Роль белков р53 и р73 в ответе опухолевых клеток на действие днк-повреждающих агентов
На правах рукописи
Виханская Фаина Львовна РОЛЬ БЕЛКОВ р53 и р73 В ОТВЕТЕ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК НА ДЕЙСТВИЕ ДНК-ПОВРЕЖДАЮЩИХ АГЕНТОВ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Санкт-Петербург 2007
Работа выполнялась в лаборатории молекулярной фармакологии Института фармакологии Марио Негри
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Поспелов Валерий Анатольевич Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Воробьев Владимир Иосифович Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей Петрович Институт экспериментальной медицина РАМН, Санкт-Петербург доктор медицинских наук, профессор Имянитов Евгений Наумович Институт онкологии им. проф. Н.Н.
Петрова, Санкт-Петербург
Ведущая организация: Российский онкологический научный центр РАМН, Москва
Защита состоится 26 октября 2007 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. факс: (812) 297-0341;
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.
Автореферат разослан _ 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Е.В.Каминская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования Несмотря на существенные успехи в лечении опухолевых заболеваний, они продолжают занимать одно из первых мест среди болезней, приводящих к летальному исходу (Cannistra, 1993). Не вызывают сомнения данные о том, что в большинстве случаев на первых этапах лечения достигается положительный химиотерапевтический эффект. Однако выздоровление наступает только у незначительной части больных (Berek et al., 1999).
Поэтому усилия многих научных групп направлены на изучение молекулярно-генетических механизмов, ответственных за чувствительность и резистентность опухолей к фармакологическим препаратам, используемым в онкологической практике.
Идентифицирована большая группа генов, которые ответственны за чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам разного механизма действия. Среди них особое место занимают гены, продукты которых участвуют в контроле клеточного цикла, эксцизионной репарации ДНК и апоптоза. Внимание к ним закономерно, так как, с одной стороны, нарушение их экспрессии приводит к нежелательной пролиферации клеток, а с другой - они вовлекаются в ответ клеток на повреждающее или антипролиферативное действие лекарственных препаратов.
Открытие супрессора опухолевого роста - белка р53, нарушение функции которого обнаруживается более чем в 50% опухолей человека (Harris, 1996), закономерно сделало первостепенным изучение его роли в ответе опухолевых клеток на химиотерапевтические воздействия. Накоплен большой экспериментальный материал о связи статуса р53 (дикий или мутантный) в разных типах опухолей с их чувствительностью к цитостатикам разной природы, показанных для терапии данных типов опухолей. Однако эти данные крайне противоречивы. По видимому, это связано с существованием множества различных типов мутаций в гене р53, а также наличием полиморфизмa.
Наиболее распространенной и изученной является замена 347G/C, приводящая к замене 72 R/P в области, богатой пролином (Malashewski et al., 1987).
Показано, что чувствительность клеток к различным воздействиям зависит от сочетания полиморфизма и мутаций в гене р53, однако эти данные также противоречивы (Bergamaschi et al., 2003;
Concin et al., 2005). Вероятно, что в некоторых типах опухолей сочетание 72/R с мутациями в коровом домене приводит к большей резистентности, чем сочетание 72/Р с теми же мутациями.
Высоко вероятно, что это может быть следствием взаимодействия мутантного р53 с другим, открытым позже белком р73 (Kaghad et al., 1997), продуктом гена, также принадлежащего семейству р53.
Из первичного продукта транскрипции гена р73 в результате альтернативного сплайсинга 5- и 3-концов и альтернативного полиаденилирования формируется ряд изоформ р73, которые проявляют в отношении р53 разнонаправленную модулирующую активность (Melino et al., 2002).
Анализ накопленных данных позволяет считать, что ответ опухолевых клеток является специфичным, как для данного типа клеток, так и для данного фармакологического вещества, и связан со специфическими факторами данной клетки, которые могут изменять функции белков семейства р53.
Цель и задачи исследования.
Целью исследования было изучение роли белков р53 и р73 в ответе опухолевых клеток на действие ДНК-повреждающих и противоопухолевых агентов, а также в регуляции событий клеточного цикла, апоптоза, репарации генетических повреждений и ангиогенеза.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи:
1. Исследовать способность опухолевого-супрессора р53 в клетках, полученных из опухолей разного тканевого происхождения (яичников, кишечника, легких), блокировать клеточный цикл и индуцировать апоптоз в ответ на генотоксический стресс.
2. Изучить вклад полиморфизма гена р53 в сочетании с «горячими» точковыми мутациями р53 в реализацию ответа клеток на генотоксический стресс.
3. Определить, в какой степени экспрессия транскрипционного фактора р73 в опухолевых клетках может влиять на экспрессию генов-мишеней р53, и какие новые гены вовлекаются в клеточный ответ при повышенной экспрессии р73.
4. Оценить вклад ключевых генов-мишеней, индуцируемых р73, в репарацию генетических повреждений в клетках опухолей яичников при действии ДНК-повреждающих факторов.
5. Установить роль р73 в регуляции генов, ответственных за ангиогенез и васкуляризацию опухолей in vivo. Выяснить, каким образом изоформы р73, в частности DNp73, не обладающие транскрипционной активностью, влияют на клеточные процессы, связанные с ангиогенезом.
6. Использовать данные о статусе и экспрессии генов р53 и р73 в опухолях различного тканевого происхождения в качестве прогностического критерия при выборе наиболее адекватного и эффективного лечения онкологических заболеваний.
Научная новизна. Впервые обнаружено новое свойство опухолевого супрессора р53 в контроле клеточного цикла клеток опухолей яичников, связанное со способностью р53 индуцировать блок в фазе G2/M, помимо известной ранее способности вызывать блок G1/S после действия повреждающих агентов. Впервые показано, что описанная как р53-зависимая активация гена р21/waf1, может происходить на уровне транскрипции в отсутствие р53, в частности после обработки клеток ингибитором топоизомеразы 2 доксорубицином. Впервые показано, что опухолевый супрессор р53 может ингибировать транскрипцию промотора гена топоизомеразы 2. Ингибирование транскрипции не связано с определенными специфическими последовательностями в промоторе гена Торо2а. Показано, что р может конкурировать с р53 за специфические сайты связывания в промоторах генов, отвечающих после активации р53 повышением уровня транскрипции. В связи с тем, что р73, является более слабым активатором транскрипции, он может ингибировать транс активирующее действие р53. Впервые выявлено плейотропное действие р73 на клетку. Показано, что р73 способен индуцировать экспрессию генов XPA, XPD и XPG, участвующих в эксцизионной репарации, усиливая, таким образом, защитные системы клетки. С другой стороны, р73 может влиять на васкуляризацию опухолей посредством регуляции факторов ангиогенеза, таких как VEGF и TSP-I. Повышенная экспрессия р способствует повышению содержания проангиогенного фактора VEGF и снижению антиангиогенного фактора TSP1, что приводит к увеличению числа кровеносных сосудов in vivо. Впервые продемонстрирован новый механизм транскрипционной активации гена р73, который связан с вытеснением транскрипционного фактора- супрессора C/EBP с промотора гена р73 при обработке клеток доксорубицином.
Научно-практическое значение. Данные о чувствительности и резистентности опухолевых клеток к ряду противоопухолевых препаратов, опосредованные генетическими модификациями генов семейства р53 и р73, могут быть использованы в клинической практике для разработки новых подходов в лечении опухолей.
Проведенные нами исследования показали, что присутствие активного р53 в клетках опухолей яичников может приводить к большей их резистентности к ингибитору топоизомеразы 2а доксорубицину, что открыло принципиально новые свойства р53, ранее не описанные в литературе. Это позволяет говорить о сложной зависимости окончательного эффекта действия химиотерапевтических препаратов этой группы от экспрессии р53.
Сходные выводы были сделаны нами при исследовании повреждающего действия таксола, ингибитора веретена митоза, широко применяемого в клинике. Впервые было обнаружено, что инактивация р53 приводит к большей лекарственной чувствительности клеток. Эти данные предполагают возможность успешного лечения группы опухолей, которые лишены нормальной экспрессии р53. Цисплатина – агент, широко использующийся при лечении опухолей и вызывающий повреждения ДНК, может быть одинаково активен независимо от статуса р53. Показано, что мутантный р53 меняет ответ клетки на стресс в зависимости от типа мутации в ДНК-связывающем домене и от вида полиморфизма Pro/Arg в кодоне 72. Кроме того, эффективность повреждающего действия зависит от типа химиотерапии.
В клетках опухолей яичников экспрессия р73 приводит к повышеннию эксцизионной репарации. Это свойство повышает резистентность клеток к обработке цисплатиной и УФ. Таким образом, присутствие р73, в некоторых типах опухолей может служить в клинике индикатором резистентности клеток. Помимо этого, нами показано, что усиленная экспрессия р73 в опухолях может способствовать ангиогенезу и предполагает возможность эффективного лечения с помощью ингибиторов ангиогенеза.
Имеют большое научно-практическое значение данные, что изоформа р73, не имеющая домена, ответственного за транскрипционную активацию и являющаяся репрессором р53 и р73 (так называемая доминантно-негативная форма р73DN), присутствующая во многих опухолях, не снижает чувствительность клеток к действию повреждающих агентов. Изоформа р73DN сама по себе не достаточна для формирования резистентного фенотипа.
