Картирование нелокализованных последовательностей днк курицы в геноме курицы и перепела.

На правах рукописи

ТРУХИНА Антонина Владимировна КАРТИРОВАНИЕ НЕЛОКАЛИЗОВАННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК КУРИЦЫ В ГЕНОМЕ КУРИЦЫ И ПЕРЕПЕЛА.

специальность: 03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт–Петербург 2011

Работа выполнена в Санкт–Петербургском государственном университете на кафедре генетики и селекции.

Научный консультант: профессор, доктор биологических наук Александр Федорович Смирнов Санкт–Петербургский государственный университет

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Лариса Васильевна Козикова ведущий научный сотрудник ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии, г. Пушкин кандидат биологических наук Наталья Алековна Дюжикова старший научный сотрудник Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, г. Санкт–Петербург Ведущее учреждение: Институт экспериментальной медицины РАМН, г. Санкт–Петербург

Защита состоится 2011 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан _ 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Л.А. Мамон ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Построение цитогенетических карт необходимо для решения фундаментальных проблем генетики, эмбриологии, вирусологии, онкологии и практических целей селекции (Leroux et al., 2005;

Morisson et al., 2005);

кроме того, в будущем без этих карт будут невозможны исследования в области функциональной геномики (Burt et al., 2002).

Картирование геномов лабораторных и сельскохозяйственных животных — одно из приоритетных направлений в частной генетике этих видов. Генетические карты хромосом позволяют анализировать генотипическую структуру вида, а также исследовать общие закономерности генетического контроля биологически важных признаков. Кроме того, результаты сравнительного картирования необходимы при исследованиях в области эволюции геномов различных видов эукариотических организмов (Burt et al., 1999, 2002, Schmid et al., 2005). Сегодня принято считать, что конечной целью любого типа картирования геномов высших позвоночных животных является установление аналогии нуклеотидных последовательностей этого вида с геномами человека и мыши (Schmid et al., 2000).

Среди позвоночных животных класс Aves (Птицы) занимает особое положение по молекулярно–генетическим характеристикам своего генома. Одной из основных особенностей этого класса животных является почти втрое меньшее, по сравнению с плацентарными, содержание ДНК в ядре, что рассматривается современными авторами как приспособление птиц к полету (Burt et al., 1999). Варьирование количества ДНК в ядре у представителей самых разных таксономических групп выражено незначительно и колеблется от 1.7 до 3.5 пг, что вероятно связано с монофилетическим происхождением этого класса животных (Kadi et al., 1993).

Наиболее изученным с генетической точки зрения видом птиц является домашняя курица Gallus domesticus. К настоящему моменту выведено большое число пород курицы, обладающих уникальными биологическими свойствами (Rose, 2000;

Schmid et al., 2000, 2005;

Romanov et al., 2009). Несмотря на то, что курица стала первым животным, использованным в генетических исследованиях (Bateson, Saunders, 1902, цит. по Romanov et al., 2009), а также первым видом птиц, у которого был полностью секвенирован геном (ICGSC, 2006), многие вопросы, связанные с картированием ее хромосом, остаются открытыми.

Японский перепел также является важным модельным объектом в ряде биологических дисциплин, но генетически изучен еще меньше, чем курица (Minvielle et al., 2007).

Кариотипы курицы и перепела очень сходны по своей структуре и состоят из 39 пар хромосом. Большинство из них (30 пар) — это мелкие трудноидентифицируемые микрохромосомы (Ohno, 1961;

Bitgood and Shoffner, 1990). Остальную часть кариотипа (8 пар аутосом и половые Z и W хромосомы) относят к группе макрохромосом. На основе дифференциального окрашивания разработана подробная цитологическая карта макрохромосом (Ladjali–Mohammedi, 1999), а также достаточно полная генетическая карта этой части кариотипа курицы (Romanov et al., 2009). К сожалению, карты микрохромосом еще далеки от насыщения. До сих пор существует проблема несоответствия числа групп сцепления (53) гаплоидному числу хромосом (n=40). К настоящему моменту из групп сцепления к определенным хромосомам отнесена 31. Остальные 22 группы не "привязаны" к какой–либо хромосоме курицы и объединены в одну общую карту под названием "Chrun". Для этих групп необходима цитогенетическая локализация с правильным определением хромосомы (Schmid et al., 2005;

Morisson et al., 2007;

Douaud et al., 2008;

Romanov et al., 2009).

