Биотехнология получения циклодекстринов полифракционного состава на основе продуцента paenibacillus ehimensis ib-739
На правах рукописи
ФЕДОРОВА ПОЛИНА ЮРЬЕВНА БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИКЛОДЕКСТРИНОВ ПОЛИФРАКЦИОННОГО СОСТАВА НА ОСНОВЕ ПРОДУЦЕНТА PAENIBACILLUS EHIMENSIS IB-739 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2012 2
Работа выполнена в лаборатории прикладной микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биологии Уфимского научного центра РАН (ИБ УНЦ РАН) Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Усанов Николай Глебович доктор биологических наук, профессор Мелентьев Александр Иванович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Логинов Олег Николаевич доктор химических наук, профессор Варламов Валерий Петрович
Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Россий ской академии сельскохозяйственных наук (г. Москва)
Защита диссертации состоится 17 февраля 2012 года в 14.00 часов на засе дании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.136.01 при Учре ждении Российской академии наук Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, проспект Октября, д. 69. Тел. (347) 235-62-47 E-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии Уфимского научного центра РАН, на официальном сайте http://ib.anrb.ru/sovet.html и на сайте ВАК Минобрнауки РФ.
Автореферат разослан 12 января 2012 г.
Ученый секретарь Объединенного диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент Р.В.Уразгильдин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Циклодекстрины (ЦД, циклические альфа-D-глюкопиранозиды), – пер спективные биотехнологические продукты с высокой добавленной стоимостью, в основе технологии получения которых лежит энзиматическая трансформация крахмала микробным ферментом циклодекстринглюканотрансферазой (ЦГТа зой, К.Ф.2.4.1.19).
Наиболее распространены и изучены альфа-, бета- и гамма-ЦД, разли чающиеся по количеству единиц -D-глюкопиранозы в макрокольце, и соот ветственно, физическими и химическими свойствами.
Благодаря способности ЦД образовывать комплексы включения с раз нообразными органическими и неорганическими соединениями, применение ЦД распространяется на такие непохожие отрасли, как пищевая промышлен ность, фармакология и косметика, органический синтез и нефтедобыча, сель ское хозяйство и процессы защиты окружающей среды, биотехнологии и экологии (Singh et al., 2002;
Biwer et al., 2002;
Martin Del Valle, 2004;
Szejtli, 2004;
Li et al., 2007). Это обусловлено тем, что комплексообразование суще ственно изменяет физико-химические характеристики включенных молекул, придавая им новые, ранее не известные, полезные свойства.
В большинстве случаев для получения комплексов включения индиви дуальных веществ с ЦД используют соответственно индивидуальные альфа-, бета- или гамма-ЦД. Однако, зачастую, например, для нужд пищевой, фарма цевтической промышленности, требуется получить комплексы ЦД с веще ствами, состав которых не является гомогенным. Это могут быть вытяжки или экстракты растений, ароматические вещества природного происхождения и др. В этом случае использование индивидуальных ЦД не обеспечивает полно ту включения всех компонентов системы и, тем самым, ограничивает потен циальные возможности получения инновационной продукции. В перечислен ных случаях целесообразно использовать ЦД полифракционного состава, т.е.
содержащие одновременно все три представителя гомологического ряда.
Для промышленного получения ЦД используются два принципиально разных подхода: метод неконтролируемой конверсии, в ходе которого в био химический реактор вводятся лишь ЦГТаза и раствор крахмала, и контролиру емый, когда в реакционную смесь добавляются еще и комплексообразователи (сольвенты) – органические или неорганические соединения, селективно реа гирующие с одним из циклических сахаров с образованием нерастворимых или слаборастворимых комплексов включения, которые сдвигают равновесия реакции в сторону одного из целевых продуктов, в результате чего возрастает его выход (Abelyan, 2005). В ряде случаев выход ЦД возрастает, достигая 40 75% масс. по отношению к субстрату, но число подобных сольвентов, нашед ших промышленное применение в производстве ЦД, ограничено.
Наиболее удачным вариантом технологии получения ЦД является со четание специфичной ЦГТазы со специфичным комплексообразователем, ко торый бы позволил осуществить конверсию крахмала с высоким выходом.
Применение комплексообразователей снимает проблему контаминации биореактора, упрощает технологию очистки продуктов конверсии из много компонентной реакционной смеси. В то же время, известные сольвентные технологии получения ЦД имеют ряд недостатков из-за токсичности ком плексо-образователей, сложности глубокой очистки ЦД от следовых коли честв растворителей, их ограниченной доступности и высокой стоимости. В то же время существует потребность в дешевых технических ЦД, в которых допускается наличие органических растворителей. В связи с этим поиск но вых эффективных технологичных малотоксичных сольвентов для организа ции многотоннажного производства альфа-, бета- и гамма-ЦД остается нере шенной и актуальной проблемой до настоящего времени.
Цель исследования Разработать методы ферментативной трансформации крахмала в цик лодекстрины с применением бактериальной циклодекстринглюканотрансфе разы и специфического сольвента, обеспечивающих постоянство соотноше ния гомологов.
Задачи исследования 1. Провести тестирование коллекционных ЦГТ-активных культур для отбора штамма бактерий, секретирующего ЦГТазу широкой специфичности, катализирующую трансформацию крахмала в смесь трех гомологов ЦД.
2. Установить таксономическое положение штамма-продуцента и осу ществить его идентификацию на основании совокупности морфологических, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик.
3. Разработать способы выделения, очистки исследуемой ЦГТазы и изучить физико-химические и каталитические свойства фермента.
