандемии холеры был связан с приобретением уже вирулентными вибрионами эльтор А Б А. ДНК-гибридизация PstI-фрагментов хромосомной ДНК с молекулярным зондом CT (амплифицированный фрагмент гена ctxA из профага CTX): 1-6 – ДНК штаммов M818, M656, 28Афг., T-4, 34Филипп., 1/67;
M – ДНК фага рестрицированная EcoRI/HindIII.
Б. ДНК-гибридизация BglII хромосомных фрагментов пандемических штаммов с молекулярным зондом RS (амплифицированный фрагмент гена rstC из профага RS1): 1- – ДНК штаммов M656, 28Афг., T-4, 34Филипп., 1/67, M818;
M – ДНК фага, рестрицированная EcoRI/HindIII.
Рисунок 4. Блот-гибридизация по Саузерну хромосомных ДНК пандемических штаммов V.cholerae биовара эльтор, рестрицированных эндонуклеазами, с молекулярными зондами CT и RS, мечеными дигоксигенином.
указанных геномных островов. Вместе с тем до сих пор отсутствуют сведения о роли VSP-1 и VSP-2 в выживаемости клинических штаммов V.cholerae биовара эльтор в окружающей среде, которая в значительной мере может определять пандемический потенциал возбудителя. В этой связи были проведены модельные эксперименты по определению конкурирующей способности вирулентных предпандемических и пандемических штаммов в условиях in vitro. В стерильную речную воду вносили одинаковое количество клеток 1-ого предпандемического и 1-ого пандемического штамма и проводили сравнение их выживаемости через 7 и 14 дней после совместного культивирования. В результате впервые обнаружено, что при совместном культивировании тестируемых штаммов в речной воде уровень выживаемости пандемических штаммов был в 3-47000 раз выше, чем предпандемических. Эти данные свидетельствуют в пользу предположения о том, что геномные острова VSP-1 и VSP- действительно играют большую роль в адаптации холерных вибрионов к окружающей среде.
Обнаруженные как сходство, так и различия в структуре и функциях геномов предпандемических и пандемических штаммов ставят вопрос об их генетических связях.
Предпандемические штаммы: 1 - MAK757, 2-3 - Celebes 30, 4 - MAK97, 5 - MAK676, 6 ATCC14033. Пандемические штаммы: 7 - M818, 8 - M656, 9 - 28Афг., 10 - Т-4, 11 34Филип., 12 - 1/67. M – ДНК фага, рестрицированная EcoRI/HindIII.
Рисунок 5. Риботипирование (гибридизация зонда 16S с BglI фрагментами рестрикции) штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных до начала и во время 7-ой пандемии холеры.
С этой целью было проведено их молекулярное типирование. В качестве основных методов анализа были выбраны риботипирование и RAPD-ПЦР-типирование.
Результаты риботипирования позволили разделить тестируемые штаммы на три основные группы, каждая из которых относилась к одному и тому же риботипу: авирулентный предпандемический, вирулентные предпандемические и вирулентные пандемические (рис. 6). Таким образом, риботипирование обеспечило четкую дифференциацию предпандемических и пандемических штаммов и показало, что исследуемые штаммы по структуре rrn-оперонов следует отнести к 3-м разным риботипам. Необходимо отметить, что штаммы, выделенные в разные периоды 7-ой пандемии холеры, относятся к одному риботипу и являются, вероятно, потомками одного клона. Вирулентные предпандемические штаммы входят в другую, но также генетически однородную группу, что может свидетельствовать в пользу предположения об их клональном происхождении.
Выявленные различия в структуре rrn-оперонов между 3-мя группами штаммов, безусловно, отражают эволюционные изменения их геномов. Вместе с тем наличие идентичных фрагментов, гибридизирующихся со специфическим зондом, может служить указанием на их общее происхождение.
Результаты со случайным праймером RAPD-ПЦР-типирования (AACGCGCAAC) полностью совпадают с результатами риботипирования.
4. Генетическое разнообразие природных штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных во время 7-ой пандемии холеры. Самостоятельный интерес представляло изучение генетического разнообразия пандемических природных штаммов, выделенных во время эпидосложнений. Изучено 99 природных штаммов, изолированных от больных (89), носителей (5) и водной среды (5) в период эпидосложнений по холере.
