Цитологический и изоферментный анализ видов рода agaricus fr. emend. karst.

На правах рукописи

МАТРОСОВА Елена Викторовна ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ И ИЗОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ВИДОВ РОДА AGARICUS Fr. emend. Karst.

Специальность 03.00.24. – микология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Научный консультант:

доктор биологических наук Камзолкина Ольга Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Коломиец Оксана Леонидовна кандидат биологических наук Сафрай Алла Иосифовна

Ведущая организация:

Главный Ботанический Сад им. Н.В.Цицина РАН, Москва.

Защита состоится 11 мая 2007 года в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу:

119992, ГСП-2, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1, тел./факс (095) 939-39-70.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан _ 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.А.Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

Актуальность темы.

Представители рода Agaricus являются объектом пристального вни мания многих исследователей. Прежде всего, это вид Agaricus bisporus (Lange) Imbach – культивируемый шампиньон. По объему производства плодовых тел этот гриб занимает первое место в мире, его выращивают более чем в 80 странах (Xu et al., 1997;

Chang, 1999). Одной из серьезных проблем в культивировании шампиньона является недостаток нового ге нетического материала для селекции сортов и штаммов (Дьяков и др., 1996;

Гарибова, 2003). Во многих работах отмечен высокий уровень гене тической гомологии коммерческих штаммов A.bisporus (Royse, May, 1982;

Raper, 1987;

Можина и др., 1993). Анализ диких популяций показывает, что они содержат большое количество новых генотипов, не представлен ных в коллекциях культивируемых линий (штаммов), и, соответственно, могут служить источником нового генетического материала, необходимо го для селекции штаммов и сортов культивируемого шампиньона двуспо рового (Raper, 1987;

Kerrigan, Ross, 1989). Проблема использования диких штаммов в селекции заключается в том, что в природе они встречаются крайне редко (Гарибова, 1964;

Гарибова, 2003). Поэтому поиск и иденти фикация дикорастущих штаммов шампиньона могут быть очень полезны в качестве источника нового генетического материала.

Ряд других видов рода также являются объектами промышленного культивирования или рассматриваются в качестве потенциально культи вируемых видов (Elliott, 1978;

Kerrigan et al., 1999;

Calvo-Bado et al., 2000;

Гарибова, 2003). Для некоторых представителей рода описана противо микробная, противовирусная, противоаллергенная и противоопухолевая активность (Wasser, Weis, 1999;

Mizuno et al., 1999;

Ohno et al., 2001;

Beel man et al., 2004;

Lin, Yang, 2006), в связи с чем особое внимание уделяется глубинному культивированию видов рода Agaricus.

Однако несмотря на отмеченную многими авторами практическую значимость видов рода Agaricus, имеются лишь единичные разрозненные работы, посвященные цитологическому анализу его представителей. Наи более подробно исследована цитология вида A. bisporus (Evans, 1959;

Сте панова, Васильев, 1994;

Камзолкина, 2005). Цитология и ультраструктура поверхностного мицелия других видов рода Agaricus практически не изу чена, а исследования ядерного аппарата ограничены, как правило, под счетом среднего числа ядер в клетке (Raper, 1976;

Hou, Elliott, 1978;

Raper, Kaye, 1978;

Sonnenberg, Fritsche, 1989;

Molitoris et al., 1996). Анализ роста глубинного мицелия ограничен биотехнологическими работами, в кото рых не уделяется внимание особенностям цитологии и биологии иссле дуемых объектов. В связи с возросшим научным и практическим интере сом к агарикоидным грибам назрела необходимость провести подробное изучение морфологии, цитологии и ультраструктуры мицелия видов рода Agaricus.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: провести комплексное морфолого-цитологическое ис следование 9 видов рода Agaricus, принадлежащих к разным экологиче ским группам.

Были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать критерии отбора дикорастущих штаммов вида A.

bisporus.

2. Сравнить изоферментный набор неспецифических эстераз у 9 видов рода Agaricus, представителей гумусовых сапротрофов, подстилочных сапротрофов и сапротрофов – «гербофилов».

3. Исследовать макро- и микроморфологию мицелия 9 видов рода Aga ricus в поверхностной культуре на разных средах и при разных темпера турах.

4. Исследовать макро- и микроморфологию мицелия 9 видов рода Aga ricus в глубинной культуре.

5. Провести сравнительное описание ультраструктуры клеток мицелия видов рода Agaricus в поверхностной и глубинной культурах.

6. Исследовать влияние ингибиторов транскрипции и трансляции бел ков на рост глубинного мицелия видов рода Agaricus.

Научная новизна работы. Впервые проведено всестороннее цито логическое исследование 31 штамма из 9 видов рода Agaricus в условиях роста в поверхностной и глубинной культурах. Исследование микромор фологии мицелия показало общую для всех штаммов тенденцию к фраг ментации мицелия и формированию хламидоспороподобных клеток при естественном старении мицелия, росте на несбалансированных средах, при повышенной температуре и в глубинной культуре.

Впервые для большинства штаммов рода Agaricus была описана дифференциация поверхностного мицелия на два структурно отличных типа: основной вегетативный мицелий и его производное - тонкий безъя дерный мицелий. Подобную дифференциацию наблюдали только на сре де сусло-агар у мицелия возрастом 7 суток и 28 суток.

Впервые проведено исследование ультраструктуры гетерокариотиче ских штаммов 9 видов рода Agaricus, которое позволило выявить общую для всех исследуемых штаммов особенность структуры клеток мицелия при росте в глубинной культуре, заключающуюся в тесной ассоциации рибосом с внешней митохондриальной мембраной.

Продемонстрировано положительное влияние ингибиторов транс крипции и трансляции белков на рост глубинного мицелия штаммов рода Agaricus.

Охарактеризовано два типа распределения хондриома у видов рода Agaricus при росте на разных средах.

Практическая значимость. Охарактеризованы основные крите рии отбора дикорастущих штаммов шампиньона двуспорового на примере трех выделенных из природы штаммов рода Agaricus. Данные исследова ния могут быть в дальнейшем использованы в грибоводческих хозяйствах, а выделенные из природы и подробно исследованные штаммы вида A.

bisporus могут представлять определенную ценность для последующей се лекционной работы.

Проведенное исследование цитологии и ультраструктуры клеток ми целия штаммов рода Agaricus при росте в поверхностной и глубинной культурах имеет в основном фундаментальное значение и вносит вклад в понимание базовых процессов, контролирующих рост, развитие, старение и гибель грибной клетки. Практическое значение данного исследования обусловлено тем, что понимание ключевых этапов жизнедеятельности грибной клетки может помочь в решении ряда биотехнологических про блем, в частности, пролить свет на причины неудовлетворительного роста видов рода в глубинной культуре.

Штаммы рода Agaricus могут быть хорошим объектом для изучения феномена связи рибосом с внешней митохондриальной мембраной и про цессов старения грибной клетки in vivo.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2003), Международной конференции, посвя щенной 100-летию начала работы профессора А.С.Бондарцева в Ботани ческом институте им. В.Л.Комарова РАН (Санкт-Петербург, 2005);

Треть ем съезде общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова (Москва, 2005);

Международной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» памяти профессора М.В.Гусева (Москва, 2006);

Международной конференции «Грибы и водо росли в биоценозах - 2005», посвященной 75-летию Биологического фа культета МГУ им. М.В.Ломоносова (Москва, 2006);

I (IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (2006), а также на заседаниях кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них - в рецензируемых журналах, 1 обзор сдан в печать.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения и че тырех глав, посвященных обзору литературы, материалам и методам ис следования, а также двух глав с описанием результатов, иллюстраций и заключений к каждой главе, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на _ страницах, содержит таблиц и рисунков. Список литературы включает _ наименований, из них _ - зарубежные, в том числе – интернет-источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы В обзоре литературы систематизированы данные по систематике, экологии и практической значимости представителей рода Agaricus;

рас смотрены жизненные циклы агариковых грибов, с акцентом на особенно стях онтогенеза амфиталличного шампиньона двуспорового и других ви дов рода;

проанализированы данные по ядерному аппарату вегетативного мицелия и плодовых тел видов рода, а также описаны системы несовмес тимости агариковых грибов.