4. Определить оптимальные параметры ферментативной конверсии крахмала исследуемой ЦГТазой для получения ЦД с нативным соотношени ем гомологов в присутствии комплексообразователей.
5. Подобрать комплексообразователь и разработать технологию одно временного получения смеси альфа-, бета- и гамма-ЦД с высоким конверси онным выходом.
Научная новизна Впервые обнаружен штамм вида Paenibacillus ehimensis IB-739, секрети рующий ЦГТазу широкой специфичности, инициирующую превращение крахмала до смесей пригодных для одновременного синтеза трех ЦД.
Определена полная последовательность гена 16S рРНК P. ehimensis IB 739, проведена реконструкция модели филогенетического древа и определено положение штамма в роду Paenibacillus.
Изучены физико-химические и каталитические свойства ЦГТазы P. ehimensis IB-739. Максимальная каталитическая активность проявляется в интервале температур 40-450С, оптимум рН=6,0, pH-стабильность в интервале 5,5–8,5, термостабильность – до 600С. По данным электрофореза в присутствии SDS фермент имел молекулярную массу 75 кДа.
Исследованы различные комплексообразователи, в том числе исполь зуемые впервые, такие как бетулин, диметилсульфоксид, метил-трет бутиловый эфир, коллоидная сера, кристаллическая сера, механо активированная сера;
комбинация сольвентов: Сера-МЭК, для проведения конверсии крахмала в ЦД, которые могут быть применены в технологиях по лучения различных гомологов ЦД.
Разработана технология получения смеси ЦД полифракционного сос тава, основанная на использовании широкоспецифичной ЦГТазы P. ehimensis IB-739 и нового бинарного сольвента (Сера-МЭК) в качестве комплексообра зователя.
Практическая значимость Штамм-продуцент, секретирующий ЦГТазу широкой специфичности, идентифицирован как Paenibacillus ehimensis IB-739.
Полная последовательность генов 16S рРНК культуры депонирована в базе данных EMBL (European Molecular Biology Laboratory)/GenBank и до ступна в сети Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) под номером FN582329.
Подобраны условия подготовительной обработки крахмальных растворов высокой концентрации и определены оптимальные параметры ферментативной конверсии крахмала ЦГТазой P. ehimensis IB-739 для получения ЦД полифрак ционного состава: доза фермента 10,0 ед на 1,0 г субстрата;
концентрация крах мала 5,0-15,0%, продолжительность процесса ферментолиза – 8-12 ч.
Предложено новое техническое решение для осуществления фермента тивной трансформации крахмала в ЦД полифракционного состава, основан ное на использовании бинарной системы комплексообразователей.
Показана принципиальная возможность и перспективность использо вания изученных комплексообразователей в технологиях получения альфа-, бета- и гамма-ЦД.
Апробация работы Материалы диссертации представлены на ряде научных форумов: меж дународной научно-практической конференции «Современная биотех нология: фундаментальные проблемы, инновационные проекты и бионано технология» (Брянск, 2010), Международной научной конференции «Биотех нология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), VI Молодежной школе конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010), XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2011), XV Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биоло гия – наука XXI века» (Пущино, 2011);
Всероссийской научной конференции с международным участием «ЭКОБИОТЕХ-2011» и II Всероссийской школе конференции молодых ученых «Современные методы и подходы в биологии и экологии» (Уфа, 2011);
VI Всероссийской научной Интернет-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2011).
Конкурсная поддержка работы Исследования поддержаны грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Разработка технологии по лучения опытных образцов альфа-, бета- и гамма-циклодекстринов» (Госу дарственный контракт № 8370/13979 от 29.04.2011 г.) по программе «Участ ник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.»).
Публикации По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 2 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикаций материалов кандидатских работ.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, эксперименталь ной части, изложения результатов, выводов, приложений и списка цитируе мой литературы, содержащего 194 ссылки. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 9 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Микроорганизмы. В работе использовали штаммы продуцентов цик лодекстринглюканотрансфераз из коллекции лаборатории прикладной мик робиологии Института биологии УНЦ РАН: Bacillus sp. IB-739, P. illinoisensis IB-1087, P. campinasensis IB-417, P. macerans IB-1053, идентифицированные по физиолого-биохимическим и филогенетическим признакам.
Среды, используемые для наработки образцов ЦГТазы.
Среда для Bacillus sp. IB-739 включала следующие компоненты, г/л:
крахмал – 10,0;
пептон – 4,0;
дрожжевой экстракт – 5,0;
КH2PO4 – 1,0;
СaСО – 1,0;
рН 7,0-7,2.
Среда для P. illinoisensis IB-1087 включала следующие компоненты, г/л: крахмал – 10,0;
пептон – 5,0;
дрожжевой экстракт – 5,0;
К2HPO4 – 2,0;
NaH2PO4 – 2,0;
рН 7,2-7,4.
Среда для P. macerans IB-I4 включала следующие компоненты, г/л:
крахмал – 10,0;
пептон – 3,0;
дрожжевой экстракт – 3,0;
кукурузный экстракт – 3,0;
КH2PO4 – 2,0;
(NH4)2SO4 – 2,0;
CaCO3 – 1,0;
рН 7,2-7,6.
Среда для P. campinasensis IB-417 включала следующие компоненты, г/л: крахмал – 10,0;
пептон – 3,0;
дрожжевой экстракт – 3,0;
кукурузный экс тракт – 3,0;
К2HPO4 – 2,0;
CaCO3 – 2,0;
Na2CO3 – 0,8-1,0;
рН 9,2-9,8.
Условия культивирования. Выращивание бактерий осуществляли в течение 68-72 часов при температуре 37-390С и скорости перемешивания мин-1 на воздушно-термостатируемых качалках типа УВМТ-12-250.
