Фотоморфогенез artemisia annua l. in vitro.
На правах рукописи
Песяк Сергей Владимирович ФОТОМОРФОГЕНЕЗ ARTEMISIA ANNUA L. IN VITRO.
03.01.05 — физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Красноярск – 2012 1
Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Томский государственный университет» Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Карначук Раиса Александровна
Официальные оппоненты: Тихомиров Александр Аполлинарьевич, доктор биологических наук, профессор, Институт биофизики СО РАН (г. Красноярск), лаборатория управления биосинтезом фототрофов, заведующий;
Войцеховская Светлана Анатольевна, кандидат биологических наук, доцент, Томский государственный педагогический университет, кафедра биологии растений и биохимии
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный университет»
Защита состоится «25» мая 2012 г. в 12-30 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.099.15 при Сибирском федеральном университете по адресу: 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 79, ауд. Р8-06;
тел./факс: (391) 244-87-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского федерального университета Автореферат разослан "_" _ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н., доцент Гаевский Николай Александрович 2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Роль лекарственных растений, как источников веществ медицинского назначения постоянно возрастает. Более 25% всех препаратов, в настоящее время, содержат соединения растительного происхождения. Однако использование в медицинской промышленности природных источников лекарственного сырья приводит к сокращению их ареала в результате неограниченного сбора или воздействия антропогенных факторов. Поэтому альтернативным источником вторичных метаболитов является культура клеток и тканей лекарственных растений, используемая в фармацевтической промышленности. Этот метод имеет ряд преимуществ перед сбором лекарственного сырья в природе и, в определенной мере, выращивания интактных растений на полях. Технология in vitro позволяет регулировать рост растительных клеток и накопление ими биологически активных веществ (БАВ), оптимизируя питательную среду путем добавления в нее гормонов, элиситоров и предшественников синтеза. Регуляторами роста и морфогенеза также могут служить факторы внешней среды, особое место среди которых занимает свет, который не только выступает как источник энергии для фотосинтеза, но также через систему рецепторов различных участков спектра может воздействовать на процессы роста клеточных культуры накопления ими вторичных метаболитов (Воскресенская, 1957;
Шульгин, 1964;
Карначук и др., 1987;
Тихомиров, 1993;
Sakamoto et. al., 1994;
Kurata et. al., 1998;
Ouyang et. al., 2003;
Seo et. al., 2004;
Головацкая, 2007;
Карначук и др. 2008).
К перспективным растениям для введения в культуру in vitro относится полынь однолетняя – Artemisia annua L, (семейство сложноцветные Asteraceae) которая продуцирует ценные сесквитерпеновые лактоны (Schou, 2007) и флавоноиды. Показано их противомалярийное, противопаразитарное, противоопухолевое и противовирусное действие. (Wright et. al., 2002). Введение Artemisia annua L. в асептическую культуру in vitro открывает перспективу круглогодичного получения растительного материала в качестве возможного источника сесквитерпеновых лактонов. Однако на сегодняшний день немногое известно о путях действия селективного света на рост клеток культуры in vitro и накопление ею биологически-активных веществ..
Цель диссертационной работы заключалась в получении каллусной, суспензионной культуры клеток полыни однолетней (Artemisia annua L.), а также культуры hairy-root (бородатые корни), и исследование регуляторной роли селективного света в фотоморфогенезе этих культур in vitro.
Задачи исследования:
1. Получить каллусную, суспензионную культуры Artemisia annua L. и культуру hairy-root, определить оптимальные условия их роста. Изучить действие различных концентраций ростовых, сигнальных веществ и элиситоров на рост и морфологические характеристики клеток каллусной и суспензионной культур.
2. Изучить действие селективного света на рост клеток каллусной и суспензионной культуры Artemisia annua L.
3. Исследовать влияние условий культивирования на содержание 3 пигментов хлорофиллов А, В и каротиноидов в клетках культуры.
4. Установить характер накопления флавоноидов в клеточных культурах Artemisia annua L. и зависимость этих процессов от действия селективного света.
Научная новизна: впервые изучено действие различных концентраций фитогормонов на морфологические параметры клеток каллусной и суспензионной культур Artemisia annua L. Показано, что гомобрассинолид в концентрации 5-10 мкг/л и сахароза в концентрации 15 г/л стимулировали рост каллусной культуры. Впервые изучено регуляторное действие селективного света на рост и морфогенез клеточных культур Artemisia annua L. Показано, что синий свет (450 нм) с экспозицией 16 часов стимулировал рост каллусной культуры Artemisia annua L, уменьшая размер всех типов клеток, что может свидетельствовать о специфическом действии этого участка спектра на процессы клеточного деления, в то время как зеленый свет (550 нм) равной интенсивности и экспозиции подавлял рост каллусной культуры, с одновременным увеличением объема клеток.