Глава 2. Материалы и методы исследования Объекты исследования.

Объектами исследования был 31 штамм из 9 видов рода Agaricus (A.

bisporus, A. arvensis Schaeff.: Secr., A. silvaticus Schaeff.: Secr., A. bitorquis (Quel.) Sacc., A. campestris Fr. s. restr. J. Lge., A. xanthodermus Genev., A.excellens (Mller) Mller, A. abruptibulbus Peck., A. macrocarpus (Mller) Mller), из них 17 гетерокариотических и 14 гомокариотических (табл. 1). В ряде опытов для сравнения исследовали 2 штамма из 2х видов рода Pleu rotus (P. ostrestus (Jacg.) P. Kumm и P. pulmonarius (Fr.) Quel.). Два гомо кариотических штамма вида A. bisporus var. bisporus (GDR – 2-40 и Pc17 3) использовали в опытах по гибридизации с гомокариотическими потом ками диких штаммов шампиньона двуспорового.

Изучение критериев отбора штаммов вида A. bisporus из природы проводили на трех штаммах рода Agaricus, найденных в 2003-2004 гг. в г.Москва. У двух штаммов (Bs83, Bs84) большинство базидий несло по две споры (они были отнесены к виду A. bisporus), а третий (Ac83) по макро морфологическим признакам был похож на плодовые тела белой разно видности двуспорового шампиньона (промышленные сорта), но большин ство базидий содержало по четыре споры.

Методы исследования.

Поверхностное культивирование мицелия проводили в термо статируемых условиях на агаризованных средах: сусло-агар (СА, 1,6°Б), картофельно-глюкозный агар (КГА), голодный агар (ГА) при 24 ± 1°С в течение 7, 14 и 28 суток.

Глубинное культивирование проводили на жидком сусле (ЖС, 1,6°Б) в колбах Эрленмейера на ротационной качалке при 200 об/мин ( ± 1°С) в течение 7-28 суток с объемом среды в колбе 50, 100 и 150 мл. В ряде экспериментов в колбы со 100 мл ЖС добавляли 15, 75 или 150 мкг агара на колбу.

Для исследования влияния ингибиторов синтеза белков на рост грибов в глубинной культуре мицелий исследуемых штаммов выращива ли на ЖС, по 100 мл среды в колбе в течение 7 суток на ротационной ка чалке при 200 об/мин. Затем в колбы добавляли ингибиторы синтеза бел ков: актиномицин D, эритромицин, хлорамфеникол в концентрациях нм/л и 500 нм/л и продолжали культивирование. Параметры роста мице лия оценивали на 2-е сутки роста культур после внесения ингибиторов.

Выделение моноспоровых и многоспоровых культур прово дили с одно- и двухсуточных споровых отпечатков Bs83, Bs84 и Ac83 на КГА с добавлением антибиотиков (ампициллин (2,5 мкг/мл), гентамицин (2,5 мкг/мл), фундазол (5 мкг/мл)). В связи с низкой жизнеспособностью спор их прорастание стимулировали зерновым мицелием шампиньона.

Таблица 1.

Штаммы родов Agaricus и Pleurotus, используемые в работе.

Ядерный ста Вид Штамм Происхождение Способ выделения тус Bs83 Москва Культура ткани Гетерокарион Bs83-4 Споровый отпечаток Bs83 Моноспоровый изолят Гомокарион Bs83-15 Споровый отпечаток Bs83 Моноспоровый изолят Гомокарион Bs83-19 Споровый отпечаток Bs83 Моноспоровый изолят Гомокарион Bs84 Москва Культура ткани Гетерокарион Bs84-1 Споровый отпечаток Bs84 Моноспоровый изолят Гомокарион Bs84-2 Споровый отпечаток Bs84 Моноспоровый изолят Гомокарион Bs84-3 Споровый отпечаток Bs84 Моноспоровый изолят Гомокарион Bs26 INRA, Франция Мицелиальная культура Гетерокарион Bs26/3 Споровый отпечаток Bs26 Моноспоровый изолят Гомокарион A. bisporus Bs94 INRA, Франция Мицелиальная культура Гетерокарион Bs423 INRA, Франция Мицелиальная культура Гомокарион U3 Совхоз «Заречье» Мицелиальная культура Гетерокарион U3 1/1 Споровый отпечаток U3 Моноспоровый изолят Гомокарион U3 1/3 Споровый отпечаток U3 Моноспоровый изолят Гомокарион Споровый отпечаток Pc Pc17-3 Моноспоровый изолят Гомокарион (Венгрия) GDR-2- Споровый отпечаток GDR- Моноспоровый изолят Гомокарион 40 (Германия) Aba Алтайский заповедник Культура ткани Гетерокарион BiC Москва Культура ткани Гетерокарион A. bitorquis Bit Коллекция Гарибовой Л.В. Мицелиальная культура Гетерокарион Скрещивание моноспо Aahet Краснодарский край Гетерокарион ровых культур A. arvensis Aa 5.3 Краснодарский край Моноспоровый изолят Гомокарион AcA Москва Культура ткани Гетерокарион Ac83 Москва Культура ткани Гетерокарион Ac83-1 Споровый отпечаток Ac83 Моноспоровый изолят Гомокарион A.campestris Ac83-2 Споровый отпечаток Ac83 Моноспоровый изолят Гомокарион Ac83-3 Споровый отпечаток Ac83 Моноспоровый изолят Гомокарион AsM Московская обл. Культура ткани Гетерокарион A. silvaticus AsY Московская область Культура ткани Гетерокарион Am150 Венгрия, Будапешт Мицелиальная культура Гетерокарион A. macrocarpus Aa284 БИН им Комарова Мицелиальная культура Гетерокарион A.abruptibulbus Ae145 Венгрия, Будапешт Мицелиальная культура Гетерокарион A. excellens Ax1517 Киев Мицелиальная культура Гетерокарион A.xanthodermus НК-35 Коллекция ВВЦ Мицелиальная культура Дикарион P.ostreatus VP-1 Московская обл. Моноспоровый изолят Дикарион P. pulmonarius Гибридизацию проводили двумя способами:

На КГА. На чашки Петри с КГА помещали два моноспоровых изоля та на расстоянии 15 мм и инкубировали при 24 ± 1°С в течение 12-14 су ток.

На зерне. В пробирки с зерном, приготовленном по Лемке (Lemke, 1972), в верхней трети столбика помещали два моноспоровых мицелиаль ных изолята, располагая их вплотную друг к другу. Инкубировали при ± 1°С в течение 20-22 суток.

Получение плодовых тел штаммов A. bisporus. Плодовые тела выращивали в камере искусственного климата с контролируемыми пара метрами влажности и температуры и собирали на стадии зрелого частного покрывала.

Люминесцентная микроскопия. В чашки Петри на СА инокули ровали блок с мицелием, рядом с ним помещали стерильные покровные стекла. Чашки инкубировали в термостате при температуре 24 ± 1°С. На росший на стекло мицелий прижизненно окрашивали родамином 6Ж (1:100000) для выявления митохондрий (Butt et al., 1989) или фиксирова ли модифицированной жидкостью Карнуа (Evans, 1959) с последующим окрашиванием реактивом ДАПИ в течение 10 минут для выявления ядер (Ota et al., 1998).

Просмотр препаратов. Препараты просматривали на микроскопе Axioskop 40 FL при увеличениях объективов х40, х100. Для просмотра препаратов, окрашенных ДАПИ и родамином, использовали светофильт ры фирмы «Zeiss» №02 и 15 соответственно. Фотографировали с помо щью камеры AxioCam MRc.