Таксономические исследования. Изучение морфологических и фи зиолого-биохимических характеристик используемых культур, способных к секреции внеклеточных ЦГТаз, проводили руководствуясь общей стратегией фенотипической дифференциации предложенной Gordon (1973) и описанной в руководствах: «Определитель бактерий Берджи» (1997), «Методы общей бактериологии» (Герхардт и др., 1984), «Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus» (Скворцова, 1983).
Культуральные особенности микроорганизмов изучали на агаризо ванных средах. Морфология клеток изучалась прямой микроскопией живых культур в динамике роста с использованием микроскопа «Leica DM 1000» (Германия).
Измерение ЦГТазной активности растворов и препаратов проводили модифицированным фенолфталеиновым методом (Усанов Н.Г. и др., 2007), используя для разбавления фермента 50 мМ ацетатный буфер рН 6,0-6,1, со держащий 10,0 мМ CaCl2. За 1 единицу активности принимали количество ЦГТазы, катализирующее образование 1,0 мкМ -ЦД в течение 1 мин при 400С.
Измерение вязкости растворов крахмала проводили с помощью циф рового ротационного вискозиметра Brookfild LSRV (США) в стеклянном реакторе объемом 400 мл, снабженном термостатирующей рубашкой. Темпе ратуру в рубашке поддерживали с помощью водного циркуляционного уль тратермостата типа UH-4. Температуру в стакане фиксировали с помощью цифрового термометра с выносным датчиком («RST Sweden», Швеция).
Ферментация. Реакцию ферментативной конверсии картофельного крахмала в ЦД проводили в периодическом режиме в стеклянном реакторе с рабочим объемом 160 мл, снабженном термостатирующей рубашкой и маг нитным перемешивающим устройством. Реакцию проводили при температу ре 450С и скорости мешалки 300 мин-1.
Количественное определение концентрации циклодекстринов.
Определение продуктов трансформации крахмала под действием ЦГТазы осуществляли с помощью ВЭЖХ на колонке «SEPARON-NH2»-5мкм (3х мм), используя в качестве элюента смесь ацетонитрил - вода в объемном со отношении 63:37. Подачу растворителя осуществляли насосом высокого дав ления НРР-5001 со скоростью 0,7 мл/мин и рабочим давлением – 70-100 ати, в качестве детектора использовали рефрактометр RIDK-102. Регистрацию и оцифровку аналогового сигнала, последующую обработку хроматограмм проводили с помощью программно-вычислительного комплекса «Мульти хром 1.59».
Статистическая обработка экспериментальных данных. Статисти ческую обработку результатов экспериментов проводили стандартными ме тодами дисперсионного и корреляционного анализа, выполнявшиеся с по мощью программы Microcal Origin 7.5 Pro.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выбор продуцента ЦГТазы Фактором селекции для отбора продуцентов ЦГТаз служила их специ фичность в отношении спектра ЦД, накапливающихся в продуктах конвер сии крахмала. При действии ЦГТазы на крахмал в реакционной смеси одно временно образуются все три гомолога. В зависимости от того, какой из них доминирует в продуктах конверсии, различают -, - и -ЦГТазы, природа которых в свою очередь зависит от видовых генетических особенностей штамма-продуцента. Например, - (Gawande and Patkar, 2001), - (Alves Prado et al., 2007) и -ЦГТазы (Kato and Horikoshi, 1986;
Hirano et al., 2006).
Для изучения кинетических особенностей ЦГТаз бактерий коллекции Института биологии УНЦ РАН P. campinasensis IB-417, P. illinoisensis IB-1087, P. macerans IB-I4 и Bacillus sp. IB-739 был применен собственный подход, ос нованный на определении безразмерных коэффициентов (Федорова, Усанов, 2011), являющихся отношениями молярных концентраций KU=[-ЦД]/[-ЦД] и KU=[-ЦД]/[-ЦД] в продуктах суточной конверсии крахмала. На рисунке представлены результаты сравнения каталитических свойств четырех изучен ных штаммов циклодекстриногенных бактерий. Как следует из графического представления, зависимости молярных соотношений KU=[-ЦД]/[-ЦД] и KU=[-ЦД]/[-ЦД] от величины стартового соотношения фермент/субстрат (E/S) в двойных логарифмических координатах выражаются линейными функ циями. Полученная информация позволяет сравнивать динамику накопления различных форм ЦД, а также ее зависимость от дозы внесенного фермента для разных типов ЦГТаз. Например, при использовании -ЦГТазы алкалотолерант ной P. campinasensis (А), накопление -ЦД относительно -ЦД падает с увели чением относительной дозировки фермента и этот процесс сопровождается ро стом отношения KU. Учитывая, что фермент на ранних стадиях реакции (что адекватно низким удельным дозировкам ЦГТаз) катализируют преимуществен ное образование длинноцепочечных - и -ЦД, которые по мере накопления начинают изомеризоваться в -ЦД, следует, что удельный выход -ЦД также снижается по мере продолжения реакции. Схожими кинетическими особенно стями обладает -ЦГТаза P. illinoisensis (Г).
ЦГТаза P. macerans (В) катализирует трансформацию крахмала иным образом: сначала в среде накапливается -ЦД, который по мере увеличения соотношения E/S трансформируется в -ЦД. Каталитическая «ретрансформа ция» - и -ЦД в - форму, по мере нарастания их концентраций в ходе реак ции является типичной и хорошо известной особенностью ферментов данно го типа (Patrick et al., 1995).
