Исследование мембранодестабилизирующих свойств гликопротеина nsp4 ротавирусов
на правах рукописи
Пономарева Наталья Вячеславовна Исследование мембранодестабилизирующих свойств гликопротеина NSP4 ротавирусов 03.01.04. – биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Нижний Новгород – 2010 2
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Нижегородском государственном университете им.
Н.И. Лобачевского» и ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора доктор биологических наук,
Научный консультант:
профессор Новикова Надежда Алексеевна доктор биологических наук,
Официальные оппоненты:
профессор Корягин Александр Сергеевич доктор медицинских наук, Лавровский Сергей Николаевич
Ведущая организация:
Нижегородская государственная медицинская академия
Защита состоится: «»_2010 г. в_час_мин на заседании диссертационного совета Д. 212.166.15. при Нижегородском госуниверситете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ННГУ.
Автореферат разослан: «»_2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук С.В. Копылова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Гликопротеин ротавируса обладает NSP Актуальность проблемы.
свойствами энтеротоксина и играет ведущую роль в патогенезе ротавирусной инфекции, которая обусловливает до 70% случаев госпитализаций детей с острой кишечной инфекций в возрасте до 5 лет и является частой причиной смертности детей в развивающихся странах [Glass R.I., 2005]. Энтеротоксин NSP4 имеет молекулярную массу 20,2 кДа и представляет продукт трансляции 10 сегмента днРНК генома ротавируса [Estes M.K., Cohen J.,1989].
Ротавирусы характеризуются широким антигенным и генетическим разнообразием. У ротавирусов группы А человека и животных установлено существование 14 G-серотипов (детерминирован гликопротеином VP7) и 27 Р генотипов (детерминирован протеазочувствительным белком VP4) [Khamrin P. et al., 2007]. Полиморфизм по гену NSP4 отражает существование 11-ти генотипов NSP ротавирусов человека и животных [Matthijnssens J. et al., 2008]. Изучение генетического разнообразия NSP4 представляет важную и актуальную задачу – в плане расширения информации о спектре NSP4-генотипов, циркулирующих на территории России и современной классификации ротавирусов, основанной на свойствах каждого геномного сегмента.
NSP4 влияет на жизненноважные процессы, протекающие в инфицированных клетках кишечника: дезорганизует микроструктуру цитоскелета энтероцитов, ингибирует транспорт клеточных белков, аминокислот и дисахаридаз, нарушает ионный баланс в клетках кишечника посредством повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция, что приводит к нарушению ресорбции воды энтероцитами и, как следствие, к диарее. Высвобождение ионов кальция из внутриклеточных хранилищ (ЭПР) объясняется разрушением их мембран в результате мембранодестабилизирующей активности ротавирусного энтеротоксина [Tian P. et al., 1996]. Но и на сегодняшний день до конца не ясны молекулярные основы вирулентности ротавирусов, не существует четких представлений о механизме развития патогенеза ротавирусной инфекции в целом и роли в нем энтеротоксина NSP4. Исследование биологической активности функционально значимых участков белковой молекулы NSP4 ротавирусов разных генотипов в модельной бактериальной векторной системе может внести новые аспекты в изучение влияния биологических особенностей NSP4 на выраженность проявлений ротавирусной инфекции и способствовать разработке альтернативных ротавирусных вакцин на основе NSP4.
Поэтому изучению биохимических и молекулярно-биологических свойств данного белка и кодирующего гена является чрезвычайно важной и актуальной задачей.
исследование мембранодестабилизирующих свойств Цель исследования:
гликопротеина NSP4 ротавирусов группы А различных антигенных типов и NSP4 генотипов.
Задачи исследования:
Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для амплификации полноразмерной 1.
последовательности и открытой рамки считывания гена NSP4 ротавируса группы А.
2. Установить нуклеотидные последовательности гена NSP4 российских изолятов ротавирусов разных G[P]-типов и определить их NSP4 генотипы.
Изучить генетические взаимосвязи исследуемых изолятов ротавируса с 3.
ротавирусами группы А человека, выделенными на разных территория земного шара, и ротавирусами животных.
Охарактеризовать мембранодестабилизирующую активность разных 4. NSP генотипов в модельной бактериальной векторной системе на основе способности ротавирусного энтеротоксина лизировать мембраны клеток Escherichia coli.
5. Провести сравнительный анализ аминокислотной последовательности NSP4, установить наличие/отсутствие взаимосвязи аминокислотных замен в функционально-активных консервативных и вариабельных регионах белковой молекулы с мембранодестабилизирующей активностью NSP4 разных генотипов.
Научная новизна и практическая значимость работы:
Подобраны и апробированы праймеры для универсальной амплификации гена NSP4 ротавирусов группы А разных генотипов, что может быть использовано при разработке тест-систем на основе ПЦР для диагностики ротавирусного гастроэнтерита. Разработанная методика амплификации гена NSP4 применяется при проведении НИР по изучению штаммов ротавирусов.
Впервые установлена первичная структура гена NSP4 15-ти российских изолятов ротавируса с доминирующими антигенными типами. Нуклеотидные последовательности NSP4 данных изолятов ротавируса депонирваны в GenBank под номерами DQ270104 - DQ270118, что расширяет международную базу данных последовательностей генома ротавирусов.
Определены генотипы энтеротоксина NSP4 новых российских изолятов ротавирусов группы А: NSP4-А (Е2), -В(Е1) и С (Е3). Показано доминирование изолятов ротавируса, характеризующихся генотипом NSP4-В (Е1).