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ). Для ис следования методом ТЭМ образцы мицелия подготавливали по описан ному ранее методу (Камзолкина, 1996). Ультратонкие срезы окрашивали водным раствором уранил-ацетата с последующим докрашиванием по Рейнолдсу (Reynolds, 1963) и исследовали с помощью микроскопа “Jeol” (JEM-100B) и «U12» (Hitachi).

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Мицелий на блоке с агаром фиксировали в парах осмия (Камзолкина, 1996). После вы сушивания образцы напыляли смесью платина / палладий (IB-3 Ion Coater) и просматривали с помощью СЭМ «Hitachi» S-405A.

Электрофорез. Применяли вертикальный электрофорез в полиак риламидном геле (PAGE) для изоферментов эстеразы (Уильямс, Уилсон, 1978). Для оценки данных использовали метод кластерного анализа с не взвешенным попарным средним (UPGMA). Для расчета генетических дис танций и анализа с последующей оценкой достоверности использовали программу Treecon for Windows (Version 1.2).

Фотографии обрабатывали в программе Axiovision 3.1. Статистиче скую обработку данных проводили в программе Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 3. Изучение свойств изолированных из природы штаммов шампиньона двуспорового (Agaricus bisporus) и четы рехспорового штамма рода Agaricus Выделение моноспоровых и многоспоровых культур.

Прорастание спор. Учет прорастания спор показал, что жизнеспо собность спор на КГА со стимуляцией живым мицелием у четырехспоро вого штамма выше, чем у двуспоровых штаммов (табл. 2). Процент про растания на чашках со стимуляцией был значительно выше, чем без нее, что согласуется с литературными данными (Losel, 1964;

Saksena et al., 1976).

Таблица 2.

Прорастание спор выделенных из природы штаммов рода Agaricus (в % от общего числа высаженных спор).

Bs83 Bs84 Ac Прорастание со стимуляцией 1,6 2,45 3, спор (в %) без стимуляции 0,05 0,34 0, Макроморфология колоний. Скорость и характер роста мицелия предположительно моноспоровых культур – потомков природных штам мов Bs83, Bs84 и Ac83, изолированных на 12-20 сутки роста, изучали на среде СА. Описание макроморфологии колоний было проведено по схеме Л.В. Гарибовой (1964). У штаммов Bs83 и Bs84 было выделено по 4 типа колоний (2 – быстрорастущих, колонии достигают 60-80 мм в диаметре на 12-е сутки роста;

2 – медленнорастущих, диаметр колоний на 12-е сутки роста не превышает 40 мм), у штамма Ac83 – 3 типа колоний (2 - быстро растущих;

1 - медленнорастущий). Два типа колоний: быстрорастущие с хорошо развитым воздушным мицелием и медленнорастущие, прижатые, с не развитым воздушным мицелием, - оказались сходными у всех иссле дуемых штаммов (рис. 1), однако, скорость роста колоний штамма Ac при данных условиях была значительно выше, чем скорость роста сход ных по морфологии колоний штаммов Bs83 и Bs84.

Медленнорастущие ко лонии были отсеяны как наиболее вероятные кандидаты в гомокарио ны (Kligman, 1943;

Dick hardt, 1985;

Castle et al., 1987). Всего у штаммов Bs83, Bs84 и Ac83 было выделено по три моно Рис.1. Макроморфология быстрорастущих (А) и споровых культуры, го медленнорастущих колоний (B), сходных у штам- мокариотический статус которых был подтвер мов Bs83, Bs84 и Ac83.

жден методом верти кального электрофореза с окрашиванием на неспецифические эстеразы и тестами на фертильность.

Гибридизация. Мы проанализировали способность исследуемых штаммов Bs83, Bs84 и Ac83 образовывать гибриды со штаммами, принад лежащими к A.bisporus var. bisporus (тестеры). Для скрещиваний были использованы 9 гомокариотических изолятов исследуемых штаммов:

Bs83- 4, 15, 19;

Bs84 – 1, 2, 3;

Ac83 – 1, 2, 3, которые были скрещены с го мокариотическими культурами-тестерами GDR -2 – 40;

Pc17 – 3;

Bs26/3;

U3 1/1;

U3 1/3 и между собой.

Успешными гибридами на КГА считались те, у которых изменялся ха рактер роста мицелия в зоне срастания за счет интенсивно растущих гиф с образованием валика или сектора быстрорастущего мицелия (Calvo-Bado et al., 2000;

Дьяков, 2003). В результате опытов было получено 5 предпо ложительно гибридных комбинаций (табл. 3): U3 1/3 x Bs83-4, U3 1/3 x Bs83-19, GDR-2-40 x Bs83-15, Bs26/3 x Bs83-4, Bs83-4 x Bs84-3.

Таблица 3.

Гибридизация моноспоровых штаммов на агаризованной среде.

GDR штаммы U3 1/1 U3 1/3 Pc17-3 Bs26/3 Bs83-4 Bs83-15 Bs83- 2/ ± ± Bs83-4 + x x x - + ± ± ± Bs83-15 x x x + ± ± ± Bs83-19 - x x x + ± ± ± Aс83-1 - - - ± ± ± Aс83-2 - - - ± ± ± Aс83-3 - - - ± Bs84-1 - - - - - - ± ± ± ± Bs84-2 - - - ± ± ± ± ± Bs84-3 - - + где + - взаимодействие с образованием сектора быстрорастущего мицелия (пред положительно гибридные);

± - срастание (признак несовместимой реакции);

- недорастание (признак несовместимой реакции);

х – скрещивание не проводи лось.

Успешными гибридами на зерне считались те, у которых характер роста изменялся по сравнению с характером роста родителей (увеличива лась скорость роста и изменялась морфология колоний). В результате бы ло получено 4 предположительно гибридные комбинации, идентичные таковым на КГА, за исключением гибрида U3 1/3 х Bs83-19.

Истинность полученных гибридов была подтверждена методом вер тикального электрофореза с окрашиванием на неспецифические эстеразы (Wang et al., 1991;

Грубе, 1994) и тестами на фертильность (Pelhman, 1967;

Kerrigan et al., 1992).

В нашем случае наиболее надежным методом оказалась гибридиза ция на КГА. Вероятно, причиной того, что не был сформирован успешный гибрид между штаммами U3 1/3 и Bs83-19 на зерне, состоит в том, что го мокарион Bs83-19 не способен к росту на данной среде. Важно отметить, что штаммы Ac83-1,2,3 не формировали ни одного успешного гибрида с тестерными штаммами, принадлежащими к виду A. bisporus. Этот факт указывает, вероятно, на его принадлежность к другому виду, либо о час тичной или полной интерстерильности данного штамма по отношению к другим штаммам вида.

Плодовые тела. У штаммов Bs83 и Bs84 в лабораторных условиях были получены плодовые тела, по макроморфологическим признакам сходные с найденными в природе изолятами и отличающиеся более мел кими размерами, что можно объяснить условиями культивирования. У штамма Ac83 плодовых тел получить не удалось. Мицелий этого штамма очень медленно обрастал компост (около 2-х месяцев) и практически не обрастал покровную смесь. Этот факт позволяет сделать предположение, что данный штамм, по-видимому, принадлежит к другой экологической группе (Lambert, 1961;

Гарибова 1982, 2003).

Изучение базидий и базидиоспор у плодовых тел исследуе мых штаммов показало, что размер спор штаммов Bs83 и Bs84 сравним со спорами штамма Bs26 (надежность – более 98%) (табл. 4). Споры штамма Ac83 мельче, чем споры штаммов Bs26, Bs83 и Bs84, но крупнее, чем споры четырехспоровых штаммов Bs94 и Bs423.

Таблица 4.

Размер спор у разных штаммов рода Agaricus.