В целом, наши данные предполагают, что ответ опухолевых клеток специфичен, однако зависит от многочисленных клеточных факторов. Результаты работы свидетельствуют о необходимости индивидуального подхода при лечении опухолей и могут быть использованы в лекционных курсах в различных институтах РАН, РАМН и университетах.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Одна из основных функций опухолевого супрессора р заключается в его способности регулировать транскрипцию широкого спектра генов, продукты которых участвуют в регуляции событий клеточного цикла, вызывая блоки G1/S и G2/M клеточного цикла после действия повреждающих агентов.
2. р53 является репрессором промотора гена Топоизомеразы 2, вовлеченного в изменения топологии ДНК и играющего критическую роль во время митоза. р53 контролирует цикл не только путем активации, но и путем репрессии генов.
3. Ингибитор циклин-зависимых киназ р21/waf1, являющийся основной мишенью р53 и принимающий участие в реализации блока G1/S после действия повреждающих агентов, может индуцироваться в опухолевых клетках по р53-независимому механизмы.
4. Экспрессия р53 может быть причиной резистентности опухолевых клеток к ДНК-повреждающим агентам различного механизма действия, таким как к доксорубицин и таксол. Р53 не может расцениваться, как решающий клеточный фактор, определяющий программу гибели опухолевых клеток при стрессе.
5. Мутации гена р53 не исчерпывают всех изменений белка, так как р53 существует по-крайней мере в двух полиморфных формах: р 72Рro/Arg. Клетки, экспрессирующие р53 72/R и несущие мутацию R249S, могут обладать повышенной резистентностью к доксорубицину.
6. р73 конкурирует с р53 за гены-мишени, причем экспрессия р может быть причиной резистентности опухолевых клеток к некоторым типам химиотерапии. р73 индуцирует ангиогенез путем активации проангиогенного фактора VEGF и репрессии антиангиогенного фактора TSP1, что приводит к повышенной васкуляризации опухолей in vivo. р73 может при некоторых условиях повышать онкогенез клетки.
7. ДНК-повреждающие агенты индуцируют р73 на уровне мРНК и белка. В промоторе р73 выявлен сайт негативной регуляции гена фактором С/ЕВР, который при обработке клеток доксорубицином меняет ядерную локализацию на цитоплазматическую.
8. Доминантно-негативная форма р73, представляющая собой изоформу р73 с делетированным транс-активирующим доменом, не меняет ответ клетки на обработку противоопухолевыми препаратами.
Апробация работы. В ходе выполнения работы ее результаты регулярно обсуждались на лабораторных семинарах фармакологического института "Марио Негри", а также на многочисленных международных симпозиумах: на международном Симпозиуме «In vitro Сytotoxicity Mechanisms», Рим, 1999;
на VII международной конференции по клинической фармакологии и терапии, Флоренция, 2000;
на зимнем митинге EORTC, Лейчестер, 2000;
на международных конференциях AACR в Новом Орлеане, 2001 и в Бостоне в 2003;
на Международных митингах по р53:
Крит, 1998, Барселона, 2002 и Дундин, 2004;
на конференции по р73/p63, Рим 2002 и 2004. Апробация диссертации была на совместном семинаре нескольких лабораторий в Институте цитологии РАН (декабрь 2006 г).
Работа проводилась при финансовой поддержке Итальянской Ассоциации Исследования рака (AIRC), Национальным Советом Рима, проектом CNR, финансируемым АСРО, фондом Nerina and Mario Mattioti, грантом Итальянского Министерства Здоровья, Фондом CARIPLO и другими Итальянскими грантами.
Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 24 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных профильных журналах, а также тезисы 9 докладов на международных конференциях и съездах.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, Результатов, Обсуждения, Выводов и Списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и рисунок. Диссертация содержит 167 наименований цитируемой литературы.
Материалы и методы исследования Клеточные линии и их культивирование. В работе использованы человеческие линии опухолей яичников, кишечника, молочной железы, карциномы легкого из коллекции Института Марио Негри, такие как А2780, IGROV-1, Pa-1, SKOV-3, HCT116, MCF7, H1299.
Клетки выращивали на среде RPMI-1640, DMEM, Iscove 's с добавлением L-глютамина и 10% фетальной сыворотки.
Химические реагенты в основном были получены из Sigma (St.
Louis, MO) и были использованы в соответствии с инструкциями.
Стабильная трансформация. Клоны получены с помощью трансфекции плазмидной ДНК методом Ca-фосфатной преципитации или липосомного переноса с помощью липофектамина-2000 (Invitrogene) c последующей селекцией на соответствующих антибиотиках. Для трансфекции использовали плазмиды, содержащие интересующие гены, а также селективные маркеры к антибиотикам G418, гигромицин В или пуромицин.
Экстракция РНК и ОТ-ПЦР. мРНК выделяли с помощью TRIZOL (Invitrogene), ОТ-ПЦР проводили с праймерами, специфичными к интересующим генам после ретротранскрипции РНК. Нозерн-гибридизация. Для количественной оценки специфической РНК, образцы разделяли электрофорезом в агарозном геле, переносили на нейлоновые фильтры и гибридизовали с 32Р-меченной к-ДНК интересующего гена. ОТ ПЦР в реальном времени. Для оценки малых количеств специфической РНК проводили анализ со сецифическими праймерами. Реакцию проводили с SYBR GREEN Master Mix (Applyed Biosystems). Вестерн-блоттинг. Белки, выделенные из клеток, разгоняли на SDS-PAGE, затем переносили на нитроцеллюлозу. В качестве первичных антител использовали антитела Santa Cruz Biotechnology, Oncogene Research и другие.
Связывание антител детектировали методом ECL (Amersham).
Люциферазную активность промоторов определяли с помощью Dual Luciferase Sestem (Promega, Milan, Italy) c использованием внутреннего контроля экспрессии ренилы pRL-SV40. САТ-анализ превращения 14С-меченного проводили путем оценки хлорамфеникола в ацетилированную форму с использованием тонкослойной хроматографии;
в качестве внутреннего контроля служила активность плазмиды CMV-gal. Направленный мутагенез в промоторных участках ДНК проводили с использованием набора Stratagene, наличие мутаций проверяли секвенированием ДНК. Анализ задержки подвижности олигонуклеотидов в геле (EMSA) проводили путем cвязывания белков экстрактов с мечеными специфическими последовательностями ДНК. Специфические и неспецифические олигонуклеотиды метили [32Р], инкубировали с белками и разделяли в неденатурирующем геле. Связывние оценивали по количеству радиоактивности, включившейся в комплекс с белком.
Иммунофлуоресценция. Для анализа внутриклеточной локализации белков использовали метод иммунофлуоресценции.
Клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали, делали проницаемыми и инкубировали с антителами. Флуоресценцию наблюдали во флуоресцентном микроскопе (Carl Zeiss, Germany).
Чип-гибридизация (microarray). Оценку экспрессии генов проводили с помощью гибридизации на микрочипах (Clonteck, ATLAS). РНК ре-транскрибировали в присутствии [32Р ]dATP (Amersham, Milan, Italy). Одинаковое количество меченной ДНК гибридизовали на фильтрах, содержащих 588 генов (Clonteck;
ATLAS human cancer). Экспрессию оценивали, используя ATLAS IMAGE Software 1.0 (Clonteck). MTT–тест. Цитотоксичность лекарственных препаратов оценивали по выживаемости клеток, которую регистрировали с помощью МТТ-теста (оценка на митохондриальную активность). Живые клетки превращают МТТ в нерастворимый осадок, который растворяют и затем измеряют интенсивность на спектрофотометре). Оценка клоногенности:
клетки высевали на низкой плотности на 6-луночные планшетки.
После 24-72 ч обрабатывали ДНК-повреждающими агентами и оставляли на 7-14 дней. Колонии окрашивали кристал-виолетом (Merck) и анализировали на анализаторе (Immagini &Computor;, Milan, Italy). Для определения апоптоза использовали Аннексин-V Клетки инкубировали с FITC-связанным Аннексин V (BD Biosciences, San Diego, CA). Реактивация поврежденной плазмиды клеткой «хозяином». Очищенную плазмиду, содержащую ген люциферазы, обрабатывали in vitro цисплатиной, осаждали, промывали этанолом и трансфецировали в интересующие клетки. В качестве внутреннего контроля использовали необработанную плазмиду -Gal, либо pRL-SV40.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава I. p53 и контроль клеточного цикла.
После открытия гена р53 как опухолевого супрессора, достаточно длительное время исследователи не могли выяснить его роль в контроле клеточного цикла, поскольку не было адекватных клеточных моделей. Первые попытки ввести в клетку и экпрессировать р53 не удавались из-за выраженной неспособности клеток к пролиферации в присутствии р53 дикого типа. В 1990 году Михайлович применил для введении р53 термочувствительный мутант, который экспрессировал мутантную форму р53 при 37°С и нормальный р53 при 32 С. Трансфекция р53 в клетки сопровождалось индукцией блока клеточного цикла в фазе G (Michailovitz et al., 1990). Наши исследования показали, что помимо G1 р53 вызывает блок G2 и это явление характерно, в частности для клеток опухолей яичников.
1.1. p53 вызывает блок G2.
Мы обнаружили, что введение термочувствительного мутанта р53 в клетки опухолей яичника приводит к блоку клеточного цикла и накоплению клеток в фазе G2 (рис.1) (Vikhanskaya et al., 1994, 1996).
