Алексей петрович исследование механизмов митохондриальной деполяризации и кальциевой дизрегуляции, индуцируемой возбуждающим медиатором глутаматом в нейронах мозга

На правах рукописи

УДК 577.3 Большаков Алексей Петрович Исследование механизмов митохондриальной деполяризации и кальциевой дизрегуляции, индуцируемой возбуждающим медиатором глутаматом в нейронах мозга 03.00.02 – Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва – 2007

Работа выполнена на кафедре физики живых систем Московского Физико-Технического Института и в Научно-исследовательском институте патологии и патофизиологии РАМН

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Борис Израилевич Ходоров

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук Гурия Георгий Теодорович доктор биологических наук Хаспеков Леонид Георгиевич

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. Ломоносова

Защита диссертации состоится «22» марта 2007 г. в _10 часов на заседании диссертационного совета при Московском физико-техническом институте по адресу:

141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., д. 9, МФТИ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан «_» 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета К 212.156. кандидат физико-математических наук Брагин В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Одной из ключевых стадий повреждения нейронов при ряде патологий центральной нервной системы является токсическое действие нейромедиатора глутамата, избыточно выделяющегося и накапливающегося в межклеточном пространстве (Duchen, 2004;

Nicholls, 2004). Исследования причин глутаматной нейротоксичности показали, что вход Са2+ через NMDA подтип глутаматных каналов и последующее накопление Са2+ в митохондриях являются основными факторами, приводящими к клеточной гибели (обзоры (Khodorov, 2004;

Nicholls and Budd, 2000)).

В исследованиях, проведенных на первичных культурах нейронов, было обнаружено, что гибель нейронов после глутаматного шока тесно связана с развитием вторичного подъема внутриклеточной концентрации Са2+ ([Ca2+]i). Это вторичное увеличение [Ca2+]i получило название отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД) (Tymianski et al., 1993). В последующих исследованиях было продемонстрировано, что ОКД сопровождается синхронной митохондриальной деполяризацией (МД) (Vergun et al., 1999). Было также показано, что МД играет решающую роль в механизме глутамат-индуцированного нарушения Са2+ гомеостаза (Khodorov et al., 1996;

Ходоров и др., 2001) и что циклоспорин А (ЦсА) и некоторые его производные замедляют или предотвращают развитие сильной МД и вторичного повышения [Ca2+]i в культивируемых нейронах центральной нервной системы (Vergun et al., 1999;

Alano et al., 2002). Принимая во внимание способность этих веществ противодействовать формированию митохондриальной поры (МП) в изолированных митохондриях, было сделано заключение о том, что открывание МП приводит к коллапсу митохондриального потенциала (м) во время глутаматного воздействия. Однако этот вывод в настоящее время поставлен под сомнение рядом других исследований, в которых не удалось воспроизвести защитный эффект ЦсА (Isaev et al., 1996;

Castilho et al., 1998;

Chinopoulos et al., 2004;

Pivovarova et al., 2004). Эти противоречия и некоторые ограничения, связанные с применением ЦсА даже на изолированных митохондриях (Brustovetsky and Dubinsky, 2000) побудили нас использовать для изучения этой проблемы новый экспериментальный подход, основанный на сравнительном анализе изменений митохондриального и цитозольного рН (рНм и рНц, соответственно). Хорошо известно, что глутамат вызывает закисление цитозоля (Пинелис и др., 1992;

Hartley and Dubinsky, 1993).

Однако влияние глутаматного воздействия на динамику нейронального рНм in situ до сих пор не изучалось. Между тем, заманчиво было предположить, что открывание митохондриальной поры вызовет снижение рНм (поскольку рНц меньше рНм), в то время как блокада открывания МП предотвратит развитие этого митохондриального подкисления.

Чтобы проверить это предположение мы исследовали изменения рНц и рНм во время длительного глутаматного воздействия, используя рН-чувствительные флуоресцентные белки, селективно экспрессированные в цитозоле и митохондриях (cytYFP, mtYFP, и экспрессируемый в митохондриях перикам 2mtRP (Porcelli et al., 2005;

Nagai et al., 2001). Эти измерения мы проводили в сочетании с одновременным мониторингом изменений [Ca2+]i. В параллельных экспериментах мы регистрировали изменения [Ca2+]i и м. Измерения проводились как в контрольных условиях, так и после воздействий, которые препятствуют открыванию МП в изолированных митохондриях. К числу таких воздействий, как известно, относятся замена внеклеточного Са2+ на Sr2+ замена или применение ЦсА (Bernardi et al., 1992).

В результате всех проведенных исследований мы пришли к заключению о существовании двух альтернативных механизмов глутамат-индуцированной отсроченной МД: открывание поры и беспоровый механизм, при котором происходит подщелачивание митохондриального матрикса.

Цель работы Изучить механизмы митохондриальной деполяризации и кальциевой дизрегуляции, вызываемой медиатором глутаматом в культивируемых нейронах.

Задачи исследования В опытах на культивируемых нейронах исследовать:

1) динамику изменений [Ca2+]i и м во время и после глутаматного воздействия;

2) роль Na+/Са2+-обменника плазматической мембраны и Са2+/Н+-АТФазы в восстановлении [Ca2+]i после глутаматного воздействия;

3) влияние ингибитора митохондриальной поры циклоспорина А (ЦсА) на динамику 2+ [Ca ]i и м во время глутаматного воздействия;

4) влияние замены ионов Са2+ на ионы Sr2+ на динамику сигналов fura-2FF и родамина-123;

5) динамику изменений [Ca2+]i, рНм и рНц во время глутаматного воздействия в присутствии и отсутствии антагонистов митохондриальной поры (ЦсА или ионы Sr2+);

6) изменения митохондриальной морфологии в нейронах in situ в Са2+- и Sr2+ содержащих средах;

7) влияние блокады I и IV комплексов дыхательной цепи митохондрий на динамику изменений [Ca2+]i и м во время глутаматного воздействия;

8) вклад различных ионов и транспортных систем в развитие митохондриальной деполяризации, индуцированной глутаматным воздействием в присутствии цианида;

9) роль снижения цитоплазматического уровня АТФ в развитии глутамат индуцированной митохондриальной деполяризации в присутствии цианида.

Научная новизна В нашей работе впервые использован новый прием для изучения роли митохондриальной поры в механизмах дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов при длительном действии глутамата - измерения рН митохондриального матрикса (рНм).

Измерения рНм in situ в сочетании с другими подходами были использованы для демонстрации роли митохондриальной поры в развитии МД.

Нами впервые проведено сопоставление динамики [Ca2+]i и рН в цитозоле (рНц) и митохондриях при длительном глутаматном воздействии. Впервые показано, что снижение рНм во время глутаматного воздействия имеет двухфазный характер, причем вторая фаза падения рНм возникает с некоторой задержкой после начала ОКД. Мы также впервые обнаружили, что антагонисты митохондриальной поры (циклоспорин А и ионы Sr2+) не предотвращают развитие ОКД и сильной МД, но существенно изменяют динамику рНм во время развития ОКД. Результаты этих экспериментов свидетельствуют в пользу того, что митохондриальная пора участвует в развитии ОКД и МД при глутаматном воздействии.