В геноме перепела число картированных генов и маркеров меньше, чем у курицы. У перепела известно несколько генетических карт (AFLP–маркеры и микросателлиты), которые в последнее время интенсивно интегрируются. Генов на таких картах не очень много и не все хромосомы имеют маркеры. Например, хромосомы 8, W и 23 пары микрохромосом (Kayang et al., 2006;

Sasazaki et al., 2006;

Minvielle et al., 2007;

Miwa 2007). В настоящее время геном перепела представлен в виде 66 групп сцепления вместо положенных 40 (гаплоидный набор хромосом) (Sasazaki et al., 2006).

До сих пор сохраняется проблема с насыщением цитогенетических карт этих объектов. Как правило, эта проблема касается группы самых мелких микрохромосом, для которых показана высокая транскрипционная активность, (McQueen et al., 1998;

Burt, 2002), однако не найдены какие–либо генетические маркеры (Schmid et al., 2005). Прогресс в поиске маркеров для этой группы хромосом у курицы достигнут благодаря использованию ВАС–библиотек, содержащих огромное количество клонов E.coli (ВАС-клоны), несущих искусственные хромосомы с большими вставками из генома (Schmid et al., 2000;

Delany et al., 2007;

Douaud et al., 2008). На сегодня при помощи хромосомоспецифичных ВАС–клонов удалось идентифицировать 22 пары микрохромосом (Douaud et al., 2008).

Анализ генетической информации из баз данных, касающихся генома курицы показывает существование проблемы "спорной" локализации генов и маркеров (NCBI, ArkDB, Ensembl). Так, например, 10% из 226 контигов имеет двойную локализацию одних и тех же маркеров (Schmid et al., 2005;

Romanov et al., 2009), что приводит к необходимости повторной локализации «спорных» маркеров с привлечением других методов картирования.

Цели и задачи исследования. Целью исследования явилось дальнейшее насыщение и совершенствование цитогенетических карт курицы и перепела, а также сравнение результатов картирования у этих видов.

Для достижения цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Определить соответствие групп сцепления E26C13, E50C23 митотическим хромосомам курицы. Осуществить локализацию с помощью SSCP–маркеров LEI0345 и LEI0336 из данных групп сцепления методами двухцветной FISH и ПЦР–реакции.

2. Локализовать гены maf, aldh1a1, pno, fzf, cw01 и микросателлиты ADL0254, LEI0342, MCW0330 на митотических хромосомах курицы и перепела с помощью двухцветной FISH.

3. Провести сравнительный анализ локализации генов maf, aldh1a1, pno, fzf, cw01 и микросателлитов ADL0254, LEI0342, MCW0330 у курицы и перепела.

Научная новизна работы. Впервые определено соответствие группы сцепления E50C23 микрохромосоме 21 курицы и показано, что маркер LEI0345 не может быть использован в качестве маркера для определения соответствия группы сцепления Е26С13 и хромосомы курицы. Осуществлена локализация пяти новых генов–ортологов (maf, aldh1a1, pno, fzf, cw01) и трех микросателлитов (ADL0254, LEI0342 и MCW0330) в геноме перепела. Впервые осуществлена совместная локализация в митотических хромосомах курицы и перепела следующих пар маркеров: maf–mc1r, aldh1a1–igvps, pno–acaca, fzf–bmp7, cw01–ubap2w, ADL0254– insr, LEI0342–hspa5, MCW0330–hspa5. Проведен сравнительный анализ локализации этих маркеров в хромосомах курицы, перепела и человека. Впервые применен метод ПЦР для локализации генов и маркеров с использованием хромосомоспецифичных ВАС–клонов. Показана необходимость применения для локализации маркеров нескольких методов картирования.