Для ЦГТазы Bacillus sp. IB-739 характерно образование относительно постоянных соотношений -, - и -ЦД, мало зависящих от дозы внесенной ЦГТазы (Б), с достаточно стабильными коэффициентами KU и KU при раз личных соотношениях E/S. Бактерии Bacillus sp. IB-739 секретируют ЦГТазу широкой специфичности, инициирующую превращение крахмала до смесей, пригодных для одновременного синтеза трех циклических декстринов.
Морфологическая и физиолого-биохимическая характеристика продуцента ЦГТазы Культура аэробных спорообразующих бактерий Bacillus sp. IB-739 бы ла выделена в 1987 году из серой среднегумусной почвы Республики Баш кортостан на селективной среде, содержавшей 0,5% -ЦД в качестве един ственного источника углерода и энергии (Усанов и др., 1989). Штамм Bacil lus sp. IB-739 обладал выраженной ЦГТазной активностью, а по каталитиче ским Рисунок 1. Зависимость выхода циклодекстринов от концентрации ЦГТаз, выделенных из бактерий различных видов в течение 24 ч трансформации 2,75% крахмала: А – P. campinasensis IB-417;
Б – Bacillus sp. IB-739;
В – P. macerans IB-I4;
Г – P. illinoisensis IB-1087. Кривые (1) и (2) обозначают величины безразмерных коэффициентов равных мо лярным отношениям [-ЦД]/[-ЦД] и [-ЦД]/ [-ЦД] в продуктах реакции соответственно.
свойствам фермент, резко отличался от аналогичного фермента P. macerans ВКМ B-506T (Егоров и др., 1988). Согласно физиолого-биохимическому те стированию культура Bacillus sp. IB-739 была отнесена к фирмикутам, обла дающим подвижностью, образующим эллиптические споры, раздувающие спорангий, и способным к росту при температурах до 500С. Рост бактерий наблюдается в диапазоне рН 6,4-8,7 на средах с глюкозой, крахмалом, пепто ном, дрожжевым экстрактом. Клетки обладают каталазной и оксидазной ак тивностью, восстанавливают нитраты, не образуют ацетилметилкарбинол. На жидких средах с -ЦД, -ЦД, глюкозой, сахарозой, арабинозой, маннитом, глицерином и D-ксилозой развитие бактерий сопровождается подкислением без образования газа.
Филогенетическая характеристика продуцента ЦГТазы Согласно сумме фенотипических признаков, исследуемый штамм IB 739 был таксономически позиционирован как близкий к типовой культуре Paenibacillus ehimensis JCM 9907T (Kuroshima et al., 1996;
Lee et al., 2004). По данным анализа последовательностей гена 16S рРНК построено филогенети ческое древо. Филогенетические взаимоотношения исследуемого штамма с другими видами Paenibacillus, в том числе обладающими ЦГТазной активно стью, представлены на рисунке 2.
Рисунок 2. Филогенетическое древо, демонстрирующее возможное поло жение штамма P. ehimensis IB-739 среди представителей рода Paenibacillus.
Обнаружено, что ближайшими родственными культурами изолята IB 739 оказались P. ehimensis KCTC 3748T (AY116665), P. ehimensis IB-G2P (FN582330), P. ehimensis HSCC 595 (AB045101), P. elgii SD17 (AY090110) с гомологией генов 16S рРНК 98,7%;
99,4%;
99,1% и 97,6% соответственно.
Как видно из представленного древа, культура IB-739 вписывается в кластер P. ehimensis, на основании чего с высокой долей вероятности может быть от несена к представителям этого вида.
Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под названием P. ehimensis ВКМ B-2680D.
Оптимизация состава питательной среды для культивирования продуцента ЦГТазы P. ehimensis IB- Известно, что большинство ЦГТаз эктрацеллюлярны. Однако, в случае культивирования P. ehimensis IB-739, процесс выделения ЦГТазы из КЖ осложнялся накоплением в ферментационной среде больших количеств мик робных экзополисахаридов, обуславливающих повышенную вязкость КЖ.
Для снижения накопления экстрацеллюлярных полисахаридов в КЖ, а также для устойчивого биосинтеза и увеличения активности ЦГТазы культурой P. ehimensis IB-739, была проведена оптимизация состава питательной среды, включающая варьирование таких параметров как содержание субстрата, ис точников азота различной природы, буферных компонентов, источников кальция. Эффект был достигнут при выращивании штамма в присутствии карбоната кальция в концентрации 1-2 г/л. Динамическая вязкость КЖ соста вила 55-75 сПа, в то время, как в варианте без использования карбоната каль ция она достигала 1560-1640 сПа, и была приемлема для выделения ЦГТазы.
Изучение динамики синтеза ЦГТазы P. ehimensis IB- Изучение динамики синтеза ЦГТазы культурой P. ehimensis IB-739 по казало, что секреция ЦГТазы начиналась через 25-27 ч от начала культивиро вания с подъемом активности до максимального (и стабильного) уровня 3,7 4,2 ед/мл после 48-55 ч. Микроскопирование проб КЖ показало, что процесс активного деления клеток к этому времени прекращается. Спорообра зование культуры P. ehimensis IB 739 в ферментационной среде начиналось через 48 ч культивиро вания. Этот процесс полностью за вершался через 72 ч, когда в среде накапливалось максимальное ко личество ЦГТазы.
Обнаружено, что максималь ное накопление ЦГТазы в жидкой среде штаммом P. ehimensis IB- Рисунок 3. Динамика роста биомассы и синтеза ЦГТазы в ходе культивиро вания штамма P. ehimensis IB-739.
происходит в период стационарной фазы роста и коррелирует с процессом перехода от вегетативной стадии роста к спорообразованию.