% клеток в клеточном цикле % клеток в клеточном цикле Время инкубации при 32С (ч) Время инкубации при 32С (ч) ки выращивали при 37 С и смещали на 32 С на Рис.1. Цитофлюориметрический анализ распределения в клеточном цикле клеток SKOV3, SKN, SK23a и SK9, культивируемых сначала при 37С, а затем при 32С указанное время. (•) G1, () S, () G2-M. SKOV3 - исходная линия, SKN – клетки, содержащие пустой вектор, SK23а и SK9 – клетки, содержащие температуро-чувствительный мутант р53.
Как видно на рисунке 1, в присутствии р53 не наблюдалось накопления клеток в фазе S или в фазе G1. Это были первые данные о том, что в определенных экспериментальных условиях р53 может преимущественно вызывать G2 блок. На этом рисунке представлены два клона, содержащие трансфецированный р53: SK23a и SK9.
Действие р53 на структуру клеточного цикла был наиболее выражен в первом из них. Одновременно, в аналогичных работах, проведенных в ряде лабораторий, также было показано, что и в других экпериментальных системах экспрессия р53 приводит к блоку G2 (Agawal et al., 1995). Механизм регуляции клеточного цикла опухолевым супрессором р53 базируется на представлении об индукции гена-мишени p21/waf1 – ингибитора активности циклин зависимых киназ (El-Deiry et al., 1993). Сам по себе р53 в отсутствии этого гена не способен вызывать блок в фазе G1. Позже был открыт ген 14-3-3 (Hermeking et al., 1997), который, как оказалось, вовлечен в формирование р53-зависимого блока G2. Следует отметить, что наши исследования были проведены за 5 лет до клонирования этого гена, а молекулярные механизмы формирования блока были расшифрованы существенно позже.
1.2. Транскрипция гена p21/waf1 может регулироваться р53-независимым способом.
р21/Waf1 был первым геном, который клонировали как мишень р53.
Обработка клеток противоопухолевыми агентами вызывает накопление р53, его стабилизацию и активацию, которая приводит к индукции транскрипции гена p21/waf1. Однако, оказалось, что не только р53 может регулировать ген р21/Waf1, существуют и другие факторы его активации. Так, в р53-негативных клетках опухолей яичников активация транскрипции гена р21/waf1 наблюдается после действия противоопухолевого агента доксорубицин (рис.2) (Vikhanskaya et al., 1995). Таким образом, р21/waf1 может останавливать пролиферацию р53-негативных опухолевых клеток.
Позже было показано, что р21/waf1 участвует в блоке клеточного цикла не только в фазе G1, но и в фазе G2.
доксорубицин цисплатина доксорубицин CDDP Рис.2. Анализ экспрессии р21/waf1 по 0 3 6 24 3 (ч) 0 3 6 24 3 24 Нозерн-гибридизации в линии SKOV- P21/waf Р21/waf (p53-null) после обработки доксорубицином и цисплатиной.
Время обработки указано в часах.
актин актин Это означает независимую от р53 возможность остановки клеточного цикла в различных фазах.
1.3. р53 подавляет транскрипцию промотора гена Топоизомеразы 2.
Будучи транскрипционным фактором, р53 обладает большими потенциальными возможностями для активации и репрессии генов.
Репрессия может осуществляться за счет прямого связывания с промоторными участками генов, но таких примеров немного. В основном, р53 связывается с помощью белок-белковых взаимодействий с супрессорами, которые и подавляют транскрипцию. Помимо этого, р53 может подавлять транскрипцию с помощью индукции белка р21/waf1. Мы исследовали появление блока G2, вызванного эктопической экспрессией р53, и обнаружили новую мишень гена р53.
Рис. 3. Ингибирование 1 4 6 10 Р промотора гена Топоизомеразы 2 с помощью р53. Концентрация репортера 2 µг.
Трансфекцию проводили в клетки SKOV3. Активность 100 85 61 58 20 промотора оценивали САТ анализом через 48 ч после Эффективность превращения хлорамфеникола трансфекции.
в его ацетилированную форму, % Установлено, что одним из механизмов формирования G2 блока может быть активация гена 14-3-3, который препятствует ядерной локализации комплекса циклин В/cdc2 после повреждения ДНК.
Удаление из клетки 14-3-3 путем гомологичной рекомбинации приводит к летальному исходу после облучения. Но регуляцию событий клеточного цикла, в том числе и в фазе G2, определяет не только активация генов посредством р53. Мы показали, что в клетках опухолей яичника, р53 может подавлять транскрипцию гена топоизомеразы 2 (рис. 3) (Sandri et al., 1996). Позднее такие же результаты были описаны на клетках фибробластов мыши, что говорит в пользу универсальности механизма р53-зависимой регуляции транскрипции гена Топоизомеразы 2 (Wang et al., 1997).
1.4. р53 и ответ клеток на действие противоопухолевых препаратов.
Ответ клетки на стресс связан с быстрыми пост-транляционными модификациями р53, в частности его ацетилированием и фосфорилированием. При этом увеличивается стабильность р53, он начинает накапливаться в клетке и активирует гены-мишени. Такие же процессы могут происходить и после действия противоопухолевых препаратов. Принято считать, что наличие нормального р53 в клетке может существенного влиять на чувствительность клеток к противоопухолевым препаратам.
Важность повышения чувствительности опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам трудно переоценить. Мы изменяли изначальный статус р53, и затем сравнивали чувствительность исходной и модифицированной клеточных линий. Тем самым, мы хотели проверить гипотезу о способности р53 изменять чувствительность различных клеточных моделей. В процессе работы была создана панель изогенных клеточных линий, экспрессирующих р53, который менялся при изменении температуры с 37°С на 32°С, описанную в главе 1.1. Нормальный р53 дикого типа в клетках А2780 опухолей яичников инактивировали с помощью введения района Е6 вируса папилломы HPV16, который способствует усиленной деградации белка р53.
Аналогичный подход был применен для клеток опухоли кишечника НСТ116, которые, так же как и А2780, содержат нормальный р53.
Эти клеточные модели были использованы для выяснения роли р при обработках, типичных для данного типа опухолей, которые применяются в клинике. Использование изогенных линий позволяет сравнивать клетки, имеющие одинаковый генетический материал и различающиеся только по одному конкретному параметру – экспрессии гена р53 (дикий или мутантный).
1.4.1. Роль р53 в ответе клеток на обработку доксорубицином.
При использовании температурочувствительного мутанта р оказалось, что присутствие активного р53 при 32С (Табл. 1) приводит к большей резистентности клеток к ингибитору Топоизомеразы 2 доксорубицину. Эта резистентность не была связана с уменьшением внутриклеточного накопления доксорубицина или его быстрым выведением из клетки.
Цитотоксичность доксорубицина при 32°С в клетках, не экспрессирующих р53, была значительно выше, чем в клетках, экспрессирующих р53, что снимало вопрос о возможном влиянии низкой температуры на эффекты, связанные с метаболизмом агента.
Мы не обнаружили изменения в токсичности при исследовании других лекарств, в частности цисплатины (Vikhanskaya et al., 1995).
Исследуя распределение клеток в цикле, экспрессию циклинов и киназ (Vikhanskaya et al., 1996), причины повышенной устойчивости клеток к агенту, пока выяснить не удалось (Vikhanskaya et al., 1996).
Существуют метаболические и сигнальные пути, которые зависят от присутствия р53 и вовлечены в доксорубицин-резистентность.
Позднее аналогичные данные были получены при исследовании действия доксорубицина на клетки опухоли кишечника (Bunz et al., 1999). Недавно показано, что при обработку доксорубицином р индуцирует ген TIGER, снижающий чувствительность к этому агенту в целом ряде опухолевых клеток (Bensaad et al., 2006). Наши данные ставят под сомнение концепцию о зависимости повышенной чувствительности клеток от присутствия р53 дикого типа, как универсального явления, и предполагают, что в определенных эпигенотипах, чувствительность может даже снижаться.
На системе термочувствительного р53 была проверена токсичность клеток к ряду ДНК-повреждающих агентов, применяемых в клинике при обработке опухолей данного типа (Табл. 2). В отличие от доксорубицина, присутствие р53 дикого типа не меняло ответ клеток на другие агенты.
Таблица 1 Цитотоксичность к доксорубицину и цисплатине в клонах, экспрессирующих температурочувствительный р (ингибирование в %) SKN SK23a SKN 23a 37°C 32°C 37°C 32°C доксорубицин 0.25µМ 25 + 8 25+3 26 + 9 0,25µМ 31 + 6 24+ 4 33 + 5 4+ 0.50µМ 69 + 9 63+ 15 86 + 5 25 + 0.50µМ 56 + 1 32 + 2 58 + 15 13 + 1.00µМ 74 + 4 58 + 4 82 + 1 48 + цисплатина 10 µg/ml 62 + 4 74 + 4 58 + 1 70 + Значения представляют собой среднее + стандартное отклонение в 3-х экспериментах, за исключением обработки доксорубицином (0.25 µМ). Использован метод подсчета с помощью МТТ-теста за исключением экспериментов, отмеченных, где ингибирование оценивали путем подсчета клеток в счетчике клеток.
Таблица 2. Чувствительность к фармакологическим препаратам клонов, экспрессирующих температуро чувствительный р53 при 32°С и мутантный р53 при 37°С (цитотоксичность представлена в дозах, подавляющих жизнеспособность клеток на 50% - IC50).
