Молекулярно-клеточные маркеры лимфоцитов больных меланомой как прогностический показатель клинического ответа на химиотерапию
На правах рукописи
Артамонов Дмитрий Николаевич МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ ЛИМФОЦИТОВ БОЛЬНЫХ МЕЛАНОМОЙ КАК ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ ПОКАЗАТЕЛЬ КЛИНИЧЕСКОГО ОТВЕТА НА ХИМИОТЕРАПИЮ 03.01.02 - биофизика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2011
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН.
Научные руководители:
доктор биологических наук Тронов Виктор Александрович доктор биологических наук, профессор Горбачева Лора Борисовна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Пальмина Надежда Павловна (ИБХФ РАН) доктор биологических наук, профессор Карпухин Александр Васильевич (МГНЦ РАМН)
Ведущая организация: биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, кафедра биофизики.
Защита диссертации состоится “16” марта 2011 г. в 13 00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.039.01 Учреждения РАН Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 117977, Москва, ул. Косыгина, д. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. Н.Н.Семенова РАН.
Автореферат разослан “_” февраля 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 002.039. кандидат химических наук Мазалецкая Л.И.
Актуальность проблемы.
Меланома, высоко агрессивное неопластическое заболевание, поддается лечению на начальных стадиях. По мере прогрессии заболевания эффективность лечения снижается. На стадии метастазирования меланома характеризуется высокой лекарственной устойчивостью и высокой летальностью. Ведущее место среди терапевтических процедур, применяемых при меланоме, занимает цитотоксическая химиотерапия.
Монофункциональные алкилирующие агенты дакарбазин, прокарбазин a также нитрозомочевины, кармустин и ломустин, входят в состав стандартного протокола лечения меланомы. Однако частота положительного ответа больных в случае терапии только дакарбазином или комбинацией дакарбазина с кармустином и ломустином не превышает 20%. Две исследовательские стратегии направлены на преодоление низкой эффективности химиотерапии: разработка новых терапевтических подходов и поиск маркеров, позволяющих прогнозировать индивидуальную устойчивость/чувствительность больных к химиотерапии.
Наиболее часто используемыми показателями для прогноза меланомы кожи являются максимальный вертикальный размер опухоли, глубина инвазии и наличие или отсутствие изъязвлений.
Однако до сих пор отсутствуют неинвазивные маркеры, позволяющие с приемлемой вероятностью прогнозировать индивидуальный терапевтический ответ, хотя потребность в них высока.
Актуальным является исследование новых маркеров прогноза заболевания, основанных на изучении механизмов устойчивости клеток к химиотерапии. Таковыми являются эффективность удаления повреждений ДНК и связанная с ней способность к предотвращению апоптоза.
С большим основанием предполагается, что толерантность опухоли к химиотерапии связана с дефектами в одном из механизмов репарации ДНК – коррекции неспаренных оснований (mismatch repair, MMR). Это предположение было подтверждено экспериментально в работах, выполненных на культивируемых клетках, полноценных и дефицитных по MMR. Совокупность полученных данных позволила сделать вывод о том, что вторичные разрывы ДНК в пролиферирующих клетках в ответ на действие метилирующего агента формируются в результате функционирования механизма MMR. В таком случае эти «отсроченные» вторичные разрывы могут быть показателем активности системы MMR. Это позволяет предположить, что вторичные разрывы, индуцированные в геноме стимулированных лимфоцитов, могут быть биофизическим маркером как самого заболевания (ассоциированного с дефицитом MMR), так и эффективности терапии.
Часто из-за невозможности получения образцов ткани опухоли лимфоциты крови больных представляются удобным и репрезентативным объектом исследований с целью прогноза развития заболевания и клинического ответа на химиотерапию.
В настоящей работе проводилось изучение эффективности MMR в сочетании с другими показателями, такими как активность эксцизионной репарации оснований (BER), экспрессия проапоптотического рецептора FasR и ключевых белков системы МMR, MLH1 и MSH2, в лимфоцитах крови больных меланомой в ходе одного цикла химиотерапии. Протокол химиотерапии включает ломустин, дакарбазин, цисплатин, ингарон (ЛДЦИ протокол). Клинический ответ больных сопоставляли с полученными значениями маркеров лимфоцитов и оценивали степень корреляции между ними.
Цель работы.
Оценить значение некоторых молекулярно-клеточных маркеров лимфоцитов крови больных диссеминированной меланомой кожи (эффективности репарации ДНК, уровней экспрессии белков MLH1, MSH2, FasR и гибели лимфоцитов) в прогнозе индивидуальной чувствительности к химиотерапии.
Задачи исследования.
- Определить типы повреждений ДНК в лимфоцитах в результате 1-го цикла химиотерапии (ХТ).
- Изучить эффективность механизмов репарации ядерной ДНК в лимфоцитах крови больных меланомой.
- Сравнить показатели ответа лимфоцитов на химиотерапию и тест воздействие метилнитрозомочевины (МНМ).
- Определить зависимость между скоростью удаления однонитевых (single stranded, ss) разрывов ДНК в лимфоцитах после химиотерапии и эффективностью системы эксцизионной репарации оснований (BER).
- Определить связь между скоростью накопления двунитевых (ds) разрывов ДНК в лимфоцитах после химиотерапии и эффективностью системы MMR.