Впервые проведено сопоставление изменений морфологии митохондрий и динамики [Ca2+]i и рНм во время глутаматного воздействия. Мы показали, что начало вторичного митохондриального подкисления сопровождается изменениями митохондриальной формы, которые, согласно имеющейся литературе, можно рассматривать как митохондриальное набухание. Впервые показано, что в Sr2+-содержащей среде глутаматное воздействие не вызывает никаких изменений митохондриальной морфологии. На основании того, что митохондриальное набухание является характерной чертой формирования митохондриальной поры и того, что во время глутаматного воздействия оно возникает лишь в Са2+-содержащей среде было сделано заключение о том, что вторичное митохондриальное подкисление и сопровождающее его митохондриальное набухание являются следствием открывания митохондриальной поры.

Впервые показано, что сильная МД, развивающаяся во время глутаматного воздействия в присутствии цианида, обусловлена снижением активности митохондриальной АТФ-синтазы вследствие глутамат-индуцированного уменьшения внутриклеточного уровня АТФ.

Научно-практическая значимость Полученные данные вносят существенный вклад в понимание механизмов митохондриальной деполяризации и дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов во время токсического воздействия медиатора глутамата. Показано, что одним из ключевых моментов в возникновении сильной митохондриальной деполяризации при токсическом действии глутамата является открывание митохондриальной поры. Этот факт необходимо учитывать при разработке препаратов, уменьшающих гибель нейронов мозга после ишемического инсульта.

В работе показано, что перикам (ratio-metric pericam) - один из широко-используемых сенсоров для измерения концентрации Са2+ в митохондриальном матриксе - обладает высокой чувствительностью к изменениям рН, что на фоне сильных сдвигов митохондриального рН, наблюдающихся во время глутаматного воздействия, не позволяет получать достоверные данные об изменениях митохондриального Са2+ во время глутаматного воздействия. Обнаружено также, что повышение митохондриальной концентрации Са2+ при глутаматном воздействии намного превышает чувствительность этого зонда к изменениям Са2+. Эти результаты необходимо учитывать при разработке и использовании сенсоров, предназначенных для измерения Са2+ в митохондриях нейронов.

Обнаружено, что слабая митохондриальная деполяризация, вызываемая малыми концентрациями протонофора, значительно усиливается при частичной блокаде дыхательной цепи. Этот факт можно использовать для оценки состояния дыхательной цепи митохондрий в интактных клетках.

Апробация работы Результаты работы были представлены на следующих конференциях: Съезд физиологического общества Великобритании (Лондон, 2002), III Съезд Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002), III Российский Конгресс по Патофизиологии, 48-ой Съезд Биофизического Общества (Балтимор, США, 2004), 34-ый Съезд Общества Нейронаук (Сан-Диего, США, 2004), конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005), 36-ой Съезд Общества Нейронаук (Атланта, США, 2006).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 9 тезисов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводились на культивируемых кортикальных, гиппокампальных и зернистых нейронах мозжечка (7-11 дней в культуре).

Для измерений рНм и рНц, а также исследований митохондриальной морфологии кортикальные и гиппокампальные нейроны трансфецировали с помощью реагента Lipofectamine 2000 плазмидами, кодирующими изоформы желтого флуоресцентного белка (YFP), селективно экспрессирующегося в митохондриях (mtYFP) и цитозоле (cytYFP), а также митохондриальный перикам (mitochondrially targeted ratio-metric pericam, 2mtRP).

Чувствительность mtYFP и 2mtRP к изменениям рН показаны на рис. 1. Мы приводим все данные, полученные с помощью YFP-конструкций и 2mtRP, как относительные изменения флуоресценции, поскольку хорошо известно, что митохондриальный ответ, индуцированный глутаматом внутри единичных клеток, является гетерогенным (см. например, Pivovarova et al., 2004).

Для измерения [Ca2+]i нейроны нагружались Са2+-чуствительными зондами fura 2(AM), fura-2FF(АМ) или MagFura-2(AM). Для измерения м нейроны нагружались потенциал-чувствительным зондом родамин-123 (3.5 мкг/мл, 15 мин, Rh123).

Измерения [Ca2+]i, [Ca2+]м, м, рНм, и рНц, а также исследования митохондриальной морфологии проводились на инвертированном флуоресцентном микроскопе Axiovert- (“Zeiss”, Германия), оборудованном CCD камерой CoolSnap-fx (“Roper Scientific”, США).

Флуоресценция зондов возбуждалась светом от ксеноновой лампы, пропускаемым последовательно через светофильтры: 340 и 380 нм для fura-2 (fura-2FF, Magfura-2) и 490 нм для Rh123 (mtYFP, cytYFP, 2mtRP). В некоторых экспериментах флуоресценция 2mtRP возбуждалась светом с длиной волны 470 нм.

Данные, полученные с помощью Са2+-чувствительных зондов представлены как отношение флуоресценции, возбуждаемой на 340 и 380 нм (F340/F380). Сигналы Rh нормировались на базальный уровень.

Плазмиды всех флуоресцентных белков любезно предоставлены проф. Р. Рицутто (R.

Rizutto, Университет Феррары, Италия).

В экспериментах со Sr2+, Са2+ полностью заменялся на Sr2+ во внеклеточной среде. В экспериментах с циклоспорином А (ЦсА), нейроны инкубировали с указанной А Б 8. 8.0 8. 1. 7. 7. 7.0 1. 2. 7. pHм, mtYFP, F/F 6.5 1. 0. 2m tR P 490, F/F 2 m tR P 470, F/F 6.0 6.5 1. 1. 0. 6. 1. 1. 0. 0. 0. 0. 0.3 0. 0. 0. 0. 0 5 10 15 20 25 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время, мин Время, мин Рис. 1. Чувствительность mtYFP (А) и 2mtRP (Б) к изменениям рН. Панель (Б) иллюстрирует чувствительность флуоресценции 2mtRP, возбуждаемой на 490 нм (2mtRP490) и 470 нм (2mtRP470). 2mtRP470 является Са2+-нечувствительной изобестической точкой перикама.

концентрацией ЦсА в течение 40-60 мин перед экспериментом. В конце экспериментов добавляли протонофор FCCP (1мкМ) в бескальциевой среде, содержащей 100 мкМ EGTA, чтобы индуцировать полную митохондриальную деполяризацию.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Отсроченная кальциевая дизрегуляция и митохондриальная деполяризация во время глутаматного воздействия в культивируемых нейронах.

1.1. Соотношение между [Ca2+]i и м во время и после глутаматного воздействия В культивируемых нейронах длительное (15-20 мин) воздействие глутамата (100 мкМ + 10 мкМ глицина) вызывает изменения [Ca2+]i и м, которые можно условно подразделить на две фазы (рис. 2). Первая фаза охватывает период от начала глутаматного воздействия до начала вторичного подъема [Ca2+]i и включает в себя начальный пик [Ca2+]i и латентный период, предшествующий сильному вторичному подъему [Ca2+]i. В наших опытах длительность латентного периода варьировала между клетками в пределах от секунд до минут. В эту фазу [Ca2+]i ответа митохондрии обычно претерпевали лишь сравнительно слабую деполяризацию.

Вторая фаза [Ca2+]i ответа, так называемая отсроченная кальциевая дизрегуляция (ОКД), включает в себя быстрый подъем [Ca2+]i до высокого уровня квази-плато. Эти изменения [Ca2+]i сопровождаются сильной практически синхронной митохондриальной деполяризацией (МД, рис. 2 В, Г).

Примерно в 50% (n=131) исследованных нами нейронов высокое [Ca2+]i плато в постглутаматный период было устойчиво к удалению внешнего Са2+ (рис. 2), что говорит о нарушении работы механизмов плазматической мембраны, ответственных за выведение Са2+ из нейронов (Khodorov et al., 1993;

Bano et al., 2005).