Проведено ПЦР-тестирование 21 гена, локализованного на профагах CTX и RS1, а также геномных островах EPI, VPI-1, VPI-2, VSP-1 и VSP-2. В результате обнаружено групп природных штаммов, геномы которых отличались от типичных по разным свойствам.
Таблица 3. Результаты анализа генетического разнообразия природных штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор, выделенных во время седьмой пандемии холеры на территории Юго-Восточной Азии и Российской Федерации.
Мобиль- Кол-во штаммов с указанным набором генов вирулентности ные генети Гены ческие 58 10 5 5 3 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 элемен ты ctxA + + + + + + + + + + + + CTX ace + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + zot RS1 rstC + + + + + + + + + + + + + tcpA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + toxT + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + VPI- + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + aldA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + mop hel1760 + + + + + + + + + + + + + nanH VPI-2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + rep deo0175 + + + + + + + + + + + + VSP- + + + + + + + + + + + + tnp pro0490 + + + + + + + + + + + + + VSP- + + + + + + + + + + + + + pro mshQ EPI + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Гены attRS + + + + + + + + + + + + + + + + + + + коровой toxR + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + области rtxA + + + + + + + + + + + + + + + + + хромо + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + hapA сомы % штаммов от 58, 10, 5, 5, 3, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, общего числа (99 штаммов) Показано, что генетическое разнообразие штаммов определяется в основном утратой мобильных элементов или их отдельных генов (табл. 3). Утрата генома профага CTX или его отдельных генов происходит в 18% случаев. Частичная потеря генов VPI- наблюдается в 27,3% случаев. Острова пандемичности VSP-1 и VSP-2 утрачиваются также довольно часто - в 13,1% и 12,1% случаев соответственно.
Вместе с тем установлено стабильное наследование ОП VPI-1, несущего гены tcpA-F, кодирующего биосинтез основного фактора колонизации. Лишь 2 штамма (5/66 и CW6) либо не имели гена tcpA, либо нуклеотидная последовательность этого гена отличалась от типичной для вибрионов эльтор. В этой связи было проведено секвенирование гена у штамма Анализ нуклеотидной tcpA V.cholerae CW6.
последовательности показал, что ген tcpA штамма CW6 действительно отличается от типичного по 44 нуклеотидам, но имеет значительную гомологию с геном tcpA V.cholerae 569B классического биовара, взятого в качестве контроля (рис. 6).
80 100 110 120 N ·········TGACATTAC····AGTAATCATTGTTCTGGGTATTATGGGTGTGGTCTCAGCGGGTGT····· Reference 569B ·························G·····C·····A··C········G·····T··G·····G······· CW6 ··············C········································T················ 190 200 210 220 230 N ····CTGCGCAAAATCTAAACAGCGTGCAAATTGCAATGACACAAACTTATCGTAGTCTTGG···· Reference 569B ·····C·······G···C··T··TA·C···G·····C·······G··A··C···G····A······ CW6 ·····A··T········C··T·CAA·C···G·G··GC·T··T························ 260 270 280 290 300 N ····CTACCGCAAACGCAAATGCTGCTACACAGCTAGCTAATGGTTTGGTCAGCCTTGGTAAGG Reference 569B ·····A··A··TG·T··G·CA·······GTA·····A··TCA··C·····T··TT·A·····AA CW6 ········A··TG·T···GCC··C··A··GGCC···A··TC···G·····T···T·A······A 320 330 340 N TTTCAGCTGATGAGGCAAAGAATCCTTTCACTGGTACAGCTATG········· Reference 569B ·A···T·C···········A··C··A····T······················ CW6 ····G··G·····A··T··A·····A·····A····················· Идентичные нуклеотидные последовательности представлены точками;
замены нуклеотидных последовательностей выделены жирным шрифтом.
Рисунок 6. Сопоставление нуклеотидной последовательности гена tcpA природного штамма V.cholerae CW6 биовара эльтор с таковой референс штамма V.cholerae N биовара эльтор и V.cholerae 569B классического биовара.