Очистка препарата ЦГТазы P. ehimensis IB- В результате проведенной очистки конечный выход ЦГТазы составил ~12% от начального, при удельной активности препарата ~770 ед/мг белка и степени очистки 25,9Х. Общие результаты очистки ЦГТазы P. ehimensis IB 739 представлены в таблице 1.
Таблица 1. Очистка ЦГТазы культуры P. ehimensis IB- ЦГТаза Вы Объем, Белок, Степень Стадии очистки ход, Ед/мг мл мг очистки Ед.
белка % Исходная 1200 2028 29,2 68,4 1 культуральная жидкость Ультрафильтрация 300 1926 52,3 36,8 1,76 94, Сорбция на крахмале 105 803,2 181,3 4,43 6,11 39, Ионно-обменная 22 245,1 769,2 0,29 25,9 12, хроматография Методом электрофореза в дена- Рисунок 4.
турирующих условиях была проде- Электрофоре монстрирована гомогенность полу- грамма препара ченной ЦГТазы, достаточная для изу- та ЦГТазы в чения ее физико-химических и ката- 12%-ном ПААГ литических свойств (рис. 4). в денатурирую По зависимости электрофорети- щих условиях.
ческой подвижности от молекулярной А – маркеры массы белковых молекул была опре- М.М.;
Б – препа делена молекулярная масса ЦГТазы рат ЦГТазы, по культуры P. ehimensis IB-739 равная сле частичной 75 кДа. очистки.
Физико-химические свойства ЦГТазы P. ehimensis IB- Стандартными методами были определены температурный и рН опти мумы, температурная и рН стабильность очищенного препарата (рис. 5). Ис следуемый фермент проявлял наибольшую циклизующую активность при T=40-450С, величина которой существенно зависела от кислотности раство ров с оптимумом рН=6,0, препарат был относительно устойчив в диапазоне рН 5,5-8,5, при температурах до 600С. Добавление ионов кальция в виде СаСl2 (в конечной концентрации 10 мМ) оказывало лишь незначительное стабилизирующее действие на изучаемый фермент.
Рисунок 5. Физико-химические свойства ЦГТазы P. ehimensis IB-739: А – рН-оптимум, Б – оптимальная температура реакции образования циклодекстринов, В – рН-стабильность, Г – термостабильность (1 – без добавления Ca2+ и 2 – в присутствии 10 мМ CaCl2).
Исходя из того, что ЦГТазы обладают аффинностью к субстрату, мы предположили, что наличие крахмала может оказывать стабилизирующее влияние на термостабильность. В связи с этим, в нашей работе был исполь зован метод определения термостабильности ЦГТазы в присутствии субстра та по динамике изменения динамической вязкости среды с помощью цифро вого ротационного вискозиметра Brookfild LSRV при скорости вращения ро тора 10 мин-1. Снижение вязкости 10%-ного раствора крахмала при 700С после внесения фермента про исходило в течение 56 мин (рис. 6).
Из этого следует, что при 700С фер мент активно работает и присутствие субстрата (крахмала) оказывает ста билизирующее действие на фермент.
Этот факт говорит о возможности проведения реакции трансформации крахмала в ЦД при более высокой, чем оптимальная, температуре, ока Рисунок 6. Снижение вязкости зывая положительное влияние на 10%-ного раствора крахмала в реологические свойства фермента присутствии ЦГТазы P. ehimensis ционной среды, без существенного IB-739. снижения циклизующей активности ЦГТазы P. ehimensis IB-739. В технологическом плане это указывает на принципиальную возможность применения данного фермента для предвари тельного «ожижения» крахмального клейстера перед ферментативной транс формацией.
Ферментативная трансформация крахмала в циклодекстрины В процессе конверсии крахмала происходит одновременное образова ние всех трех ЦД в различных соотношениях -, - и -ЦД. Выход индивиду альных ЦД зависит от характера используемой ЦГТазы, ее количества, кон центрации субстрата, физико-химических условий проведения ферментного катализа.
Влияние дозировки фермента на накопление ЦД Определяющее значение для процесса ферментации имеет количество добавляемого фермента. Незначительный избыток фермента приводит к рез кому снижению выхода ЦД, поскольку начинает преобладать реакция дис пропорционирования с образованием линейных мальтоолигосахаридов. При низких концентрациях ЦГТазы количество образовавшихся ЦД также незна чительное, что может быть объяснено тем, что за данный отрезок времени реакция не успевает полностью закончиться, т.е. при увеличении времени инкубации возможно достижение максимального выхода ЦД. Таким образом, для получения удовлетворительного выхода ЦД количество добавляемого фермента необходимо по возможности минимизировать (Абелян и др., 1991).
Особенностью ЦГТазы P. ehimensis IB-739 является то, что для этого фермента характерно обра зование относительно постоянных соотношений -, - и -ЦД, мало за висящих от дозы внесенной ЦГТазы.
Однако суммарный выход ЦД может зависеть от внесенной дозы фермен та. Данные наших исследований свидетельствуют (рис. 7), что опти мальными для трансформации крах мала в ЦД можно считать удельную Рисунок 7. Влияние дозировки дозировку на уровне 8,0-10,0 ед на 1 ЦГТазы P. ehimensis IB-739 на вы г субстрата. ход циклодекстринов.
Влияние времени трансформации на выход ЦД Концентрация ЦД во время конверсии крахмала непрерывно меняется, и содержание циклических олигосахаридов в реакционной смеси практиче ски всегда проходит через максимум. При действии исследуемой ЦГТазы P. ehimensis IB-739 на неожиженный 3%-ный картофельный крахмал при удельной дозировке фермента 10,0 ед/г, происходило одновременное накоп ление -, - и -ЦД, при этом реакция практически прекращалась через 10- часов. Суммарный выход циклических декстринов достигал 45-47% от ис пользованного субстрата (рис. 8).