В остальных нейронах восстановление [Ca2+]i в первые минуты постглутаматного периода все же наблюдалось. Процесс восстановления [Ca2+]i практически во всех клетках начинался раньше восстановления м. Синхронное восстановление [Ca2+]i и м наблюдалось только в некоторых нейронах, где ОКД начиналась за несколько минут до окончания глутаматного воздействия.

1.2. Соотношение между [Ca2+]i и внутриклеточным рН Известно, что в изолированных митохондриях сильная деполяризация при Са2+ перегрузке матрикса может возникать либо в результате открывания митохондриальной поры (МП) либо вследствие повышения протонного градиента на внутренней митохондриальной мембране (Nicholls and Budd, 2000;

Nicholls and Fergusson, 2002). Для выяснения спорного вопроса о том, какой из этих механизмов лежит в основе глутамат индуцированной МД мы исследовали динамику изменений митохондриального рН (рНм) в нейронах во время длительного действия глутамата. При постановке этих опытов мы исходили из гипотезы, что открывание МП должно сопровождаться подкислением митохондриального матрикса (поскольку рНц ниже рНм), а повышение протонного градиента - проявляться в увеличении митохондриального рН (рНм).

Эти опыты проводились на кортикальных нейронах, экспрессирующих в митохондриях или цитозоле рН-чувствительные желтые флуоресцентные белки. Для одновременного прослеживания динамики [Ca2+]i и рН клетки нагружали красителем fura- или fura-2FF. Однако, одновременные измерения рНм и м было невозможно выполнить вследствие перекрытия спектров возбуждения и эмиссии YFP и Rh123. Однако большое сходство изменений [Ca2+]i и м во время глутаматного воздействия можно использовать для того, чтобы рассматривать изменения [Ca2+]i как очень близкий аналог изменений м.

Поэтому о взаимоотношениях м-рНм мы судили по взаимосвязи [Ca2+]i-рНм.

Прежде всего, мы исследовали взаимосвязь [Ca2+]i и цитозольного рН (рНц). Ранее при помощи обычных флуоресцентных зондов (BCECF, SNARF) было установлено, что глутаматное воздействие приводит к сильному снижению рНц (см. обзор Khodorov, 2004).

Наши эксперименты с использованием cytYFP подтвердили и дополнили результаты этих исследований. Первая фаза кальциевого ответа, вызванного глутаматом, сопровождалась в Б А глутамат глутамат 0 Ca2++EGTA 2+ 0 Ca +EGTA 5. [Ca2+ ]i, Fura-2FF, F340/F 2. 4. м, Rh123, F/F 2. 4. 1.8 3. 3. 1. 2. 1. 2. 0.6 1. FCCP FCCP 1. 0. 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 Время, мин Время, мин В Г глутамат [Ca 2+ ]i, Fura-2FF, F340/F 2. [Ca 2+ ] i, Fura-2FF, F 340 /F 4. [Ca2+]i 0. 3. 2.0 4. м, Rh123, F/F м, Rh123, F/F 1.8 3.3 0.30 3. 1.6 2. м 3. 1.4 0. 2. 1.2 2. FCCP 2.1 0. 1. FCCP 2. 1. 0. 0.15 1. 0.6 1. 2+ 0 Ca +EGTA 1. глутамат 0.4 0. 0. 0. 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 Время, мин Время, мин 2+ Рис. 2. Динамика [Ca ]i и м во время и после глутаматного воздействия в кортикальных (А-В) и гиппокампальных (Г) нейронах.

А Б глутамат глутамат [Ca2+]i, Fura-2FF, F340/F380 1. [Ca2+]i, Fura-2FF, F340/F 2.8 1. 1.0 Tц 1. pHц, cytYFP, F/F 2. pHц, cytYFP,F/F 0. 0.9 2. 1.2 0. 1. FCCP 0. 1. 1.0 0. pHц 0.7 1. 0. 0.8 1. 0.6 0. 0. 0. 2+ 0. 0 Ca +EGTA 0.5 0. 0 1 2 3 4 5 6 0. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Время, мин Время, мин Рис. 3. Динамика цитозольного рН (рНц) и [Ca2+]i во время и после глутаматного воздействия. Глутамат приводит к повышению [Ca2+]i и снижению рНц. Развитие ОКД сопровождается ослаблением цитозольного ацидоза (А), начало которого помечено пунктирной стрелкой. Отмывание глутамата не оказывала никакого влияния на [Ca2+]i и рНц в (А). Панель (Б) показывает как производились измерения времени задержки Tц.

кортикальных нейронах развитием сильного цитозольного ацидоза (рис. 7), который был обратим при отмывке глутамата. Вторичному же подъему [Ca2+]i сопутствовало ослабление этого ацидоза, причем ослабление ацидоза возникало примерно через 105 ± 20 сек (n = 8) после начала ОКД. Удаление глутамата в большинстве экспериментов не приводило к восстановлению ни [Ca2+]i ни рНц.

1.2.1. Динамика рНм во время и после глутаматного воздействия Изменения митохондриального рН (рНм) во время глутаматного воздействия также имели двухфазный характер. В первую фазу развивалось медленное умеренное подкисление митохондриального матрикса, которому предшествовало слабое кратковременное повышение рНм (рис. 4). Учитывая сильную зависимость рНм от цитозольного рН (Addanki et al., 1968;

Kristian et al., 2001), мы предположили, что первичное закисление митохондрий является следствием глутамат-индуцированного снижения рНц, тогда как предшествующее короткое первичное подщелачивание обусловлено усиленным выведением протонов в ответ на вход Са2+ в митохондрии. Повышение рНм при входе Са2+ в митохондрии было описано во множестве работ, проведенных на изолированных митохондриях (см. (Nicholls and Budd, 2000) и ссылки там).

Во вторую фазу глутамат-индуцированного повышения [Ca2+]i примерно в 70% (n=23) нейронов происходило значительное ускорение и усиление падения рНм (вторичное закисление) (рис. 4А, В)). В остальных нейронах вторичному закислению в начале развития ОКД предшествовало транзиторное подщелачивание митохондриального матрикса (рис. 4Б).

Анализ этих данных привел нас к предположению, что оба типа изменений рНм во время ОКД являются результатом кальциевой перегрузки матрикса митохондрий. Однако, вторичное снижение рНм происходит только в том случае, когда кальциевая перегрузка ведет к открыванию поры. В тех же случаях, когда открывание поры почему-либо затруднено или невозможно происходит лишь повышение протонного градиента на митохондриальной мембране.

Для проверки предположения о роли поры в механизмах вторичного подкисления были проведены опыты, в которых Ca2+ заменялся на Sr2+.

1.3. Влияние замены ионов Са2+ ионами Sr2+ на динамику м во время и после глутаматного воздействия.