Практическая значимость. Полученные данные по светорегуляторной зависимости морфогенеза клеточных культур Artemisia annua L. могут быть использованы в дальнейшем для интенсификации роста культур in vitro не только этого растения, но и других ценных видов, а также для интенсификации образования вторичных метаболитов, в том числе флавоноидов. Культуры и методики, полученные и разработанные в ходе выполнения этой работы, используются при проведении большого практикума по биотехнологии растений, в лекционных курсах «Клеточная культура растений» и «Физиология растений» для биологов, агрономов и специалистов по защите растений в Томском государственном университете. Получен патент на состав оптимизированной питательной среды для культивирования каллусной культуры Artemisia annua L. Подана заявка на патент по действию селективного света на рост каллусной культуры Centaurea scabiosa L., в материалах которого использованы методы, выработанные в процессе выполнения диссертационной работы.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю, д.б.н., профессору Карначук Р.А. за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы, д.б.н., профессору Головацкой И.Ф. за помощь в измерении параметров источников света, лаборантам Медведевой Ю.В., Большаковой М.А. и к.б.н. Дорофееву В.Ю. за помощь в проведении лабораторных исследований. Также автор искренне признателен к.б.н., доценту Гвоздевой Е.С., к.б.н., старшему преподавателю Ефимовой М.В., д.б.н., профессору Карначук О.В. и д.б.н., профессору Астафуровой Т.П. за помощь в представлении и защите кандидатской диссертации.
4 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Особенности культивирования клеток лекарственных растений in vitro 1.1 Клеточные культуры растений как источник биологически активных веществ Анализируются работы, посвященные введению в клеточную культуру лекарственных растений различных родов и семейств, в том числе и Artemisia annua L (Бутенко, 1959, 1964, 1999;
Загоскина и др., 1979;
Кунах, 2001;
Чайко, 1999;
Luczkiewicz, 2003, Smetanska, 2009;
Yamada, 1967) 1.2 Вторичные метаболиты Artemisia annua L. и их фармакологическое действие.
На основе литературных данных показывается значимость полыни однолетней, как единственного доступного источника сесквитерпеновых лактонов, обладающих противомалярийными, противопаразитарными, противоопухолевыми и противовирусными свойствами. Показано, что флавоноиды интактных растений полыни однолетней также могут проявлять данные свойства в основном в синергизме с сесквитерпенами (Bhakuni et. al., 2001;
Ferreira et. al., 1996, 2005;
Lawerence et. al., 1993;
Tu et. al., 1981;
Wright, 2002;
).
1.3 Морфологические изменения клеток в процессе культивирования В процессе каллусогенеза и дальнейшего роста и развития клетки культур претерпевают значительные морфологические изменения, что является отражением их генетической нестабильности. Однако, при переходе к выращиванию в условиях in vitro многие свойства, присущие нормальным клеткам, сохраняются, в том числе и возможность синтеза вторичных метаболитов (Бутенко, 1959, 1964, 1999;
Вардапетян и др., 2000;
Загоскина и др., 1979;
Карначук и др., 1998, 1999, 2001;
Opatna et. al., 1997;
Yukihiro et. al., 1991).
2. Фоторегуляция роста и морфогенеза клеточных культур лекарственных растений.
2.1 Фотоморфогенез интактных растений Спектральный состав света играет большую роль в жизни растений.
Механизм действия светового сигнала на растение включает в себя рецепцию его специализированными пигментами, передачу сигнала и ответ как на уровне отдельных клеток, так и целого растения (Головацкая и др., 2007, 2008;
Карначук и др., 2008;
Клешнин, 1959;
Тихомиров и др., 1991, 2000;
Cashmore, 2004;
Kim et. al., 2007;
Lуpez-Juez et. al., 2008;
Walters, 2005).
5 2.2 Действие селективного света на ростовые, биохимические параметры и морфогенез клеточных культур.
Селективный свет также может регулировать морфологические и биохимические параметры клеточных культур растений. Красный свет ускорял рост hairy-root культуры Artemisia annua L. и увеличивал накопление в ней артемизинина. Однако, на каллусных и суспензионных культурах этого вида действие селективного света не изучено (Евстигнеев, 1975;
Карпилов и др., 1977;
Протасова и др., 1987;
Смолов и др., 1980;
Curtin et. al. 1993;
Liu et. al., 2002;
Noe et. al., 1998;
Qi et. al, 2008;
Wang et. al., 2001).