Теоретическая и практическая ценность работы. Домашняя курица и японский перепел являются ценными сельскохозяйственными видами и модельными объектами. Полученные данные могут быть использованы в селекции, в позиционном клонировании, в медицинской генетике. Они полезны для решения фундаментальных проблем эмбриологии, иммунологии, вирусологии, онкологии, для определения консервативной синтении в геномах птиц, человека, мыши, а также для построения карт генома общего предка позвоночных животных и животных в целом. Данные по эволюционному консерватизму районов хромосом человека и домашней курицы могут быть использованы для моделирования хромосомных болезней человека. Сравнительное картирование геномов японского перепела и курицы помогут лучше разобраться в происхождении и эволюции этих видов. Результаты, полученные в работе, используются при чтении курсов лекций по генетике животных и при проведении практических занятий на кафедре генетики и селекции СПбГУ.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 18–м Международном Коллоквиуме по Цитогенетике Животных и Картированию Генов (18th–ICACGM, Bucharest, Romania, 2008), 17–й Международной хромосомной конференции (17th ICC, Boone, NC, 2009), на V съезде ВОГиС (Москва, МГУ, 2009), 2–й Московской Международной Конференции «Молекулярная Филогенетика MolPhy–2», (Москва, МГУ, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ: 3 статьи и 4 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, состоящего из источников. Работа изложена на 138 страницах и содержит 21 рисунок, схем и 9 таблиц.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

Материалом исследования служили препараты митотических хромосом из эмбрионов кур породы Бурый Леггорн и японского перепела, любезно предоставленых А.Л. Вахрамеевой из собственного частного хозяйства (Ленинградская область).

Цитологические препараты метафазных хромосом получали из 72–х часовых эмбрионов курицы и 96–ти часовых эмбрионов перепела стандартным способом (Fechheimer, 1990;

Lichter et al., 1991). Готовые препараты хранили до использования при –20оС в 70% этаноле.

Молекулярно–генетические методы.

Для получения компетентных клеток DH5[alpha] E.coli, трансформации, выделения ДНК, электрофореза, ПЦР использовали стандартные методы (Кузнецова, Винтер, 1997).

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH).

Гибридизацию проводили на митотических хромосомах курицы и перепела, используя методику Лихтера и Кремера (Lichter, Cremer, 1992), включая обработку РНКазой А (100мкг/мл), протеиназой К (0,2 мг/мл) и 4% раствором параформальдегида.

В качестве ДНК–зондов использовали:

ДНК из 20–ти хромосомоспецифичных ВАС–клонов. Информация о них 1) представлена в таблице 1.

ДНК из 12–ти ВАС–клонов, которые требовалось локализовать: два клона, 2) содержащие SSCP–маркер LEI0345 (r49А10, r55М23) из группы сцепления Е26С13, два клона, содержащие SSCP–маркер LEI0336 (r19Е22, r13С08) из группы сцепления Е50С23, и по одному ВАС–клону, содержащему остальные 8 маркеров.

Информация о них представлена в таблице 2.

Все ВАС–клоны были любезно предоставлены М.Н. Романовым (Университет Штата Мичиган, США).

ДНК выделяли из ВАС–клонов E.coli трех геномных ВАС–библиотек курицы:

ТАМ31Н1, ТАМ32, CHORI–261. Наличие нужных вставок проверяли с помощью метода ПЦР соответствующими праймерами.

Хромосомоспецифичные зонды метили биотином (biotin–16–dUTP, "Boehringer Mannheim"), изучаемые – дигоксигенином (digoxigenin–16–dUTP, "Boehringer с помощью ник–трансляции или методом случайной Mannheim") олигонуклеотидной затравки. Гибридизацию in situ проводили в течение 18 – часов. Биотин и дигоксигенин выявляли с помощью наборов для детекции соответствующих гаптенов (Boehringer Mannheim, Германия (биотин) и Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Германия (дигоксигенин)) Для окрашивания хромосом в заключающую среду (VectaShield) добавляли DAPI.