SKN SKN Отношение SK23 SK23 Отношение 37°C 32°C 32:37 37°C 32°C 32: доксорубицин 0.29±0.08 0.76°±0.11 2.6 0.14±0.05 1.6°±0.39 11.. цисплатина 16.67±6.3 19.67±9.3 1.2 7.67±2.00 11.67±5.3 1. L-PAM 19.34±5.6 27.54±10. 1.4 15.08±2.3 28.52±7.9 1. MNNG 77.5±2.9 60.6±0.06 0.8 68.2±9.0 68.2±1.9 1. VP-16 4.08±1.02 9.86±1.02 2.4 3.23±1.03 10.71±2.0 3. m-AMSA 0.55±0.2 0.57±0.15 1.0 0.40±0.11 0.51±0.0.7 1. MTX 0.47±0.09 0.62±0.12 1.3 0.40±0.11 0.49±0.13 1. TAX 7.0±0.6 6.9±0.6 1.0 7.1±0.2 9.4±2.1 1. CPT 0.48±0.10 0.56±0.16 1.2 0.48±0.12 0.58±0.12 1. FCE2451 73.04±0.3 4.07±0.07 1.2 2.02±0.12 3.08±0.41 1. IC50 (в µМ) рассчитывались по трем экспериментам. Обработку проводили в течение 24 ч, затем через 72 ч определяли жизнеспособность клеток по МТТ.
1.4.2. р53 и действие таксола.
Таксол является противоопухолевым агентом, который связывается с тубулином и действует на микротрубочковый аппарат клетки на стадии митоза. Таксол широко применяется в клинике при лечении опухолей яичников. В связи с этим, была исследована роль р53 в определении признака устойчивости клеток к этому агенту. Для этой цели использовали изогенную систему клеток опухолей яичников: А2780, содержащую нормальный р53, и линию, полученную введением продукта вируса HPV Е6, в которой р53 был почти полностью деградирован (Vikhanskaya et al., 1998). Известно, что таксол может вызывать накопление р53 путем стабилизации белка р53 (Blagosklonny et al., 1996). Правомерно было ожидать, что присутствие р53 при обработке таксолом может внести изменения в ответ клеток. При проверке распределения клеток по циклу (рис. 4), было обнаружено, что в исходной линии А2780 таксол практически не вызывает изменений в распределении клеток. В тоже время, после инактивации р53, накопление клеток в фазе G2/M после действия таксола увеличивается с 9% до 62%. Это событие приводит к увеличению чувствительности клеток к таксолу (рис. 5).
А Таксол,100nM контроль Количество клеток А2780/Е Таксол,100nM контроль Содержание ДНК Содержание ДНК Рис.4. Распределение по клеточному циклу после обработки таксолом (1 ч) и при дальнейшей инкубации в течение последующих 24 ч.
Рис.5. Ингибирование роста при обработке таксолом.
А2780 (o) и А2780/E6 (•).
% от контроля МТТ-тест проводили через 72ч после обработки клеток (24ч).
Концентрация таксола (nM) ирование роста клеток при обработке таксолом А По-видимому, накопление клеток в G2/M в отсутствии р53 является в определенной мере причиной повышения чувствительности опухолевых клеток яичника к таксолу. Таким образом, таксол может проявлять противоопухолевое действие более эффективно в отсутствии р53, и линия А2780/Е6 является одним из таких примеров. Для того чтобы убедиться в правомочности такого вывода, были исследованы другие линии клеток опухолей яичника, не подвергавшиеся дополнительной модификации и были получены клоны, экспрессирующие р53 под контролем тетрациклин зависимого промотора в линии SKOV3 (Таблица 3) (Debernardis et al., 1997).
В этой серии экспериментов не наблюдалось положительной корреляция между присутствием р53 и повышенной чувствительностью к таксолу. Скорей наоборот, наблюдалась повышенная устойчивость линии А2780, несущей нормальный р53, к таксолу. Введение гена р53 под контролем тетрациклинового промотора в линию SKOV3 р53-null, не меняло существенно IC50.
Линии, содержащие мутантный р53, и p53-null линии, такие как SW626, OVCAR-3, OVCAR-5, OVCAR-8 и SKOV-3, не отличались повышенной резистентностью по сравнению с линией А2774, содержащей р53 дикого типа.
Для понимания механизмов чувствительности клеток к таксолу, была проведена оценка апоптотической гибели клеток методом ДНК фрагментации по связыванию ДНК на фильтрах и с использованием окрашивания методом TUNEL. Уровень апоптотической гибели был очень низок. Вероятно, отсутствие апоптоза в клетках опухолей яичников и является причиной отсутствия влияния р53 на чувствительность клеток. Таким образом, р53 может играть существенную роль в ответе клеток на повреждение, по крайней мере, в опухолях яичников, только в том случае, когда может быть запущена программа апоптоза.
Таблица 3.
Чувствительность к таксолу различных клеточных линий, полученных из опухолей яичников (IC50 ).
Статус р53 IC50 (nM) OVCAR-3 мут (248RQ) 4. OVCAR-5 мут (вставка 3bp в 224) 6. OVCAR-8 мут (дел 126-132 7. SW626 Мут (262 G V) 3. SKOV-3 делеция 4. A2774 дикий тип 6. А2780 дикий тип РА-1 дикий тип 3. IGROV-1 дикий тип 8. SK4T+ тет делеция SK4T - тет дикий тип SK23a 37°C мут (135 С V) 7. SK23a 32°C дикий тип 9. SKN 37°C делеция 7. SKN 32°C делеция 7. Статус р53 определяли в каждой клеточной линии с помощью PCR амплификации и последующего секвенирования экзонов 5-8. IС50 концентрация таксола, вызывающая 50% гибели клеток после обработки 24 ч. Гибель клеток оценивали после инкубации в течение 72 ч. Клетки культивировали в присутствии (+) и отсутствии (-) 1 µг/мл тетрациклина.
Наши данные о зависимости чувствительности клеток от статуса р53, полученные на клетках опухолей яичников, совпадают с выводами другой группы;
авторы также элиминировали р53 с помощью продукта HPV E6 и анализировали чувствительность к таксолу (Wahl et al., 1996).
1.4.3. Р53 и ответ клеток на обработку цисплатиной.
Цисплатина является противоопухолевым агентом, вызывающим формирование моно-аддуктов и межцепочечных сшивок. Обработка цисплатиной, повреждая ДНК, стимулирует накопление в клетках р53 (рис. 6). В этой части работы также было исследовано функциональное значение индукции р53 в определении клеточной чувствительности к обработке цитостатиком. С использованием модели, несущей термо-чувствительный мутант р53, было обнаружено, что присутствие р53 при обработке цислатиной (Таблица 1) не вызывает изменений ответа клеток.
Рис. 6. Активация р53 и HCT 0 24 48 72 р21/waf1 в ответ на обработку Время, ч цисплатиной p (25 µМ, 1 ч). Белки тестировали через указанное время с p21/waf помощью Вестерн-блоттинга.
Кроме клеток опухолей яичника, действие цисплатины было исследовано на клетках опухоли кишечника НСТ116, содержащей нормальный р53, инактивированный затем с помощью введения продукта вируса HPV E6 (рис. 8) Оказалось, что инактивация р приводит к сенсибилизации клеток (рис. 7).
НСТ Рис. 7. Действие цисплатины на клетки опухоли кишечника, содержащие дикий тип р НСТ116 () и клетки клона НСТ116/Е6, в которых р был инактивирован % от контроля (). Цитотоксическое действие цисплатины оценивали по клоногенной выживаемости.
Результаты представляют собой среднее трех независимых экспериментов.
Цисплатина µМ Рис. 8. Инактивация р53 в клетках линии НСТ116 при стабильной НСТ116HCT 116 Е и НСТ116/E Исходная линия трансфекции продукта вируса Цисплатина - + - + HPV16 E6. Обработка цисплатиной р Р 24 ч 25 µМ. Контроль (-), обработка цисплатиной (+).
Сходные результаты были получены на линии клеток опухоли груди MCF-7 (Fun et al., 1995). Введение экзогенного продукта вируса папилломы может неспецифически менять ответ клетки на повреждение. В связи с этим была проведена проверка зависимости чувствительности клеток, полученных из опухолей яичников и не подвергшихся дополнительным модификациям, от статуса р53.
Оказалось, что и в случае неизогенных клеток чувствительность к цисплатине не определяется статусом р53 (De Feudis et al., 1997).
Наши результаты по сенсибилизации клеток могут быть связаны с отсутствием репарации ДНК, во многих случаях опосредованной р53. Однако, следует отметить данные, которые существуют в литературе и отличаются от наших. В частности, показано снижение чувствительности к цисплатине в линиях, несущих мутантный р53 по сравнению с линиями, экспрессирующими р дикого типа (Perego et al., 1996). Эти противоречия до настоящего времени не объяснены, и являются свидетельством того, насколько трудно прогнозировать результаты лечения.
1.4.4. Полиморфизм р53 72Pro/Arg в сочетании с “горячими” точковыми мутациями в ДНК связывающем домене и чувствительность к ДНК повреждающим агентам.