Обнаружение штамма с комбинированными свойствами возбудителей двух биоваров подтверждает предположение ряда исследователей о том, что в современный период происходит горизонтальный перенос генов вирулентности от классических холерных вибрионов, образовавших природный резервуар генов патогенности, к холерным вибрионам эльтор. Таким образом, показано, что в основе генетического разнообразия штаммов лежит нестабильность геномов их мобильных элементов, связанных с вирулентностью и/или пандемичностью. Заслуживают внимания результаты, указывающие на циркуляцию в природных популяциях штаммов, геном которых был очень сходен с геномами вирулентных предпандемических изолятов. Эти 4 штамма (5/66, 6/67, CW6 и ME7) не имели ни профага RS1, ни островов пандемичности VSP-1 и VSP- при наличии других мобильных элементов, связанных с вирулентностью. Следует также отметить, что представленные нами данные о генетическом разнообразии клинических штаммов V.cholerae биовара эльтор, отличаются от ранее полученных результатов, согласно которым эти изоляты являются генетически однородной популяцией.
Проведение в настоящей работе более глубокого анализа их геномов позволило впервые выявить более высокий уровень их генетического разнообразия, который связан с утратой ими островов пандемичности или отдельных генов из острова патогенности VPI-2.
Выявление штаммов V.cholerae биовара эльтор с вариабельным геномом профага CTX позволило изучать особенности инфекционного процесса при экспериментальной инфекции, вызванной природными изолятами, несущими различный набор фаговых генов ctxA, zot и ace (ctxA+ zot+ ace+;
ctxA+ zot- ace+;
ctxA- zot+ ace+;
ctxA- zot+ ace-;
ctxA- zot- ace-).
Экспериментальную инфекцию воспроизводили на 37 кроликах-сосунках. В результате было установлено, что все ctxA+ штаммы, независимо от присутствия генов zot или ace, были вирулентны. Отсутствие гена ctxA при сохранении zot и ace определяло развитие энтеропатогенного синдрома, что характерно для слабовирулентных штаммов. Утрата всех генов профага приводила к авирулентности штамма. Таким образом показана явная связь между характером инфекционного процесса у модельных животных и вариабельностью генома профага.
Итак, выявленное генетическое разнообразие природных штаммов свидетельствует о том, что формирование генетически измененных патогенных вариантов происходит постоянно и с довольно высокой частотой. Эти события указывают на необходимость проведения мониторинга внешней среды с использованием адекватных диагностических средств. Полученные данные о наличии или отсутствии в геноме природных штаммов 20-25 различных генов будут использованы для геномной паспортизации штаммов хранящихся в Государственной коллекции V.cholerae, патогенных бактерий «Микроб».
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данной работе впервые проведен комплексный сравнительный анализ фенотипических и генетических свойств 25 предпандемических и пандемических штаммов V.cholerae биовара эльтор для углубления наших знаний об эволюции генома этого патогена. Основным итогом фенотипического анализа явилось выявление идентичных серологических, биохимических свойств, а также резистентности к диагностическим фагам у всех изученных штаммов, независимо от времени выделения, их вирулентности и пандемического потенциала. Предпандемические штаммы отличались от пандемических лишь появлением у последних устойчивости к изученным антибиотикам.
Генетический анализ предпандемических штаммов показывает присутствие в их геноме общих с пандемическими штаммами структурных и регуляторных генов (attRS, hapA, rtxA;
toxR, luxO, luxS, hns, pepA), а также мобильного элемента EPI. Несомненно, что эти гены и геномный остров EPI имеют древнее происхождение. Впервые показано, что предпандемические штаммы, как и пандемические изоляты способны формировать биопленку в условиях in vitro. Это свойство указывает на возможность сохранения их во внешней среде в течение длительного периода. Вместе с тем выявлены и подтверждены различия между геномами вирулентных предпандемических и пандемических штаммов.