3. Материалы и методы 3.1 Ботаническая характеристика Artemisia annua L.
Artemisia annua L. или полынь однолетняя происходит из средних регионов Китая, где она является частью степной растительности на высоте 1000-1500 метров над уровнем моря. Из Китая она распространилась в южной Сибири, Вьетнаме и Северной Индии. За пределами Азии, это растение было интродуцировано в дикой природе в различных странах Европы (Венгрия, Болгария, Румыния, Франция), Северной Америки (США) и Южной Америки (Аргентина). Встречается в Западной (Алтай, Барнаул), Средней (Красноярский край: Хакасия, Тува) и Восточной Сибири (Юг Иркутской области).
3.2. Получение клеточных культур Artemisia annua L.
Культура клеток полыни однолетней (Artemisia annua L.) была получена при использовании в качестве экспланта молодых листьев интактных растений, выращенных in vitro. Каллусогенез проводился на среде Мурасиге-Скуга с добавлением фитогормонов 0,2 мг/л 2,4-Д и 0,2 мг/л 6-БАП. Был установлен светозависимый характер роста клеточных культур Artemisia annua L.
Культивирование каллусной культуры проводили на белом свету интенсивностью 4000 люкс при +25±1 °С и влажности 60-70 % (люминесцентные лампы Philips TL-D 36W/54-765). Для исследования действия различных концентраций фитогормонов и других ростовых веществ каллусную культуру полыни выращивали в простерилизованных емкостях на агаризованной среде MS, по 15-20 повторностей на каждый вариант эксперимента. Питательные среды стерилизовали в течение 20 минут автоклавированием при давлении 1,2 атм. Суспензионную культуру получали ресуспензированием каллусной в модифицированной среде MS, но без добавления агара. Выращивание проводили в колбах на шейкерах (Heidolph Unimax 2010, Германия;
BioSan OS-10, Латвия) при 100 об./мин. Использовали конические колбы объёмом 100 мл для индукции суспензии (1-й пассаж), затем колбы Эрленмейера объёмом 250 мл, содержащие 50 мл среды.
Культивирование проводили на рассеянном белом свету интенсивностью 6 Люкс при температуре 25±1 С и влажности 60-70 %. Для получения 100 мл клеточной суспензии брали 2-3 г свежей каллусной ткани. В экспериментах использовали не менее 10 сосудов для каждого варианта. Субкультивирование проводили через каждые 10-14 суток в зависимости от скорости роста биомассы.
Прирост сырой биомассы оценивали по общепринятому показателю ростовой индекс. Ростовые характеристики суспензии определяли, измеряя сухую и сырую биомассу, количество клеток в камере Фукса-Розенталя. Сухую массу определяли, высушивая клетки при температуре 50-55°С до воздушно сухого состояния.
3.3 Исследование действия селективного света Исследовано действие монохроматического красного (лампы Philips TL-D 36W/15 RED), синего(лампы Philips TL-D 36W/18 BLUE) и зеленого (лампы Philips TL-D 36W/17 GREEN) света на ростовые характеристики каллусной культуры полыни однолетней (Wang, 2001). Световой поток был выровнен по падающим квантам на уровне 160 мкМ м2/с (Avantes Avaspec, Голландия).
Для изучения действия селективного света каллусную культуру выращивали в стерильных пластиковых чашках Петри на модифицированных средах MS по 20 повторностей на каждый вариант эксперимента.
Интенсивность света выравнивалась с учетом поглощения пластиковой чашкой.
3.4 Морфометрические исследования клеточных культур.
Для фиксации клеточных культур использовали фиксатор Кларка или уксусный алкоголь (Барыкина, 2004). Для определения размеров клеток каллуса использовали световую микроскопию. При исследовании пользовались методом приготовления микропрепаратов, предварительно прибегая к условиям мацерации. Объём клеток вычисляли по формуле с учётом показателя формы клетки К (Цельникер и др., 1978).
3.5 Определение содержания фотосинтетических пигментов Исследовали влияние условий культивирования на накопление фотосинтетических пигментов каллусной культурой, которые определяли количественно (Lichtenthaler, 1987) на спектрофотометре (Schimadzu UV-1650, Япония). Из значений экстинций при данных длинах волн вычисляли концентрации (С) пигментов по формулам.
3.6 Определение содержания флавоноидов.