Мутации гена р53 представляют основные модификации белка, проявляющиеся при развитии опухолей. Помимо мутаций в р имеется полиморфный сайт в кодоне 72 экзона 4, который кодирует либо аминокислоту аргинин 72/R, либо пролин 72/P. Полиморфизм по гену р53 зависит в сильной мере от этнического происхождения и варьирует в разных популяциях. Полиморфизм связан с областью р53, богатой по пролину, которая участвует в регуляции пролиферации и апоптоза. Полиморфные формы обладают различными биохимическими и биологическими свойствами. Мы исследовали, как полиморфизм в сочетании с мутациями в гене р может менять ответ клеток опухолей легкого на обработку агентами, применяемыми при лечении. Были сконструированы векторы, несущие 6 «горячих» мутаций гена р53 в сочетании с разными полиморфными формами: либо 72/Pro, либо с 72/Arg (R175H, G245S, R248W, R249S, R273H, R282W) и получены поликлональные линии из клеток Н1299 легочной карциномы, имеющих исходный генотип р53-null. Все клеточные линии экспрессировали мутантный р53, который обладал различной подвижностью при электрофорезе в зависимости от присутствия пролина или аргинина в кодоне 72 (рис. 9).
вектор р актин Рис. 9. Анализ поликлональных популяций, полученных после трансфекции клеток Н1299 векторами, несущими 6 «горячих» мутаций гена р53 в ДНК-связывающем домене в сочетании с одним из полиморфизмов в позиции 72: аргинином или пролином. Поликлональная линия, содержащая пустой вектор, использована в качестве контроля. Для выявления р использовали моноклональные антитела DO1.
Обработка цисплатиной, этопозидом и гемцитабином не зависела от типа полиморфизма, однако обработка доксорубицином была более эффективна в случае сочетания мутации R249S р53 с полиморфной формой 72/Pro, чем с 72/Arg (Рис. 10).
вектор 72Р 72R Число живых клеток,% 175H 245S 248W 249S 273H 282W к контролю Доксорубицин,(µМ) Рис. 10. Чувствительность к доксорубицину линий Н1299, содержащих «горячих» мутаций в сочетании с р53 полиморфизмом 72 P/R. Анализ проводили с помощью МТТ теста. В случае мутации 249S наблюдали достоверные различия в чувствительности между 72P и 72R вариантами (72R72P).
Очевидно, что полиморфизм может играть роль в ответе клеток на повреждение. Тем не менее, наблюдается зависимость от типа мутации и характера обработки, и эффект не всегда предсказуем, поскольку он еще зависит от вида опухоли, т.е. от эпигенотипа (Vikhanskaya et al., 2005). Это же явления описано в работе, проведенной на опухолях головы и шеи (Bergamaschi et al, 2003). Однако, при исследовании опухолей этого типа, авторы пришли к выводу, что присутствие 72Arg приводит к резистентности в сочетании со всеми мутациями р53, и при любых типах обработки. Наконец, существуют данные, которые говорят что полиморфизм в мутантном р53 в опухолях яичника (Concin et al., 2005) не определяет связь между резистентностью клеток и полиморфизмом в кодоне 72. Наши данные предсказывают, что ответ может определяться целым набором факторов, включающих не только наличие мутаций в р53 и полиморфизм 72Pro/Arg, но и другие генетические характеристики опухолей. Резистентность может объясняться способностью мутантного р53 + 72/R связываться с другим членом семейства - р73 и инактивировать его гораздо более эффективно, чем в случае мутантного р53 + 72/P. В клетках Н1299, использованных в нашей работе, это различие отсутствовало (Vikhanskaya et al., 1995).
Глава 2. р73 – второй член семейства р53.
Ген р53 был открыт в 1979 г., и долгое время считалось, что р уникален. Однако через 18 лет семейство р53 было дополнено открытием генов р73 и р63 (Kaghad et al., 1997). Ген р73 имеет 63% гомологии в ДНК-связывающем домене, 38% гомологии с доменом тетрамеризации и 29% гомологии с трансактивирующим доменом р53. С последовательности гена р73 транскрибируются C-концевые сплайсинговые формы (p73,,,,, ). Помимо этого, возможен альтернативный сплайсинг в N-концевой части р73 и существует альтернативный промотор в 3-ем интроне, что в результате приводит к синтезу белка, не имеющего трансактивирующего домена (доминантно-негативная форма - DN p73) (Vossio et al., 2002).
Наиболее существенная разница между двумя членами семейства состоит в том, что для р73 до настоящего времени нет точных данных о том, что он является опухолевым супрессором (Marabese et al., 2007). Мыши с нокаутом по р73 не формируют опухолей и, кроме того, р73 может быть гиперэкспрессирован в ряде опухолей без остановки их пролиферации. Мутации в гене р73 встречаются крайне редко.
Р73 активирует многие р53-зависимые гены, хотя эффективность активации отличается от индукции в сравнении с р53. В частности, многие р53-зависимые гены, такие как р21/waf1, bax, PIG активируются значительно слабее.
2.1. Взаимодействие между р53 и р73.
Поскольку р73 экспрессируется практически во всех нормальных и опухолевых клетках, представлялось важным понять, как р73 может взаимодействовать с р53. Этот вопрос особенно актуален для опухолей, содержащих нормальный р53. В результате экспериментов по иммунопреципитации, мы не выявили физического взаимодействия белков р73 и р53 (Vikhanskaya et al., 2000). Aналогичные данные были получены в других работах (Davison et al., 1999). Тем не менее, были поставлены эксперименты по выявлению функциональной связи между двумя белками (рис.
11). Для этого в клетки трансфецировали р53 и р73 вместе с репортерной плазмидой, содержащей канонический сайт связывания для р53.
Рис. 11. Подавление транскрипционной активности р53 в линии SKOV3 при ко-трансфекции р73 вместе с диким или мутантным р53. Концентрация р53 вариировала, тогда как концентрация р всегда составляла 1 мкг. В качестве репортера использовали плазмиду pG13-Luc, содержащую в промоторе 13 копий сайта связывания р53, и ген люциферазы.
По-видимому, р73, связываясь с теми же последовательностями в промоторе, что и р53, но, обладая более низкой способностью активировать гены, таким образом, может ослаблять эффект р53.
Р73 может влиять на активацию р53-зависимых генов не только в случае стресса, но и в нормальных условиях жизни клеток. Недавно были открыты изоформы р53 (Bourdon et al., 2005), которые могут экспрессироваться в опухолевых клетках и также могут конкурировать с нормальным р53. В целом, конкуренция между всеми членами семейства р53 представляет собой сложную картину.
По-видимому, существование опухолей, развивающихся в клетках с р53 дикого типа, может объясняться снижением активности белка в присутствии р73. В экспериментах по ко-трансфекции р53 и р активность р53 значительно подавлялась. Оказалось, что это связано со снижением связывания р53 с последовательностью, являющейся каноническим (CON) сайтом связывания для р53. Этот результат был получен на ядерных экстрактах из клеток клонов, экспрессирующих р73 (рис. 12).
А Б компетиторы Р53комп мышь лексы Чел.
рис12.
Рис.5.ДНК - связывающая активность р53 лизатов клеток,экспрессирующих й ( SK23) й 3(А2780) Рис. 12. ДНК-связывающая активность р53 в лизатах клеток, экспрессирующих р53 мыши и человека, в присутствии р (А2780, р73.4,5) и в его отсутствии (А2780). (А) - контроль и (Б) обработка цисплатиной (15 µМ).
2.2. р73 и гены репарации ДНК.
В клонах, экспрессирующих р73 (Vikhanskaya et al., 2000), было изучено его влияние на экспрессию генов с использованием техники гибридизации транскриптов с 588 генами, иммобилизованными на фильтре (микро-эррей). В двух независимых клонах, с высокой экспрессией р73 (А2780/р73.4 и А2780/р73.5) по сравнению с клетками, экспрессирующими вектор, наблюдалось значительное усиление экспрессии генов, участвующих в эксцизионной репарации ДНК (табл. 4) (Vikhanskaya et al., 2001).
Данные, полученные с помощью гибридизации на микрочипах (microarray), были подтверждены методом Нозерн-гибридизации (рис. 13). Повышенная экспрессия генов репарации XPB, XPD и ХPG наблюдалась в клонах и не увеличивалась после обработках ДНК-повреждающими агентами, что заметно отличалось от экспрессии гена GADD45, который дополнительно индуцируется при воздействиях, повреждающих ДНК.
Таким образом, установлено, что р73 усиливает транскрипцию генов XPD, XPG и XPB, принимающих участие в эксцизионой репарации ДНК и, таким образом, повышает способность клеток репарировать повреждения ДНК. Это приводит к повышению резистентности к таким агентам, как цисплатина и ультрафиолетовое облучение (УФ).
Таблица 4.
Количественные изменения экспрессии генов в клонах, содержащих р73 (А2780р73.4, А2780р73.5) по сравнению с контролем.
Индуцируемые гены Супрессируемые гены Гены/ клоны А2780.р73.4 А2780.р73.5 Гены/клоны А2780.р73.4 А2780.р73. Р73 10 11 Rho C 0.41 1. BAX 2.1 2.3 Collagen III 0.62 0. GADD45 3.45 2.8 Desmoplak3 0.4 1. PIG3 1.45 2.6 MMP2 0.34 0. PIG11 1 1.8 PDGFR 0.31 1. b-RAF 2.4 0.8 Paxillin 0.49 1. DNA-PK 5 6 Stromelysin1 0.24 0. ATM 3.2 2.3 TIMP-2 0.71 0. XRCC6 2.2 3.5 MEKK3 0.67 0. XPG 2.3 2.05 Cdherin 14 0.32. XPD 3.9 4. XPB 4.5 3. XRCC1 2.5 MGMT 2.7 2. HMLH1 1.7 2. PIG12 2.26 1. УФ цисплатина Рис. 13. Анализ генов CDNA3 p73.4 p73.5 CDNA3 p73.4 p73. репарации в клонах А2780, - +- +- + - + -+- + содержащих р73 после УФ (слева) и обработки GADD цисплатиной (справа).