Впервые установлены филогенетические связи по гену NSP4 ротавируса G1P[8] типа со штаммами, выделенными на территории Скандинавских стран, а G3P[8] и G3P[9] типов со штаммами из стран Юго-Восточной Азии. Установлено, что ротавирусы генотипов G1, G3, G4 и P[8] типа по гену NSP4 фиогенетически родственны ротавирусам свиней;
G3P[6], G3P[9] и G2P[4] типов ротавирусам крупного рогатого скота, G3P[9] типа ротавирусам кошек.
Эти результаты дополняют представления о распространении штаммов ротавируса на разных территориях земного шара и свидетельствуют об эволюционных связях между ротавирусами животных и человека, подчеркивая необходимость их одновременного мониторинга.
На основе вектора pET22b+ создано три авторских генетических конструкции (pET22b-G3P[9]-NSP4-C, pET22b-G1P[8]-2-NSP4-B, pET22b-G9P[6]-NSP4-A), экспрессирующие в клетках Escherichia coli энтеротоксин NSP4 разных генотипов.
Впервые проведен сравнительный анализ мембранодестабилизирующей активности NSP4 штаммов ротавирусов разных G[P]-типов, выделенных от детей с гастроэнтеритом (G1P[8], G3P[9]) и бессимптомной формой инфекции (G9P[6]).
Впервые в сравнительном плане охарактеризованы аминокислотные последовательности NSP4 российских изолятов ротавирусов с разной выраженностью клинических проявлений инфекции. Полученные в ходе настоящего исследования результаты имеют значение для разработки альтернативной ротавирусной вакцины.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработана методика синтеза и амплификации кДНК полноразмерной последовательности и открытой рамки считывания гена энтеротоксина NSP4, позволившая охарактеризовать NSP4-генотипы ротавирусов группы А, актуальных для территорий России. Спектр NSP4 генотипов ротавируса представлен тремя генотипами – А (Е2), В (Е1) и С (Е3).
2. Ротавирус G1P[8] типа, циркулирующий на территории Н.Новгорода, проявляет филогенетическое родство по гену NSP4 со штаммами из Скандинавских стран, а G3P[8,9] типа со штаммами из стран Юго-Восточной Азии. Ротавирусы G1, G3, G4 и P[8] типов генетически родственны ротавирусам свиней, G3P[6,9] и G2P[4] типов ротавирусам крупного рогатого скота, G3P[9] типа ротавирусам кошек.
3. Создано три генетические конструкции (pET22b-G3P[9]-NSP4-C, pET22b G1P[8]-2-NSP4-B, pET22b-G9P[6]-NSP4-A), экспрессирующие в клетках E.coli энтеротоксин NSP4 генотипов А, В и С. Экспрессия сопровождается торможением экспоненциального роста культуры что свидетельствует о сходных E.coli, мембранодестабилизирующих свойствах ротавирусов разных NSP4-генотипов Ротавирусы, обнаруженные у детей с диареей и бессимптомной формой 4.
инфекции, не имеют значимых аминокислотных замен в важных для проявления энтеротоксических свойств доменах NSP4.
Апробация работы:
Основные положения диссертации доложены и обсуждены:
• на VII Нижегородской сессии молодых ученых (г. Н. Новгород, 2009 г.);
на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и • микробиологии имени академика И.Н. Блохиной и проблемных научно-практических семинарах института.
• на юбилейной Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения», посвященной 90-летию ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД (г. Н. Новгород, 2009 г.);
диссертация апробирована на заседания кафедры молекулярной биологии и • иммунологии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского (02 февраля 2010 г.).
Объем и структура диссертации:
Материалы диссертации изложены на 116 страницах машинописного текста.
Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 152 источников литературы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 10 таблицами.
По результатам диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Работа поддержана грантом Н204 в рамках программы «Развитие научного потенциала высшей школы», 2005 г.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования В работе использовали:
ротавируссодержащие образцы фекалий детей, госпитализированных в • инфекционные стационары г. Нижнего Новгорода в период 1992-2004 гг. и Городской клинический перинатальный центр г. Омска в период 2002-04 гг.;
штамм ротавируса SA11. Всего исследовано 30 проб.
• нуклеотидные последовательности геномных кДНК ротавирусов, собранных в базе данных Всего GenBank /EMBL/ DDBJ [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/].
использовано 75 последовательностей.
бактериальные штаммы: E.coli Тор 10 F';
E.coli BL21gold (DE3);
E.coli BL21gold • (DE3) codon plus (любезно предоставлены Институтом Вирусологии им. Д.И.
Ивановского, Москва).
• питательные среды: LB, 2xYT, SOC • компьютерные программы «Oligo 4,0», 1989-91 (США);
«GeneDoc, версия 2.5.000», 1997 (США), «MegAline», «ClustalW» » из набора программ MEGA v.3.1, BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/].
Экстракцию РНК ротавируса и её электрофоретипирование методом электрофореза в ПААГ осуществляли, как описано [Новикова Н.А., Епифанова Н.В., 1994]. РНК ротавирусов для постановки ОТ-ПЦР выделяли методом высокосолевой очистки (патент №2313792) и с использованием комплекта реагентов «РИБО-сорб» производства ФГУН ЦНИИЭ (Москва), согласно инструкции по применению.
Олигонуклеотидные праймеры для постановки ОТ-ПЦР синтезировали в фирме «Литех», Москва. Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле в трис-боратной буферной системе.
Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли по алгоритму Neighbor-joning в двухпараметрической модели Kimura-2 в программе MEGA v.3.1. Достоверность топологии филограмм оценивали методом повторных выборок на основании анализа 1000 псевдореплик [Kumar S. et al., 2004].