Для локализации SSCP–маркеров на митотических хромосомах курицы использовали метод двухцветной FISH–гибридизации, которую проводили в два этапа. На первом этапе осуществляли FISH–гибридизацию со смесями ("пулами") из хромосомоспецифичных ВАС–клонов. Последние были разделены по принадлежности к определенным хромосомам на 4 группы: хромосомы 9–13 (I группа), хромосомы 14–18 (II группа), хромосомы 19–23 (III группа) и хромосомы 24–28, W (IV группа). ВАС–клонов для микрохромосом 25, 29–39 не было. С каждым из этих "пулов" ставили отдельную двухцветную FISH–гибридизацию с SSCP–маркерами LEI336 и LEI0345. На втором этапе, проводили двухцветную FISH–гибридизацию тех же маркеров с отдельными хромосомоспецифичными ВАС–клонами из той группы, в которой на предыдущем этапе были выявлены совместный сигнал в пределах одной хромосомы.

Таблица 1. Хромосомоспецифичные ВАС–клоны, использованные в работе.

Источники информации микрохро ВАС-клоны, содержащие маркеры о локализации данных мосома соответствующие маркеры последовательностей 9 r73J ncl Schmid et al., 10 r30A b2m Carlborg et al., 2003;

11 r46G mc1r Kerje et al., 12 Schmid et al., 2000 r20B arf 13 Buitenhuis et al., 2002 r53D pou4f 14 r27C hba 15 Schmid et al., 2000 r24F igvps 16 r85G mhcb 17 Schmid et al., 2005 r32P hspa 18 r24I h3f3b 19 Schmid et al., 2000 r21A acaca 20 r13H bmp 21 Schmid et al., 2005 r85L eno 22 Suchyta et al., 2001 r18P dpysl 23 MCW249 Aerts et al., 2005 r16G 24 Jennen et al., 2002 r29H opcml 26 LEI0074 r25N Schmid et al., 27 MCW233 r76B 28 Smith J. et al., 2002 r79A insr W Schmid et al., 2005 CH114G ubap2w Примечание: LEI…. — сокращение обозначает маркер, полученный в Университете Лейцестер, Великобритания;

MCW…. — сокращенная запись маркера, выявленного в сельскохозяйственном университете Вагенингена, Вагенинген, Нидерланды.

Таблица 2. ВАС–клоны, содержащие молекулярные маркеры, которые не были ранее локализованы методом двухцветной FISH.

Содержащийся маркер Принятое Предполагаемая ВАС–клон сокращение Полное название маркера локализация (хромосома) маркера (Schmid et al., 2000;

2005) онкоген мышечно-апоневротической r40P04 maf фибросаркомы ген алкогольдегидрогеназы 1 А r20G17 aldh1a микросателлит r36H02 MCW0330 микросателлит r27G22 LEI0342 ген опсина r21N16 pno ген опухоли Вильмса r80A21 fzf микросателлит r27G07 ADL0254 последовательность cw r55E18 W cw r49А10 — LEI0345 SSCP-маркер r55М23 — LEI0345 SSCP-маркер r19Е22 — LEI0336 SSCP-маркер r13С08 — LEI0336 SSCP-маркер Примечание: LEI…. — сокращение обозначает маркер, полученный в Университете Лейцестер, Великобритания;

MCW…. — сокращенная запись маркера, выявленного в сельскохозяйственном университете Вагенингена, Вагенинген, Нидерланды;

ADL…. — маркер, выявленный в лаборатории болезней птиц и онкологии, Ист Лансинг, США.

Флуоресцентная микроскопия.

Препараты анализировали с помощью системы флуоресцентного микроскопа Leica DM6000B (Leica Microsystems GmbH, Germany), оборудованного цветной цифровой CCD камерой Leica DC500 и набором светофильтров для соответствующих флуорохромов. Для получения и обработки фотоизображений использовали программное обеспечение Leica QWin v.1.2 (Leica Microsystems GmbH, Germany). В каждом случае гибридизации анализировали по 20– метафазных пластинок с хорошим разбросом хромосом.

б) а) Рис.1. Локализация маркера LEI0345 на митотических хромосомах курицы (2цв.FISH). а) LEI0345 (красный сигнал, родамин), б)bmp (зеленый сигнал, FITC). Хромосомы окрашены DAPI. Стрелками указаны сайты специфической гибридизации маркеров.