XPB CDNA3 - клон, содержащий пустой вектор, р73.4, 5 XPD клоны, экспрессирующие XPG р73. Экспрессию белков актин определяли по Вестерн блоттингу.
Используя реактивацию поврежденной плазмиды клеткой «хозяина», был исследован вопрос о влиянии гиперэкпрессии генов эксцизионной репарации на репарационный потенциал клеток. Для этой цели, плазмиду, кодирующую ген люциферазы, обрабатывали in vitro цисплатиной и затем трансфецировали в клетки, экспрессирующие либо р73, либо вектор (рис. 14). Для оценки эффективности трансфекции вводили необработанную плазмиду Renilla. В этих экспериментах репарация в трансфицированных плазмидах должна проходить за счет внутриклеточных факторов, и эффективность работы этих факторов оценивается по уровню люциферазной активности.
PGL Рис. 14. Реактивация клеткой «хозяина» плазмиды, обработанной in vitro Относительная люцеферазная цисплатиной, и затем трансфецированной в клетки.
А2780/pCDNA3 () контроль;
А2780/p73.4 (•) и А2780/p73.5 –ген р активность (o). Данные представляют среднее 3-х независимых экспериментов.
50 100 150 200 Цисплатина (мкм) В результате проведенных экспериментов было обнаружено, что репарация плазмиды осуществлялась быстрее в клонах, содержащих р73, что согласуется с данными по экспрессии этого гена.
2.3. р73 и ангиогенез.
2.3.1. р73 регулирует TSP-1 и VEGF.
Васкуляризация опухолей контролируется балансом между проангиогенными и антиангиогенными факторами (Hanahan and Folkman, 1996). Эти факторы индуцируются или подавляются онкогенами и антионкогенами (Mukhopadahyaya et al., 1995;
Dameron et al., 1994). В связи с этим, было исследовано влияние р73 на экспрессию факторов васкуляризации опухолей. Оказалось, что экспрессия антиангиогенного фактора TSP-1 подавлена в клонах, гиперэкспрессирующих р73 по сравнению с линией, несущей вектор. Это подавление наблюдалось как на уровне РНК, так и на уровне белка. В то же время, оба клона, экспрессирующие р73, продуцировали повышенный уровень проангиогенного фактора VEGF (рис. 15 а, б, в) (Vikhanskaya et al., 2001а).
Исследование секреции этих факторов в среду показало, что секреция TSP-1 снижена, тогда как VEGF повышена (даты не представлены). Тем не менее, точный механизм регуляции этих событий пока неизвестен, поскольку р73 не может действовать на уровне промоторной активности обоих факторов.
TSP-1 VEGF TSP В А VEGF 18S 18S TSP Б актин Рис. 15. Экспрессия про- и антиангиогенных факторов (VEGF и TSP1) в клонах А2780, экспрессирующих вектор pCDNA3 и р73:
р73.4 и р73.5. А, В - РНК-гибридизация, Б - ОТ-ПЦР.
Возможно также, что существуют другие регуляторные последовательности этих генов, выходящие за границы участков промоторов, которые были использованы нами в люциферазных экспериментах. Влияние р73 на время полужизни РНК исследованных про- и антиангиогенных факторов обнаружено не было (данные не представлены).
2.3.2 р73 и васкуляризация опухолей in vivo.
Кроме эффектов р73 in vitro, была исследована его роль процессе ангиогенеза in vivo. Клетки клонов, экспрессирующих р73 или пустой вектор, вводили под кожу бесстимусных nude мышей и после образования опухолей в них была исследована плотность сосудов (рис. 16).
б в а Рис. 16. Иммуногистохимия CD-31. Анализ васкуляризации опухолей, полученных из клонов, экспрессирующих вектор (а) либо р73: р73.4 (б) и р73.5 (в).
Таким образом, в результате экспрессии р73 ангиогенез в опухолях усиливается, что выражается в увеличении плотности кровеностных сосудов. Не исключено, что агенты, снижающие ангиогенез, могут быть эффективны при повышенной экспрессии р73.
2.4. Регуляция экспрессии р73 после действия ДНК повреждающих агентов.
2.4.1. Индукция РНК и белка.
Уже в первой работе, описывающей функции нового белка р73, было показано, что р73, в отличие от р53, не может активироваться при действии клеточных стрессов. Тем не менее, впоследствии стали появляться данные, что р73 также может накапливаться в клетках после генотоксических стрессов в результате пост-трансляционных модификаций белка, таких как ацетилирование и фосфорилирование.
Мы исследовали возможность активации р73 ДНК повреждающими агентами на уровне транскрипции. В клетках нейробластомы линии SH-SY5Y после обработки доксорубицином накопление р73 выявлялось как на уровне РНК, измеряемой количественно методом real-time ОТ-ПЦР, так и на уровне белка, оцениваемого по Вестерн-блоттингу (рис. 17).
Б А р73 актин мРНК отношение р Р Р Е2F актин доксорубицин (µМ) : 0 1 0 Рис.17. Индукция р73 РНК(А) и белка (Б) в клетках SH-SY5Y Рис.17. Индукция РНК р73 (А) и белка р73 (Б) в клетках SH-SY5Y.
2.4.2. Активация промотора гена р73 после обработки доксорубицином.
Несмотря на то, что промотор р73 был клонирован (Ding et al., 1999), регуляция его не была исследована. Для понимания механизмов активации транскрипции гена р73 после действия доксорубицина, была проанализирована активность полного промотора р73 и его делеционных мутантов после обработки доксорубицином. Оказалось, что активность полноразмерого промотора р73 (2.7 т.п.о.) увеличивается при обработке доксорубицином. Этот фрагмент гена содержал три E2F1 связывающих последовательности и гипотетическую р последовательность. Мы проконтролировали способность промотора отвечать активацией на введение Е2F1 и убедились, что он активируется при котрансфекции с плазмидой, несущей ген Е2F1, как это было описано в других работах (Irwin et al., 2000) (данные не представлены). Оказалось, что фрагмент меньшего размера - 1.8 т.п.о. отвечает на доксорубицин (рис. 18). В этом фрагменте отсутствовал потенциальный сайт для связывания р53 и один из трех E2F1 сайтов. Этот фрагмент промотора активировался доксорубицином более чем в два раза сильней по сравнению с контролем.
2444 LUC LUC - LUC - -1210 LUC -883 LUC -220 LUC вектор 1 2 3 4 Относительная люциферазная активность Рис. 18. Действие доксорубицина на активность промотора р73.
Конструкции, содержащие различные 5-делеции промотора, были клонированы в векторе pGVB2 и трансфицированы в клетки SH-SY5Y нейробластомы. После трансфекции клетки обрабатывали доксорубицином в течение 24 ч и анализировали люциферазную активность. Белые столбики - контроль, черные столбики - обработка доксорубицином.
2.4.3. Участие транскрипционного фактора C-EBP в регуляции промотора р73.
При дальнейшем уменьшении длины промотора до 1.2 кВ, начиная с места старта транскрипции (фрагмент содержал два сайта связывания E2F1), индукция доксорубицином уже не наблюдалась.
Мы предположили, что в области размером 0.6 т.п.о., находящейся между 1.8 т.п.о. и 1.2 т.п.о., имеется последовательность, которая может отвечать за индукцию доксорубицином. Секвенирование этого фрагмента выявило два сайта связывания: с факторами C/EBP и WT. Мутационные замены в одном из этих сайтов – C/EBP приводят к активации промотора (рис. 19). Это позволяет предполагать, что C/EBP может быть фактором супрессии промоторной активности гена, который диссоциирует при обработке доксорубицином (Marabese et al., 2003). Свойства C/EBP, как транскрипционного репрессора, в литературе уже описаны (Slomiany et al., 2000).
активность А Относительная люциферазная 1.8 кб 1.8 кб CEBP/ мут 1.8 кб WTмут Б Доксо. 0 1 0 1 0 µМ ая активность 1.8 кб после мутации CEBP/ и WT без обработки Рис. 19. Люциферазная активность фрагмента промотора р73 (1. т.п.о.) после мутации сайтов связывания С/ЕВР и WT. Анализ активности без обработки (А) и после обработки доксорубицином (Б).
Эксперименты продемонстрировали новый, неописанный ранее механизм регуляции р73 на уровне регуляции транскрипции.
2.5. Гиперэкспрессия р73 в клетках опухолей яичников и чувствительность к обработкам ДНК повреждающими агентами.
При изучении р73 был обнаружен ряд его свойств, таких как конкуренция с р53 (рис. 11 и 12), увеличение количества белка в ответ на повреждающие агенты (рис. 17), регуляция генов репарации (Таблица 3, рис. 13) и непосредственное участие в репарации, показанное в клонах, гиперэкспрессирующих р73 (рис.
14). Это позволяло предполагать, что р73 принимает участие в ответе клеток на повреждения. В связи с этим, была исследована роль р73 в модуляции ответа клетки на обработку цисплатиной (рис. 20 а). р73 снижал чувствительность к цисплатине, а также к УФ облучению, вызывающему образование пиримидиновые димеров в ДНК (рис. 20 б ). Оба типа повреждений восстанавливаются способом эксцизионной репарации с участием продуктов генов XPA, XPB,XPG.