Экстракцию ДНК из 1%-го агарозного геля проводили с использованием набора реагентов «РИБО-сорб» производства ФГУН ЦНИИЭ (Москва), согласно инструкции производителя.
Определение нуклеотидной последовательности гена NSP4 осуществляли с использованием праймеров: NSP4R и NSP4F, набора реагентов ABI PRISM BigDye Terminator v.3.1, в автоматическом режиме на приборе ABI Prism Avant 3130, согласно рекомендациям производителя. Работа проведена на базе Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН в совместной работе с к.б.н. Д.В.
Новиковым. и д.б.н. Г.А. Прилиповым.
Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli осуществляли с использованием набора реагентов «Miniprep Kit» (США, 1997) согласно инструкции производителя.
Компетентные клетки E.coli трансформировали в электропораторе BioRad (США) согласно инструкции производителя. Экспрессию белка индуцировали 1 мМ ИПТГ.
Детекцию NSP4, экстрагированного из культуры клеток E.coli, проводили методом электрофореза в ПААГ с использованием буферных растворов Лэммли [Laemmli U.K., 1970].
Результаты и их обсуждения Оптимизация методики ОТ-ПЦР для амплификации полноразмерной последовательности гена NSP4 ротавируса группы А. Последовательность NSP кодируется 10-м геномным сегментом днРНК, имеющим у ротавирусов группы А размер 754 н.о. Синтез кДНК гена NSP4 и определение ее нуклеотидной последовательности обеспечивают базис для изучения вариабельности гена NSP4 и энтеротоксических свойств белковой молекулы в целом и ее отдельных доменов. К началу наших исследований в научной зарубежной литературе были представлены праймеры для амплификации полноразмерной последовательности гена NSP4, подобранные более 10 лет назад [Zhang M, Zeng C.Q.-Y., Dong Y., 1998]. Расширение информации о последовательностях гена NSP4, и вариабельность генома ротавирусов послужили основанием для модификации праймеров с целью их адаптации к современным штаммам ротавирусов.
На первом этапе работы с использованием программы Mega 3.1. проведен сравнительный анализ 27 полных нуклеотидных последовательностей гена NSP разных генотипов, представленных в GenBank/ЕMBL/DDBJ к настоящему времени, по результатам которого сконструированы собственные версии праймеров для амплификации полноразмерной последовательности гена NSP4: NSP4-F 1-[5 н.о., ggCTTTTAAAAgTTCTgT-3]-18 NSP4-R 729-[5 ggTCACRYTAAgACCRTTCCTTC-3]-752 н.о. Регион 5-конца, соответствующий области прямого праймера, предложенного Zhang M. с соавт., не имеет нуклеотидных замен, поэтому мы сократили его последовательность до 18 н.о. Регион 3-конца, соответствующий обратному праймеру, предложенному Zhang M. с соавт., характеризуется вариабельностью нуклеотидов. С целью повышения специфичности обратного праймера мы модифицировали его путем введения вырожденных оснований (R – A/G;
Y – C или T/U) и увеличением последовательности до 23 н.о.
Модифицированные праймеры фланкируют участок гена NSP4 размером 752 н.о., что соответствует полноразмерной кДНК 10-го сегмента генома ротавирусов.
Для эффективной амплификации кДНК гена NSP4 были оптимизированы условия постановки ПЦР с учетом температуры плавления праймеров, установленной при помощи компьютерной программы «OLIGO 4.0» (США). На основе проведенного анализа температура отжига праймеров составила 55°С.
Теоретически подобранные условия проведения ПЦР и специфичность модифицированных праймеров были экспериментально подтверждены на пробах, содержащих РНК ротавируса разных G[P] типов. ПЦР осуществляли в режиме: 94 оС 3 мин;
45(94°С-30 с, 55°С-30 с, 72°С-1 мин);
72оС – 5 мин. С использованием оптимизированной методики амплификации была синтезирована кДНК полноразмерной последовательности 10-го сегмента генома 15 природных изолятов ротавируса человека с доминирующими и необычными электрофоретипами РНК, относящихся к различным G[P] типам и SG подгруппам. Электрофоретипы РНК и субгрупповая принадлежность изолятов ротавируса были определены в совместной работе с сотрудниками лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной. При проведении многолетних наблюдений в период 1997-05 гг. на территории Нижегородской области была установлена циркуляция ротавирусов семи G[P] типов: G1P[8], G1P[6], G2P[4], G3P[8], G3P[6], G3P[9] и G4P[8] с доминированием типа G1P[8]. В сезон 2004-05 гг.
зафиксировано перераспределение генотипов ротавируса, что отразилось в доминировании типа G2P[4].
Рис. 1. Схема электрофоретипов РНК ротавирусов группы А, использованных в настоящей работе Сверху цифрами обозначены номера ЭФ-типов РНК;
внизу указаны G[P]-типы ротавирусов.
SA11 – обозначение референтного штамма ротавируса обезьян Тип G4P[8] являлся минорным на протяжении всего периода наблюдения [Новикова Н.А. и др., 2007;
Федорова О.Ф., 2006]. Спектр G[P]-типов ротавирусов, исследуемых в настоящей работе, определен на основании предыдущих наблюдений и охватывает все перечисленные G[P]-типы, распространенные на территории Нижегородской области. Профили миграции сегментов РНК изучаемых вариантов ротавируса показаны на рисунке 1.
Разработанная методика явилась базой для изучения первичной структуры гена NSP4 у различных штаммов ротавируса человека, актуальных для территории России.