- Оценить возможность использования повреждения ДНК, эффективности репарации (BER и MMR) как прогностических показателей химиотерапии больных диссеминированной меланомой.
- Оценить возможность использования экспрессии белков MLH1, MSH2, FasR и гибели лимфоцитов как прогностических показателей химиотерапии больных меланомой кожи.
Научная новизна.
- Показано, что межиндивидуальные вариации эффективности BER не влияют на цитотоксический ответ лимфоцитов и клинический ответ больных на химиотерапию.
- Показано, что повреждения однонитевой ДНК вносят незначительный вклад в цитотоксический эффект химиотерапии.
- Разработан метод оценки эффективности пострепликативного механизма MMR в лимфоцитах с помощью BrUdR-меченых dsДНК-комет.
- Показана корреляция количества индуцированных вторичных ds-разрывов ДНК в ФГА-стимулированных лимфоцитах больных с эффективностью MMR в них.
- Впервые показана достоверная корреляция между количеством вторичных ds-разрывов ДНК, индуцированных химиотерапией в лимфоцитах больных, и клиническим ответом этих больных на химиотерапию.
- Впервые обнаружена достоверная корреляция между ответом лимфоцитов больных меланомой на химиотерапию и на тест-воздействие метилнитрозомочевиной in vitro, что делает возможным определение неинвазивных маркеров, прогнозирующих клинический ответ до начала химиотерапии.
Научно-практическая значимость.
Установлено, что функциональная эффективность системы MMR и связанное ней накопление dsДНК разрывов являются прогностическими маркерами клинического ответа опухоли и могут быть использованы в качестве дополнительного фактора прогноза с учетом клинико гистологических параметров. Применение данного критерия в клинической практике позволяет стратифицировать больных с учетом потенциального развития заболевания и может использоваться для назначения адъювантной терапии.
Положения, выносимые на защиту.
- Разработаны методы оценки эффективности в лимфоцитах больных меланомой дорепликативного механизма BER и пострепликативного механизма MMR.
- Межиндивидуальные вариации эффективности BER не влияют на цитотоксический ответ лимфоцитов и клинический ответ больных на химиотерапию. Вместе с тем, не исключается антиапоптотическое влияние BER, снижающее эффективность химиотерапии.
- Уровень вторичной деградации dsДНК в лимфоцитах пациентов, подвергнутых химиотерапии, является независимым прогностическим маркером ЛДЦИ-протокола химиотерапии. Этот показатель включает в себя как эффективность ММR, так и частично эффективность механизма эксцизионной репарации нуклеотидов (NER).
Апробация результатов.
Основные результаты работы были представлены на:
7-ом Международном симпозиуме по таргетной противоопухолевой терапии (7th International Symposium on Targeted Anticancer Therapies, Amsterdam, The Netherlands, March 23-25, 2009), 8-ой Международной конференции «Биохимическая физика», Москва, 11- ноября, 2008, 8-ой Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 21-22 апреля 2009, 10-ой международной летней школе по биофизике (10-th International Summer School on Biophysics “Supramolecular Structure and Function”, Sept.19 - Oct.01, Rovinj, Croatia, 2009), 9-ой Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Н.Новгород, 21 мая 2010, III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010», Москва, 21-25 июня 2010, 10-ой Международной конференции «Биохимическая физика», Москва, 8- ноября, 2010.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Объем и структура диссертации Работа изложена на 103 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 93 источника. Работа иллюстрирована 37 рисунками и 1 таблицей.
Содержание работы.
Методы.
Характеристика больных и процедура химиотерапии.
В работе использовали лимфоциты крови больных диссеминированной меланомой кожи, проходивших курс лечения в отделении химиотерапии и комбинированных методов лечения злокачественных опухолей НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Протокол лечения (LDCI, ЛДЦИ, ломустин, дакарбазин, цисплатина, ингарона) включал в себя ежедневное введение ингарона 5 ·105МЕ в течение 5 дней, ломустина (80 мг/м2 перорально в 1-й день), дакарбазина (250 мг/м2 в/в в1-й 3-й дни) и цисплатина (80 мг/м2 в/в в 3-й день). Введение ингарона (5 ·105МЕ три раза в неделю) продолжалось еще три недели. Следующий курс начинали на 6-й неделе с ежедневного введения ингарона. Было исследовано больных (8 женщин и 4 мужчин) диссеминированной меланомой кожи, имеющих гистологическое подтверждение диагноза. Клинический ответ определялся по критериям для солидных опухолей (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors - RECIST). У 3 больных была достигнута частичная (50%) регрессия опухоли (ЧР), у 2 отмечена стабилизация болезни (СЗ), у остальных наблюдали прогрессию заболевания (ПЗ).
Выделение лимфоцитов и оценка доли погибших клеток.