Хорошо известно, что все клеточные системы, способные транспортировать Са2+, такие как Na+/Са2+ обменники, Са2+ насосы, митохондриальный унипортер, и различные ионные каналы также могут транспортировать Sr2+ (Xu-Friedman and Regehr, 1999;

Gunter et al., 2000;

Hille, 2001). Однако, в отличие от Са2+, ионы Sr2+ не вызывают открывания МП и A Б глутамат глутамат FCCP1. [Ca2+]i, Fura-2FF, F340/F380 1.0 0 Ca+EGTA 1. 0. [Ca2+ ]i, Fura-2FF, F340/F 2+ 0 Ca +EGTA 1. 0.9 1.0 0. pHм, mtYFP, F/F pH м, mtYFP, F/F 0. 0.8 0. 0.6 0. 0.7 0.8 0. 0. 0.6 0. 0. 0.5 0.4 0. pHм 0. 0. 0.4 0. 0. FCCP 0. 0. 0.4 0.2 0. 0 10 20 30 40 50 0 5 10 15 20 25 Время, мин Время, мин В Г глутамат глутамат 1. FCCP 0. [Ca 2+ ]i, Fura-2FF, F 340 /F [Ca2+]i, Fura-2, F340/F tк 6 1. 1. pHм, mtYFP, F/F pH м, mtYFP, F/F 0. 0. 0. 0. tОКД 0. 0. 0. 0. 0.7 0. 2 0. 0.6 0. 0 Ca2++EGTA 1 0. 0.5 0. 0 5 10 15 20 0 100 200 300 400 500 600 700 Время, мин Время, сек Д r 2 = 0.9 5 8 tк, сек 0 250 500 750 1000 1250 tО КД, с е к Рис. 4. Динамика [Ca2+]i и рНм во время и после глутаматного воздействия в кортикальных нейронах. ОКД, возникающая во время глутаматного воздействия, сопровождается подкислением митохондриального матрикса (А-Д), которому в ряде нейронов предшествовало кратковременное повышение рНм (Б, В). Панель (Г) показывает, что удаление глутамата вскоре после возникновения ОКД приводит к быстрому восстановлению [Ca2+]i и рНм. Панель (Д) показывает, как производились измерения длительности задержек. Корреляционной диаграмме (Е) подтверждает наличие корреляции между временами начала ОКД и начала вторичного снижения рНм препятствуют открыванию МП, вызванному Са2+, вследствие вытеснения ионов Са2+ из общего центра связывания (Bernardi et al., 1992).

Прежде всего, мы исследовали как влияет замена Са2+ на Sr2+ на динамику [Ca2+]i и м. На рис. 5 показано, что Sr2+-содержащем растворе глутамат вызывает такую же сильную двухфазную МД, как и в Са2+-содержащей среде. На основании этих данных мы сделали вывод, что открывание классической ЦсA-чувствительной митохондриальной поры не является строго обязательным для развития сильной МД во время глутаматного воздействия. Эти результаты, однако, не исключают возможности того, что глутамат А Б глутамат глутамат 1. [Sr2+]i, Fura-2FF,F340/F м, Rh123, F/F 1.3 1. 0. 0. FCCP 2+ 0 Sr2++EGTA FCCP 0 Ca 2++Sr2+ 0 Sr +EGTA 2+ 2+ 0. 0 Ca +Sr 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 35 Время, мин Время, мин В Г глутамат 1.7 3. глутамат [Ca 2+ ] i,Fura-2FF, F 340 /F 5. [Sr 2+ ] i, Fura-2FF, F 340 /F 1.2 1. 4. м, Rh123, F/F м, Rh123, F/F 1.1 2. 1. 4. 1.0 3.5 1. 0.9 2. 3.0 1. FCCP 2. 0. FCCP 1. 0.7 1. 2.0 1. 0.6 2+ 1. 0 Sr +EGTA 1. 0 Ca2++Sr2+ 0.5 2+ 2+ 0 Ca +Sr 1. 1. 0. 0.4 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 25 30 Время, мин Время, мин Рис. 5. Динамика сигналов fura-2FF и rh123 в кортикальных (А-В) и гиппокампальных нейронах (Г) во время глутаматного воздействия в Sr2+ содержащей среде.

индуцированная МД в Sr2+-содержащей среде была обусловлена неспецифическим повышением протонной проводимости мембраны (Холмухамедов и др. 1991;

Ichas and Mazat, 1998) или открыванием ЦсА–нечувствительной поры в митохондриальной мембране в результате взаимодействия Sr2+ с липидами этой мембраны (Sultan and Sokolove, 2001a, б).

Для выяснения механизма МД, индуцированной глутаматом в Sr2+-содержащей среде, мы исследовали происходящие в этих условиях изменения рНц и рНм.

Изменения [Sr2+]i и рНц оказались качественно сходными с теми изменениями, которые [Ca2+]i и рНц претерпевают в присутствии Са2+ (рис. 6). Однако, ослабление ацидоза возникало со значительно большей задержкой по сравнению с Са2+-содержащей средой ( ± 39 сек по сравнению с 105 ± 20 сек, р 0.05, t тест).

В отличие от этого, динамика изменений рНм после Са2+/Sr2+ замены претерпевала значительные изменения: вслед за первичным закислением вместо его вторичного усиления возникало четко выраженное транзиторное митохондриальное защелачивание (рис. 7). Этот результат мы расценили как свидетельство в пользу высказанного нами предположения о том, что вторичное закисление матрикса, возникающее в большинстве нейронов в Са2+ содержащей среде, является результатом открывания митохондриальной поры. После замены Са2+ на Sr2+ его накопление в митохондриальном матриксе не открывало поры вследствие чего вместо снижения рНм произошло его сильное транзиторное увеличение. Как уже указывалось, в Са2+-содержащем растворе сходное по динамике, но менее выраженное по амплитуде митохондриальное защелачивание, наблюдалось только в 30% нейронов.

Рис. 6. Динамика [Sr2+]i и FCCP глутамат 0. [Sr2+]i, Fura2-FF, F340/F380 1.0 рНц во время глутаматного 0. pHc, cytYFP, F/F воздействия.

0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0 Sr2++EGTA 0 Ca2++Sr2+ 0. 0. 0 5 10 15 20 25 30 Время, мин Возникновение вторичного защелачивания в самом начале ОКД также говорит о том, что сильная МД в Sr2+-содержащей среде не была обусловлена открыванием поры.

Заключение о том, что МД в стронций-содержащей среде при действии глутамата не является следствием открывания митохондриальной поры получило подтверждение при исследовании влияния Са2+/Sr2+ замены на глутамат-индуцированные изменения морфологии митохондрий.

Известно, что в открывание митохондриальной поры сопровождается набуханием митохондрий в суспензии и захват Sr2+ митохондриями не вызывает их набухания (Bernardi, 1999).

В покое нейрональные митохондрии имели палочкообразную форму, и первая фаза 2+ [Ca ]i и рНм ответа на глутаматное воздействие сопровождалась малозаметными изменениями митохондриальной морфологии. Во время развития ОКД также не наблюдалось изменений формы митохондрий до тех пор, пока не начиналось вторичное подкисление митохондриального матрикса. Во вторую фазу снижения рНм форма митохондрий существенно менялась: из палочкообразных митохондрии превращались в шарообразные (n=5 экспериментов). Подобные изменения морфологии митохондрий классифицировались ранее как их набухание (Dubinsky and Levi, 1998;

Pivovarova et al., 2004).

Митохондриальное набухание, вызываемое длительным глутаматным воздействием, является обратимым. Известно, что прекращение глутаматного воздействия в самом начале развития ОКД приводит к достаточно быстрому восстановлению [Ca2+]i и м (Khodorov, 2004). Мы обнаружили, что такое восстановление [Ca2+]i сопровождается не только восстановлением рНм (рис. 4В), но и восстановлением палочкообразной формы митохондрий.

Необходимо подчеркнуть, что глутамат-индуцированное набухание митохондрий является Са2+-зависимым: после замены Са2+ на Sr2+ глутаматное воздействие не вызывает заметных изменений формы митохондрий, а значит митохондриальное набухание являлось следствием открывания МП.