Синтезированные с применением данной методики полноразмерные последовательности 10-го сегмента генома ротавирусов также использовали в качестве матриц для амплификации открытой рамки считывания гена NSP4 с целью клонирования ее в экспрессирующей бактериальной векторной системе.
Изучение вариабельности гена NSP4 ротавируса группы А разных G[P] типов. На следующем этапе работы определена первичная структура 10-го сегмента генома исследуемых изолятов ротавируса.
Установленные последовательности гена депонированы в NSP GenBank/ЕMBL/DDBJ по номерами DQ270104 – DQ270118. Известно, что 10-й сегмент генома ротавирусов характеризуется высоким уровнем вариабельности, что отражает существование различных NSP4 генотипов. По последним данным установлено существование 11-ти NSP4-генотипов (Е-enterotoxin 1-11).
Нуклеотидные последовательности гена NSP4 15-ти российских изолятов ротавируса, установленные в настоящей работе, использовали для множественного выравнивания и филогенетического анализа с соответствующими последовательностями типовых штаммов различных NSP4-генотипов и штаммов ротавирусов человека известных G[P] типов, выделенных на территориях разных стран, и представленных в GenBank/ЕMBL/DDBJ. Гомологию последовательностей определяли с помощью программы BLAST. На рисунке 2 видно, что при построении филогенетического дерева нижегородские штаммы РВ образовали три кластера, соответствующие NSP4-A (Е2), В (Е1) и С (Е3) генотипам. Различия в нуклеотидных последовательностях РВ разных генотипов достигали 25% и не превышали 7,9% для последовательностей одного генотипа в пределах субкластера и 13,7% - в пределах кластера.
Большинство геновариантов ротавируса, обладающих «длинным» ЭФ-типом РНК и SGII специфичностью, группировались с референтным штаммом Wa (AF200224), имеющим NSP4-B генотип. Данный генотип установлен у штаммов с доминирующими антигенными типами и электрофоретипами РНК в 73,3% и представлен в основном типом G1P[8], генотип G4 являлся минорным, что соответствовало спектру распределения геновариантов ротавируса на территории Нижегородской области в период 1997-2004 г [Новикова Н.А. и др., 2007].
Кластер Wa-подобных штаммов состоит из 3-х субкластеров (I, II и III), различия в нуклеотидных последовательностях которых по отношению к штамму Wa достигали 2,6%, 6,2% и 7,7%. Генетические варианты ротавируса серотипа G1 и субгенотипов и входящие в данный кластер, образовали P[8]-1 P[8]-2, самостоятельные группы (Iа и Iб).
61 N.N.392 G1P[6]-(86) 71 N.N.12813 G1P[8]-2-(72) Iа 86 N.N.12705 G1P[8]-2-(61) N.N.13518 G4P[8]-2-(85) N.N.83117 G1P[8]-2-(46) N.N.131 G1P[8]-1-(4) NSP4-E1(B) N.N.6932 G1P[8]-1-(4) Iб генотип N.N.6919 G1P[8]-1-(3) Wa 100 N.N.623 G3P[8]-2-(88) I 100 N.N.13286 G3P[8]-(87) N.N.12908 G4P[9]-(90) III A G4 NSP4-Е9 генотип CMP 100 N26-02P6 NSP4-Е6 генотип RV176- N.N.12871G3P[9]-(10) NSP4-Е3 (С) генотип 87 AU 40 PP-1 NSP4-Е8 генотип 100 RV52/ Е5 генотип BAP N.N.11825 G3P[6]-(19) 67 N.N.13144 G3P[9]-(68) Е3 (A) генотип N.N.12698 G2P[4]-(70) DS- EW NSP4-Е10(F) генотип NSP4-Е4(E) генотип Ch- NSP4-Е11 генотип Ty- 92 AvRV-1 NSP4-Е7 (D) генотип 0. Рис. 2. Определение генотипа NSP4 изолятов ротавирусов группы А Показаны индексы поддержки 60;
названия референтных штаммов выделены жирным шрифтом Названия референтных штаммов выделены жирным шрифтом Римскими цифрами I, II и III указаны субкластеры в кластере, сформированном ротавирусами, принадлежащих генотипу NSP4-B;
Ia –группа, образованная субгенотипом P[8]-2;
Iб – группа, образованные субгенотипом P[8]- Генетические варианты ротавируса с «коротким» и «широким» ЭФ-типами РНК (подгруппа SGI), составили единый кластер с референтным штаммом DS- (AF174305), имеющим генотип NSP4-A. Эти результаты подтверждают данные зарубежных авторов о связи NSP4-генотипа ротавируса с VP6-субгруппой, а именно, связи генотипа NSP4-A с подгруппой SGI, а генотипа NSP4-B с подгруппой SGII [Iturriza-Gomara M. et al., 2002]. Высокий уровень различий (13,7%) между нуклеотидными последовательностями гена NSP4 исследуемых изолятов ротавируса, входящих в разные субкластеры в кластере, сформированном ротавирусами генотипа NSP4-A, позволяет предположить существование новых генотипов NSP4.
Необычный вариант ротавируса N.N.12871-G3P[9]-(10)/SGI с «широким» 10-м ЭФ-типом РНК группировался с референтным штаммом Au-1 (D89873), имеющим генотип NSP4-С. Гомология нуклеотидных последовательностей составила 99,8%.