У больных брали кровь из вены до начала, спустя 8 дней после начала первого цикла химиотерапии и после завершения первого терапевтического цикла (30 дн). Лимфоциты выделяли из венозной гепаринизированной крови больных сразу после получения образцов. Кровь наслаивали на разделяющую смесь фиколла-верографина ( = 1.078 г/см3) и центрифугировали при комнатной температуре 800 g, 30 мин. Выделенные лимфоциты суспендировали в среде RPMI-1640, содержащей L-глутамин мг/мл, фетальную сыворотку быка 20%, антибиотики, ФГА 10 мкг/мл. Часть лимфоцитов исследовали сразу после их выделения, часть культивировали в течение 48 ч при 37 С. Погибшие клетки определяли по выпетливанию нуклеоида из спонтанно пермеабилизованных клеток. Для этого клетки суспендировали в растворе низкоплавкой агарозы при 37 С, суспензию наносили на предметное стекло (30 мкл) и накрывали покровным стеклом.
После застывания геля покровное стекло удаляли и слайд помещали в метанол при комнатной температуре. Дегидратированный слайд высушивался на воздухе, окрашивался красителем Sybr-Green и микроскопировался в режиме флуоресценции. Определяли долю пермеабилизованных клеток, имеющих характерное гало из петель нуклеоида, окаймляющего клетку.
Определение повреждения ДНК методом комет.
Использовали два варианта метода – нейтральный для оценки поврежденности двунитевой ДНК (dsДНК) и щелочной, для определения однонитевых разрывов ДНК (ssДНК). В первом случае 100 мкл суспензии клеток (0.5-1х106в PBS) смешивали с 200 мкл 1%-ного раствора легкоплавкой агарозы тип IV (Sigma). Смесь (30 мкл) наносили на предметное стекло, накрывали покровным стеклом (18х18 мм). После застывания геля стекло удаляли и слайд погружали в лизирующий раствор, содержащий 2.5 M NaCl, 30 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1% лаурилсаркозинат, 0.03 мг/мл протеиназы К, рН 8.0. Спустя 12-16 ч лизиса при 37 С слайды погружали в раствор, содержащий 2.5 М NaCl, 0.1 M EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1% Triton X-100, 1% DMSO, pH 10 на 1 ч в холодильнике.
Слайды помещали в горизонтальную камеру для электрофореза, заполненную ТАЕ-буфером (рН 8.3) и выдерживали в течение 40 мин в холодильнике. Электрофорез проводили при 0.56 В/см в течение 40 мин.
После электрофореза слайды погружали в охлажденный раствор 0.3 М NaOH, 1 mM EDTA (15 мин), трижды ополаскивали 0.4 М Tris-HCl, pH 7.4 и 1 раз в PBS. Слайды дегидратировали метанолом и высушивали на воздухе.
После высыхания и окрашивания Sybr-Green слайды микроскопировали во флуоресцентном режиме. Для определения однонитевых разрывов слайды после инкубации в лизирующем буфере при рН 10 помещали в электрофоретическую камеру, заполненную охлажденным раствором 0.3 М NaOH, 1 mM EDTA, pH 13. После инкубации в течение 40 мин в холодильнике, проводили электрофорез 0.75 В/см, 22 мин. После электрофореза слайды ополаскивали раствором 0.4 М Tris-HCl и проводили те же операции, что и для нейтральных комет. В процессе микроскопии накапливали изображения комет в памяти компьютера и обсчитывали их по программе CASP. Показателем поврежденности ДНК служил параметр момент хвоста комет, mt (Olive tail moment).
Оценка эффективности механизмов репарации BER и MMR.
Для оценки эффективности механизма эксцизии оснований (BER) измеряли способность лимфоцитов больных до химиотерапии элиминировать АР-сайты, индуцированные в них тестирующим воздействием метилнитрозомочевиной (МНМ). Для этого в суспензию лимфоцитов в культуральной среде добавляли МНМ до концентрации мкМ. В параллельную пробу вместе с МНМ добавляли метоксиамин (МХ, мкМ), блокирующий репарацию. Суспензии инкубировали 20 ч при 37 С и измеряли однонитевые разрывы в ДНК, используя щелочной вариант метода комет. Показателем эффективности BER было отношение mt комет лимфоцитов после добавления МНМ+МХ к mt комет лимфоцитов после добавления только МНМ (mtMНМ+МХ/ mtМНМ).
Эффективность MMR оценивали по количеству вторичных двунитевых разрывов ДНК, формирующихся спустя 24-48 ч после тест-воздействия метилнитрозомочевиной на стимулированные лимфоциты. Кратко метод включал в себя стимуляцию лимфоцитов (48 ч) в среде, содержащей BrUdR (100 мкМ);
обработку клеток метилнитрозомочевиной (50 мкМ) с одновременным подавлением O6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT) с помощью О6-бензилгуанина (O6bzG, 100 мкМ). Спустя 24-48 ч после добавления агентов определяли количестко двунитевых разрывов, используя нейтральный вариант метода ДНК-комет. Для визуализации делящихся клеток на влажные слайды после нейтрализации раствором 0.4 М Tris-HCl (pH 7.4) наносили раствор анти-BrUdR антитела в PBS (30 мкл, мкг/мл), накрывали покровным стеклом и инкубировали 1 ч в темноте при комнатной температуре. После инкубации стекло удаляли и слайд трижды отмывали холодным PBS. Последнюю отмывку проводили PBS, содержащим бычью сыворотку 2%. После удаления излишков влаги с поверхности слайда, наносили 30 мкл PBS, содержащие 10 мкг/мл FITC-коньюгат вторичного антитела, накрывали покровным стеклом и инкубировали 1 ч в темноте.