1.4. Влияние циклоспорина А на динамику [Ca2+]i, м, рНц и рНм во время глутаматного воздействия Наряду со стронцием, мы использовали другой антагонист МП - циклоспорин А (ЦсА), который не предотвращает открывание МП, но существенно повышает пороговую концентрацию Са2+ необходимую для открывания МП (Bernardi, 1999;

Chalmers and Nicholls, 2003).

Мы обнаружили, что прединкубация нейрональных культур с циклоспорином А (ЦсА, гиппокампальные - 0.5 мкМ, кортикальные - 0.5, 1, 3, и 5 мкМ) не повлияла заметным образом на развитие ОКД и МД (n = 71 кортикальные (рис. 8А, Б), n = 325 гиппокампальные (рис. 8В, Г).

На первый взгляд, присутствие ЦсА (0.5 мкМ) не повлияло на динамику рНц во время глутаматного воздействия: так же как и в контроле первичный подъем [Ca2+]i сопровождался цитозольным подкислением, а вслед за ОКД возникало повышение рНц (рис. 9). Однако, оказалось, что ЦсА, так же как и Sr2+, достоверно отсрочил повышение рНц: 188 ± 24 сек по отношению к 105 ± 20 сек в контроле (p 0.05).

Присутствие ЦсА (0.5 мкМ) также существенно повлияло на динамику рНм во время глутаматного воздействия в кортикальных нейронах. Неожиданно оказалось, что нейрональные ответы в присутствии ЦсА подразделяются на 3 подтипа. К нейронам первого типа можно отнести клетки, в которых ЦсА не оказал видимого эффекта, т.е. в этих клетках (11 из 29 нейронов) ОКД сопровождалось вторичным снижением рНм. Ко второй группе клеток можно отнести нейроны (n = 8), в которых ОКД в присутствии ЦсА сопровождалось значительным повышением рН митохондриального матрикса (рис. 10 А). Последнее было очень схоже с кратковременным повышением рНм, вызываемым глутаматом в Sr2+ содержащей среде (см. рис. 7). По нашим представлениям, в этих нейронах ЦсА A Б глутамат глутамат 1. [Sr2+ ]i, Fura-2FF, F340 /F tщ [Sr 2+ ] i, Fura-2FF, F 340 /F 1. 1.0 0. pH м, mtYFP, F/F pH м, m tYFP, F/F FCCP 1. 0.9 0. 2+ 0 Sr +EGTA 1. 0. 0.8 0. tОКД 0. 0.6 0.7 0. 0 Ca2+ + Sr2+ 0 Ca2++Sr2+ 0.4 0.6 0.3 0. 0 1 2 3 4567 8 9 10 0 100 200 300 400 Время, сек Время, мин В r 2=0. tщ, сек 0 100 200 300 400 500 600 700 t О КД, сек Рис. 7. Соотношение между [Sr2+]i и рНм в кортикальных нейронах во время глутаматного воздействия. (А) и (Б) показывают типичные соотношения между [Sr2+]i и рНм в нейронах во время глутаматного воздействия. Панель (Б) показывает, как производились измерения времен. (В) показывает наличие корреляции между временем начала митохондриального подщелачивания и временем начала вторичного подъема [Sr2+]i.

А Б глутамат [Ca2+]i, Fura-2FF, F340/F 2.1 4. глутамат FCCP 1. 4. м, Rh123, F/F 1. 3. 1. 1.3 3. 1. 2. 0. 2. 0. FCCP 0.5 1. 0 Ca 2+ +EGTA ЦсА 2+ ЦсА 0.3 0 Ca +EGTA 1. 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 Время, мин Время, мин В Г [Ca2+]i, Fura-2FF, F340/F 0. глутамат глутамат 0. м, Rh123, F/F 0. 0. 0. 0.4 0. 0.2 FCCP FCCP ЦсА (1 M) 0. ЦсА (1 M) 0. 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 0 3 6 9 12 15 18 21 24 Время, мин Время, мин Рис. 8. Динамика [Ca2+]i и м в кортикальных (А, Б) и гиппокампальных (В, Г) нейронах во время глутаматного воздействия в присутствии ЦсА (0.5 мкМ).

предотвратил открывание МП и, следовательно, МД, вызванная глутаматом развивалась по «беспоровому» механизму. В третьей группе кортикальных нейронов (n = 10) вторичное митохондриальное подщелачивание возникало после развития ОКД (рис. 10 Б). Необходимо отметить, что в таких клетках начало ОКД сопровождалось вторичным митохондриальным подкислением.

Таким образом, развитие ОКД и синхронной с ней МД сопровождается в большинстве нейронов отсроченным подкислением и набуханием митохондрий. Это снижение рНм и изменение формы митохондрий обусловлены открыванием митохондриальной поры. Формирование МП подтверждается тем, что митохондриальное набухание является Са2+-зависимым и не наблюдается в Sr2+-содержащей среде. В пользу того, что вторичное подкисление является следствием открывания митохондриальной поры, говорит то, что антагонисты поры (ЦсА и Sr2+) существенно изменяют динамику рНм: в их присутствии вместо вторичного митохондриального подкисления наблюдается выраженное митохондриальное подщелачивание.

Анализ взаимоотношений между изменениями рНм, [Ca2+]i и м помогли сделать заключение о механизме сильной МД во время глутаматного воздействия. По нашим представлениям, в нейронах, где вторичное подкисление развивалось практически синхронно с ОКД, эта МД индуцировалась открыванием МП. В клетках же, где открывание МП (вторичное снижение рНм) было отсрочено по сравнению с началом ОКД и сопровождалось подъемом рНм, развитие МД происходило по беспоровому механизму.

Наиболее вероятно, что сильная МД и повышение рНм во время глутаматного воздействия вызывались входом Са2+ (или Sr2+) в митохондрии на фоне ослабления транспорта фосфата в митохондрии. Этот механизм развития МД более типичен для нейронов, подвергнутых Рис. 9. Динамика [Ca2+]i и рНц во глутамат FCCP [Ca 2+ ]i, Fura-2FF, F 340 /F 1. время глутаматного воздействия 1. 1. pH ц, cytYFP, F/F в присутствии ЦсА в 0.9 0. 0.8 кортикальном нейроне.

0. 0 Ca2++EGTA 0. 0. 0. 0. 0. 0. ЦсА 0. 0. 0 5 10 15 20 Время, мин Б A глутамат глутамат FCCP [Ca2+]i, Fura-2FF, F340/F 0.9 1. 1.2 1.1 [Ca2+]i, Fura-2FF, F340/F 1.1 1.0 0. pHм, mtYFP, F/F pHм,mtYFP, F/F 1. 1.0 0.9 0. FCCP 0. 0.8 0. 0. 0.8 2+ 0.7 2+ 0 Ca +EGTA 0 Ca +EGTA 0. 0.7 0. 0. 0.6 0. рНм 0. 0.5 0. 0. 0.4 ЦсА 0. ЦсА 0. 0. 0.3 0. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 5 10 15 Время, мин Время, мин В r 2 = 0.6 4 5 tщ, сек 0 200 400 600 800 1000 1200 tО КД, с е к Рис. 10. Влияние ЦсА на динамику рНм в кортикальных нейронах. Панель (А) демонстрирует пример нейрона, в котором ОКД сопровождалось подщелачиванием митохондриального матрикса. В нейроне, показанном на (Б), подъем рНм начинался только после развития ОКД и вторичного снижения рНм. Панель (В) показывает корреляцию между временем начала ОКД и моментом начала вторичного митохондриального подщелачивания. Времена измерялись как показано на рис. 7Б.