Проведен филогенетический анализ по гену NSP4, позволивший проследить родство штаммов ротавируса, циркулирующих среди населения центральной России (Н.Новгород), со штаммами, выделенными на других территориях земного шара (рис.3). Генетический вариант ротавируса G1P[8]-1-(3) типа, доминировавший на территории европейской части России в 1984-96 гг., и ассоциирующийся с тяжелой формой ротавирусного гастроэнтерита с выраженным респираторным синдромом Н.А. и др., 1992,1998,2007], оказался генетически близкородственным [Новикова штамму ротавируса G1P[8]-1, выделенному в Финляндии [Maunula L. et al., 2002].
Представляется вероятным, что российский доминирующий генетический вариант ротавируса имел общее происхождение со штаммом, G1P[8]-1-(3)/NSP4-B циркулировавшим на территории Скандинавских стран, или являлся тем же штаммом. Другие генетические варианты (4-й, 34-й ЭФ-типы РНК) ротавируса G1P[8]-1 типа циркулировали в более поздние сроки и, по всей вероятности, являются дериватами штамма G1P[8]-1-(3). В то же время генетические варианты ротавируса G1P[8]-2 (46-й, 61-й и 72-й ЭФ-типы), G4P[8]-2 (85-й ЭФ-тип), а также G1P[6] (86-й ЭФ-тип) могут иметь самостоятельное происхождение.
Варианты ротавируса генотипа NSP4-B типов G3P[8]-2 (88-й и 87-й ЭФ-типы РНК) и G4P[9]-(90), а также необычный вариант G3P[9]-(10)-NSP4-C группируются со штаммами из Тайваня и Китая. Эти данные могут свидетельствовать о заносе штаммов ротавируса на территорию России из стран Юго-Восточной Азии.
Штаммы G3P[6]-(19) и G3P[9]-(68) подгруппы SGI с ЭФ-типом РНК, характеризующимся широким разбегом 5-6 сегмента РНК в ПААГ, что характерно для ротавирусов крупного рогатого скота, составили субкластер в кластере DS- подобных штаммов. Ротавирусы G2P[4]-NSP4-A типа, выделенные на территориях различных стран и континентов, в том числе и на территории России, образовали самостоятельную группу близкородственных штаммов, что свидетельствует об устойчивости данной генетической комбинации серотипа и генотипа.
N.N.392 G1P[6]-(86) 68 N.N.12813 G1P[8]-2-(72) 93 N.N.12705 G1P[8]-2-(61) N.N.13518 G4P[8]-2-(85) N.N.83117 G1P[8]-2-(46) Fin-G4-91-Major Finland Fin-G1-97-Major Finland Wa G1P[8] NSP4-B генотип N.N.131 G1P[8]-1-(4) N.N.6932 G1P[8]-1-(34) N.N.6919 G1P[8]-1-(3) TI25 G3P[8] Taiwan TG59 G1P[8] Taiwan 100 N.N.623 G3P[8]-2-(88) N.N.13286 G3P[8]-2-(87) N.N.12908 G4P[9]-(90) 97SZ37 G9 China CMH134/04 G3P[9] Tailand N.N.12871 G3P[9]-(10) NSP4-C AU1 G3P[9] N.N.11825 G3P[6]-(19) N.N.13144 G3P[9]-(68) DS-1 G2P[4] 92H102 G2 Japan NSP4-A 100 S2 G2 Australia N.N.12698 G2P[4]-(70) 97SZ8 G2 China 1040 G2P[4] India 0. Рис. 3. Филограмма, построенная на основе выровненных нуклеотидных последовательностей гена NSP4 российских изолятов РВ-А разных G[P]-типов и NSP4-генотипов и штаммов ротавирусов человека, выделенных на территориях других стран Показаны индексы поддержки 60.
Указаны названия штаммов, их географическое происхождение, G[P]-типы, в скобках указан номер ЭФ-типа РНК. Названия референтных штаммов выделены жирным шрифтом Проведен филогенетический анализ ротавирусов человека и штаммов ротавирусов животных, представленных в базе данных GenBank. Установлено, что основная масса изучаемых вариантов ротавируса, образует самостоятельный геномный кластер «истинных» ротавирусов человека, включающий штаммы типов G1P[8]-1, G1P[8]-2, G3P[8]-2 и G4P[8]-2 (Wa-геногруппа) (рис.4). Эта группа штаммов РВ человека по последовательности гена NSP4 близка к ротавирусам свиней. Идентичность нуклеотидных последовательностей составила 87,7-91%.
Штаммы ротавируса человека G3P[6]/NSP4-А и G3P[9]/NSP4-А, принадлежащие геногруппе DS-1, кластеризовались со штаммами ротавируса крупного рогатого скота. Идентичность нуклеотидных последовательностей составила 90,4-90,8%. По всей вероятности данные штаммы ротавируса или их предки являются реассортантами с ротавирусами крупного рогатого скота и приобрели от них ген NSP4.
Штамм G3P[9]/NSP4-С, имеющий ЭФ-тип РНК, характерный для геногруппы Au-1, оказался в кластере, формируемом ротавирусами кошек. Уровень гомологии нуклеотидных последовательностей составил 97,5%. Данный вариант вируса может являться реассортантом между ротавирусами кошек и человека, возникшим вследствие трансмиссии генов.