После удаления покровного стекла слайды отмывали в PBS, дегидратировали в метаноле, высушивали, окрашивали иодистым пропидием (1 мкг/мл) и микроскопировали в режиме флуоресценции с набором фильтров для FITC.
Кометы, формируемые делящимися клетками, содержали BrUdR и FITC и флуоресцировали в зеленой области. Покоящиеся клетки были окрашены оранжевым цветом. Эффективность MMR характеризовалась отношением моментов хвостов комет, формируемых клетками после тест-обработки и необработанными (mtМНМ+O6bzG/mtO6bzG).
Иммуноцитохимическое определение экспрессии белков.
Лимфоциты иммобилизовали в низкоплавкой агарозе в виде тонкого слайда на поверхности предметного стекла. Клетки фиксировали, инкубируя слайды 20 мин в 3%-ном формальдегиде в PBS в холодильнике. Затем пермеабилизовали в 0.2% тритоне Х-100 в PBS (20 мин в холодильнике).
Слайды, предназначенные для определения уровня FasR, процедуре пермеабилизации не подвергались. После каждой процедуры слайды трижды отмывались в PBS, последняя отмывка после первичного антитела проводилась в PBS, содержащем 2% фетальной сыворотки. Обработка слайдов антителами проводилась также, как описано в предыдущих пунктах раздела. Контролем служили слайды с иммобилизованными клетками, которые подвергались такой же обработке, но без первичных антител. В конце слайды дегидратировали в метаноле, высушивали и хранили в темноте.
FITC-флуоресцирующие клетки фотографировали, полученные изображения анализировали на компьютере. Регистрировали флуоресценцию не менее клеток в каждом слайде и определяли долю FITC-позитивных клеток.
Представляемым показателем уровня экспрессии каждого белка было произведение средней флуоресценции одной клетки, умноженной на долю FITC-позитивных клеток в каждом слайде.
В таблице 1 приведены все использованные в данной работе параметры и методы их определения.
Статистический анализ.
Оценка линейной корреляции проводилась в Origin 6.0 методом наименьших квадратов. Для определения достоверности различий в 2-х группах использовался критерий Манна – Уитни - Вилкоксона. Для оценки эффективности маркеров были выбраны стандартные параметры – чувствительность (TPF) и 1-специфичность (FPF).
Определяемый Метод определения параметр Поврежденность После ХТ (2 ч., 48 ч., 30 сут.) или тест-воздействия МНМ, одно-, ДНК двунитевые разрывы ДНК, АР-сайты. Метод ДНК комет.
Эффективность BER 2 ч. после тест-воздействия МНМ±МХ, однонитевые разрывы ДНК Эффективность 48 ч. после тест-воздействия МНМ + [ФГА MMR стимул.+О6BzG+BrUdR], разрывы ds-ДНК Уровень hMLH1 и Иммуноцитохимия 48 ч. после ФГА-стимуляции hMSH Уровень FasR Иммуноцитохимия после 48 ч. инкубации Индекс Иммуноцитохимия 48 ч. после ФГА-стимуляции+ BrUdR пролиферации Цитотоксичность Релаксация нуклеоида через 2 ч. после ХТ Табл. 1. Набор использованных в данной работе параметров и методов их определения. BER - эксцизионная репарация оснований, MMR - коррекция неспаренных оснований,, AP-сайты - апурин/апиримидиновые сайты, ХТ – химиотерапия, МНМ – метилнитрозомочевина, MX – метоксиамин, ФГА фитогемагглютинин, BrUdR – бромдезоксиуридин.
Результаты.
1. Повреждение ssДНК и ее репарация с участием механизма BER.
В результате одного цикла ЛДЦИ-химиотерапии в лимфоцитах пациентов накапливаются повреждения ДНК, которые значительно увеличивают электрофоретическую подвижность однонитевой ДНК (ssДНК).
Как видно из рисунка рисунка 1, обработка метилнитрозомочевиной также увеличивает электрофоретическую подвижность ssДНК. В обоих случаях возникшие повреждения ssДНК с большей или меньшей скоростью репарируются (Рис.1). Это позволило оценить в лимфоцитах больного фактическую эффективность репарации повреждений ssДНК, индуцированных одним циклом LDCI-терапии и эффективность механизма BER. Эффективность репарации ssДНК определялась отношением моментов хвостов комет, формируемых клетками через 2ч. и 48 ч. после х/т - mt2ч /mt48ч.
Для оценки эффективности дорепликативного механизма BER в лимфоцитах использовался метод с использованием ингибитора репарации BER метоксиамина (МХ). Показателем эффективности BER, определяемой до хтмиотерапии, в этом случае было отношение mt комет лимфоцитов после добавления смеси МНМ+МХ к mt комет лимфоцитов после добавления только МНМ (mtMНМ+МХ/ mtМНМ 2ч).
Связь между эффективностью репарации повреждений ssДНК и эффективностью BER, представленная на рисунке 2а, с высокой достоверностью (R = 0.89, p0.001) описывается линейной зависимостью.
Это говорит о том, что в удалении повреждений ssДНК, возникших в результате химиотерапии, принимает участие механизм BER.
Рис. 1. Динамика поврежденности ssДНК в процессе инкубации лимфоцитов in vitro.