Показано, что в отличие от клинических изолятов, выделенных в 1937 г. и содержащих в геноме профаг CTX, а также ОП VPI-1 и дефектный ОП VPI-2, пандемические штаммы имели дополнительные мобильные элементы – профаг RS1 и острова пандемичности и VSP-2. Эти данные полностью согласуются с результатами других VSP- исследователей. Кроме того, впервые установлено, что пандемические штаммы, имеющие VSP-1 и VSP-2, характеризуются большей выживаемостью в водной среде по сравнению с вирулентными предпандемическими изолятами, лишенными этих геномных островов.
Выявленные различия в выживаемости между сравниваемыми штаммами подтверждают участие VSP-1 и VSP-2 в формировании пандемического потенциала у возбудителя последней пандемии холеры.
Полученная информация о фенотипических и генетических особенностях предпандемических и пандемических штаммов, а также данные риботипирования и RAPD-ПЦР-типирования свидетельствует в пользу предположения о следующих этапах эволюции генома возбудителя холеры эльтор: авирулентные предпандемические штаммы V.cholerae eltor вирулентные предпандемические штаммы V.cholerae eltor вирулентные пандемические штаммы V.cholerae eltor. Это означает, что происходило поэтапное обогащение генома авирулентного штамма-предшественника различными МГЭ, связанными с вирулентностью и пандемичностью.
Самостоятельный интерес представляет данные о генетическом разнообразии природных штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных в период 7-ой пандемии холеры во время эпидосложнений. В результате выявлено 20 групп штаммов, отличающихся от типичных отсутствием того или иного мобильного элемента (профагов CTX, RS1, островов пандемичности VSP-1 и VSP-2) либо отдельных генов, входящих в состав CTX и/или VPI-2. Вместе с тем на основе секвенирования гена tcpA из ОП VPI- были обнаружены штаммы V.cholerae биовара эльтор с гибридным геном tcpA, имеющим значительную область гомологии с геном tcpA холерных вибрионов классического биовара. Выявленное генетическое разнообразие природных штаммов свидетельствует о продолжающихся изменениях генома возбудителя холеры эльтор, в результате которых могут сформироваться новые варианты патогенных клонов с новыми диагностически значимыми и вирулентными свойствами.
Полученные фундаментальные данные явились основой для решения ряда прикладных вопросов.
ВЫВОДЫ 1.Авирулентные и вирулентные штаммы V.cholerae биовара эльтор, выделенные до начала 7-ой пандемии, не отличаются от пандемических изолятов по серологическим и биохимическим свойствам, а также резистентности к холерным диагностическим бактериофагам. Вместе с тем сравниваемые штаммы имеют разную чувствительность к изученным лекарственным препаратам.
2.В геномах авирулентных и вирулентных предпандемических штаммов холерных вибрионов эльтор содержатся общие регуляторные гены toxR, luxO, luxS, hns, pepA, а также мобильный генетический элемент – остров персистенции EPI, что свидетельствует об их древнем происхождении.
3.Впервые показано, что предпандемические штаммы, содержащие EPI, способны формировать биопленку, что указывает на возможность сохранения их во внешней среде в течение длительного периода.
4.Выявлены значительные различия между геномами авирулентных и вирулентных предпандемических штаммов. В геноме вирулентных штаммов, в отличие от авирулентных, присутствуют дополнительные мобильные элементы: две копии профага CTX и два острова патогенности VPI-1 и VPI-2, из которых последний является дефектным. Эффективная экспрессия ключевых генов патогенности ctxAB и tcpA, входящих в состав соответственно CTX и VPI-1, определяет способность этих штаммов вызывать экспериментальную холерную инфекцию у биомоделей.
5.Показано широкое распространение островов пандемичности VSP-1 и VSP- среди штаммов V.cholerae биовара эльтор, выделенных во время 7-ой пандемии холеры.
Впервые обнаружен более высокий уровень выживаемости в водной среде пандемических штаммов по сравнению с предпандемическими, что подтверждает роль VSP-1 и VSP-2 в формировании пандемического потенциала у возбудителя холеры эльтор.
6.Генетическое разнообразие изученных пандемических штаммов, выделенных в эпидемически опасные периоды, выражается в присутствии в природных популяциях изолятов, не имеющих либо таких мобильных элементов как CTX, RS1, VSP-1 или VSP-2, либо отдельных генов CTX и VPI-2. Кроме этого при анализе нуклеотидных последовательностей обнаружены штаммы, содержащие VPI-1 с гибридным геном tcpA.