б) а) Рис.2. Локализация маркера LEI0336 на митотических хромосомах курицы (2цв.FISH). а) LEI0336 (красный сигнал, родамин), б) eno1 (зеленый сигнал, FITC). Хромосомы окрашены DAPI. Стрелками указаны сайты специфической гибридизации маркеров.

а) б) Рис.3. Локализация гена fzf на митотических хромосомах курицы (2цв.FISH).

а) fzf (красный сигнал, родамин), б)bmp7 (зеленый сигнал, FITC). Хромосомы окрашены DAPI. Стрелками указаны сайты специфической гибридизации I маркеров.

а) б) а) б) Рис.4. Локализация микросателлита ADL0254 на митотических хромосомах курицы (2цв.FISH). а) ADL0254 (красный сигнал, родамин), б)insr (зеленый сигнал, FITC). Хромосомы окрашены DAPI. Стрелками указаны сайты специфической гибридизации маркеров. m — не установленная хромосома.

I б) а) II б) а) Рис.5. Локализация микросателлита MCW0330 на митотических хромосомах курицы (I) и перепела (II) (2цв.FISH). а) MCW0330 (красный сигнал, родамин), б)hspa5 (зеленый сигнал, FITC). Хромосомы окрашены DAPI.

Стрелками указаны сайты специфической гибридизации маркеров.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Поиск соответствия группы сцепления Е26С13 одной из хромосом курицы методом двухцветной FISH–гибридизации и ПЦР.

Анализ результатов первого этапа двухцветной FISH–гибридизации митотических хромосом курицы с ВАС клонами, содержащими SSCP–маркер LEI0345, показал, что он локализуется в одной из микрохромосом группы 19–23. В результате FISH–гибридизации с ВАС клонами, специфичными для микрохромосом 19–23, было установлено, что маркер LEI0345 принадлежит микрохромосоме 20 (рис. 1). Он был выявлен в той же микрохромосоме, что и ген bmp7 (маркер хромосомы 20). В соответствии с результатом локализации этого маркера группа сцепления Е26С13 также была отнесена к хромосоме 20. Используя другие маркеры из группы сцепления Е26С13 и двухцветную флуоресцентную in situ гибридизацию, Делани с соавторами (Delany et al., 2007) "привязали" ее к хромосоме 4, а Доуд (Douaud et al., 2008) ту же группу сцепления отнес к микрохромосоме 25. Данные этих работ представлены в таблице 3.

Следует отметить, что у Делани с помощью метода FISH был локализован только ген mcl1 (r42К16, GenBank AF120210). Остальная часть группы сцепления попала в эту хромосому благодаря анализу ее полного сиквенса (http://genome.ucsc.edu;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid= 031). Прямой локализации маркера LEI0345 вместе с геном mcl1 на митотических хромосомах курицы методом двухцветной FISH–гибридизации не осуществлялось.

В то же время в работе Доуд с соавторами (Douaud et al., 2008) методом FISH был получен иной результат.

В связи с различиями результатов разных лабораторий в локализации маркера LEI0345 на хромосомах курицы, мы решили использовать другой метод (ПЦР). В качестве образцов была использована ДНК из хромосомоспецифичных ВАС– клонов и праймеры для маркера LEI0345. Кроме того, были поставлены отрицательный (смесь для ПЦР без добавления ДНК и с вектором без вставки) и положительный (ВАС-клон, содержащий маркер LEI0345, и геномная ДНК курицы) контроли. Результаты ПЦР реакции представлены на рисунке 6. Продукты амплификации были получены почти со всеми пробами, кроме проб для хромосом 19 и 22. Стрелкой отмечен продукт реакции, полученный с ВАС–клоном, содержащим ген bmp7 из хромосомы 20. В этом случае наблюдалась наибольшая концентрация продукта ПЦР реакции. Исходя из результатов ПЦР, можно предположить, что данный маркер многократно представлен в геноме курицы, и поэтому не может быть использован для соотнесения группы сцепления Е26С13 с микрохромосомами. Однако последовательность, заключенная в использованных ВАС–клонах, располагается в микрохромосоме 20, что было выявлено с помощью метода FISH.