1 – интактные лимфоциты, 2– после обработки метилнитрозомочевиной (50 мкМ in vitro), 3– лимфоциты, выделенные из крови больного после 1 цикла ХТ.
2. Повреждение ssДНК и механизм BER не коррелируют с клиническим ответом на ЛДЦИ-терапию.
Полученные результаты обнаруживают значительную межиндивидуальную вариабельность эффективности BER и степени повреждения ss-ДНК в лимфоцитах больных в результате химиотерапии (Рис. 3г). Исходные повреждения (2ч. после химиотерапии) удаляются с различной эффективностью в лимфоцитах всех больных (48 ч. после ХТ).
Спустя месяц после первого цикла у трех больных наблюдали полное восстановление целостности ss-ДНК (Рис. 3г). На рис. 3а-в приведены микрофотографии характерных ss-ДНК-комет из лимфоцитов больных до, спустя 2 ч. и 30 суток после 1 цикла химиотерапии.
Рис. 2. Зависимость репарации ss- и ds-разрывов ДНК от эффективности систем репарации.
а. Корреляция скорости удаления ss-разрывов ДНК в лимфоцитах за 48ч после 1 цикла химиотерапии с активностью механизма BER в лимфоцитах пациентов. Эффективность репарации ssДНК определялась отношением моментов хвостов комет, формируемых клетками через 2ч. и 48 ч. после ХТ - mt2ч /mt48ч.
б - Линейная корреляция между накоплением вторичных ds-разрывов ДНК спустя 48 ч после 1 цикла химиотерапии и эффективностью механизма MMR в лимфоцитах 11 больных меланомой. Эффективность накопления вторичных повреждений dsДНК численно равняется отношению моментов хвостов комет, формируемых клетками через 48 ч. после химиотерапии и интактными клетками – mt48ч/mtintact.
Принимая во внимание такое единообразие ответа лимфоцитов, следует ожидать, что повреждения на уровне ss-ДНК (АР-сайты, однонитевые разрывы) и ассоциированный с ними механизм BER вряд ли могут быть хорошим прогностическим маркером ЛДЦИ-протокола химиотерапии.
Подтверждение этого получено на 5 пациентах. Рисунок 3д показывает связь эффективности удаления поврежденности ss-ДНК от клинического ответа больных на химиотерапию. Эффективность репарации повреждений ssДНК определялась на основании данных, приведенных на рис. 3г, и численно равнялась отношению моментов хвостов комет, формируемых клетками через 2ч. и 48 ч. после ХТ - mt2ч /mt48ч. Результат демонстрирует отсутствие разницы в эффективности репарации поврежденности ss-ДНК в лимфоцитах пациентов с различными клиническими ответами на ЛДЦИ терапию (TPF = 0, FPF = 0.67). Поскольку, как показано ранее рисунке 2а, эффективность репарации поврежденности ss-ДНК линейно связана с эффективностью BER, то последний параметр также не может быть прогностическим маркером данного протокола химиотерапии.
3. Двунитевые разрывы после химиотерапии связаны с активацией механизма MMR.
Несмотря на серьезное повреждение ssДНК, химиотерапия не вызывает формирование двунитевых разрывов (Рис. 4а). Напротив, классический индуктор разрывов ДНК гамма-излучение, хотя и в разной степени, но увеличивает электрофоретическую подвижность ssДНК и dsДНК. Тем не менее, отмечается изменение ds-нуклеоидов: хотя они и сохраняют симметрию, но становятся менее компактными и менее яркими.
Такое же различие между ss- и ds-кометами наблюдалось после воздействия на лимфоциты МНМ in vitro.
Эти наблюдения указывают на то, что превалирующим типом повреждений ДНК после химиотерапии являются АР-сайты. АР-сайты трансформируются в однонитевые разрывы в щелочных условиях (в ss кометах). При нейтральном рН сохраняется целостность фосфодиэфирной цепи ДНК.
Таким образом, в результате лизиса клеток в нейтральном буфере формируются разрыхленные, симметричные ds-нуклеоиды, ДНК в которых не мигрирует в электрическом поле. На рис. 4 б-г приведены гистограммы распределения клеток по моментам хвостов ds-комет, mt, и микрофотографии соответствующих комет 2ч после химиотерапии, через 48 ч. и спустя суток и микрофотографии соответствующих комет. На рис. 4а приведена динамика накопления вторичных двунитевых разрывов за этот период времени. Только спустя 48 ч после химиотерапии в лимфоцитах формируются двунитевые разрывы ДНК, и наблюдается миграция dsДНК и формирование хвоста ds-комет. Спустя 30 суток накапливается значительное количество нерепарированных повреждений dsДНК.
Рис. 3. Влияние химиотерапии на поврежденность ss-ДНК в лимфоцитах больных.
a, б, в – микрофотографии ДНК-комет из лимфоцитов больных до, спустя ч и 30 сут после 1 цикла химиотерапии соответственно;
г поврежденность ssDNA, выраженная в значениях момента комет (mt) до химиотерапии (ХТ), 2 ч., 48 ч. и 30 сут после ХТ;
д – связь между клиническим ответом 5 больных меланомой и эффективностью репарации ss-разрывов ДНК, вызванных ХТ, в лимфоцитах этих же больных.