А Б Рис. 20. Цитотоксический Ри ф эффект ДНК по ци повреждающих агентов %от контроля M (Г различного механизма Кл ве действия на клетки А2780, ЦисплатинаµМ УФ Дж/м со В Г содержащие вектор () (рис. 20, б) или ген р73:
клоны р73.4 (o) и р73.5 ().
Эффект оценивался по клоногенной выживаемости.
MNNGµM топотекан µM По данным гибридизации c 588 генами (микроэррэй) в клонах, экспрессирующих р73 был увеличен уровень экспрессии генов MMR (Таблица 3). Известно, что эта система репарации может влиять на активность агентов, метилирующих ДНК. Действительно, чувствительность к метилирующему агенту MNNG была понижена (рис. 20 в), учитывая, что клоны имели одинаковую чувствительность к ингибитору Топоизомеразы 1 Топотекану (рис.
20 г). Таким образом, наши данные предсказывают резистентность к цисплатине в тех типах опухолей яичников, которые имеют повышенный уровень р73.
2.6. Изоформы р73 и их роль в регуляции ответа опухолевых клеток на повреждающие агенты.
Р73 экспрессируется в виде многочисленных изоформ, представляющих собой альтернативный сплайсинг С–концевых и N-концевых последовательностей. N-делетированные изоформы (DNp73, DN'p73, DExp73и DEx2/3p73) представляют собой продукты альтернативного сплайсинга в N-концевой части р73. Все они не имеют трансактивирующего домена. Интересно, что одна из этих изоформ: DNp73 образуется за счет использования альтернативного промотора, находящегося в третьем интроне.
DNр73 присутствует в достаточно большом количестве в опухолях, и вероятность того, что эта форма может играть роль в ответе клеток на ДНК-повреждающие агенты, очень велика. Кроме того, было показано, что DNp73 может ингибировать активность р73 и р53 (Stiewe et al., 2002). Мы создали тетрациклин-индуцируемую форму DNp73 в клетках НСТ116 (клетки опухоли кишечника). В работе были использованы клоны, содержащие вектор и два клона, индуцирующие DNp73 (рис. 21).
HCT116/8a HCT116/DN3 HCT116/DN УФ дж/m УФ дж/m УФ дж/m Цисплатина µм Цисплатина µм ЦисплатинаµМ % от контроля Доксорубицин µМ Доксорубицин µМ Доксорубицин µМ Рис. 21. Цитотоксический эффект ДНК-повреждающих агентов различного спектра действия на клоны НСТ116, индуцибельно экспрессирующие DNp73 (НСТ116/8а и НСТ116/DN14) и клетки, несущие пустой вектор - НСТ116DN3. Клетки высевали в 6 луночные планшеты на нормальную среду, затем индуцировали в течение ночи доксициклином (2 мкг/мл) и обрабатывали ДНК повреждающими агентами. Эффективность действия оценивалась по клоногенной выживаемости.
Для того, чтобы установить роль DNр73 в ответе на повреждение, клетки обрабатывали различными ДНК повреждающими и антипролиферативными агентами. Обработки проводили в условиях, когда экспрессировалась DNр73 изоформа.
Присутствие DNр73 не изменяет ответ клетки на повреждение. Это означает, во-первых, что экспрессия DNp73 не влияет существенно на хеморезистентность и, во-вторых, ингибирование эндогенного р53 DNр73 не вносит существенный вклад в окончательный ответ клетки на повреждение.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В нашей работе была поставлена задача выяснить, в какой мере р и члены семейства р53: р73 и изоформа р73DN могут определять ответ клеток на химиотерапию опухолей. Выбор семейства р53 произошел не случайно, поскольку к моменту начала работы казалось, что с помощью активации р53 можно решать все вопросы, связанные с ответом клетки на стресс, и в том числе опухолевой клетки на обработку химиотерапевтическими агентами.
Но, несмотря на многочисленные исследования во многих лабораториях и наши данные, представленные в автореферате, очень трудно однозначно ответить на этот вопрос. По нашим наблюдениям в целом ряде случаев присутствие функционально активного р53 может повысить резистентность клеток. Наше заключение не кажется совершенно неожиданным после открытия нового гена-мишени р53 - TIGER, который индуцируется р53 и в то же самое время снижает чувствительность многих опухолевых клеток к доксорубицину. Белок р73, экспрессирующийся на высоком уровне во многих опухолях, также может быть фактором, повышающим резистентность. Более того, появляются все новые и новые данные о противоречивой роли р73 в онкогенезе. Недавно нами было продемонстрировано, что р73 способствует росту клеток в присутствии c-jun, активируя AP-1-зависимые гены. Особенно трудно сделать заключение об увеличении чувствительности в результате экспрессии дикого типа р53 при анализе результатов, полученых на опухолях яичников. Этот тип новообразований отличается очень низким уровнем апоптоза по сравнению с другими видами новообразований. Отсутствие апоптоза и присутствие р может усилить репарационные процессы и увеличение резистентности. В целом "реставрация " апоптозного фенотипа может кардинально усилить чувствительность опухолевых клеток.
Пути реставрации апоптоза интенсивно изучаются. Опираясь на наши данные можно придти к заключению, что в некоторых случаях инактивация р53 и р73 может снизить репарацию и увеличить чувствительность.
Комбинирование классических химиотерапевтических лекарств с агентами, которые могут изменить сигнальные пути, нарушенные в клетках опухолей яичников, является очень перспективным подходом. Поиск генетических дефектов и характеристика новых генов может помочь в определении более эффективной стратегии, принимающей во внимание генетические изменения. Исследования экспрессии генов на различных стадиях развития опухолей на клиническом оперативном материале с применением техники микроэррэй и ОТ-ПЦР в реальном времени, а также выявление новых мишеней в настоящее время является одним из самых многообещающих подходов. Это позволяет выявить более широкий спектр изменений, применение статистики дает объективную оценку.
Очевидно, что определение статуса р53 и р73 в опухолях не является само по себе достаточным для прогноза и выбора лечения.
В самое последнее время стало очевидно, что семейство р содержит множество изоформ, которые проявляют антагонизм по отношению к дикому типу р53. Очевидно, требуется индивидульный подход в каждом особом случае и необходимы дальнейшие поиски специфических препаратов.
ВЫВОДЫ 1. Опухолевый супрессор р53 участвует в регуляции клеточного цикла, вызывая блоки G1 и G2 при действии ДНК-повреждающих агентов. Будучи транскрипционным фактором, р53 активирует гены, негативно регулирующие клеточный цикл, такие как p21Waf1, и репрессирует транскрипцию генов, участвующих в репарации повреждений ДНК, таких как топоизомераза 2. Установлено, что активация p21Waf1может происходить по р53-независимому механизму.
2. В определенных условиях р53 может не только сенсибилизировать клетки к повреждающим агентам, но и повышать их резистентность. Экспрессия транскрипционно активного р53 в клетках различных опухолей приводит к повышению резистентности клеток к доксорубицину - ингибитору топоизомеразы 2, таксолу - агенту, действующему на митотический аппарат и цисплатине - агенту, вызывающему повреждения ДНК.
3. Наличие полиморфизма в пролин-богатой области белка р 72P/R в сочетании с определенными «горячими» точковыми мутациями в ДНК-связывающем домене р53 может существенно менять ответ клеток на действие ДНК-повреждающих агентов.
4. Белок р73, относящийся к семейству р53 и имеющий большую степень гомологии с р53, может обладать онкогенными свойствами.
Как транскрипционный фактор, р73 способен конкурировать с р за регуляторные последовательности, находящиеся в промоторных участках р53-зависимых генов-мишеней, и снижать их транскрипцию.
5. Установлено, что р73 усиливает транскрипцию генов XPD, XPG и XPB, принимающих участие в эксцизионой репарации ДНК и, таким образом, повышает способность клеток репарировать повреждения ДНК. Это приводит к повышению резистентности к таким агентам, как цисплатина и ультрафиолетовое облучение (УФ). р73 усиливает процесс васкуляризации опухолей, повышая экспрессию VEGF и репрессируя антиваскулярный фактор TSP-I.
6. Впервые показано, что транскрипционный фактор C/EBP связывается с промотором гена р73, вызывая подавление его транскрипции. При обработке клеток доксорубицином C/EBP диссоциирует от промотора р73, что приводит к активации промоторной активности.
7. Изоформа р73 - DNp73, образующаяся при инициации транскрипции с альтернативного промотора и не имеющая транс активирующего домена, не обладает вследствие этого транскрипционной активностью. Данная изоформа обладает способностью подавлять трансактивирующий потенциал как р53, так и р73. Поскольку DNp73 экспрессируется во многих типах опухолей, предполагалось, что уровень экспрессии DNp73 может модулировать клеточный ответ на действие различных противоопухолевых препаратов. По нашим данным оказывается, что DNp73 не является существенным детерминантом резистентности.
Список цитируемой литературы:
1. Agawal M.L., Agawal A., Taylor W.R., Stark G.R. 1995.
Proc.Natl.Acad.Sci., 92:8493- 2. Bensaad K., Tsuruta A., Selak M.A., et al., 2006, Cell, 126, 107- 3. Berek J.S. 1999. Ann.Oncol.,10 (suppl.1):87- 4. Bergamaschi D., Gasco M., Hiller L et al. 2003, Cancer Cell, 3:387 5. Blagosklonny M.V., Shulte T.W., Nquyen P. et al. 1995. Cancer Research, 55:4623- 6. Bourdon JC, Fernandes K., Murray- Zmijewski F. Liu G., Xirodimas DP, Saville MK, Lane DP. 2005. Genes Dev., 19: 2122-37.