Флавоноиды – одни из самых распространенных среди всех вторичных соединений, в растениях встречаются повсеместно. В Artemisia annua L.. также были найдены представители данного класса веществ, кроме того показано, что 7 флавоноиды артемизинон и кастицин способны увеличивать эффективность лекарственного действия артемизинина и других сесквитерпеновых лактонов. В связи с этим представляло интерес установление содержания суммы флавоноидов в клеточных культурах в зависимости от условий выращивания и действия экзогенных факторов, в том числе и селективного света. Методика определения флавоноидов, основанная на поглощении комплекса флавоноидов с хлоридом алюминия (III) на 415 нм, при пересчете на стандартный раствор ГСО рутина. Сумму флавоноидов определяли фармакопейным методом для определения количественного содержания флавоноидов в траве зверобоя по статье 52 ГФ XI (Государственная Фармакопея СССР..., 1990).
3.7 Методы обработки данных Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась на персональном компьютере, с помощью программ Excel 2007, Statistica 8.0 и языка программирования R. Если выборки подчинялись закону нормального распределения, то для их сравнения использовали Т критерий Стьюдента, в противном случае использовали критерий Манна-Уитни. В работе использовался уровень значимости равный 0,05.
4. Оптимизация условий культивирования каллусной культуры и получение суспензионной культуры Artemisia annua L.
4.1 Влияние физиологически-активных веществ на рост каллусной культуры Artemisia annua L.
4.1.1 Действие экзогенных гормонов Объектом исследования служила изолированная культура каллусных клеток, полученная в 2007 году (штамм 1М) (Песяк, 2008). Для получения значительной массы быстрорастущей клеточной культуры Artemisia annua L.
необходимо оптимизировать условия ее культивирования по составу питательных сред. Также представляет несомненный интерес изучение действия физиологически-активных веществ, входящих в состав питательной среды, на ростовые параметры каллусной культуры. Одними из наиболее важных компонентов питательных сред являются фитогормоны. Для экспериментов по изучению влияния фитогормонов на ростовые параметры каллусных культур были выбраны фитогормоны -Нафтилуксусная кислота (НУК) и 6-Бензиламинопурин (БАП) в 9 различных (Blando, 2006). После анализа морфометрических показателей клеток каллуса Artemisia annua L.
отмечено, что при увеличении концентрации НУК объем клеток увеличивается.
Дальнейшие измерения ростового индекса и накопления воздушно-сухой массы каллусной культуры Artemisia annua L. показали, что оптимальной средой для культивирования каллусной культуры Artemisia annua L. является среда МС с 0,5-1 мг/л НУК 0,2 мг/л БАП (Песяк, 2007;
Пат. С1 2393217). Добавление в питательную среду гормона БАП в концентрации 0,5 мг/л приводит к снижению объемов клеток культуры. При увеличении концентрации БАП до 8 мг/л отмечено снижение доли вытянутых клеток по сравнению с округлыми (рис. 1).
а б в г Рисунок 1 - Контурный график интерполяции сплайн-функцией зависимостей ростовых и морфологических показателей каллусной культуры Artemisia annua L от концентрации в питательной среде фитогормонов НУК и БАП: а – объем клеток, 103мкм3, б – значения коэффициента К, в – ростовой индекс, г –накопление воздушно-сухой биомассы, г/л среды. По оси х – концентрация фитогормона НУК, по оси y – фитогормона БАП.
4.1.2 Действие физиологически-активных добавок Известно, что на ростовые и биохимические показатели клеточных культур растений влияет не только состав среды (Weathers et. al. 1997), но и также добавление других веществ, активно влияющих на рост культур (Mairet et. al. 2009). Для исследования действия различных компонентов питательной среды на морфофизиологические и ростовые характеристики каллусной культуры Artemisia annua L., были поставлены эксперименты по изучению влияния гидролизата казеина в концентрации 300 мг/л, мио-инозитола в концентрации 100 мг/л (Loewus et. al., 2000), фитогормона ГК3 – гиббереллиновой кислоты в концентрации 0,01 мг/л (Smith et. al., 1997) и 9 активированного угля в концентрации 1г/л (Thomas, 2008) в различных комбинациях. Во всех вариантах эксперимента среда содержала фитогормоны НУК и БАП в концентрациях 0,5 мг/л и 0,2 мг/л соответственно.
Максимальные значения объемов клеток каллуса отмечены на среде с мио инозитолом и ГК3. Минимальные – у каллусной ткани, выращенной на средах с содержанием казеина, активированного угля и мио-инозитола. Значимые отличия по коэффициенту К найдены только у каллусной культуры, выращиваемой на среде с гидролизатом казеина. Наибольшие значения ростовых показателей отмечены на средах с добавлением мио-инозитола, а также мио-инозитола и гиббереллиновой кислоты. Таким образом, установлено, что добавление мио-инозитола (100 мг/л) в питательную среду стимулировало, а добавление активированного угля и фитогормона ГК3 подавляло рост каллусной культуры Artemisia annua L. (Smith. et. al., 1997).