N.N.392 G1P[6]-(86) 84 N.N.12813 G1P[8]-2-(72) N.N.12705 G1P[8]-2-(61) N.N.13518 G4P[8]-2-(85) N.N.83117 G1P[8]-2-(46) РВ-А N.N.131 G1P[8]-1-(4) человека N.N.6932 G1P[8]-1-(34) N.N.6919 G1P[8]-(3) N.N.12908 G4P[9]-(90) N.N.623 G3P[8]-2-(88) 100 N.N.13286 G3P[8]-2-(87) RU172 porcine A34 porcine РВ-А свиней A2 porcine 99 OSU porcine FRV384 feline РВ-А N.N.12871 G3P[9]-(10) 77 100 кошек FRV1 feline WC3 bovine CBNU-2 bovine N.N.11825 G3P[6]-(19) N.N.13144 G3P[9]-(68) РВ-А телят MF66 bovine N.N.12698 G2P[4]-(70) CP-1 bovine EC murine РВ-А мышей Ch-1 Avian РВ-А птиц 0. Рис. 4. Филограмма, построенная на основе выровненных нуклеотидных последовательностей гена NSP4 нижегородских изолятов РВ-А разных G[P]-типов и штаммов ротавирусов животных Показаны индексы поддержки 60.
Указаны названия штаммов, их видовая принадлежность, G[P]-типы, в скобках указан номер ЭФ-типа РНК Таким образом, в результате проведенной работы впервые установлена нуклеотидная последовательность гена NSP4 российских (Нижний Новгород) изолятов ротавирусов группы А доминирующих антигенных G[P] типов и показана вариабельность по гену NSP4. На основе проведенного анализа подобраны варианты ротавируса для изучения мембранодестабилизирующих свойств NSP4 разных генотипов. Особый интерес представляли изоляты ротавируса, выделенные от детей с симптоматической и бессимптомной формой инфекции.
Изучение энтеротоксических свойств NSP4 ротавирусов группы А разных генотипов. Выраженность диареи при инфицировании различными геновариантами ротавирусов, возможно, объясняется молекулярно-биологическими свойствами энтеротоксина NSP4. Экспрессия NSP4 в бактериальной векторной системе может служить моделью для оценки токсических свойств на основе способности NSP перфорировать мембраны бактериальных клеток. Возможность применения в качестве модели для изучения токсических свойств NSP4 цитоплазматической мембраны E.coli объясняется тем, что мембраны кишечной палочки по липидному составу идентичны мембранам эндоплазматического ретикулума [Browne E.P., 2000].
Схема эксперимента по изучению мембранодестабилизирующей активности NSP4 разных генотипов, разработанная в ходе данного исследования, включала:
синтез кДНК открытой рамки считывания гена NSP4, создание экспрессирующей NSP4 генетической конструкции на основе вектора pET22b, трансформацию компетентных клеток рекомбинантными плазмидами, несущими вставку последовательности гена NSP4, и индуцируемую экспрессию энтеротоксина в культуре клеток E.coli. (рис. 5).
Для получения экспрессии NSP4 в клетках E.coli необходимо было получить кДНК открытой рамки считывания (ОРС) гена энтеротоксина. С этой целью на основе сравнительного анализа 42-х нуклеотидных последовательностей NSP разных генотипов, были сконструированы собственные версии праймеров для амплификации ОРС гена NSP4, удовлетворяющие условиям клонирования: NSP4 F(ОРС) 33-[5–TGCggACATATggATAAgCTTgCCgACCTC–3]-64 н.о., NSP4-R(ОРС) 549-[5–TCAACCTCgAgCATKgATgCAgTCACTTC–3]-577 н.о.
Так как целью работы являлось получение векторной системы для экспрессии ОРС, при конструировании праймеров в их последовательности были внесены сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции NdeI (cat atg внесен в прямой праймер), XhoI (ctc gag внесен в обратный праймер), что необходимо для корректной ориентации вставки последовательности ОРС NSP4 при постановке ее под экспрессию.
Рис. 5. Схема проведения эксперимента по экспрессии NSP4 в E.coli Регион 5-концевого участка последовательности, соответствующего области прямого праймера, представляет собой консервативный участок, что и определило выбор праймера. Нуклеотидные замены в регионе участка 3-концевого последовательности, соответствующего области обратного праймера, определили необходимость введения вырожденных оснований (К – G/T). Сконструированные нами праймеры, NSP4-F (ОРС) и NSP4-R (ОРС), фланкируют фрагмент гена NSP размером 544 н.о., расположенный с 33 по 577 н.о. Температура отжига праймеров, выбранная с использованием программы «OLIGO 4.0» (США), составила 55°С.
Теоретически подобранные условия проведения ПЦР и специфичность сконструированных праймеров экспериментально апробованы в реакции, где в качестве матрицы для амплификации открытой рамки считывания гена NSP4 служила полноразмерная кДНК энтеротоксина ротавирусов человека. ПЦР осуществляли в режиме: 94 оС-3 мин;
(94 оС-10 с, 55 оС-10 с, 72 оС-10 с)42;
72 оС - 5 мин.
С использованием разработанной нами методики синтезированы последовательности ОРС гена NSP4 ротавируса геновариантов G1P[8]-2-NSP4-B, G3P[9]-NSP4-C, вызывающих симптоматическую инфекции, и G9P[6]-NSP4-A типа, выделенного от новорожденного с бессимптомной формой инфекции. Для экспрессии ОРС гена NSP4 перечисленных изолятов ротавируса в клетках E.coli штамма BL21(DE3) codon plus выбран вектор pET22b+, обладающий сильным промотором гена 10 фага Т7, подходящей для вставки емкостью и простотой селекции. В результате генетических манипуляций получена кольцевая форма рекомбинантной ДНК, содержащая вставку последовательности ОРС гена NSP4, и пригодная для трансформации: pET22b-NSP4-G1P[8]-2, pET22b-NSP4-G3P[9], pET22b-NSP4-G9P[6] (рис.6).