7. Bunz F., Hwang P.M., Torrance C., Waldman T. et al. 1999.
J.Clin.Invest., 104:263- 8. Cannistra S.A. 1993. Cancer of the ovary. N.Eng. J. Med, 329:1550 1559.
9. Concin N., Hoffstter G, Berger A., Gehmacher A. et al., 2005. Clinical Сancer Res., 11: 8372- 10. Dameron K.M., Volpert O.V., Tainsky M.A., Bouck N. 1994.
Science, 265:1582-1584.
11.De Feudis P., Debernardis D., Beccaglia P., et al., Br.J.Cancer, 76 :
474-479.
12. Davison T.S., Vagner C., Kaghad M. et al. 1999. J.Cell.Biol, 274:
18709-18714.
13. Ding Y., Inoue T., Kamiuma J. et al. 1999 DNA Res., 6:347- 14. el Deiry W. Tokino W.S., Velculescu V.E., Levy V.E. et al. 1993.
Cell, 75:817-825.
15. Fun S., Smith M.L., Rivet D.J. et al., 1995. Cancer Research, 55:1649-1654.
16. Hanahan D. and Folkman J. 1996. Cell, 86:353-364.
17. Harris C.C. 1996. Br.J.Cancer, 73:261-269.
18. Hermeking H., Lengauer C., Polyak K., Zhang L. et al. 1997, Mol.Cell, 1:3-11.
19. Irwin M., Marin M.C., Philips A.C. 2000. Nature, 407:645-648.
20. Kaghad M., Bonnet H., Yang A. et al., 1997. Cell, 909-819.
21. Lane D. 1992. Nature, 358:15-16.
22. Matlashewsky G.J., Tuck S., Pim D., Lamb P., Schneider J., Crawford L.V. 1987. Mol.Cel.Biol., 7:961-963.
23. Melino G., De L.,Vousden K.H. 2002. Nat.Rev.Cancer, 2:605-615.
24. Michalovitz D, Halevy O, Oren M. 1990. Cell, 62:671-680.
25. Mukhopadhyay D., Tsiokas L., Sukhatme V.P. 1995.Cancer Res., 55:6161-6165.
26. Perego P., Giarola M., Righetti S.C. et al. 1996, 56: 556-562.
27. Slomiany B.A., D'Arigo K.I., Kelly M.M., Kutz D.T. 2000.
Mol.Cell.Biol., 20:5986- 28. Stiewe T., Theseling C.C., Putzer B.M. 2002. J. Biol.Chem., 277:141777- 29. Vossio S., Palescandolo E., PediconiN. et al. 2002. Oncogene, 21:3796-3803.
30. Wahl A.F., Donaldson K.L., Fairchild C., Lee et al.1996. Nature Med., 2:72- 31. Wang Q., Zambetti G.P., Suttle D.P. 1997, Mol.Cell.Biol, 17:389 397.
Список публикаций по теме диссертации:
1. Vikhanskaya F.L. 1983. Repair of DNA and chromatin structure.
Review. Mutagenesis and repair in virus-cell system. Moskva, Nauka, 72-83.
2. Ф.Л.Виханская, Т.В.Поспелова, И.В.Волков, А.Н.Кукушкин, С.Б.Светликова, В.А.Поспелов. 1991. Продукт гена р53 вовлечен в регуляцию активности промотора протоонкогена c-fos. Доклады Академии наук СССР. 321(4): 846-849.
3. Vikhanskaya F., Erba E., D'Incalci M., Broggini M. 1994.
Introduction of wild-type p53 in a human ovarian cancer cell line not expressing endogenous p53. Nucleic Acids Res. 22: 1012-1017.
4. Vikhanskaya F., D'Incalci M., Broggini M. 1995. Decreased cytotoxic effects of doxorubicin in a human ovarian cancer-cell line expressing wild-type p53 and WAF1/CIP1 genes. Int. J. Cancer. 61:
397-401.
5. Graniela Sir E.A., Vikhanskaya F., Broggini M. 1995. Sensitivity and cellular response to different anticancer agents of a human ovarian cancer cell line expressing wild-type, mutated or no p53. Ann. Oncol. 6:
589-593.
6. Debernardis D., Graniela Sire' E.A., De Feudis P., Vikhanskaya F., Valenti M., Russo P., Parodi S., D'Incalci M., Broggini M. 1997. P status does not affect sensitivity of human ovarian cancer cell lines to paclitaxel. Cancer Res. 57: 870-874.
7. Sandri M.I., Isaacs R.J., Ongkeko W.M., Harris A.L., Hickson I.D., Broggini M., Vikhanskaya F. 1996. p53 regulates the minimal promoter of the human topoisomerase IIa gene. Nucleic Acids Res. 24: 4464-4470.
8. Vikhanskaya F., Clerico L., Valenti M., Stanzione M.S., Broggini M., Parodi S. and Russo P. 1997. Mechanism of resistance to cisplatin in a human ovarian carcinoma cell line selected for resistance to doxorubicin.
Possible role of p53. Int. J. Cancer. 72: 155-159.
9. Colella G., Vikhanskaya F., Codegoni A.M., Bonazzi C., D'Incalci M., Broggini M. 1998. hMLH1 and hMSH2 expression and bax frameshift mutations in ovarian cancer cell lines and tumors.
Carcinogenesis. 19: 691-694.
10. Vikhanskaya F., Vignati S., Beccaglia P., Ottoboni C., Russo P., D'Incalci M., Broggini M. 1998. Inactivation of p53 in a human ovarian cancer cell line increases the sensitivity to taxol by inducing G2 arrest and apoptosis. Exp. Cell Res. 241: 96-101.
11. Vikhanskaya F., Colella G., Valenti M., Parodi S., D'Incalci M., Broggini M. 1999. Co-operation between p53 and hMLH1 in a human colocarcinoma cell line in response to DNA damage. Clin. Cancer Res.
5: 937-941.
12. Vikhanskaya F., Broggini M. 2000. p53 transfectants in ovarian cancer. IN: Methods in Molecular Medicine: Ovarian Cancer. Humana Press, Totowa, NJ, USA. 187-192.
13. Vikhanskaya F, D'Incalci M, Broggini M. 2000. P73 competes with p53 and attenuates its response in a human ovarian cancer cell line Nucleic Acids Res. 28: 513-519.
14. Damia G, Filiberti L, Taya Y, Vikhanskaya F, D'Incalci M, Broggini M. 2001. Different p53 amino terminal phosphorylation induced by cisplatinum and taxol in human cancer cells. Neoplasia. 3(1): 10- 15. Vikhanskaya F, Marchini S, Marabese M, Gallieri E, Broggini M.
2001. p73alpha overexpression is associated with resistance to treatment with DNA damaging agents in a human ovarian cancer cell line Cancer Res. 61: 935-938.
16.Vikhanskaya F., M.R. Bani, P. Borsotti, C. Chilardi, R.Ceruti, G.
Ghisleni, M. Marabese, R. Giavazzi, M., Broggini and G. Taraboletti.
2001. p73 overexpression increases VEGF and reduces thrombospondin 1 production: implications for tumor angiogenesis. Oncogene.
20(50):7293-300.
17. F.Vikhanskaya and M.Broggini. 2002. Genetic alterations in Ovarian cancer Cell that might Account for Sensitivity to Chemotherapy in patients. International Review of Cytology. Vol. 219: 157-197.
18. M. Marabese, F. Vikhanskaya, C. Rainelli, T. Sakay, M. Broggini.
2003. DNA damage induces transcriptional activation of p73 by removing C/EBP Repression on E2F1. Nucleic acid Research. 31(22):
1-9.
19. F. Vikhanskaya, M.M. Siddique, M.K.Lee, M. Broggini, K.
Sabapathy. 2005. Evaluation of the combined effect of p53 codon polymorphism and hot-spot mutations in response to anticancer drugs.
Clinical Cancer Res. 11(12):4348-4356.
20. Marabese M, Marchini S, Sabatino M.A. Polato F, Vikhanskaya F, Marazzo E., Riccardi E., Scanziani E, Broggini M. 2005. Effect of inducible overexpression of DNp73alfa on cancer cell growth and response to treatment in vitro and in vivo. Cell Death Differ. 12 (7): 805 814.
21. M. Marabese, F.Vikhanskaya, M.Broggini. 2007. p73: a chiaroscuro gene in cancer. Eur J Cancer. 43(9):1361-1372.
22. Vikhanskaya F., Ming Kei Lee, M. Mazzoletti, M. Broggini, Kanaga Sabapathy. 2007. Cancer-derived p53 mutants suppress p53 target gene expression-potencial mechanism for gain of function of mutant p53. Nucleic Acid Res. 35(6): 2093-104.
23. K. Hettinger, F. Vikhanckaya, M.K. Poh, I. de Belle, J-T. Zhang, Sag Raddy and K. Sabapathy. 2007. c-Jun promotes cellular survival by suppression of PTEN. Cell Death Differentiation. 14, 218-229.
24. Vikhanskaya F., Toh Wen Hong, Iqbal Dullo, Wu Qiang, L.Boominathan, Ng Huck Hui, Karen Vousden, Giannino Del Sal and Kanaga Sabapathy. 2007. A novel role for p73 in supporting cellular growth through c-Jun-dependent AP-1 transactivation. Nature Cell Biol.
9(6):698-706.