Известно, что циклические продукты, образовавшиеся в первый момент реакции, продолжают участвовать в ней, непрерывно трансформируясь друг в друга, причем этот процесс может про исходить и в отсутствие крахмала (Vilett et al., 1990;
Sabioni and Park, 1992;
Bovetto, 1992;
Абелян, 1995).
Для ЦГТазы P. ehimensis IB- помимо трансформации крахмала в ЦД свойственны также реакции дециклиза ции и межмолекулярного трансглико зилирования. При конверсии смеси, со держащей 5%-ный раствор -ЦД в мM ацетатном буфере (рН 6,0-6,1) и ЦГТазу P. ehimensis IB-739 (в дозиров ке 10,0 ед/г -ЦД), в продуктах реакции обнаруживаются три гомолога ЦД при Рисунок 8. Влияние времени реак- соотношении -, -, -форм равном ции на выход циклодекстринов. 12,5: 83,6: 3,9 % масс.
Концентрация ЦГТазы 10,0 ед на 1 г субстрата.
Влияние концентрации субстрата на выход ЦД Концентрация субстрата существенно влияет на выход ЦД в результате реакции циклизации. В процессе изменения стартовых концентраций неожи женного субстрата в диапазоне от до 15%, удельный выход суммы циклических продуктов снижался соответственно с 55% до 20% (рис.
9). Аналогичные результаты полу чены также для других типов ЦГТаз (Makela et al., 1988;
Akimaru et al., 1991a;
Bovetto et al., 1992;
Abelyan et al., 1993;
Абелян и др., 1994).
Выход ЦД выше при исполь зовании неразжиженного (нативно Рисунок 9. Влияние концентрации го) крахмала (Lee and Kim, 1991).
субстрата на выход циклодекстринов. Однако, в этом случае, достижимое Концентрация ЦГТазы 10,0 ед на 1 г содержание субстрата в биореакто ре не может превышать 3-5%, из-за субстрата.
высокой вязкости клейстера. Сни жение концентраций приводит к одновременному увеличению объемов реак торов и повышению финансовых затрат. Возрастают энергетические расходы на выпаривание больших количеств жидкости в процессе последующего вы деления ЦД из реакционной смеси, снижаются экономические показатели.
Использование высоких концентраций крахмала предполагает его предвари тельную обработку химическими, физическими или ферментными методами (Абелян и др., 1995а).
Наиболее распространенными являются ферментные методы обработ ки, например, крахмал гидролизующими ферментами, такими как пуллулана зы и изоамилазы, увеличивающими выход ЦД на 4-6% (Schmid, 1996;
Rendleman, 1997). В то же время, для ожижения крахмала применяются ЦГТазы, используемые для транс формации крахмала (Lee and Kim, 1992;
Slominska and Sobkowiak, 1997;
Prowe and Antranikian, 2001).
Для изучения процессов фер ментативной трансформации крах мала в ЦД, при дальнейших исследо ваниях, мы проводили предвари тельное ожижение субстрата, ис пользуя ферментативную обработку ЦГТазой Рисунок 10. Снижение вязкости 10 и суспензий крахмала P. ehimensis IB-739. При этом дози- 15%-ных растворов крахмала в при ровка фермента 0,2 ед/г крахмала сутствии ЦГТазы P. ehimensis IB-739.
обеспечивала снижение вязкости даже 15%-ного раствора картофельного крахмала до приемлемых значений 600-700 сПа. Процесс изменения вязкости 10 и 15%-ных растворов крахмала с течением времени показан на рисунке 10.
Ферментативная конверсия крахмала с использованием органических и неорганических соединений Исходя из полученных данных, был сделан вывод о том, что, несмотря на все ранее обнаруженные положительные особенности ЦГТазы P. ehimensis IB-739 суммарный выход ЦД не превышает 50% и достигнуть технологиче ски приемлемой степени конверсии субстрата без использования комплексо образователей нам не удастся.
Известно, что селективность комплексообразователя сильно зависит от типа используемой ЦГТазы, что приводит к совершенно разным результатам, в одном случае повышая, в другом – подавляя реакцию циклизации (Black wood and Bucke, 2000;
Starnes, 2001). В то же время, выход и соотношение ЦД также меняются в зависимости от условий реакции, которые необходимо подобрать для каждого конкретного фермента.
В нашей работе, мы изучали влияние различных комплексообразователей на процесс ферментативной конверсии картофельного крахмала (5%-ного рас твора, предварительно ожиженного ЦГТазой P. ehimensis IB-739). Для этих це лей в ферментационную среду добавляли исследуемое вещество в количестве, определяемом из стехиометрического соотношения комплексант: ЦД = 1:1, предполагая, что выход ЦД, составит не менее 50% от количества субстрата.
Результаты испытания ряда сольвентов в процессе ферментолиза и их влияния на суммарный выход ЦД, а также выход их индивидуальных форм представлены на рисунке 11. По этим данным, в контрольном варианте опы та, при суммарном выходе ЦД 61,3%, соотношение -, - и -ЦД составило 28,0: 59,6: 12,4 % масс., что можно рассматривать в качестве равновесного состава продуктов реакции для данной ЦГТазы.
Большинство испытанных комплексообразователей существенно уве личивают суммарный выход ЦД: избирательно повышают выход -ЦД, но приводят к снижению доли - и -ЦД в конечном продукте.
При использовании элементной серы общий выход ЦД увеличивался незначительно – на 8-10%. Следует отметить, что при этом, соотношение -:
-:
-ЦД практически не изменялось по сравнению с результатами конверсии крахмала без добавления комплексообразователей и составило 28,1: 59,0:
12,9 % масс., что соответствует равновесному состоянию при выходе 67,8%.