Эффективность репарации повреждений ssДНК определялась отношением моментов хвостов комет, формируемых клетками через 2ч. и 48 ч. после ХТ - mt2ч /mt48ч. ПБ – прогресс заболевания, СБ – стабилизация заболевания, ЧР – частичная ремиссия.
Таким образом, была определена эффективность накопления вторичных ds-разрывов. Она представляет собой отношение моментов хвостов комет, формируемых клетками через 48 ч. после химиотерапии и интактными клетками – mt48ч/mtintact.
Эффективность накопления разрывов ds-ДНК в лимфоцитах пациентов, подвергнутых ЛДЦИ-химиотерапии, была сопоставлена с эффективностью механизма MMR в лимфоцитах. Эффективность MMR, определяемая до химиотерапии, характеризовалась отношением моментов хвостов комет, формируемых клетками после тест-обработки и необработанными (mtМНМ+O6bzG/mtO6bzG)48ч. Результат такого сопоставления для 11 исследованных больных представлен на рисунке 2б. Прослеживается линейная корреляция между эффективностью MMR и степенью деградации dsДНК в лимфоцитах больных, подвергнутых одному циклу химиотерапии.
Этот факт отражает с высокой вероятностью (R2=0.96, р0.0001) вовлеченность механизма MMR в процесс вторичной деградации ds-ДНК в лимфоцитах пациентов после цикла ЛДЦИ-химиотерапии.
4. Вторичная деградация ds-ДНК коррелирует с клиническим ответом на ЛДЦИ-терапию.
Ds-деградация ДНК (и ассоциированная с ней активация механизма MMR) также, как и ss-повреждение ДНК, является вторым исследованным генотоксическим ответом лимфоцитов на LDCI-химиотерапию. Однако, в отличие от последней, ds-деградация инициируется спустя 48 и более ч.
после первого цикла терапии (Рис.4а) и нарастает во времени. Спустя месяц число ds-разрывов в ДНК возрастает более чем в 3 раза по сравнению с начальным (Рис. 4а). Корреляция накопления вторичной поврежденности dsДНК в лимфоцитах с клиническим ответом пациентов на ЛДЦИ химиотерапию представлена на рис. 5а. Поврежденность dsДНК численно равняется отношению моментов хвостов комет, формируемых клетками через 48 ч. после химиотерапии и интактными клетками – mt48ч/mtintact.
У пациентов в состояниях прогрессии и стабилизации заболевания обнаружен одинаковый генотоксический ответ лимфоцитов на химиотерапию (практически отсутствие такового). У больных с частично положительным клиническим ответом обнаружена высокая степень вторичной ds-деградации генома лимфоцитов в ответ на химиотерапию (р0.0001, TPF = 1, FPF = 0).
5. Уровень экспрессии белков не коррелирует с клиническим ответом.
На рисунках 5 б-г представлена связь между клиническим ответом больных меланомой и тремя исследованными параметрами ответов лимфоцитов на первый курс ЛДЦИ-терапии. Таковыми в данном случае являлись экспрессия основных белков системы MMR, hMLH1+hMSH2, экспрессия проапоптотического рецепторного белка FasR и доля погибших клеток в результате первого цикла химиотерапии. Все параметры определялись спустя 48 ч. после терапии.
Не было обнаружено различий в экспрессии белков системы MMR (Рис.5б) и проапоптотического рецепторного белка FasR (Рис. 5в) среди больных с различным ответом на химиотерапию (р=0.74, TPF = 0.67, FPF = 0.5 для FasR;
p=0.32, TPF = 0.33, FPF = 0.25 для MLH1+MSH2). Вместе с тем, в ответ на химиотерапию увеличивалась доля погибших и погибающих лимфоцитов в крови больных с положительным ответом на химиотерапию (p=0.025, TPF = 1, FPF = 0.4, Рис. 5г).
Рис. 4. Вторичная деградация dsДНК в лимфоцитах больных меланомой после химиотерапии (ХТ) (а). Микрофотографии типичных комет и соответствующие им гистограммы распределений клеток по степени повреждений через 2 ч. (б), спустя 48 ч (в) и 30 сут. (г) после химиотерапии.
Рис. 5. Корреляция между клиническими ответами больных на химиотерапию и вторичными ds-разрывами ДНК, индуцированными в лимфоцитах спустя 48 ч. после химиотерапии (а), уровнем экспрессии белков MLH1 и MSH2, определенном через 48 ч. после первого цикла химиотерапии.
(б), экспрессией рецептора FasR, определенном через 48 ч. после первого цикла химиотерапии. (в) и долей погибших лимфоцитов через 48 ч. после первого цикла химиотерапии (г). Поврежденность dsДНК численно равняется отношению моментов хвостов комет, формируемых клетками через 48 ч. после химиотерапии и интактными клетками – mt48ч/mtintact. ПБ – прогресс заболевания, СБ – стабилизация заболевания, ЧР – частичная ремиссия.
Обсуждение.