В дальнейшем была изучена динамика ростовых процессов каллусной культуры, выращиваемой на среде с добавлением мио-инозитола и без него.
Установлено, что ростовой индекс увеличивается к концу субкультивирования как на контрольной среде, так и на опытной, с содержанием данного вещества.
Различия не значимы.
Фитогормон гомобрассинолид (ГБ) ускоряет рост растений на первой стадии культивирования (Fujioka et. al., 1997), а также рост культуры hairy-root полыни однолетней и продукцию артемизинина (Wang. et. al., 2002). В наших экспериментах показано, что индекс роста достигал максимальных значений при выращивании на среде с 5-10 мкг/л ГБ, а минимальных значений – на среде с содержанием 0,5-1 мкг/л этого же брассиностероида. Наибольший прирост воздушно-сухой массы каллусной культуры наблюдался на среде с 5 мкг/л гомобрассинолида, в то время как увеличение или снижение концентрации данного гормона приводило к уменьшению этого параметра.
На рост клеточных культур влияет изменение состава сахаров в среде, которые могут выполнять роль сигнальных молекул (Roland et. al., 2006).
Известно стимулирующее действие глюкозы, по сравнению с сахарозой, на рост интактных растений Artemisia annua L. и содержание в них артемизинина (Wang et. al., 2003). Изучено действие уменьшенного содержания сахарозы в среде, а также глюкозы на ростовые и морфологические характеристики каллуса. Минимальные объемы клеток наблюдались в каллусной культуре на среде с глюкозой 30 г/л. На среде с глюкозой происходило увеличение коэффициента К, что свидетельствует о преобладании в культуре на этой среде вытянутых клеток. Максимальных значений индекса роста достигает каллусная культура, выращиваемая на среде со снижением в 2 раза содержанием сахарозы, в то время, как замена сахарозы на глюкозу не оказывала влияния на рост. Наибольший прирост биомассы также наблюдался на среде с содержанием сахарозы 15 г/л.
10 4.1.3 Действие элиситоров Множество вторичных метаболитов растений могут вырабатываться в больших количествах под действием внешних стимулов химической природы, называемых элиситорами (Weathers et. al., 2010). В суспензионной культуре Artemisia annua L. элиситор метилжасмонат оказывает стимулирующее на рост и накопление артемизинина (Baldi et. al., 2008). Проведены эксперименты по изучению влияния жасмоновой кислоты в концентрации 5 мг/л на рост каллусной культуры полыни однолетней. Значимых различий по параметру объемов клеток между культурами, выращенными на средах с добавлением жасмоновой кислоты и без нее, не обнаружены. Также не обнаружено значимых отличий по ростовому индексу. Однако каллусная культура, выращенная на среде с добавлением жасмоновой кислоты, накапливает в 1, раза больше воздушно-сухой массы чем культура на среде без жасмоновой кислоты.
4.2 Морфологические изменения при введении в суспензионную культуру клеток Artemisia annua L.
Переход к суспензионным культурам в первую очередь был вызван тем, что при таком режиме культивирования, как правило, происходит интенсификация ростовых, а в ряде случаев и биохимических процессов.
Суспензионная культура была получена из каллусной.
4.2.1 Оптимизация условий культивирования суспензионной культуры Artemisia annua L.
Начальным этапом работы было оптимизация условий выращивания по соотношению фитогормонов, изучение её цитологических и физиологических характеристик, в частности размера клеток, скорости роста суспензии, оптимального времени субкультивирования (Baldi A. et. al. 2008). Было установлено, что на средах с содержанием фитогормонов НУК 1 и 0,5 мг/л и БАП 0,2 мг/л суспензионная культура Artemisia annua L. показывает максимальный прирост числа клеток в течении субкультивирования.
4.2.2 Динамика роста суспензионной культуры Artemisia annua L.
Исследовались кинетические характеристики роста культуры, выращиваемой на среде с содержанием фитогормонов НУК и БАП в концентрациях 0,5 и 0,2 мг/л соответственно. На девятые сутки субкультивирования суспензионной культуры происходит увеличение количества клеток в 2 раза. При изучении объема клеток суспензионной культуры максимальные значения были обнаружены также на девятые сутки субкультивирования.
4.3 Получение культуры генетически-трансформированных корней A.
annua L.