Показано, что в основе изменения вирулентных свойств различных штаммов лежит вариабельность генома профага CTX.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Осин А.В., Нефдов К.С., Смирнова Н.И. Гетерогенность структуры генома 1.
предпандемических и пандемических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор // Холера и патогенные для человека вибрионы. – Ростов-на-Дону, 2004. – Вып. 17. – С. 58 – 59.
Смирнова Н.И., Осин А.В., Нефедов К.С., Краснов Я.М., Гусева Н.П. Полиморфизм 2.
гена tcpA, участвующего в контроле биосинтеза основного фактора колонизации, у предпандемических и пандемических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор // Медицинская микробиология - XXI век. – Саратов, 2004. – С. 205-207.
Осин А.В., Нефедов К.С., Смирнова Н.И. Роль мобильных генетических элементов в 3.
изменении вирулентных и эпидемических свойств холерных вибрионов биовара эльтор // Материалы Международной конференции «Молекулярная медицина и I биобезопасность». – М., 2004. – С. 145-146.
Осин А.В., Нефедов К.С., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ 4.
геномов холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры // Генетика. – 2005. – Т. 41, №1. – С. 1-10.
Нефдов К.С., Осин А.В., Смирновой Н.И. Генетическое разнообразие пандемических 5.
штаммов холерных вибрионов биовара эльтор, выделенных из различных источников на территории Юго-Восточной Азии // Проблемы особо опасных инфекций. – Саратов, 2005.
– Вып. 1. - С. 46-51.
Нефедов К.С., Осин А.В., Смирнова Н.И. Влияние мобильных генетических 6.
элементов на вирулентность и эпидемический потенциал холерных вибрионов биовара эльтор // Материалы Всеросс. научно-практ. конф. «Окружающая среда и здоровье». – Суздаль, 2005. – С. 172-175.
Нефедов К.С., Осин А.В., Ливанова Л.Ф., Смирнова Н.И. Фенотипическая и 7.
генотипическая характеристика предпандемических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор. // Сб. матер. проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». – Ростов-на-Дону, 2005. – Вып.18. – С. 81-82.
Осин А.В., Нефедов К.С., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Смирнова Н.И. Мультилокусное 8.
секвенирование предпандемических и пандемических штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор // Материалы VII межгосударственной научно-практической конф. государств – участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств участников Содружества Независимых Государств». – Оболенск, 2006. – С. 117-118.
Смирнова Н.И., Нефдов К.С., Осин А.В., Ливанова Л.Ф., Краснов Я.М. Изучение 9.
распространенности регуляторных генов, контролирующих экспрессию генов вирулентности, среди штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор с разным пандемическим потенциалом // Молекул. генетика. – М., 2007. – № 1. – С. 15-22.
10. Нефедов К.С., Осин А.В. Изменчивость структуры профага вирулентности CTXф Vibrio cholerae и ее влияние на течение инфекционного процесса // Материалы X Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье». – Санкт-Петербург, 2007. – С. 304-305.
11. Смирнова Н.И., Осин А.В., Нефедов К.С., Кульшань Т.А., Заднова С.П., Ливанова Л.Ф., Топорков А.В., Кутырев В.В. Вариабельность генома профага CTXф и ее роль в изменении вирулентных свойств Vibrio cholerae биовара эльтор // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 2007. – №.6. – С.20-26.
12. Осин А.В., Нефедов К.С., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Смирнова Н.И Типирование штаммов V.cholerae биовара эльтор методом мультилокусного секвенирования // Сб.
трудов 6-ой Всеросс. научн.-практ. конф. «Молекулярная диагностика – 2007». – М., – Т.1. – С.389-391.
13. Осин А.В., Нефедов К.С., Кульшань Т.А., Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И.
Эволюционные преобразования генома возбудителя холеры эльтор и их роль в возникновении штаммов с разным эпидемическим потенциалом // Матер. IX съезда Всерос. научно-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. – М., 2007. – Т. 1. – С. 182-183.