Известно, что ЦД плохо подходят для получения комплексов с неорга ническими соединениями (Szejtli, 1988). В отношении серы известно, что она образует комплекс включения с -ЦД, в котором она представлена в алло тропной форме S8 (Патент РФ № 2321598, 2008). Получение комплексов включения ЦД с серой затрудняется ее чрезвычайно низкой растворимостью в водных средах. Возможно, невысокий выход ЦД при добавлении Рисунок 11. Состав продуктов ферментативной конверсии крахмала при использовании различных комплексообра зователей. В качестве субстрата использовали 5%-ный картофельный крахмал. Дозировка ЦГТазы 10,0 ед на 1,0 г субстрата.
комплексообразователя может быть связан с недостаточной доступностью элементной серы для комплексообразования с ЦД в реакционных растворах.
С целью преодоления этой проблемы мы решили использовать различ ные формы серы, а именно коллоидную, полученную из гипосульфита натрия (Методические разработки…, 1999), и механо-активированную, полу ченную при ее механической обработке в дезинтеграторном устройстве. В другом варианте мы решили использовать раствор серы. Эмпирически был подобран растворитель для элементной серы – метилэтилкетон (МЭК), со гласно предварительным испытаниям, не сдвигающий равновесие в сторону образования - или -ЦД. Предварительно была определена растворимость серы в МЭК, составившая 5,24±0,2 мг/ мл.
В серии экспериментов была осуществлена ферментативная трансфор мация 10%-ного деполимеризованного картофельного крахмала ЦГТазой P. ehimensis IB-739 (в дозировке 10 ед/г) в присутствии серы и ее раствора в МЭК (при стехиометрическом соотношении комплексант : ЦД = 1:1). В таб лице 2 представлены полученные результаты.
Таблица 2. Состав продуктов ферментативной конверсии 10%-ного «ожи женного» картофельного крахмала при использовании различных форм серы в качестве комплексообразователей Соотношение ЦД в реакционной смеси, Общий % масс.
Сольвент выход ЦД, альфа- бета- гамма % Без сольвента 36,07 30,9 57,1 12, Сера механо 44,22 27,6 69,3 3, активированная Сера коллоидная 50,85 32,1 63,4 4, Сера в МЭК 65,01 29,0 65,8 5, Из представленных данных следует, что в варианте с сочетанием двух комплексообразователей (Сера+МЭК), степень конверсии 10%-ного карто фельного крахмала повышается до 65-67%. Без использования комплексооб разователей суммарный выход ЦД не превысил 36%. Существенного измене ния соотношения -, -, -ЦД по сравнению с контролем не происходит и, та ким образом, данная смесь комплексообразователей позволяет осуществить конверсию крахмала с более высоким выходом одновременно трех гомоло гов.
Разработка лабораторной технологии получения ЦД полифракционного состава С применением сочетания широкоспецифичной ЦГТазы P. ehimensis IB-739 и бинарного комплексообразователя была разработана лабораторная технология получения ЦД полифракционного состава, включающая следую щие основные этапы (рис. 12):
Крахмал ЦГТаза Ожижение и Буферные клейстеризация Р. ehimensis IB-739 компоненты Элементная сера в Ферментативная ЦГТаза Р. ehimensis IB- растворе МЭК трансформация Продукты конверсии Инактивация ЦГТазы Р. ehimensis IB- Гидролиз остаточного крахмала и Глюкоамилаза линейных декстринов Дистилляция МЭК Сера Фильтрация Сушка Сухая реакционная смесь, содержащая альфа-, бета-, гамма- ЦД Рисунок 12. Схема получения смеси циклодекстринов.
1. Подготовка субстрата для ферментативной конверсии.
В качестве субстрата был использован 15%-ный картофельный крах мал. Оптимальная дозировка ЦГТазы P. ehimensis IB-739 для ожижения по предварительным экспериментам составила 0,2 ед на 1,0 г АСВ крахмала.
2. Ферментативная конверсия в присутствии бинарного комплексооб разователя.
Дозировка ЦГТазы P. ehimensis IB-739 для реакции циклизации соста вила 10,0 ед на 1,0 г крахмала.
Предварительно были подобраны оптимальная концентрация МЭК (5% об/об) и элементной серы (5%) в растворе МЭК для получения наибольшего выхода ЦД без существенного изменения соотношения между -, -, -ЦД.
Основываясь на результатах исследования динамики конверсии крах мала, комплексообразователь следует вносить в первые несколько часов ве дения ферментолиза, поскольку именно в это время отмечалась максималь ная скорость накопления ЦД под действием ЦГТазы.
Ферментативную конверсию проводили при температуре 450С и рН 6,0, которые были выбраны исходя из особенностей применяемой для конверсии крахмала ЦГТазы штамма.
Время ведения процесса ограничили 24 часами, так как к этому сроку скорость конверсии крахмала в ЦД замедляется настолько, что дальнейшее ведение процесса нецелесообразно.
3. Выделение, разложение комплекса и получение ЦД.
Для освобождения конверсионной смеси от остаточного крахмала и линейных декстринов был проведен гидролиз реакционной смеси глюкоами лазой при 700С в течение 10 ч, после предварительной инактивации ЦГТазы P. ehimensis IB-739 термообработкой при 1000С.
Дистилляция получаемой водной суспензии комплекса до объема 50% от первоначального и последующая фильтрация приводит к его разрушению и удалению МЭК и серы.