В нашем исследовании мы намеревались оценить эффективность двух важных механизмов репарации ДНК после химиотерапии, BER и MMR, в связи с клиническим ответом больных меланомой. Как показали наши результаты, наилучшая корреляция наблюдалась между клиническим ответом и степенью вторичной ds-деградации ДНК. Природа процесса вторичной ds-деградации ДНК была описана ранее на опухолевых клетках человека, культивируемых фибробластах человека и стимулированных лимфоцитах человека. Была показана его связь с активной системой пострепликативной MMR, приводящей к формированию двунитевого разрыва в ответ на появление в ДНК аддукта, метилированного по О гуанина, под действием алкилирующих соединений. В данной работе мы показали линейную корреляцию между эффективностью MMR в лимфоцитах и вторичной ds-деградацией ДНК, сопровождающей химиотерапию (Рис. 2б), что свидетельствует в пользу участия MMR в процессе деградации. Однако, отсутствие корреляции экспрессии MLH1 и MSH2 с клиническим ответом (Рис.5а) не позволяет считать эти белки прогностическими маркерами химиотерапии. В литературе данные по экспрессии белков системы ММR противоречивы. В случае проапоптотического FasR тенденция к увеличению его экспрессии у пациентов с положительным ответом на терапию более выражена, но все же не достоверна (р=0.32, Рис.5б). Достоверное увеличение доли погибших лимфоцитов у больных с положительным ответом на химиотерапию (Рис.5г) говорит о том, что, по крайней мере, частично этот ответ ассоциирован с индукцией апоптоза в клетках. Скорее всего, апоптоз инициируется двунитевыми разрывами преимущественно по Fas независимому пути. Разрывы формируются благодаря активации системы пострепликативной MMR, но без заметного увеличения экспрессии ключевых белков MLH1 и MSH2.
Часто из-за невозможности получения образцов ткани опухоли лимфоциты крови больных представляются удобным и репрезентативным объектом исследований с целью прогноза развития заболевания и клинического ответа на химиотерапию. Такой подход фактически осуществлен в данной работе. Поэтому возникает вопрос, в какой степени данные, полученные на лимфоцитах крови, могут отражать закономерности и процессы, протекающие в опухолевых клетках. Ответ на этот вопрос, применительно к ЛДЦИ-протоколу представлен на рисунке 6.
На схеме показано, что ЛДЦИ-протокол терапии индуцирует в клетках повреждения ДНК трех типов: апуриновые/апиримидиновые сайты, метилированный по О6 гуанин и сшивки ДНК.
АП-сайты формируются главным образом из метилированных по N аденина и по N7 гуанина. Сшивки ДНК формируются под действием ломустина и цисплатина и включают в себя внутрицепочечные, межцепочечные сшивки и сшивки ДНК с белками хроматина.
Как показано на рисунке 6, удаление возникших повреждений и репарация ДНК осуществляется тремя механизмами – BER, MMR и NER.
Каждый механизм удаляет преимущественно один из возникших типов повреждений, хотя возможно частичное перекрывание механизмов репарации (например, в репарации сшивок могут участвовать элементы системы MMR). До вступления в дело механизмов репарации лимфоциты и опухолевые клетки одинаково отвечают на вызванный терапией химический стресс.
Рис. 6. Схема реализации цитотоксического эффекта ЛДЦИ-протокола химиотерапии. Цифрами обозначены следующие механизмы: 1- р53 зависимая активация Fas, 2 – деградация Bcl-2 в митохондриях, 3 – транслокация AIF из митохондрий в ядро.
Теперь рассмотрим участие репарации. На сегодня в клетках меланомы не идентифицированы мутации в генах, кодирующих белки системы BER. Таким образом, активность механизма репарации BER примерно одинакова в клетках меланомы и в лимфоцитах.
Многие опухолевые клетки обнаруживают дефицит системы MMR (колоректальный рак, рак яичников, рак шейки матки и некоторые другие).
Дефицит может быть связан как с соматической мутацией, так и с эпигенетическим ингибированием соответствующего промотора. Тем не менее, в клетках меланомы не обнаружены мутации в системе MMR. В тех же случаях, когда дефицит MMR был подтвержден по нестабильности микросателлитов, это не отражалось на клиническом ответе на химиотерапию. Этот путь отмечен одной звездочкой (*), говорящей о возможном источнике различий между опухолевыми клетками и лимфоцитами. Что касается механизма эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) у больных меланомой, то здесь сведений очень мало. Кроме того, из-за большого числа генов, участвующих в этом механизме репарации, идентификация мутаций или анализ полиморфизма затруднены. Поэтому этот механизм тоже отмечен одной звездочкой, как и в случае MMR.
Таким образом, лимфоциты и опухолевые клетки к этапу формирования двунитевых разрывов ДНК в ответ на химиотерапию приходят с примерно равным успехом. Двунитевые разрывы ДНК являются индуктором апоптоза во всех клетках. Трансляция сигнала от него проходит различными путями. На сегодня известны по крайней мере 3 пути: активация Fas;
подавление активности Bcl-2 и транслокация в ядро митохондриального апоптотического фактора AIF (отмечены тремя звездочками ***). Два последних пути связаны с митохондриями. В этой части можно ожидать максимальных различий в ответах опухолевых клеток и лимфоцитов. Это усложняет корреляцию гено- и цитотоксического эффектов на лимфоцитах с токсическим эффектом на опухолевых клетках, который лежит в основании клинического ответа на химиотерапию. И тем не менее, наш результат показывает наличие такой корреляции, что является обнадеживающим фактом, побуждающим к дальнейшим исследованиям.
Выводы.