Возможно, что обнаруженная нами множественная локализация данного маркера в геноме курицы объясняется его теломерным происхождением (Thomson Известно, что для этих et al., 1999;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

последовательностей характерно большое количество повторов и множественная локализация в хромосомах (Delany et al., 2007). Благодаря использованию метода Таблица 3. Соответствие группы сцепления Е26С13 одной из хромосом курицы по разным источникам.

Группа Маркер ВАС-клон хромосома Метод ссылка сцепления 42K16 4q FISH mcl анализ нуклеотидной последовательности Delany et al., LEI0345 4p группы сцепления Е26С bw90F5 25 2цв. FISH COPA Е26С bw88F Douaud et al., микрохро 2цв.FISH с клоном bw64M мосома bw90F ARHGEF bw64M r49A10 Trukhina, Smirnov, 2цв. FISH LEI0345 r55M Примечание: ExxCxx— интегрированная группа сцепления, объединяющая Ист–Лансингскую (Ехх) и Комптоновскую (Схх) группы сцепления;

LEI…. — сокращение обозначает маркер, полученный в Университете Лейцестер, Великобритания;

q — длинное плечо хромосомы, p — короткое плечо хромосомы.

Рис. 6. Результаты ПЦР с использованием ДНК хромосомоспецифичных ВАС–клонов (табл.1) и праймеров для маркера LEI0345 (табл.2). Стрелкой показан ВАС–клон, содержащий маркер из хромосомы 20 (bmp7). ПК – положительный контроль, ОК – отрицательный контроль.

ПЦР нами были выявлены дополнительные сайты локализации этого маркера, что было невозможно при помощи FISH метода. После обнаружения множественной локализации маркера LEI0345 в хромосомах курицы стало понятно, почему в разных лабораториях этот маркер был локализован в разных хромосомах.

Поиск соответствия группы сцепления Е50С23 одной из хромосом курицы методом двухцветной FISH–гибридизации и ПЦР.

Анализ результатов двухцветной FISH гибридизации показал, что маркер LEI0336 из группы сцепления Е50С23 локализуется в микрохромосоме 21 (по совместной локализации с геном eno1 из хромосомы 21). Результаты этой гибридизации представлены на рис. 2. С помощью ПЦР были получены аналогичные результаты (рис.7): фрагмент ДНК из ВАС–клона, содержащего ген eno1, дал положительную реакцию с праймерами для маркера LEI0336 (на рисунке он показан стрелкой). Также были поставлены положительный контроль (с ВАС– клоном, содержащими маркер LEI0336, и геномной ДНК курицы), и отрицательный контроль (реакционная смесь без добавления ДНК, и с добавлением ВАС–клона без вставки).

Рис.7. Результаты ПЦР с использованием ДНК хромосомоспецифичных ВАС–клонов (табл.1) и праймеров для маркера LEI0336 (табл.2). Стрелкой показан ВАС–клон, содержащий маркер из хромосомы 21, и на котором образовался амплификат с праймерами для LEI0336.

ПК – положительный контроль, ОК – отрицательный контроль.

Поскольку результаты локализации маркера LEI0336 в геноме курицы двумя методами совпали, то мы пришли к заключению, что данный маркер и группа сцепления Е50С23, в целом, принадлежат микрохромосоме 21. Однако это заключение противоречит выводам, сделанным Мориссон с соавторами (Morisson et al., 2007). В своей работе они объединили группу сцепления Е50С23 с Е22С19W28, используя анализ полностью секвенированного генома курицы, и с помощью FISH– гибридизации одного из маркеров последней группы сцепления отнесли ее к микрохромосоме 25. Необходимо отметить, что при этом ни одного маркера из группы сцепления Е50С23 этим методом локализовано не было. Результаты соотнесения разными авторами группы сцепления Е50С23 с одной из хромосом курицы представлены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты поиска соответствия группы сцепления Е50С23 одной из хромосом курицы по разным источникам.