Таким образом, в лабораторных условиях продемонстрирована воз можность получения ЦД полифракционного состава на основе технологии, включающей использование широкоспецифичной ЦГТазы P. ehimensis IB 739 и бинарной системы МЭК-Сера в качестве комплексообразователя при конверсии крахмала. Данная технология обеспечивает наличие в конечном продукте трех гомологов -, -, -ЦД, в соотношении соответствующем на тивному, а именно 25,6: 66,3: 8,1 % масс. с общим выходом циклодекстринов до 75%.
ВЫВОДЫ На основании тестирования коллекционных культур выбран 1.
штамм, продуцирующий циклодекстринглюканотрансферазу широкой спе цифичности. Согласно физиолого-биохимическим, культурально морфологическим характеристикам и последовательности гена 16S рРНК, штамм идентифицирован как Paenibacillus ehimensis IB-739.
Изучены физико-химические и каталитические свойства ЦГТазы 2.
P. ehimensis IB-739. Максимальная каталитическая активность проявляется в интервале температур 40–450С, оптимум рН=6,0, pH-стабильность в интерва ле 5,5–8,5, термостабильность – до 600С.
Подобраны условия предподготовки крахмальных растворов вы 3.
сокой концентрации для ферментолиза и определены оптимальные парамет ры ферментативной конверсии крахмала ферментом P. ehimensis IB-739 для получения ЦД с нативным соотношением гомологов (ЦД полифракционного состава): доза фермента 10,0 ед/г субстрата;
концентрация крахмала 5,0 15,0%, продолжительность процесса ферментолиза – 8-12 ч.
Исследован процесс ферментативной конверсии крахмала с ис 4.
пользованием комплексообразователей и разработан бинарный сольвент – МЭК-Сера, обеспечивающий выход ЦД не ниже 75%, при сохранении натив ного соотношения гомологов.
Разработана схема получения ЦД полифракционного состава, ос 5.
нованная на использовании широкоспецифичного фермента P. ehimensis IB 739 и нового бинарного сольвента в качестве неспецифичного комплексооб разователя.
БЛАГОДАРНОСТИ Свою искреннюю благодарность автор выражает д.б.н., профессору А.И. Мелентьеву за помощь при подготовке рукописи диссертации. Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Е.А. Гильвановой и к.б.н.
Е.А. Щелчковой за постоянное внимание и помощь в работе. Автор искренне благодарит всех сотрудников лаборатории прикладной микробиологии ИБ УНЦ РАН за постоянную поддержку в процессе выполнения работы.
Особую признательность и благодарность автор выражает безвременно ушедшему из жизни первому научному руководителю к.б.н., доценту Н.Г. Усанову за идейное вдохновение, научно-методическое руководство и ценные советы.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Федорова П.Ю., Усанов Н.Г., Андресон Р.К., Гильванова Е.А. Paenibacil lus ehimensis ИБ-739 в биотехнологии утилизации нефтяных шламов // Вестник Оренбургского государственного университета.– Спецвыпуск.
Проблемы экологии Южного Урала.– 2009.– № 3.– С. 506-508.
2. Федорова П.Ю., Усанов Н.Г., Гильванова Е.А. Бактерии Paenibacillus ehimensis – новый источник циклодекстринглюканотрансфераз // Мате риалы Международной научно-практической конференции «Совре менная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные проекты и бионанотехнология», 26 апреля – 8 мая 2010 года, г. Брянск / Изд-во: «Ладомир». –Брянск, 2010.– С. 124-129.
3. Усанов Н.Г., Федорова П.Ю., Гильванова Е.А., Егуткин Н.Л. Метил трет-бутиловый эфир: новый комплексообразователь для биотехнологии -циклодекстрина // Материалы Международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия», 26 – 28 мая 2010 года, г. Са ранск / Изд-во Мордов. ун-та, 2010.– С. 54-55.
4. Федорова П.Ю., Усанов Н.Г., Гильванова Е.А. Бактерии Paenibacillus ehimensis – новый продуцент циклодекстринглюканотрансферазы // Ма териалы VI Молодежной школы-конференции с международным уча стием «Актуальные аспекты современной микробиологии», 25 – 27 ок тября 2010 года, г. Москва / Изд-во: ООО «МАКС пресс». – Москва, 2010.– С. 159-161.
Федорова П.Ю. Бактерии Paenibacillus ehimensis – источник цикло 5.
декстринглюканотрансфераз // XVIII Международная конференция сту дентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011»;
секция «Био логия»;
11 – 15 апреля 2011 года;
Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет. – М.: МАКС Пресс, 2011.– С. 171.
Федорова П.Ю., Усанов Н.Г., Гильванова Е.А. Бактерии Рaenibacillus 6.
ehimensis – новые циклодекстриногенные микроорганизмы // БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА: 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых;
секция «Биология и экология микроорганизмов», 18 – 22 апреля 2011 года, г. Пущино.– С. 347.
Федорова П.Ю., Гильванова Е.А., Усанов Н.Г. Сравнение кинетических 7.
свойств различных циклодекстринглюканотрансфераз // Известия Са марского научного центра Российской академии наук.– 2011.– Т. 13, №5(3).– С. 203-206.
Федорова П.Ю., Андресон Р.К., Алехин Е.К., Усанов Н.Г. Природные 8.
циклические олигосахариды – циклодекстрины в системах доставки ле карств // Башкирский медицинский вестник.– 2011.– № 4.– С. 125-131.
9. Gilvanova E.A., Aktuganov G.E., Fedorova P.Y., Melentjev A.I., Usanov N.G. Paenibacillus ehimensis partial 16S rRNA gene, strain IB-739 // EMBL Nucleotide Sequence Database.- 2009. - Accession number FN582329.