Рис. 6. Схема генетической конструкции pET22b-NSP4(ОРС) Компетентные клетки E.coli BL21(DE3) codon plus трансформировали полученными рекомбинантными плазмидами и индуцировали ИПТГ. В качестве контроля использовали клетки, трансформированные плазмидой pET22b без вставки гена NSP4.
Контроль экспрессии проведен методом электрофореза в NSP полиакриламидном геле, где показано присутствие искомого белка в бактериальной культуре после индукции экспрессии (рис.7).
1 2 3 4 5 6 7 8 20, 14, Рис. 7. Электрофореграмма белков, полученных из клеточного дебриса культуры E.coli, индуцированной для экспрессии NSP 1, 7 – NSP4, экспрессированный в составе рекомбинантной плазмиды pET22b-G1P[8]-2-NSP4-B;
2, 8 – NSP4, экспрессированный в составе рекомбинантной плазмиды pET22b-G3P[9]-NSP4-C;
3, 9 – NSP4, экспрессированный в составе рекомбинантной плазмиды pET22b-G9P[6]-NSP4-A;
1,2,3 – NSP4, экстрагированный из жидкой культуры E.coli;
7,8,9 – NSP4, экстрагированный из клеточного дебриса E.coli;
5 – протеинкиназа К – 14,3 кДт;
6 – лизоцим – 28 кДт После индукции экспрессии NSP4 была проведена серия замеров оптической плотности трансформированных бактериальных культур, результаты которой показали статистически значимое по сравнению с контролем (р 0.05) нарушение способности E.coli к наращиванию биомассы (рис. 8).
геноварианта ротавируса типа, близкородственного NSP4-С G3P[9] ротавирусам кошек, при экспрессии в модельной системе E.coli вызывал угнетение роста бактериальной культуры. Приобретение генов ротавируса кошек не снизило вирулентность исследуемого изолята для человека.
эпидемически значимого варианта ротавируса типа, NSP4-B G1P[8]- вызывающего гастроэнтерит, характеризующийся интенсивным диарейным синдромом и высокой частотой госпитализаций, проявил одинаковую способность нарушать рост бактериальной культуры наряду с NSP4 генотипов А и С.
NSP4-A ротавируса генотипа G9P[6], выделенного от новорожденного с бессимптомной формой инфекции, при экспрессии в клетках E.coli вызывал угнетение роста бактериальной культуры, подобно ротавирусам генотипов G1P[8]-2 NSP4-B и G3P[9]-NSP4-C ротавирусов, выделенных от детей с гастроэнтеритом.
Рис. 8. Изменение оптической плотности культур-продуцентов E.coli после индукции экспрессии NSP Таким образом, установлено, что NSP4 разных генотипов ротавирусов, обнаруженных у детей с симптоматической и бессимптомной формой инфекции, при экспрессии в клетках характеризуются эффектом торможения роста E.coli бактериальной культуры, что свидетельствует об их сходных мембранодестабилизирующих свойствах. Эти результаты могут свидетельствовать, что бессимптомное течение ротавирусной инфекции, вероятно, обусловлено не молекулярно-биологическими свойствами вирусного энтеротоксина NSP4, а иными факторами вирусной природы, либо факторами организма хозяина.
С целью подтверждения отсутствия связи молекулярно-биологических свойств NSP4 разных генотипов с выраженностью диарейного синдрома у инфицированных ротавирусами детей проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей исследуемых изолятов ротавируса в регионах NSP трансмембранного и цитоплазматического доменов белковой молекулы (табл. 1).
Таблица Сравнение аминокислотных последовательностей NSP4 разных генотипов в регионе цитоплазматического домена белковой молекулы 140 150 160 обобщенная HDNLIVRPVD VIDMSKEFNQ KNIKTLDEWE SGKNPYEPKE VTASM последовательность NSP4 G[P]-тип генотип _T G1P[8]-1 B S_ _ G1P[8]-2 B K_ S_ _ G3P[8]-2 B Y_ T_T_ N_ _ _ _ _ _ _ I _ _ G4P[8]-2 B _AK_ S_ _ G4P[9] B K_A_ S_ _ G1P[6]-2 B K_ S_ _ G2P[4] A Y_KST_ E_TI VRE_ _A_ G3P[6] A K_M_T_ D_TI _ _ V _ _ _E _ _ _ _T _A_ G9P[6] A K_M_T_ E_TI _ _ V _ _ _E _ _ _ _A_ G3P[9] C MIK_ K _ _ _ T Q _I _ _ R Q F _ _ _N _ _ T E_ E _ _ _ _ _ _ _ L Обобщенная последовательность, составлена из наиболее часто встречающихся аминокислотных оснований Известно, что регион, соответствующий цитоплазматической части белковой молекулы обладает выраженной функциональной активностью, NSP4, характеризуется высокой вариабельностью и отвечает за проявление энтеротоксических свойств NSP4, а аминокислотные замены в нем могут изменять (снижать) способность энтеротоксина индуцировать диарею и обуславливать различные клинические проявления ротавирусной инфекции [Huang H. et al., 2004;
Обнаружено, что и в цитоплазматической части, и в Deepa R.,2007].
трансмембранном регионе молекулы NSP4 имеются специфичные, свойственные определенному NSP4-генотипу, а также уникальные замены аминокислот. Однако обнаруженные замены не влияли на мембранодестабилизирующую активность энтеротоксина.