Штамм Размер спор N (число измерений) Длина, мкм Ширина, мкм 7,37 ± 0,62 5,23 ± 0, Bs 83 (лабораторный изолят) 7,54 ± 0,55 5,56 ± 0, Bs84 (лабораторный изолят) 5,6 ± 0,36 4,46 ± 0, Bs94 7,24 ± 0,6 5,39 ± 0, Bs26 4,4 ± 0,43 3,3 ± 0, Bs423 7,49 ± 0,65 5,88 ± 0, Bs83 (природный изолят) 7,04 ± 0,88 5,695 ± 0, Bs84 (природный изолят) 6,46 ± 0,77 5,46 ± 0, Ac83 (природный изолят) Измерение базидий лабораторных изолятов штаммов Bs83 и Bs84 по казало, что ширина базидий исследуемых штаммов в 1,3 раза больше, чем у штамма Bs94 и в 1,5 раза больше, чем у штаммов Bs26 и Bs94. Длина стеригм превышает длину стеригм у других штаммов A. bisporus более чем в 2 раза, а ширина стеригм - в 2-4 раза (табл. 5). При этом размер ядер у штаммов Bs83 и Bs84 на всех стадиях морфогенеза базидий несколько меньше, чем у штамма Bs26. Надежность измерений – более 97%.

Таблица 5.

Размер базидий и стеригм разных штаммов A. bisporus.

размер стеригм ширина бази- ширина штамм n n дий длина в нижней час в средней части ти* Bs94 5,44 ± 0,65 11 2,07 ± 0,36 0,98 ± 0,1 0,6 ± 0,11 Bs423 4,75 ± 0,34 17 1,94 ± 0,27 0,94 ± 0,1 0,48 ± 0,11 Bs26 4,7 ± 0,5 21 2,28 ± 0,59 1,29 ± 0,36 0,79 ± 0,09 Bs83 7,3 ± 0,75 15 4,43 ± 0,87 2,54 ± 0,5 1,99 ± 0,6 Bs84 7,1 ± 0,45 18 3,6 ± 0,45 1,96 ± 0,28 1,6 ± 0,13 где n - число измерений, * - ширина стеригм в месте соединения с базидией Исследование изоферментных спектров неспецифических эстераз методом электрофореза у штаммов рода Agaricus.

Проведено сравнение электрофоретических спектров неспецифиче ских эстераз исследуемых штаммов Bs83, Bs84 и Ac83 с другими штамма ми вида A. bisporus и видами A. silvaticus, A. bitorquis, A. arvensis, A.

campestris, Pleurotus ostreatus, P. рulmonarius. На дендрограмме видно, что изоляты Bs83 и Bs84, ранее определенные как штаммы вида A. bis porus, кластеризуются вместе с другими штаммами шампиньона двуспо рового (рис. 2). Штамм Ac83 с высокой степенью достоверности попадает в один кластер со штаммом AcA, относящемуся к виду A. campestris. Этот факт позволяет сделать вывод о том, что не идентифицированный штамм Ac83 является представителем вида A. campestris.

Рис.2. Дендрограммы сходства видов рода Agaricus по неспецифическим эс теразам.

В нашем исследовании мы провели сравнение электрофоретических спектров эстераз у разных видов рода Agaricus, представителей разных экологических групп (гумусовые сапротрофы, подстилочные сапротрофы, сапротрофы-«гербофилы»). Было получено три больших достоверных кластера (рис.3). Первый кластер составляют виды A. bisporus (секция Duploannulatae, гумусовый сапротроф), A. bitorquis (секция Duploannu latae, гумусовый сапротроф), A. xanthodermus (секция Xanthodermatae, сапротроф-«гербофил»). Второй кластер – A. excellens (секция Arvenses, подстилочный сапротроф), A. silvaticus (систематическое положение дос товерно не установлено, подстилочный сапротроф), A. macrocarpus (сек ция Arvenses, подстилочный сапротроф), A. abruptibulbus (секция Arven ses, подстилочный сапротроф). Третий кластер – A. campestris (секция Agaricus, сапротроф-«гербофил»), A. arvensis (секция Arvenses, сапро троф-«гербофил»). Систематическое положение штаммов дано по по следним данным молекулярной систематики (Geml et al., 2004;

Kerrigan et al., 2005), принадлежность к экологической группе дана по работам Л.В.

Гарибовой (2003) и А.П. Григанського (1995). Мы предполагаем, что виды, принадлежащие к одной экологической группе, обладают сходной фер ментативной активностью, так как в один кластер преимущественно объе диняются виды - представители одной экологической группы. Исключе ние составляет штамм вида A. xanthodermus (Ax1517), который принад лежит к группе сапротрофов-«гербофилов», но объединяется вместе со штаммами видов A. bisporus и A. bitorquis (гумусовые сапротрофы). При чина этого явления, вероятно, в генетической близости секций Duploan nulatae и Xanthodermatae, показанной рядом авторов на основании дан ных молекулярной систематики (Geml et al., 2004;

Kerrigan et al., 2005). По нашему мнению, исследование ферментативных спектров неспецифиче ских эстераз методом электрофореза является подходящим методом для разделения штаммов и видов внутри рода Agaricus, определения видовой принадлежности неизвестных штаммов, установления принадлежности вида к экологической группе и т.д. Тем не менее, важно отметить, что в дальнейшем необходимо исследовать большее число видов рода для того, чтобы с уверенностью говорить о том, что является первопричиной объе динения штаммов в один кластер – генетическая близость или принад лежность к той или иной экологической группе.

Рис.3. Дендрограммы сходства видов рода Agaricus по неспецифическим эс теразам.

Для видов рода Agaricus характерна большая вариабельность макро морфологических признаков (Гарибова, 2003;

Challen et al., 2003), поэтому в настоящее время систематика рода основывается преимущественно на исследовании ДНК различными методами (Calvo-Bado et al., 2000;

Challen et al., 2003;

Geml et al., 2004 и др.), которые достаточно дороги и не всегда доступны. Помимо анализа ДНК, наиболее надежными методами уста новления видового статуса изолятов являются гибридизация и изозим ный анализ (Micales, Bonde, 1995;

Calvo-Bado et al., 2000 и др.). Но эти критерии, будучи применимы поодиночке, не всегда являются достаточно достоверными для установления видовой принадлежности штаммов рода Agaricus. Так, например, для ряда представителей первичногомоталлич ной популяции A. bisporus var. eurotetrasporus Callac et Guinberteau харак терна частичная интерстерильность по отношению к другим штаммам A.

bisporus и полная несовместимость с представителями собственной ва риации (Callac et al., 1998A). Для проведения изозимного анализа необхо дима максимальная стандартизация условий, так как на экспрессию генов влияет множество факторов (состояние окружающей среды, стадия жиз ненного цикла и т.д.) (Harris et al., 1976;

Paranjipe et al., 1979;

Можина и др., 1993);

кроме того, необходимо найти мономорфный локус и точно оп ределить пределы вариабельности внутри таксона (Micales, Bonde, 1995).

Поэтому для установления видовой принадлежности организма не доста точно использование одного критерия, а только комплекса культурально морфологических, биохимических, цитологических и генетических кри териев.

Глава 4. Особенности макро-, микроморфологии и ультраструк туры мицелия видов рода Agaricus при росте на разных типах сред Настоящая глава посвящена изучению вегетативного роста и струк туры мицелия видов рода Agaricus при различных условиях культивиро вания.

Макроморфология роста мицелия на средах СА, КГА, ГА.

Большинство гетерокариотических колоний видов рода Agaricus форми ровали колонии типов «C» и «B» на средах СА и КГА, но при этом значи тельно отличались между собой по ряду признаков: степени развития воз душного мицелия, зональности колоний, их плотности, способности к формированию секторов, скорости роста. На ГА все исследуемые штаммы формировали колонии типов «B», реже «A». Колонии гомокариотических штаммов имели сходную макроморфологию и принадлежали к морфоло гическому типу «А» (реже «B»).