глутаматному воздействию в присутствии антагонистов МП. В отсутствии же этих антагонистов такой механизм МД наблюдался лишь в 30% нейронов.

2. Механизмы митохондриальной деполяризации, вызываемой глутаматным воздействием в присутствии блокаторов дыхания В первой части нашей работы мы исследовали механизмы МД, вызываемой глутаматом в присутствии кислорода. Однако, при таких патологических состояниях, как ишемия/гипоксия глутамат воздействует на нейроны в условиях пониженного содержания кислорода. Поэтому следующим этапом наших исследований было изучение механизмов митохондриальной деполяризации, вызываемой глутаматом в условиях гипоксии.

Снижение содержания кислорода при гипоксии ингибирует процессы переноса электронов в IV комплексе дыхательной цепи, что, в свою очередь, приводит к ингибированию всей дыхательной цепи (Nicholls and Budd, 2000). Фармакологическая блокада IV комплекса дыхательной цепи имеет схожее с гипоксией влияние на митохондриальную энергетику - она тормозит перенос электронов по дыхательной цепи. Это сходство между эффектами фармакологических ингибиторов и гипоксии широко используется для моделирования гипоксии. Одним из широко используемых ингибиторов дыхательной цепи является цианид, снижающий активность IV комплекса дыхательной цепи. В своей работе мы также использовали этот ингибитор (химическая гипоксия, ХГ Рис. 11. Динамика [Ca2+]i и глутамат 6 2. [Ca 2+ ]i, Fura-2FF, F 340 /F м во время химической гипоксии, глутамата и их 2.0 совместного применения. KCN м, Rh123, F/F (3 мМ) сам по себе не оказывал 1. влияния на [Ca2+]i и вызывал лишь слабую МД, которая 1. значительно усиливалась при 3 Oligo 1.4 добавлении глутамата.

Последующее применение FCCP 1. 2 олигомицина (Oligo), и затем FCCP не вызывало 1. KCN 1 дополнительной МД, указывая 0.8 на то, что МД, возникшая при 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 глутаматном воздействии, была практически максимальной.

Время, мин Кривые получены усреднением по 35 нейронам.

Рис. 12. Влияние глутаматного Sr2+ глутамат 0 Sr2++EGTA 1.6 воздействия в Sr2+-содержащей [Sr 2+ ] i, Fura-2FF, F 340 /F 1.4 среде в присутствии цианида на 1. FCCP м, Rh123, F/F м. Культивируемые зернистые 1. 1.2 нейроны мозжечка помещали сначала в среду, содержащую KCN и ионы 1. 1. Sr2+ Са2+, вместо а затем 0.8 обрабатывали глутаматом. Глутамат 1. вызвал сильную МД. Плавное 0.6 1.0 снижение сигнала родамина- 0.4 после окончания глутаматного KCN 0. воздействия связано с постепенным 0. вытеканием зонда из клетки, а не с 0 3 6 9 12 15 18 реполяризацией митохондрий (Ward Время, мин et al., 2000). Представленные кривые являются усреднением по нейронам.

А Б ДНФ 2. Oligo KCN FCCP 2.0 Oligo NaCN 2. м, R h1 23, F/F м, Rh123, F/F 1. 1. 1.6 1. 1.4 1. 1.2 1. FCCP 1.0 1. Ротенон 0.8 0. 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Время, мин Время, мин Рис. 13. Влияние митохондриальных ядов на м. (А) Протонофоры ДНФ (200 мкМ) и FCCP (1 мкМ) вызывали коллапс м в гиппокампальных нейронах. Блокада IV комплекса дыхательной цепи с помощью NaCN (3 мМ) индуцировала слабую МД, которая усиливалась до максимума при ингибировании митохондриальной АТФазы олигомицином (2.5 мкг/мл, Oligo). (Б) В зернистых нейронах мозжечка ингибирование I комплекса дыхательной цепи ротеноном не вызывает МД и последующее добавление олигомицина вызывает лишь незначительную МД, которая усиливается только при применении цианида. Представленные кривые являются усреднением по 10 (А) и 27 (Б) нейронам.

(Dubinsky and Rothman, 1991)) и сравнили его эффекты с эффектами блокады I комплекса дыхательной цепи ротеноном.

2.1. Эффекты блокаторов дыхательной цепи Опыты проводились на культивируемых (6-10 дней в культуре) нейронах мозжечка.

Во всех нейронах блокада дыхательной цепи с помощью NaCN или KCN (3 мМ) приводила к развитию сравнительно слабой митохондриальной деполяризации (~15-20% от максимальной МД, вызываемой применением протонофора, 300 нейронов), последующее же применение глутамата индуцировало сильную МД и значительный подъем [Ca2+]i (рис.

11).

Одной из возможных причин развития сильной МД во время глутаматного воздействия в присутствии цианида может являться повышение проводимости митохондриальной мембраны, и, в частности, открывание митохондриальной поры. Наши опыты показали, что эта МД не была связана с открыванием митохондриальной поры, поскольку качественно схожая сильная МД (рис. 12) наблюдалась во время глутаматного воздействия в присутствии цианида в Sr2+-содержащей среде. Однако эти результаты не исключают возможности того, что глутамат вызывал повышение проводимости по механизму, обусловленному митохондриальной порой нечувствительной к ЦсА (Sultan and Sokolove, 2001a,b). В подтверждение возможности существования такого механизма говорит тот факт, что повышение протонной проводимости протонофором динитрофенолом (ДНФ) значительно усиливает МД, индуцированную цианидом (рис. 13А). Необходимо подчеркнуть, что для значительного усиления МД, индуцированной цианидом, достаточно очень малой дозы ДНФ (8 мкМ), которая при нормальном функционировании дыхательной цепи вызывает лишь слабую МД.

Необходимо отметить, что в условиях блокады дыхательной цепи цианидом м поддерживается реверсированной митохондриальной АТФ-синтазой и блокада этого механизма олигомицином (2.5 мкг/мл, Oligo) приводит к полной МД (рис. 13А).

А Б ДНФ ДНФ ДНФ FCCP 1. 10 ДНФ, 2.6 200 1.7 2.4 Oligo м, Rh123, F/F KCN м, Rh123, F/F 1. 2.2 ДНФ 2.0 1. 1.8 1. 1.6 1. 1.4 1. 1. 1. 1. 1.0 Ротенон 0. 0. 0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Время, мин Время, мин Рис. 14. Потенцирование протонофором динитрофенолом МД, вызванной ингибиторами дыхательной цепи. КСN (0.5 мМ (А)) и ротенон (2 мкМ (Б)) значительно потенцируют МД, вызываемую малыми дозами разобщителя ДНФ (8, 10 или 20 мкМ).

Представленные кривые являются усреднением по 15-25 нейронам.

Мы сравнили эффекты, производимые CN, с эффектами блокады I комплекса дыхательной цепи ротеноном. Опыты показали, что ротенон сам по себе не вызывает МД, но так же как и цианид, значительно усиливает МД, вызываемую малыми дозами протонофора (рис. 14Б). Однако блокада митохондриальной АТФазы/синтазы олигомицином в присутствии ротенона не вызывала такой сильной МД, как в присутствии цианида (рис. 13).