11 Культура hairy-root модифицированных корней Artemisia annua L. была получена с использованием методов листовых дисков, инфицированных Agrobacterium rhizogenes (штамм A4USA) (Guo et. al., 2004). Первые три пассажа культура корней культивировалась на агаризованной среде B5 с содержанием цефатоксамина для элиминации бактерий, затем на жидкой среде B5 без антибиотика в колбах 250 и 100 мл на шейкерах при 100 об./мин при ± 1 °С (Wang et. al., 2001;
Liu et. al., 2002). Индекс роста культуры модифицированных корней составил 6,31±0,41.
5.Роль света в морфогенезе клеточной культуры Artemisia annua L.
По литературным данным известно, что свет регулирует рост и морфогенез интактных растений (Карначук, 2001;
2008). Облучение белым светом с экспозицией 16 часов и интенсивностью 4000 люкс стимулирует рост культуры hairy-root Artemisia annua L. и продукцию ей артемизинина по сравнению с темнотой (Liu et. al., 2002). Стимулирующее действие на эти параметры оказывает красный свет (610-715 нм) по сравнению с белым (Wang et. al., 2001).
Таким образом, на сегодняшний день показано, что даже на морфологические и биохимические параметры культур генетически-модифицированных корней можно воздействовать селективным светом. Однако не изучено действие селективного света на клеточную культуру данного растения.
5.1. Действие селективного света на каллусную культуру Artemisia annua L.
Исследовано действие селективного красного, синего и зеленого света на рост каллусной культуры Artemisia annua L. за период субкультивирования в суток. Фотопериод составлял 16 часов. Максимальные значения индекс роста показаны у каллусной культуры, выращенной на синем свету по сравнению с каллусной культурой в темноте (t=-3,3;
p=0,001), на зеленом свету рост подавлялся. При изучении объема клеток и коэффициента K максимальные значения обнаружены у клеток каллусной культуры, выращенной на зеленом свету, красный и синий свет приводили к уменьшению этих показателей. Это может свидетельствовать об увеличении пролиферативной активности каллуса, выращиваемого на синем свету, и о снижении на зеленом (рис. 2).
Были проведены исследования по выращиванию каллусной культуры Artemisia annua L. на пластиковых и стеклянных чашках Петри, отличающихся на 2% по коэффициенту пропускания. Отличий по ростовому индексу между культурами на красном и синем свету не обнаружено, на зеленом выявлены значимые отличия. Зеленый свет в вариантах с использованием пластиковых и стеклянных чашек Петри приводил к увеличению объемов клеток каллусной культуры.
Изучено кратковременное действие селективного света на рост каллусной культуры при облучении световыми потоками с теми же параметрами, что и в первом опыте, в течение 1 часа на протяжении 15 суток (Folta et. al., 2001;
12 Cashmore, 2003). Основную часть времени культуры росли в темноте. Выявлено ускорение роста каллуса на зеленом свету, по сравнению с синим или белым светом. При изучении объемов клеток каллусной культуры выяснено, что значимые снижения этого параметра были обнаружены у культуры, выращиваемой на кратковременном синем и белом свету.
а б в Рисунок 2 - Действие селективного света на ростовые и морфологические характеристики каллусной культуры Artemisia annua L. (а – ростовой индекс, б –объем клеток, в – коэффициент К), на: 1 - красном 2 - синем, 3 - зеленом, 4 – белом свету, 5 - темноте. Экспозиция 16 часов, продолжительность роста культуры 15 суток.
Эксперименты, проведенные с каллусной культурой Artemisia annua L., выращенной на синем свету с экспозицией в 1 час и 16 часов показали, что в недифференцированных каллусных клетках синий свет, как и в интактном растении, подавляет процессы растяжения клеток, и, возможно, стимулирует процессы деления (Протасова, 1978;
Карначук и др., 1991;
Головацкая и др., 1996, 2005, 2008, 2010;
Ouang et. al., 2003).
Полученные данные по действию зеленого света на рост каллусной культуры дают возможность предположить о наличии специфического ответа недифференцированных клеток Artemisia annua L. in vitro. На сегодняшний день у растений не выявлены отдельные рецепторы зеленого света.
Криптохромы и фитохромы могут напрямую поглощать зеленый свет (Kim et.
13 al., 2004). Однако по немногим литературным данным известно, что зеленый свет может вызывать ответ, обратный по отношению к световым реакциям растения на синий свет. Показано, что зеленый свет замедляет прорастание семян, совместное действие зеленого света с красным или синим ингибирует накопление биомассы в проростках томата (Went, 1957). Ранние исследования на культуре клеток показали, что зеленый свет, как и ультрафиолет, ингибирует накопление биомассы по сравнению с синим, красным, дальним красным светом и темнотой. Этот эффект был обратим при переносе культуры с зеленого света на любой другой (Klein, 1964;
Yeoman, 1971). Зеленый свет может вызывать фототропический изгиб проростков Arabidopsis thaliana и латука отличающийся от изгиба, вызванного синим светом (Steinitz et. al., 1985). Полевые исследования показали положительное влияние зеленого света на накопление ароматических и фенольных компонентов в Ocimum basilicum (базилик камфорный) (Loughrin et. al., 2001). Исследования устьичных движений замыкающих клеток показали, что зеленый свет может снимать специфический эффект действия синего света, УФ-А и УФ-Б (Eisinger et. al., 2003).