Типы колоний даны по классификации Л.В.Гарибовой (1964): С - бы строрастущие колонии (12-е сутки роста, СА, диаметр колоний более мм), с хорошо развитым воздушным мицелием;

А – медленно растущие колонии (12-е сутки роста, СА, диаметр колоний менее 20 мм), воздушный мицелий развит слабо или не развит совсем;

В – переходные от медленно растущих к быстрорастущим колониям (12-е сутки роста, СА, диаметр ко лоний 30-40 мм), воздушный мицелий слабо развит.

Микроморфология роста штаммов рода Agaricus на агари зованных средах.

Микроморфология вегетативного поверхностного мицелия гомо- и гетерокариотических штаммов рода Agaricus была изучена в субапикаль ной зоне роста у молодых (7-е сутки роста) и более старых (28-е сутки рос та) культур, в результате чего было выявлено многообразие морфологиче ских форм вегетативного мицелия в процессе роста на агаризованных сре дах. Оно было представлено:

- обычным мицелием (толщиной 2-4,5 мкм), который преобладал на ранних стадиях развития у всех исследуемых штаммов на средах СА, КГА, ГА. Обычный мицелий был в той или иной мере инкрустирован кристал лами оксалата кальция, при росте на ГА практически вся поверхность гиф была покрыта кристаллами оксалата различной формы.

Для штаммов вида A. bitorquis на 7-е сутки роста на СА отмечена бо родавчатость на гифах (рис. 4). Природа этого явления до конца не ясна, некоторые авторы рассматривают бородавчатость как выделение экссудата (Stalpers, Vulg, 1983) или формирова ние кристаллов оксалата кальция особой фор мы (Гарибова, 1982). У ряда штаммов видов A.

campestris, A. bisporus, A. arvensis, A. xantho dermus, A. silvaticus преимущественно на более поздних стадиях роста (28-е сутки) на средах СА и КГА обычный мицелий формирует тяжи из параллельно идущих гиф и петли. Подобные структуры были ранее описаны для ряда грибов (Miller, 1971;

Pantidou et al., 1983;

Бухало, Рис.4. Бородавчатость на гифах штаммов A.bitorquis 1988), и в том числе для видов рода Agaricus (Molitoris et al., 1996).

(СА, 7-е сутки роста).

- тонким мицелием (толщиной 1 – 1,5 мкм), который присутствовал у всех штаммов на СА на более поздних стадиях роста (начиная с 28-х суток роста), а у некоторых штаммов уже на 7-е сутки роста (штаммы AcA (A.

campestris), Aahet (A. arvensis), AsM (A. silvaticus), U3 (A. bisporus)) (рис.

5). Подобный мицелий был ранее описан Ноблсом, как нитевидный, асеп тированный мицелий дереворазрушающих грибов (Nobles, 1965). К сожа лению, в работе не представлены фотографии и размеры, а только рисун ки данного типа мицелия. Позднее подобный мицелий был обнаружен О.В.Камзолкиной (2005) у ряда штаммов A. bisporus (на 28-е сутки роста), P. ostreatus и P. pulmonarius (на 7-е сутки роста) и назван поисковым по аналогии с «хоминговым» мицелием у грибов, отвечающим за специфи ческое взаимодействие артроконидий с гифами или гиф с гифами (Brodie, 1972;

Fries, 1983). Для остальных видов рода Agaricus такой мицелий опи сан впервые. На КГА и ГА дифференциация на обычный и тонкий мице лий отсутствует.

Рис.5. Обычный и тонкий мицелий (указан стрелкой).

Штаммы Bs26 (A.bisporus) (слева, СА, 28-е сутки роста) и U (A.bisporus) (СА, 7-е сутки роста).

- фрагментами мицелия (одноклеточными или многоклеточными), которые присутствуют на более поздних этапах развития на СА и КГА (28 е сутки роста) (рис. 6). Они, как правило, короче клеток обычных вегета тивных гиф и, по-видимому, выполняют функцию вегетативного размно жения культуры. Особенно сильно был фрагментирован мицелий гомока риотических штаммов. При росте на ГА мицелий всех штаммов образовы вал большое количество фрагментов уже на 7-е сутки роста. Мицелий не которых штаммов практически полностью состоял из фрагментов мице лия (штаммы Bs423 (A. bisporus), Aahet (A. arvensis)).

- хламидоспороподобными клетками и хламидоспорами, которые также наблюдали на более поздние сроки развития (рис. 7). Данные структуры, по-видимому, служат для перенесения неблагоприятных усло вий.

Рис.6. Фрагменты мицелия. Штаммы Рис.7. Хламидоспоры и хламидоспоропо Bs83-4 (A.bisporus) (слева, СА, 7-е су- добные клетки. Штаммы Bs тки роста) и Bs423 (A.bisporus) (КГА, (A.bisporus) (слева, СА, 28-е сутки роста) 28-е сутки роста) и Bs26 (A.bisporus) (СА, 28-е сутки роста) Макро- и микроморфология мицелия штаммов рода Agari cus при росте в глубинной культуре (ГК).

Для штаммов рода Agaricus характерен рост в форме пеллет в глу бинной культуре. Виды штаммов A. bisporus и A. bitorquis в глубинной культуре формировали округлые плотные или рыхлые пеллеты 2-15 мм в диаметре в количестве 15-20 штук на колбу (штаммы вида A. bisporus) и до 50 штук (штаммы вида A. bitorquis). Сухая биомасса составляла 4-5 г/л у штаммов вида A. bisporus и 8-12 г/л у штаммов вида A. bitorquis. Для ос тальных изученных в работе штаммов сухая биомасса мицелия при росте в глубинной культуре не превышала 2,5 г/л, пеллеты мелкие, овальные, размером не более 3 х 2 мм. Штаммы вида A. campestris не росли в глу бинной культуре при данных условиях.

Глубинный мицелий слабо ветвился, иногда гифы содержали боль шое количество липидных капель и вакуолей. Для всех штаммов на 7-е су тки роста была характерна тенденция к фрагментации мицелия и образо ванию коротких, округлых, хламидоспороподобных клеток, располагаю щихся терминально или интеркалярно, одиночно или цепочками. Степень фрагментации мицелия значительно возрастала по мере старения мице лия. Мицелий некоторых штаммов на 28-е сутки роста в ЖС практически полностью состоял из фрагментов (штаммы Bs94, Bs26 (A. bisporus), Aahet (A. arvensis), все гомокариотические штаммы). Ни для одного из иссле дуемых штаммов в ГК не обнаружена дифференциация мицелия на обыч ный и тонкий.

Прижизненное исследование митохондрий у клеток поверхностно растущего и глубинного мицелия изучаемых видов рода Agaricus было проведено на 3-и, 7-е, 12-е и 28-е сутки роста в трех зонах гифы: зона 1 – апикальный фрагмент гифы (до 30 мкм от апикального кончика);

зона 2 – клетки мицелия, удаленные от апикального кончика (30-100 мкм);

зона – зрелые клетки мицелия (более 100 мкм от апикального кончика).

Данное исследование позволило выделить два типа распределения зернистых и палочковидных митохондрий (отвечающих разному состоя нию хондриома) при росте мицелия штаммов рода Agaricus на разных ти пах сред. Первый тип наблюдали преимущественно у молодого (3-14 суток роста) мицелия исследуемых штаммов, выращенного на агаризованных средах (СА, КГА), а также в клетках глубинного мицелия штаммов A. bi torquis. Для этого типа характерны мелкие зернистые митохондрии в апи кальной зоне (зона 1), длинные палочковидные в субапикальной зоне (зо на 2) и зернистые, полученные в результате фрагментации палочковид ных митохондрий в зрелых клетках мицелия (зона 3) (рис. 8, А).