Схожие различия в эффектах цианида и ротенона были описаны ранее на гепатоцитах (Akerman and Jarvisalo, 1980) и отнесены к работе шунтирующих механизмов в дыхательной цепи. Ротенон ингибирует I комплекс дыхательной цепи, но поступление электронов в дыхательную цепь возможно через II комплекс этой цепи. Наличие ротенона препятствует также накоплению оксалоацетата, возникающего при дыхании опосредованном II комплексом и способного ингибировать II комплекс (см. например (Brustovetsky and А Б Oligo Oligo 1. [C a 2+ ] i, Fura -2 FF, F 34 0 /F 38 ротенон ротенон FCCP 2.3 FCCP 2. 1. м, R h123, F/F 1. 1. 1. 0. 1. 0.6 1. 1. 0. глутамат глутамат 0. 0. 0 3 6 9 12 15 18 0 3 6 9 12 15 18 Время, мин Время, мин Рис. 15. Динамика [Ca2+]i и м во время воздействия глутамата и/или ротенона.

Ротенон сам по себе не оказывал практически никакого влияния на [Ca2+]i (А) и м (Б).

Добавление глутамата привело к двухфазному подъему [Ca2+]i (А) и сигнала родамина (Б).

Сильная МД развивалась только при вторичном подъеме [Ca2+]i.

NMG-Na+ Глутамат 2.2 Рис. 16. Зависимость МД, вызываемой глутаматом в 2. 0 Ca2++EGTA условиях химической гипоксии, от м, Rh123,F/Fo ионного состава внеклеточной 1. среды. Применение KCN вызвало 1.6 слабую МД, которая усилилась только при добавлении глутамата в 1. Na+-содержащей среде. Последующее Са2+ добавление индуцировало 1.2 FCCP дополнительный прирост МД.

1. KCN Снижение флуоресценции в конце эксперимента отражает медленное 0. вытекание зонда из клеток. Кривая 0 5 10 15 20 является усреднением по Время, мин нейронам.

Dubinsky, 2000) и ссылки там). Иными словами, присутствие ротенона переводит митохондрии внутри клетки на окисление субстратов II комплекса, но не вызывает полной блокады дыхательной цепи. Поэтому, различие в эффектах ротенона и цианида может быть обусловлено именно тем, что первый ингибитор лишь снижает активность дыхательной цепи, в то время как второй полностью ингибирует дыхание митохондрий.

Таким образом, повышение протонной проводимости митохондриальной мембраны значительно усиливает МД, вызываемую блокадой любого звена дыхательной цепи.

Следовательно, если МД, индуцированная глутаматом в присутствии цианида, была результатом повышения проводимости митохондриальной мембраны, то сходная сильная МД должна наблюдаться во время действия глутамата в присутствии ротенона. Однако, применение глутамата в присутствии ротенона вызвало лишь умеренные МД и [Ca2+]i подъем, которые после некоторого латентного периода сменялись сильной МД и увеличением [Ca2+]i до максимума (рис. 15). На основании того, что сильная МД развивалась только при совместном применении глутамата и цианида, но не глутамата и ротенона мы пришли к заключению о том, что сильная глутамат-индуцированная МД в присутствии цианида не была обусловлена повышением проводимости митохондриальной мембраны.

Одним из возможных механизмов, индуцирующих сильную МД в присутствии цианида является снижение активности митохондриальной АТФазы, поддерживающей м в условиях блокады дыхания. Функционирование этой АТФазы в значительной степени зависит от наличия АТФ. В настоящее время установлено, что глутамат вызывает снижение внутриклеточного уровня АТФ (Богачев и др., 1992;

Пинелис и др., 1997;

Kushnareva et al., 2005) путем активации Na+/К+-АТФазы и Са2+-АТФазы плазматической мембраны. Это, в свою очередь, может привести к развитию МД в присутствии цианида.

Применение глутамата в присутствии цианида не вызывает МД, если во внешней среде отсутствуют ионы, проникающие в клетки (рис. 16, Са2+ заменен на ЕGTA (100 мкМ), Na+ заменен на N-метил-D-глюкамин (NMG) - ион, не проникающий в клетки).

Последующее возвращение нейронов в Na+-содержащую среду приводит к развитию митохондриальной деполяризации, которая усиливается при возвращении в Са2+ содержащую среду (n = 90 клеток).

Однако механизмы МД, вызываемой Na+ во время глутаматного воздействия в условиях химической гипоксии, могут быть разными. Развитие МД может происходить вследствие унипортер-опосредованного электрофоретического входа Na+ в митохондрии (Kirichok et al., 2004). Повышение [Na+]i может также приводить к снижению внутриклеточного уровня АТФ за счет активации Na+/К+-АТФазы. Для выяснения механизма этой МД был проведен эксперимент в присутствии ингибитора Na+/К+-АТФазы уабаина (0. мМ). Уабаин предотвратил МД, вызываемую глутаматом в присутствии цианида в 2. Контроль ат 2. м, Rh123, F/F м та 2. +Уабаин лу 1. +Г 1. KCN FCCP 1. +EGTA 2+ +Ca 1. 1. 0. 0 200 400 600 800 1000 Время, сек Рис. 17. Влияние уабаина на митохондриальную деполяризацию, вызываемую глутаматом во время химической гипоксии. Нейроны мозжечка подвергались действию глутамата в условиях химической гипоксии в присутствии (уабаин) и отсутствии (контроль) уабаина (0.5 мМ). Применение глутамата в бескальциевой среде в присутствии цианида вызывает развитие МД. Уабаин практически снимает эту МД, но не предотвращает МД, вызываемую добавлением Са2+ (n = 85).

бескальциевой среде (рис. 17, n = 82). Необходимо отметить также, что применение цианида вызывало одинаковую МД как в контроле, так и в присутствии уабаина. Этот факт говорит о том, что повышение Na+, которое могло бы возникнуть в присутствии уабаина, само по себе не усиливало МД, вызванную цианидом.

Известно, что уабаин уменьшает расход АТФ вследствие ингибирования Na+/К+ АТФазы, но не предотвращает вход Na+, поэтому мы пришли к выводу о том, что митохондриальная деполяризация, вызванная глутаматом в присутствии цианида, является следствием снижения уровня АТФ.

Однако накопление натрия, во время глутаматного воздействия в бескальциевой среде приводит лишь к частичной МД, которую можно усилить с помощью возвращения в Са2+-содержащую среду (рис. 16, 17). Следовательно, вход Са2+ в нейроны запускает ряд процессов, приводящих к МД.

Одним из Са2+-зависимых механизмов МД, вызываемой глутаматом в присутствии цианида, может быть электрофоретический захват Са2+ митохондриями. По всей видимости, этот механизм может вносить вклад в глутамат-индуцированную МД в присутствии цианида, однако, проверка этого предположения требует дальнейших исследований.

Другим возможным механизмом Са2+-зависимой МД является снижение активности митохондриальной АТФазы вследствие работы Са2+/Н+-АТФазы плазматической мембраны.

К сожалению, в настоящее время отсутствуют специфические ингибиторы этого насоса плазматической мембраны, и нам не удалось проверить вклад падения АТФ, индуцированного работой Са2+/Н+-АТФазы, в развитие МД, вызванной глутаматным воздействием в присутствии цианида. Однако, сравнение динамики развития Са2+ индуцированной МД в присутствии и отсутствии уабаина показывает, что снижение АТФ является доминирующим фактором, обуславливающим развитие этой МД. Так, в контроле добавление Са2+ вызывает быстро развивающуюся МД, которая достигает максимума через ~1.5 мин. В присутствии уабаина, сохранившего АТФ, МД развивается значительно медленнее - она достигает максимума только через 5 мин после возвращения в Са2+ содержащую среду. Мы полагаем, что это замедление развития Са2+-зависимой МД обусловлено именно уменьшением расхода АТФ в присутствии уабаина и, как следствие, поддержанием высокой активности митохондриальной АТФазы.