1. Превалирующим типом повреждений, прослеживаемых на уровне ssДНК после химиотерапии, являются АП-сайты.
2. Эффективность репарации этих повреждений после одного цикла ЛДЦИ терапии, линейно зависит от эффективности системы BER (R2=0.89, p0.001).
Несмотря на значительную межиндивидуальную вариацию этого параметра, все повреждения ssДНК в лимфоцитах больных элиминируются к началу следующего цикла терапии, что указывает на низкую прогностическую значимость этих дефектов и механизма BER (TPF = 0, FPF = 0.67). Тем не менее, нельзя полностью исключить антиапоптотическое влияние BER, снижающее эффективность химиотерапии.
3. Повреждения однонитевой ДНК вносят незначительный вклад в цитотоксический эффект химиотерапии (гибель лимфоцитов in vitro).
4. Ds-разрывы ДНК в лимфоцитах больных появляются только спустя 48 ч.
Эта вторичная деградация dsДНК коррелирует с эффективностью механизма MMR в лимфоцитах (R2=0.96, р0.0001).
5. Уровень вторичной деградации dsДНК в лимфоцитах пациентов, подвергнутых химиотерапии, является независимым прогностическим показателем эффективности ЛДЦИ-терапии меланомы кожи. (p 0.0001, TPF = 1, FPF = 0).
6. Эффективность накопления вторичных повреждений dsДНК в ответ на химиотерапию коррелирует с ответом на тест-воздействие метилнитрозомочевиной (R2 = 0.96, p = 3·10-2), что открывает возможность прогнозировать клинический ответ больных на химиотерапию по результатам тестирования ответа лимфоцитов больных in vitro до начала химиотерапии.
7. Не обнаружено достоверных различий в экспрессии белков системы MMR и FasR среди больных с различным ответом на химиотерапию (р=0.74, TPF = 0.67, FPF = 0.5 для FasR;
p=0.32, TPF = 0.33, FPF = 0.25 для MLH1+MSH2).
8. В ответ на химиотерапию достоверно увеличивалась доля погибших и погибающих лимфоцитов в крови больных с положительным ответом на химиотерапию (p=0.025, TPF = 1, FPF = 0.4).
Практические рекомендации.
Проведение исследований с определением поврежденности ds-ДНК в лимфоцитах крови больных меланомой кожи целесообразно для оценки прогноза ответа опухоли на ЛДЦИ-протокол химиотерапии. Их использование позволяет:
- выделять группы больных с повышенным риском прогрессирования заболевания и с ожидаемым позитивным ответом на химиотерапию;
- индивидуализировать назначение адъювантной терапии.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. D. N. Artamonov, V. A. Tronov, L. U. Dederer, and L. B. Gorbacheva.
Correlation between Responses of Peripheral Blood Lymphocytes of Melanoma Patients to Chemotherapy and Methylnitrosourea Treatment in vitro.
Annals of Oncology, Volume 20, Supp. 3, (2009), p, 39.
2. В.А. Тронов, Д.Н. Артамонов, Л.Ю. Дедерер, М.Е. Абрамов, М.Р.
Личиницер, Л.Б. Горбачева.
Ответы лимфоцитов крови больных меланомой на химиотерапию и тест-воздействие метилнитрозомочевиной. Российский биотерапевтический журнал, Т. 8, №2, (2009), 23.
3. D.N. Artamonov, V.A. Tronov, L.B. Gorbacheva.
Efficiency of DNA Repair Mechanisms in Blood Lymphocytes of Melanoma Patients as Possible Prognostic Factor of Chemotherapy. Book of abstracts. Tenth International Summer School on Biophysics, Sept.19- Oct.01, Rovinj, Croatia, (2009), 80.
4. Тронов В.А., Артамонов Д.Н., Горбачева Л.Б. Генетические маркеры меланомы. Генетика. Т. 46, №2, (2010), 168-179.
5. В.А. Тронов, Д.Н. Артамонов, М.Е. Абрамов, М.Р. Личиницер, Л.Б.
Горбачева.
Ответ лимфоцитов крови больных меланомой на химиотерапию.
Корреляция с клиническим ответом. Российский биотерапевтический журнал, Т. 9, №2, (2010), 46.
6. Д.Н. Артамонов, В.А. Тронов, Л.Б.Горбачева.
Одно- и двухнитевые разрывы ДНК и эффективность их репарации в лимфоцитах крови больных меланомой кожи как прогностический фактор терапии, III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика – 2010" 21–25 июня 2010 г. Сборник материалов, 175 177.
7. Тронов В.А., Артамонов Д.Н., Абрамов М.Е., Личиницер М.Р., Горбачева Л.Б.
Связь эффективности репарации ДНК, уровня экспрессии белков MLH1, MSH2 и FasR в лимфоцитах больных диссеминированной меланомой кожи с клиническим ответом на химиотерапию. Вопросы онкологии, Т.57, №2, (2011), 181-187.
8. Тронов В.А., Артамонов Д.Н., Абрамов М.Е., Горбачева Л.Б.
Эффективность репарации ДНК лимфоцитов, их гибель, а также экспрессия белков MLH1, MSH2, FasR как факторы прогноза клинического ответа на химиотерапию больных диссеминированной меланомой.
Цитология. Т. 53, №1, (2011), 10-16.