Второй тип наблюдали преимущественно в клетках глубинного и ста реющего мицелия штаммов рода Agaricus при росте на СА и в клетках ми целия гомокарионов, а также в клетках молодого и стареющего мицелия штаммов Agaricus при росте на КГА и ГА. Для этого типа характерны ша рообразные митохондрии в апикальной клетке (зона 1), скопления шаро образных митохондрий в виде отдельных конгломератов или единичные шаровидные митохондрии – в субапикальной зоне (зона 2) и отдельные шарообразные митохондрии в зрелых клетках мицелия (зона 3) (рис. 8, Б).

А. 1-й тип распределения хондриома Б. 2-й тип распределения хондриома Зона 1 (до мкм от апи кального кон чика) Зона 2 (30- мкм от апи кального кон чика) Зона 3 (более 100 мкм от апикального кончика) Рис.8. Типы распределение хондриома в клетках мицелия штаммов рода Agaricus при разных условиях роста (окрашивание родамином).

Исследование ядерного аппарата вегетативного мицелия при разных условиях культивирования (среды СА, ЖС) проводили по таким парамет рам, как размер интерфазных ядер, количество ядер в клетках и ядерно плазменное отношение (ЯПО) (количество ядер, отнесенное к длине ги фы, в которой производился подсчет).

Ядра в клетках поверхностного и глубинного мицелия (7-е сутки рос та) располагались в основном в центральной части гифы, по отдельности, крайне редко по два или собраны в группы. Размер ядер в клетках поверх ностной культуры разных штаммов составлял 2,5 – 3,5 х 1 – 1,6 мкм при окрашивании реактивом ДАПИ, форма ядер в основном округлая или ве ретеновидная. Размер ядер в клетках глубинной культуры был значитель но меньше по сравнению с поверхностной культурой у всех исследуемых штаммов и составлял в среднем 1-2 х 1-1,6 мкм. По форме большинство ядер были округлыми или овальными. Окрашивание тонкого мицелия ре активом ДАПИ не показало присутствия в нем ядер.

Количество ядер в клетках поверхностного мицелия на 7-е сутки роста варьируровал у разных штаммов, но в основном клетки мицелия штаммов рода Agaricus содержали от 1 до 8 ядер, при преобладании 2-5 ядерных клеток. Для мицелия возрастом 28 суток и глубинного мицелия было ха рактерно уменьшение среднего количества ядер на клетку. Значительно возрастало количество безъядерных клеток (у разных штаммов оно варь ирровало от 6% до 80% от общего числа клеток) и клеток с небольшим ко личеством ядер (от 1 до 3). Исключением из общей картины является вид A. bitorquis, клетки которого сохраняли стабильное дикариотическое со стояние, как при естественном старении мицелия (28-е сутки роста), так и при росте в ЖС.

Кроме того, для глубинного мицелия было характерно более низкое значение ЯПО по сравнению с поверхностной культурой, как в субапи кальной, так и в апикальной зонах роста мицелия (табл. 6). У штаммов видов A. bisporus и A. bitorquis ЯПО в поверхностной культуре превышало ЯПО в глубинной культуре в 1,3 – 2,16 раз (у штамма Bit значения ЯПО в поверхностной и глубинной культурах практически не отличались). У штаммов остальных видов ЯПО в поверхностной культуре превышало ЯПО в глубинной культуре в 2,16 – 6,25 раз.

Таблица 6.

ЯПО в апикальной и субапикальной зонах поверхностного и глубин ного мицелия штаммов рода Agaricus.

ЯПО (на 10 мкм длины гифы) ЯПО (ПК)/ ЯПО (ГК) Поверхностная культура Глубинная культура Вид Штамм N Субапи- Субапи Апикаль- Апикаль- Суб кальная кальная Апик ная зона ная зона апик зона зона Bs26 1,4 ± 0,28 1,22 ± 0,26 0,73 ± 0,2 0,6 ± 0,23 1,91 2,03 Bs94 1,61 ± 0,14 1,12 ± 0,17 0,92 ± 0,41 0,65 ± 0,18 1,75 1,72 Bs423 1,9 ± 0,32 1,51 ± 0,21 1,26 ± 0,3 0,7 ± 0,2 1,5 2,16 A.bisporus Bs83 1,33 ± 0,29 1,01 ± 0,31 0,7 ± 0,18 0,47 ± 0,16 1,9 2,15 U3 1,26 ± 0,3 1,15 ± 0,25 0,61 ± 0,25 0,55 ± 0,22 2,06 2,09 Bit 0,97 ± 0,18 0,55 ± 0,14 0,85 ± 0,27 0,58 ± 0,21 1,14 0,98 A.bitorquis BiC 1,4 ± 0,18 0,96 ± 0,26 1,03 ± 0,25 0,68 ± 0,14 1,36 1,44 Aahet 1,03 ± 0,21 0,92 ± 0,39 0,48 ± 0,27 0,22 ± 0,11 2,15 4,18 A.arvensis Aa5.3 1,73 ± 0,12 1,25 ± 0,25 0,43 ± 0,14 0,2 ± 0,08 4,02 6,25 Ax1517 1,46 ± 0,12 0,85 ± 0,28 0,73 ± 0,15 0,38 ± 0,17 2 2,23 A.xanthodermus AsM 1,73 ± 0,43 1,33 ± 0,31 0,78 ± 0,19 0,48 ± 0,27 2,22 2,77 A.silvaticus AsY 1,65 ± 0,29 1,27 ± 0,33 0,63 ± 0,24 0,37 ± 0,14 2,62 3,43 Aa284 1,3 ± 0,2 0,95 ± 0,19 0,6 ± 0,16 0,3 ± 0,17 2,16 3,17 A.abruptibulbus Ae145 1,93 ± 0,16 1,33 ± 0,43 0,76 ± 0,27 0,3 ± 0,11 2,54 4,43 A.excellens Am150 1,8 ± 0,19 1,15 ± 0,35 0,83 ± 0,37 0,42 ± 0,23 2,17 2,74 A.macrocarpus Таким образом, микроморфология глубинного мицелия отличается от микроморфологии равновозрастного поверхностного мицелия по це лому ряду признаков: тенденции к повышенной фрагментации мицелия и образованию хламидоспороподобных клеток, преобладанием зернистых митохондрий, размером и формой ядер, средним числом ядер на клетку и значением ЯПО. По вышеперечисленным показателям глубинный мице лий возрастом 7 суток напоминает стареющий поверхностный мицелий возрастом 28 суток. Ранее была высказана гипотеза об ускоренном старе нии клеток мицелия штаммов вида A. bisporus под действием стресса (глубинное культивирование) (Камзолкина, 2005). Изменение формы ядер и уменьшение числа ядер на клетку отмечено в литературе для ста реющих клеток плодовых тел (Степанова, Васильев, 1994). Кроме того, наиболее значительные изменения происходят в клетках тех штаммов, которые хуже всего растут в глубинной культуре (A. arvensis, A. silvaticus, A. xanthodermus), наименее – в клетках мицелия A. bitorquis, лучше всего растущего в глубинной культуре.

Анализ ультраструктуры клеток поверхностного и глубинного мице лия разных видов рода показал значительные отличия на уровне клеточ ных покровов и митохондрий.

Клеточные покровы.

Клеточные стенки (КС) в поверхностной культуре исследуемых штаммов имели типичную для базидиомицетов слоистую структуру и со стояли из 1-2, реже 3 слоев разной электронной плотности. Клеточные стенки в глубинной культуре были в 1,2 – 1,6 раз толще, чем в поверхно стной культуре у всех исследуемых штаммов (рис. 9) и состояли, как пра вило, из большего количества слоев (3-6). В КС большинства исследуемых штаммов наблюдали линзовидные включения, имеющие тонкогрануляр ную структуру, которые, вероятно, имеют белковую природу (Козлова, Камзолкина, 2004). В апикальном кончике растущей гифы, как в поверх ностной, так и в глубинной культуре наблюдали группы везикул и муль тивезикулярные тела, которые являются компонентами апикального тельца и отвечают за синтез компонентов КС (Grove, Bracker, 1970;

Gir bardt, 1979). В апикальном кончике тонкого мицелия наблюдали микро филаменты и не наблюдали везикул, что говорит, вероятно, об ином спо собе синтеза КС тонкого мицелия.