Таким образом, на сегодняшний день ясно, что центральная часть видимого спектра также способна вызывать определенные физиологические ответы в целых интактных растениях. Однако на клеточном уровне действие зеленого света недостаточно изучено (Folta, 2003). На основании проделанной работы, можно сделать предположение о специфичности действия зеленого света, отличающегося от синего света. Облучение зеленым светом клеток каллусной культуры приводит к эффектам, противоположным синему свету и свойственным белому. В то время, как синий свет может вызывать увеличения ростового индекса каллусной культуры и одновременное ингибирование растяжения клеток, зеленый свет снижает интенсивность ростовых процессов в каллусной культуре и снижает пролиферативную активность клеток. Из всего вышеизложенного можно сделать предположение о том, что некоторые ростовые фотореакции, связанные с действием зеленого света в культуре недифференцированных клеток in vitro не связаны с рецепторами синего света, криптохромом и фототропином.
5.2 Действие селективного света на суспензионную культуру Artemisia annua L.
Исследовано влияние селективного света на ростовые параметры суспензионной культуры Artemisia annua L. на оптимизированной среде. При изучении объема клеток суспензионной культуры, значимые отличия это параметра у культур, не обнаружены. При изучении индекса роста, а также накопления сухой массы суспензионной культуры, установлено, что выращивание на красном свету приводит к уменьшению данных показателей по сравнению с синим светом. Минимальных значений средних объемов клеток культура на красном свету достигает на третьи сутки культивирования, на синем свету - на первые и третьи, а на белом - на пятые. Максимальных – на 14 красном и синем свету - на пятые, на белом - на девятые сутки соответственно.
При изучении изменения коэффициента К показано, что во всех вариантах он превышает 1,5, минимальные его значения обнаруживаются на третьи сутки субкультивирования (в случае с синим светом также и на пятые), а максимальные – на девятые. Таким образом, можно сделать предположение о том, что максимальную митотическую активность суспензионная культура проявляет, начиная с третьих суток субкультивирования.
Суспензионная культура Artemisia annua L., по сравнению с каллусной, не показывает значимых эффектов стимуляции ростовых процессов и ингибирования растяжения клеток. Вероятнее всего эти эффекты связаны с тем, что клетки суспензионной культуры не получали достаточного освещения из-за поглощения светового излучения жидкой питательной средой и массой клеток.
Также это может быть связано с изменениями в процессах активации генов, связанных с выращиванием клеток во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде.
6. Накопление биологически-активных веществ в клеточных культурах 6.1 Определение содержания фотосинтетических пигментов в каллусной и суспензионной культурах A.annua L.
Белый свет приводил к накоплению фотосинтетических пигментов в каллусных клетках Artemisia annua L. Максимальные значения накопления хлорофиллов А и В получены у каллусной культуры, выращиваемой на среде с содержанием фитогормонов НУК и 6-БАП в концентрации 0,5 и 0,2 мг/л соответственно. Установлено, что стимулирующее действие на накопление пигментов в культуре оказывает добавление мио-инозитола и активированного угля, в то время, как гидролизат казеина подавляет процессы накопления хлорофиллов А и В а также каротиноидов в культуре Artemisia annua L., выращиваемой на свету. Изучено накопление пигментов в процессе культивирования каллусной культуры на среде с добавлением мио-инозитола.
Минимальные количества пигментов обнаруживаются на 7-е и 13-е сутки культивирования. Это может быть связано с особенностями ростовых процессов культуры на протяжении субкультивирования. Селективный свет также влияет на накопление фотосинтетических пигментов в каллусных культурах, выращенных на свету разного спектрального состава. Содержание хлорофиллов А и Б минимально в каллусной культуре на красном свету (рис.
3).
6.2 Определение содержания флавоноидов в каллусной и суспензионной культурах Спектрофотометрическими методами установлено, что максимальных значений содержание флавоноидов достигает в каллусной культуре, 15 выращиваемой в темноте, в то время, как световой режим культивирования препятствует их накоплению. При изучении действия сахаров и жасмоновой кислоты на накопление флавоноидов каллусной культурой установлено, что изменение источников углеводов в среде и добавление жасмоната не приводит к значимым отличиям по накоплению флавоноидов. Максимальные значения накопления этих веществ обнаружены в каллусной культуре, выращенной на среде с содержанием гомобрассинолида 10 мкг/л среды.