Группа Маркер ВАС локализация Метод сцепления (хромосома) Маркер из группы Нет данных о сцепления 2цв. FISH ВАС–клонах (Morisson et al., 2007) Е22С19W Е50С r19Е22 2цв. FISH, ПЦР LEI (Trukhina, Smirnov, 2010) r13С Примечание: ExxCxxWxx — интегрированная группа сцепления, объединяющая Ист– Лансингскую (Ехх), Комптоновскую (Схх) и Вагенингеновскую (Wxx) группы сцепления;

LEI…. — сокращение обозначает маркер, полученный в Университете Лейцестер, Великобритания.

Наши данные являются более правдоподобными, так как совместную локализацию маркера из группы сцепления Е50С23 и LEI хромосомоспецифичного ВАС клона с маркером из микрохромосомы 21 (eno1) удалось показать двумя методами.

Локализация микросателлита LEI0342, последовательности cw01, и гена fzf в митотических хромосомах курицы.

С помощью хромосомоспецифичных ВАС–клонов и метода двухцветной FISH, также было показано, что последовательность cw01, микросателлит LEI0342 и ген опухоли Вильмса локализуются в хромосомах W, 17 и 20, соответственно. Эти результаты полностью согласуются с данными генетических карт курицы (Schmid et al., 2000) и подтверждаются работами других авторов (Delany et al., 2007;

Sazanov et al., 2005). Совместная локализация использованных пар маркеров (cw01 — ubap2w, LEI0342 — hspa5, fzf — bmp7) с помощью метода FISH в геноме курицы осуществлялась впервые. Данные этой локализации представлены в таблице 5.

Таблица 5. Локализация микросателлита LEI0342, последовательности cw01 и гена fzf на митотических хромосомах курицы.

Локализация маркера на митотических хромосомах курицы по разным источникам Гены или другие маркеры Schmid et al., 2000 Trukhina, Smirnov, Генет. локализация ArkDB, NCBI FISH FISH карты (хромосома) LEI0342 — 17 17 + (микросателлит) fzf (ген опухоли Е32 — 20 20 + Вильмса) — — cw01 W W + Примечание: ArkDB, NCBI — базы данных по геномам важнейших сельскохозяйственных животных и модельных объектов;

LEI…. — сокращение обозначает маркер, полученный в Университете Лейцестер, Великобритания, W — половая хромосома курицы.

На рис.3 (стр.9) представлены результаты локализации гена fzf. Сайты специфической гибридизации показаны стрелками. На фотографии видно, что и ген fzf и bmp7 (из хромосомы 20) расположены в одной микрохромосоме. Наши данные по локализации генов fzf и bmp7 на хромосоме 20 хорошо согласуются с результатами картирования, полученными в других лабораториях (Schmid et al., 2005). Так, например, согласно генетической карте генома курицы, опубликованной Шмид в 2000 году, гены fzf и bmp7 принадлежат группе сцепления Е32. Позже эта группа была отнесена к микрохромосоме 20 (Schmid et al., 2005). Однако из двух генов только bmp7 был локализован с помощью FISH в хромосоме 20 (Schmid et al., 2005). Данные полного сиквенса генома курицы также говорят в пользу совместной локализации этих генов в одной и той же хромосоме.

(http://www.ensembl.org/Gallus_gallus/).

Локализация микросателлита ADL0254 в митотических хромосомах курицы.

Исследование локализации микросателлита ADL0254 на митотических хромосомах курицы показало, что он имеет два сайта локализации: один сайт располагается в микрохромосоме 28 (вместе с геном insr), другой — в микрохромосоме бльшего размера (рис.4). Результаты также изложены в таблице 6, из которой видно, что они отличаются от информации, представленной в базах данных по геному курицы и в обзоре Шмид за 2005 год. Высказано предположение о наличии двух копий этого микросателлита в геноме курицы.

Таблица 6. Результаты локализации микросателлита ADL0254 на митотических хромосомах курицы методом FISH по разным источникам.

Локализация маркера на митотических хромосомах курицы микроса- Trukhina, Smirnov, Schmid et al., теллит локализация ArkDB, NCBI Генет. карты FISH FISH (хромосома) 28+микрохромо — ADL0254 28 28 + сома Локализация генов maf, aldh1a1, pno и микросателлита MCW0330 в митотических хромосомах курицы.