У штаммов вида A.arvensis бльшая часть содержимого клеток в ГК была разрушена. В клетках штамма этого вида не сохранилось каких-либо различимых компонентов, за исключением скоплений пузырьков, трубо чек и вакуолей различного размера. КС представлена одним тонким слоем средней электронной плотности и значительно тоньше КС в поверхност ной культуре (в 1,5 раза) (рис. 9) Толщина КС, нм Рис.9. Толщина клеточной стенки у разных штаммов и видов рода Agaricus при росте в поверхностной и глубинной культурах (7-е сутки рос та).

Митохондрии.

На срезах клеток поверхностно растущего мицелия профили мито хондрий выглядели довольно крупными относительно размеров клетки, преимущественно удлиненными или гантелеобразными в сечении струк турами (рис. 10). В среднем на продольный срез клетки приходилось 3- крупных митохондриальных профилей. Количество митохондриальных профилей значительно возрастало при культивировании в ЖС и достига ло 10-15 штук на срез. При этом форма митохондриальных профилей бы ла преимущественно шаровидная, и их размеры были значительно мельче митохондриальных профилей на срезах клеток поверхностной культуры.

Внутренняя мембрана митохондрий в ГК формировала пластинчатые кристы, реже встречались митохондрии с невыраженными кристами.

Наружная мембрана митохондрий в ГК большинства исследуемых штаммов была тесно ассоциирована с рибосомами (рис. 10). Степень вы раженности данного признака напрямую связана со способностью роста штаммов в ГК. Так, у штаммов, лучше всего растущих в ГК (A. bitorquis, Bs423), ассоциации митохондриальной мембраны с рибосомами обнару жено не было.

У некоторых штаммов (Bit, BiC (A. bitorquis), AcA, Ac83 (A. campestris), Bs26 (A. bisporus)) наблюдали единичные случаи локализации рибосом на наружной мембране митохондрий в поверхностной культуре, являющие ся, вероятно, случайным событием или связанным с начальным этапом старения клеток. У штаммов Aa284 (A. abruptibulbus) и Bs423 (A. bisporus) наблюдали большое количество рибосом на наружной мембране мито хондрий в поверхностной культуре.

а б в Рис.10. Морфология митохондрий штаммов рода Agaricus.

а – в поверхностной культуре (штамм Aahet (A. arvensis)) б, в – в глубинной культуре (б – штамм Ae145 (A. excellens);

в – Am150 (A.

macrocarpus)).

В литературе описана связь внешней митохондриальной мембраны с цитоплазматическими рибосомами в клетках Saccharomyces cerevisiae (Kellems, Butow, 1972;

Watson, 1972;

Kellems et al., 1974;

Kellems, Butow, 1974;

Kellems et al., 1975), Rhodothorula rubra (Keyhani, 1973), покоящихся спорах Dictyostelium discoideum (Cotter et al., 1969), клетках млекопитаю щих (Fnfschilling, Rospert, 1999;

Ades, Butow, 1980;

McKenzie, Payne, 2004). Предполагается, что механизм связывания рибосом с внешней ми тохондриальной мембраной подобен механизму связи рибосом с эндо плазматическим ретикулумом (ЭПР) (Kellems, Butow, 1972). Показано, что количество связанных с митохондриями рибосом увеличивается в клет ках, в которых идет активный синтез белков, и уменьшается, как только темпы синтеза протеинов падают (Kellems et al., 1975). Предполагают, по аналогии с ЭПР, что связанные рибосомы селективно осуществляют пере нос митохондриальных белков, синтезируемых на цитоплазматических рибосомах, внутрь митохондрий ко-трансляционно или сразу после окон чания трансляции. На основании этих данных, можно предположить, что в случае с глубинным культивированием штаммов рода Agaricus происхо дит интенсивный синтез белков, связанных с условиями роста под дейст вием стресса.

Важно также отметить, что для ГК характерно преобладание шерохо ватого ЭПР, в отличие от ПК, где больше гладкого ЭПР, что также являет ся признаком активного синтеза белков в ГК (Loeb et al., 1967;

Lee et al., 1971).

Влияние ингибиторов на рост штаммов Agaricus и Pleurotus.

Мы исследовали влияние ингибиторов транскрипции и трансляции белков на рост мицелия в глубинной культуре разных штаммов рода Aga ricus (Bs26, Bs423 (A. bisporus), Aahet (A. arvensis), Aa284 (A.

abruptibulbus)), которые принадлежат к разным экологическим группам и обладают разной способностью к росту в ГК. Для сравнения мы взяли штамм VP-1 (P. pulmonarius), для которого характерен хороший рост ми целия в глубинной культуре, с формированием большого количества ок руглых плотных и рыхлых пеллет разного размера (сухая биомасса со ставляет 15-20 г/л). Для наших исследований мы взяли следующие инги биторы: актиномицин D (ингибитор транскрипции), эритромицин и хло рамфеникол (ингибиторы трансляции белков). Все исследуемые ингиби торы значительно тормозили рост мицелия видов родов Agaricus и Pleuro tus в поверхностной культуре (Imbernon, 1978;

Matsumoto, Fukumasa Nakai, 1993).

Для всех исследуемых нами штаммов шампиньона Bs26 (A. bisporus), Aahet (A. arvensis), Aa284 (A. abruptibulbus)) характерно улучшение роста мицелия при добавлении в среду ингибиторов. Это выражалось в увели чении числа колоний на колбу и среднего размера колоний, изменении микроморфологии мицелия (в частности, уменьшалось число фрагменти рованных и сильно вакуолизированных гиф), увеличении сухой биомассы (у штамма Bs26). У всех штаммов в той или иной степени менялась мор фология митохондрий, а у штаммов Bs26 и Bs423 при росте в присутствии ингибиторов практически все клетки в субапикальной зоне содержали ни тевидные митохондрии. На ультраструктурном уровне не наблюдали свя зи рибосом с внешней митохондриальной мембраной у всех исследуемых штаммов при воздействии эритромицином и хлорамфениколом.

Обратную картину наблюдали у штамма VP-1 (P. pulmonarius), для которого было характерно ингибирование роста при добавлении антибио тиков в глубинную культуру. Это выражалось в уменьшении среднего чис ла колоний на колбу, увеличении числа сильно вакуолизированных и из витых, сильно ветвящихся гиф, а также фрагментов мицелия. Кроме того, большое количество гиф содержали шаровидные зернистые митохондрии в субапикальной зоне гифы.

Вероятно, добавление в глубинную культуру ингибиторов транскрип ции и трансляции блокирует синтез белков, участвующих в процессе уско ренного старения грибной клетки. Доказательством тому является улуч шение роста штаммов шампиньона в глубинной культуре под действием ингибиторов, изменение формы митохондрий в зоне 2, отсутствие связи рибосом с внешней мембраной митохондрий. Подобное действие ингиби торов на рост грибов активно используется многими авторами для полу чения косвенных доказательств существования апоптоза в клетках Sac charomyces cerevisiae (Tomasz, Waks, 1975;

Madeo et al., 1999;

Lewis, 2000;

Holbrook, Menninger, 2002). Добавление ингибиторов в среду оказало не благоприятное влияние на рост штамма вешенки в глубинной культуре, хотя этот штамм хорошо растет в глубинной культуре без них. В данном случае клетки мицелия не подвержены ускоренному старению и, соответ ственно, используемые ингибиторы тормозят рост в глубинной культуре аналогично тому, как это происходит в поверхностной культуре.

Заключение.

Для всех штаммов и видов рода Agaricus описаны общие цитологиче ские признаки, наблюдаемые при естественном старении мицелия (28-е сутки роста) и под действием стрессовых факторов (высокая температура, глубинное культивирование, бедная по азоту среда) (рис. 11).