Рисунок 3 – Содержание хлорофиллов А, В и каротиноидов в каллусной культуре,Artemisia annua L., выращенной на селективном свету.
Установлено что действие селективного света приводило к снижению этого параметра. Минимальные значения отмечались в культуре, выращенной на синем свету. В темноте культура продуцирует флавоноиды в количествах, сравнимых с образцами из листьев интактных растений (рис. 4). В суспензионной культуре отмечено увеличенное накопление флавоноидов в культуре на синем свету по сравнению с красным светом.
16 Рисунок 4 – Содержание флавоноидов в интактном растении Artemisia annua L., а также в каллусной культуре, выращенной на свету разного спектрального состава. 1 – красный свет, 2 - синий, 3 - зеленый, 4 – белый, 5 – темнота, 6 – интактное растение.
ВЫВОДЫ 1. Получены светозависимые каллусная и суспензионная культуры Artemisia annua L. и определены основные параметры наиболее благоприятных условий для их культивирования. 6-Бензиламинопурин в концентрации 0,5 мг/л в среде уменьшает объемы каллусных клеток в возрасте 15 суток. Увеличение содержания 6-Бензиламинопурина в среде до 1 мг/л снижает долю вытянутых каллусных клеток по сравнению с округлыми. Наибольший прирост биомассы и объемов клеток суспензии отмечен на 9-е сутки культивирования.
2. Получена культура hairy-root корней Artemisia annua L., рост которой не зависит от света.
3. Синий свет (450 нм) с экспозицией 16 часов стимулировал рост каллусной культуры Artemisia annua L, уменьшая размер всех типов клеток, что может свидетельствовать о специфическом действии этого участка спектра на процессы клеточного растяжения. Зеленый свет (550 нм) равной интенсивности и экспозиции подавлял рост каллусной культуры, с одновременным увеличением объема клеток.
4. В культуре клеток Artemisia annua L. in vitro на свету разного спектрального состава идет синтез пигментов: хлорофиллов А, B и каротиноидов.
5. Свет подавлял образование флавоноидов, максимальные значения накопления которых обнаружены в каллусной культуре Artemisia annua L. в условиях темнового режима культивирования.
17 Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в журналах, рекомендуемых ВАК:
1. Песяк С.В. Действие селективного света на рост клеточных культур растения Artemisia annua L. // Вестник ТГУ. Биология. – 2010. – № 2(10) – С.
29-36.
2. Карначук Р.А., Медведева Ю.В., Дорофеев В.Ю., Песяк С.В.
Питательная среда для культивирования каллусной культуры Artemisia annua L.
// Патент РФ № 2009100365 – 2010. – Бюл. № 18 – С. 5.
Публикации в других научных изданиях:
1. Песяк С.В., Окладникова Н.Н. Накопление флавоноидов и аскорбиновой кислоты в каллусной культуре Scutellaria baicalensis Georgi. // XIV междунар. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ-2007»: тезисы докладов – Москва: Издательство МГУ, 2007 – С. 125.
2. Песяк С.В., Комлева Е.В., Карначук Р.А. Оптимизация условий культивирования каллусной культуры полыни однолетней // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: тез. докл. 9 междунар. конф., Звенигород. – Москва: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008 – С. 295-296.
3. Песяк С.В., Комлева Е.В. Оптимизация питательной среды для эффективного культивирования каллусной культуры Artemisia annua L. // Современные фундаментальные проблемы физиологии и биотехнологии растений и микроорганизмов: тез. докл. молодежн. всерос. школы-семинара – Томск: Самиздат, 2008 – С. 26-27.
4. Песяк, С.В. Действие селективного света на рост суспензионной культуры Artemisia annua L. // XVI международн. научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ-2010»: тез. докл. – Москва: Издательство МГУ, 2010 – С. 260-261.
5. Карначук Р.А., Медведева Ю.В., Песяк С.В., Дорофеев В.Ю. Клеточная культура Artemisia annua L. как возможный источник веществ противопаразитарного действия. // Биотехнология начала III тысячелетия: тез.
докл. междунар. науч. конф. – Саранск: Типография ООО «Мордовия – Экспо», 2010 – С. 117-118.
6. Карначук Р.А., Дорофеев В.Ю., Гвоздева Е.С., Песяк С.В. Практикум по биотехнологии растений – Томск: Томский государственный университет, 2010 – 72 С.
18