Суммируя все вышесказанное, можно заключить, что разработанная нами методика ПЦР с использованием сконструированных праймеров явилась методической базой для изучения первичной структуры гена NSP4 у различных штаммов ротавируса человека, актуальных для территории России. С использованием оптимизированной методики синтезированы кДНК полноразмерного гена NSP4 и его открытой рамки считывания ротавирусов группы А человека. Впервые показана принадлежность российских изолятов ротавирусов к трем из 11-ти известных NSP4 генотипов – А (Е2), В (Е1), С (Е3), c доминированием штаммов, относящихся к генотипу NSP4-В. Проведенный на основе последовательности гена NSP сравнительный анализ, выявил филогенетическое родство ротавирусов типа G1P[8] со штаммами из Скандинавских стран, а G3 cеротипа – со штаммами из стран Юго Восточной Азии. Установлено, что изоляты ротавируса G1-, G3-, G4- и P[8] типов являются близкородственными ротавирусам свиней, G3P[6]-, G3P[9]- и G2P[4] типов – ротавирусам крупного рогатого скота и G3P[9] типа – ротавирусам кошек. Эти данные свидетельствуют об эволюционных связях между ротавирусами человека и животных. Созданы генетические конструкции на основе вектора pET22b, содержащие открытую рамку считывания гена NSP4 разных генотипов. Получена экспрессия NSP4 в составе рекомбинантных плазмид в бактериальной культуре E.coli шт.BL21(DE3)codon plus. Присутствие NSP4 в культуре E.coli после индукции экспрессии подтверждено методом элетрофореза в полиакриламидном геле.
Установлено, что экспрессия NSP4 исследуемых изолятов ротавируса, выделенных от детей с симптоматической и бессимптомной формой инфекции, характеризовалась эффектом торможения роста бактериальной культуры, что свидетельствует о сходных мембранодестабилизирующих свойствах разных генотипов ротавируса.
NSP Обнаруженные замены аминокислот в трансмембранном и цитоплазматическом доменах белковой молекулы NSP4 исследуемых изолятов ротавируса были генотипспецифическими и не влияли на способность энтеротоксина перфорировать мембраны клеток E.coli.
ВЫВОДЫ 1. Разработаны оригинальные версии праймеров для универсальной амплификации кДНК полноразмерного гена энтеротоксина NSP4 ротавирусов группы А и его открытой рамки считывания.
2. Впервые установлены NSP4-А (Е2), -В (Е1) и С (Е3) генотипы российских изолятов ротавирусов группы А разных G[P]-типов. Изоляты ротавируса, характеризующиеся генотипом NSP4-В (Е1), доминировали.
3. Установлены филогенетические связи по гену NSP4 российских изолятов ротавируса G1P[8] типа со штаммами ротавируса из Скандинавских стран, а G cеротипа со штаммами из стран Юго-Восточной Азии.
4. Впервые установлено родство по гену NSP4 российских изолятов ротавирусов G1, G3, G4 генотипов и P[8] типа с ротавирусами свиней, G3P[6], G3P[9] и G2P[4] типов с ротавирусами крупного рогатого скота и G3P[9] типа с ротавирусами кошек.
5. Созданы генетические конструкции pET22b-NSP4-G1P[8]-2, pET22b NSP4-G3P[9], pET22b-NSP4-G9P[6], экспрессирующие NSP4 в культуре E.coli, штамм BL21(DE3) codon plus. Экспрессия сопровождалась торможением экспоненциального роста культуры E.coli независимо от типа NSP4.
6. Установлено, что замены аминокислот в вариабельных регионах белковой молекулы NSP4 не влияют на способность ротавирусного энтеротоксина дестабилизировать мембраны клеток E.coli.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК:
1. Пономарева Н.В. Синтез полноразмерной кДНК гена NSP4 ротавируса группы А / Пономарева Н.В., Новиков Д.В., Савельев Р.С., Новикова Н.А. // Вестник ННГУ.
2006. № 11. С. 139-141.
2. Пономарева Н.В. Изучение связи клинических проявлений ротавирусной инфекции с аминокислотными заменами в последовательности энтеротоксина NSP4 / Пономарева Н.В., Новиков Д.В., Новикова Н.А. // Вестник военно-медицинской академии. Санкт-Петербург. 2008. № 22. C. 546-547.
3. Новикова Н.А. Анализ нуклеотидных последовательностей гена NSP ротавирусов группы А, изолированных в Нижнем Новгороде / Новикова Н.А., Пономарева Н.В., Новиков Д.В., Прилипов Г.А., Епифанова Н.В., Голицына Л.Н. // Вопросы Вирусологии. 2008. №6. C. 35-39.
II. Статьи, доклады, тезисы докладов региональных и всероссийских конференций:
1. Пономарева Н.В. Анализ последовательностей гена энтеротоксина NSP штаммов ротавируса человека / Пономарева Н.В., Новиков Д.В., Новикова Н.А. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины». СПб. 2006. С. 254-254.
2. Пономарева Н.В. Вариабельность гена энтеротоксина NSP4 ротавирусов человека // Докл. ХI нижегородской сессии молодых ученых (Естественнонаучные дисциплины). Нижний Новгород. 2006. С. 196-197.
3. Пономарева Н.В. Генетические взаимосвязи ротавирусов человека и животных // Материалы Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (X Всероссийская конференция «Человек и его здоровье»). СПб. 2007. С. 355-356.
4. Пономарева Н.В. Генетические взаимоотношения между ротавирусами человека, выделенными в России и других регионах мира // Докл. ХII нижегородской сессии молодых ученых (Естественнонаучные дисциплины). Нижний Новгород. 2007.
С. 24-25.
5. Пономарева Н.В. Энтеротоксин и его роль в патогенезе ротавирусной инфекции / Пономарева Н.В., Новикова Н.А. // Материалы юбилейной Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения». Нижний Новгород. 2009. С. 158-162.