Изменения на уровне организма могут быть обратимыми (замедление роста, образование фрагментов мицелия и хламидоспороподобных кле ток) и необратимыми (остановка роста и образование нежизнеспособных пропагул).

Изменения на уровне клеток мицелия затрагивают ядерный аппарат и хондриом. Они проявляются в уменьшении числа ядер на клетку и раз мера ядер, в преобладании зернистых митохондрий в субапикальной зоне, в прогрессивном развитии тесной ассоциации внешней мембраны мито хондрий с рибосомами и возрастании вакуолизации цитоплазмы. Провес ти четкую границу между обратимыми и необратимыми изменениями в клетках мицелия на данном этапе исследований не представляется воз можным. В том случае, когда необратимые изменения в мицелии затраги вают все клетки, происходит гибель всего грибного организма.

Стрессовое воздействие Глубинное культиви- Высокая температура Бедная по азоту среда рование (голодание) Молодой Стареющий мицелий мицелий Изменения на уровне организма Обратимые Необратимые - Замедление скорости роста;

- Остановка скорости роста;

- Образование фрагментов мице- -Образование нежизнеспособных лия и хламидоспоро- пропагул подобных клеток Изменения на уровне клетки - Изменение состояния ядерного аппарата (изменение размера и формы ядер, уменьшение среднего числа ядер на клетку и значения ЯПО);

- Изменение состояния хондриома (преобладание зернистых мито хондрий в субапикальной зоне гифы);

- Прогрессивное развитие тесной ассоциации рибосом с наружной митохондриальной мембраной.

Гибель клеток и организма Рис. 11. Последовательность событий, происходящих в мицелии видов рода Agaricus в процессе роста и под действием стрессовых факторов.

Приведенная последовательность событий, происходящих в мицелии 31 штамма 9 видов рода Agaricus (рис. 11), наблюдаемая в процессе есте ственного старения клеток мицелия, растущего на лабораторных средах, и под действием стрессовых факторов, указывает на существование онтоге нетической программы развития и гибели клеток мицелия грибов из рода Agaricus.

Проведенные исследования позволяют заполнить существовавший ранее пробел в знаниях программы онтогенетического старения клеток мицелия видов рода Agaricus.

Выводы 1. Комплексное цитологическое исследование 31 штамма из 9 видов ро да Agaricus в поверхностной и глубинной культурах на разных средах по зволило выявить ряд общих черт и особенностей, характерных для видов, принадлежащих к определенной экологической группе.

2. Впервые для видов A. bitorquis, A. excellens, A. macrocarpus, A. xantho dermus, A. arvensis, A. campestris, A. abruptibulbus, A. silvaticus показана дифференциация поверхностного мицелия на два структурно отличных типа: основной вегетативный мицелий и его производное – тонкий безъя дерный мицелий.

3. Впервые проведен анализ изоферментного набора неспецифических эстераз у 9 видов рода Agaricus, принадлежащих к гумусовым сапротро фам, подстилочным сапротрофам и сапротрофам-«гербофилам». Показа но сходство электрофоретических спектров у видов, относящихся к одной экологической группе.

4. Охарактеризованы основные критерии отбора дикорастущих штам мов вида A. bisporus на примере трех выделенных из природы изолятов:

Bs83, Bs84 (вид A. bisporus) и Ac83 (вид A. campestris). Показана необхо комплексного подхода (изучение культурально димость морфологических, биохимических, цитологических и генетических свойств штаммов) для определении систематического положения пред ставителей рода Agaricus.

5. Показана общность процессов старения мицелия при длительном росте на бедной по азоту агаризованной среде, на несбалансированной жидкой среде и при экстремально высоких температурах на макро-, мик роморфологическом и ультраструктурном уровнях. Признаками этого процесса являются: замедление скорости роста мицелия, формирование колоний без воздушного мицелия, фрагментация мицелия и образование хламидоспороподобных клеток, изменение состояния хондриома, умень шение числа ядер на клетку и размера ядер, прогрессивное развитие тес ной ассоциации внешней мембраны митохондрий с рибосомами, вакуоли зация цитоплазмы.

6. Продемонстрировано положительное влияние ингибиторов транс крипции и трансляции белков на рост глубинного мицелия, присутствие которых тормозит развитие каскада процессов старения глубинного ми целия.

7. Охарактеризовано два типа распределения хондриома у видов рода Agaricus при росте на разных средах. Показано преобладание нитевидных митохондрий в субапикальной зоне гифы при благоприятных условиях роста и преобладание шаровидных митохондрий при неблагоприятных условиях роста (повышенная температура, глубинное культивирование и других).

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Козлова М.В., Волкова В.Н., Панчева Е.В. Цитологические исследования го мо-, гетеро- и псевдогомоталлических штаммов Agaricus bisporus (Lange) Im bach с разными типами жизненных циклов// Тезисы 7-й пущинской школы – конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», 13 –16 апреля 2003г. Пущино. 2003. С. 249.

2. Панчева Е.В., Волкова В.Н., Камзолкина О.В. Количественное определение ДНК в ядрах шампиньона двуспорового при окрашивании реактивом ДАПИ // Цитология. 2004. Т.46, №4. С. 381-384.

3. Dyakov M.Yu., Kozlova M.V., Pancheva E.V., Kamzolkina O.V., Dyakov Yu.T.

Structure of vegetative surface mycelium of Pleurotus pulmonarius // Тр. между нар. конф., посвященной 100-летию начала работы профессора А.С. Бондарце ва в Ботаническом институте им. В.Л.Комарова РАН. Санкт-Петербург, 24- апреля 2005. Т.1. С. 172- 4. Панчева Е.В., Камзолкина О.В. Макро- и микроморфология видов рода Aga ricus в поверхностной и глубинной культурах // Тр. междунар. конф., посвя щенной 100-летию начала работы профессора А.С. Бондарцева в Ботаниче ском институте им. В.Л.Комарова РАН. Санкт-Петербург, 24-28 апреля 2005.

Т.2. С. 67-71.

5. Камзолкина О.В., Дьяков Ю.Т., Козлова М.В., Панчева Е.В., Дьяков М.Ю.

Смешанные культуры вешенки и дрожжей. // Труды третьего съезда общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова. Москва. 25-27 октября 2005. С.

109- 6. Камзолкина О.В., Гришанина А.Н., Панчева Е.В., Волкова В.Н., Козлова М.В.

Микроморфологические особенности штаммов Pleurotus pulmonarius (Fr.)Quel. и P.ostreatus (Jacq.)P.Kumm., культивируемых отдельно и совместно с дрожжами // Цитология. 2006. Том 48, №2. С. 153-160.

7. Kamzolkina O.V., Volkova V.N., Kozlova M.V., Pancheva E.V., Dyakov Yu.T., Callac Ph. Karyological evidence for meiosis in the three different types of life cy cles existing in Agaricus bisporus //Mycologia. 2006. V.98 (5). P. 763-770.

8. Матросова Е.В., Камзолкина О.В. Ультраструктура клеток мицелия видов ро да Agaricus в поверхностной и глубинной культурах // Материалы I (IX) конф.

молодых ботаников в Санкт-Петербурге (21-26 мая 2006 года). СПб: изд-во ГЭТУ, 2006. С. 287-288.

9. Камзолкина О.В., Козлова М.В., Матросова Е.В. Особенности ультраструкту ры клеток в смешанной культуре вешенки и дрожжей. // Материалы междунар.

конф., посвященной 75-летию Биологического факультета МГУ им.

М.В.Ломоносова. Москва. 2006. С. 69-70.

10. Камзолкина О.В., Матросова Е.В. Особенности структуры и функционирова ния митохондрий мицелиальных грибов. // Материалы междунар. конф. «Фи зиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» па мяти профессора М.В.Гусева. Москва. 2006. С. 55.

11.Камзолкина О.В., Матросова Е.В. Митохондрии грибов (Обзор). // Успехи общей и прикладной микологии (в печати).