ВЫВОДЫ 1. В опытах на культивируемых кортикальных и гиппокампальных нейронах показано, что первичное повышение [Ca2+]i и слабая митохондриальная деполяризация (МД), вызванные глутаматным воздействием, у всех нейронов сочетались с параллельным снижением цитозольного и митохондриального рН (рНц и рНм, соответственно).

2. Вторая фаза подъема [Ca2+]i (отсроченная кальциевая дизрегуляция, ОКД) и синхронная с ней сильная МД, развивающиеся во время глутаматного воздействия, у большинства нейронов сопровождались вторичным сильным закислением матрикса и ослаблением цитозольного ацидоза, свидетельствуя о перераспределении протонов между цитозолем и матриксом. У небольшой группы нейронов вторичному падению рНм предшествовало повышение рНм, сочетающееся с началом ОКД.

3. Воздействия, блокирующие формирование классической митохондриальной поры (замена Са2+ на Sr2+ или инкубация клеток в среде, содержащей циклоспорин А) препятствовали усилению вторичного митохондриального закисления в начале ОКД.

Вместо этого закисления возникало выраженное транзиторное защелачивание митохондрий, что исключает возможность объяснения сильной МД открыванием не только классической, но и какой-либо другой поры в митохондриальной мембране.

4. В опытах на гиппокампальных нейронах показано, что вторичное митохондриальное закисление сопровождается набуханием митохондрий, которое может быть предотвращено заменой ионов Са2+ на антагонист митохондриальной поры ионы Sr2+.

5. Сопоставление динамики рНм в присутствии и отсутствии ингибиторов митохондриальной поры привело нас к заключению о том, что существует два альтернативных механизма МД, сопровождающей ОКД: (1) открывание митохондриальной поры, ведущее к коллапсу митохондриального потенциала и закислению матрикса, и (2) беспоровая МД, сочетающаяся с митохондриальным защелачиванием. В отсутствии блокаторов митохондриальной поры глутамат индуцированная МД в большинстве нейронов возникает только при активации митохондриальной поры.

6. Блокада четвертого комплекса дыхательной цепи цианидами значительно усиливает митохондриальную деполяризацию, вызываемую глутаматным воздействием. В основе этого эффекта лежит быстрое истощение АТФ, необходимого для поддержания митохондриального потенциала в условиях, когда этот потенциал генерируется реверсированной митохондриальной АТФ-синтазой.

7. В отличие от цианидов, блокатор первого комплекса дыхательной цепи ротенон лишь слабо потенцирует эффекты глутамата, поскольку в этих условиях митохондриальный потенциал поддерживается не реверсированной АТФ-синтазой, а редуцированной (II IV комплексы) дыхательной цепью.

8. Замена Са2+ на Sr2+ не предотвращает развития сильной МД при совместном применении глутамата и цианида, свидетельствуя о том, что открывание митохондриальной поры не является необходимым для усиления глутаматом митохондриальной деполяризации вызываемой цианидами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Bolshakov A.P., Mikhailova M.M., Jurevicius A., Surin A.M., Pinelis V.G., Khodorov B.I.

(2003). Contribution of Ca2+ and Na to glutamate-induced mitochondrial depolarization in cerebellar granule cells. Биологические Мембраны 20: 443-445.

2. Сурин А.М., Большаков А.П., Михайлова М.М., Сорокина Е.Г., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. (2006). Арахидоновая кислота усиливает рост концентрации Са2+ и митохондриальную деполяризацию, вызванные глутаматом в гранулярных нейронах мозжечка. Биохимия 71(8): 1066-73.

3. Shalbuyeva N., Brustovetsky T., Bolshakov A., Brustovetsky N.(2006) Calcium-dependent spontaneously reversible remodeling of brain mitochondria. J. Biol. Chem. 281(49): 37547 58.

4. Михайлова М.М., Большаков А.П., Сурин А.М., Пинелис В.Г. Ходоров Б.И. (2003).

Снижение устойчивости нейронов к токсическому воздействию глутамата в отсутствие глюкозы. Биологические Мембраны, 20: 446-448.

5. Khodorov B., Surin A., Bolshakov A., Mikhailova M., Storozhevykh T., Jurevicius A., Sorokina E., Vinskaya N., Pinelis V. Prolonged glucose deprivation causes dramatic changes in [Са2+]i and mitochondrial responses to a toxic Glu challenge in young cerebellar granule cells (CGC). The Physiological Society Meeting, London-2002. J. Physiology 547P:

PC23.

6. Сурин А.М., Сторожевых Т.П., Большаков А.П., Винская Н.П., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И., M.R. Duchen. О роли F1Fo-ATPазы в нарушениях кальциевого гомеостаза, индуцированного токсическими дозами глутамата в зрелых гиппокампальных нейронах. Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 16-18 июня 2003, стр.198-200.

7. Khodorov B., Bolshakov A., Jurevicius A., Mikhailova M., Sorokina E., Surin A., Cooper M., Pinelis V. Mitochondrial depolarization induced by cyanide in cultured central neurons is age-dependent. 48th Annual Meeting of Biophysical Society, Baltimore, February 2004, 2357-pos/B454.

8. Ходоров Б.И., Вабниц А.В., Михайлова М.М., Большаков А.П., Сорокина Е.Г., Сурин А.М., Пинелис В.Г. О природе отсроченных нарушений кальциевого гомеостаза нейрона при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Третий Российский Конгресс по патофизиологии. Москва 9-12 ноября 2004. Тезисы докладов, стр. 146.

9. Сурин А.М., Большаков А.П., Михайлова М.М., Cенилова Я. Е., Сорокина Е.Г., Пинелис В.Г. Влияние арахидоновой кислоты на индуцированные глутаматом изменения Ca2+ и митохондриального потенциала в культивируемых нейронах.

Третий Российский Конгресс по патофизиологии. Москва 9-12 ноября 2004. Тезисы докладов, стр. 144.

10. Khodorov B.I., Bolshakov A.P., Mikhailova M.M., Vabnitz A.V., Surin A.M., Storozhevykh T.P., Sorokina E.G., Senilova Y.E., Pinelis V.G. A difference in the mechanisms of mitochondrial depolarization induced by cyanides, glucose deprivation or glutamate exposure in cerebellar granule cells. 34th Annual Meeting of Society for Neuroscience, San Diego 2004, Itinerary viewer 795.5.

11. Сурин А.М., Большаков А.П., Михайлова М.М., Сорокина Е.Г., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г. Роль арахидоновой кислоты в нарушениях Ca2+ гомеостаза, вызванных глутаматом в культивируемых нейронах. Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 6-8 июня 2005.

12. Большаков А.П., Михайлова М.М., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Влияние глутаматного воздействия на митохондриальный рН в кортикальных нейронах. Конференция «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты». Москва 14-16 марта 2005.

Тезисы докладов, стр. 135.

13. Brustovetsky N., Shalbuyeva N., Brustovetsky T., Bolshakov A. Calcium-dependent spontaneously reversible morphological changes in CNS mitochondria. 36th Annual Meeting of Society for Neuroscience, Atlanta 2006, Neuroscience meeting planner 19.7.