Нами также были обнаружены гены, предварительная локализация которых другими авторами не подтвердилась в наших экспериментах. Методом двухцветной FISH–гибридизации было показано, что гены maf, aldh1a1, pno и микросателлит MCW0330 локализуются независимо от генов mc1r (микрохромосома 11), igvps (микрохромосома 15), acaca (микрохромосома 19) и hspa5 соответственно. С ними необходимо продолжать работу. На рисунке 5а представлены результаты экспериментов с геном aldh1a1, а в таблице 7 — результаты локализации трех генов (maf, aldh1a1, pno) и микросателлита. На фотографиях видно, что пара генов aldh1a1–igvps располагается в разных микрохромосомах.

Таблица 7. Результаты локализации генов maf, aldh1a1, pno и микросателлита MCW0330 на митотических хромосомах курицы по разным источникам.

Локализация генов на митотических хромосомах курицы.

Trukhina, Smirnov, Schmid et al., Гены локализация ArkDB, NCBI генет. карты FISH FISH (хромосома) 11 или др. микрохромосома — микрохромосома (не 11) 11 + maf — — микрохромосома (не 15) aldh1a1 15 + — микрохромосома (не 19) 19 19 + pno — микрохромосома (не17) MCW0330 17 17 + Локализация ортологичных последовательностей изучаемых молекулярных маркеров в митотических хромосомах перепела.

С целью насыщения цитогенетических карт перепела и сравнительного картирования хромосом курицы и перепела для 8 маркеров курицы определялась локализация их ортологов в митотических хромосомах перепела. Результаты локализации этих маркеров в геноме перепела и их сравнение с результатами локализации тех же маркеров в геноме курицы представлены в таблице 8. Нами было показано, что ортологи гена опухоли Вильмса, микросателлита LEI0342 и последовательности cw01 распределяются в геноме перепела так же, как и у курицы. Они находятся в хромосомах 20, 17 и W соответственно. Кроме того микросателлит ADL0254 у перепела встречается только в микрохромосоме 28, в отличие от курицы, у которой этот микросателлит представлен в виде двух копий: в микрохромосоме 28 и микрохромосоме бльшего размера. Локализация оставшихся трех генов (maf, aldh1a1 и pno) и микросателлита MCW0330 отличается от той, которая была получена при картировании их в геноме курицы (микрохромосомы 11, 15, 19 и 17, соответственно): ген maf оказался сцепленным с геном mc1r, ген aldh1a1 — с геном igvps, ген pno — с геном acaca, а микросателлит MCW0330 — с геном hspa5. На рис. 5(II) представлены результаты локализации гена–ортолога aldh1a1 в геноме перепела. На основании полученных результатов было высказано предположение, что в геноме перепела существует, по крайней мере, четыре перестройки с участием следующих маркеров: maf, aldh1a1, pno и MCW0330.

Таблица 8. Локализация восьми молекулярных маркеров курицы на митотических хромосомах перепела.

Гены или микросателлиты Хромосома перепела Хромосома курицы 20 fzf cw01 W W LEI0342 17 28+ микрохромосома ADL0254 микрохромосома (не 11) maf микрохромосома (не 15) aldh1a1 микрохромосома (не 19) pno микрохромосома (не 17) MCW0330 В заключение хочется отметить, что, несмотря на кажущийся прорыв в изучении хромосом курицы, связанный с появлением в 2006 году новой редакции полностью секвенированного генома данного вида, исследователи по–прежнему сталкиваются с проблемами при построении генетических карт этого объекта.

Одной из таких проблем является «несовпадение» полученных в разных лабораториях результатов локализации одних и тех же маркерных последовательностей. Это «несовпадение» может быть обусловлено, с одной стороны, разной разрешающей способностью многочисленных методов картирования (Schmid et al., 2000, 2005;

Romanov et al., 2009), а с другой — использованием в экспериментах разных пород курицы (Schmid et al., 2000, 2005).

Наличие в кариотипах курицы и перепела большого количества мелких трудноидентифицируемых микрохромосом не позволяет собрать полную коллекцию хромосомоспецифичных клонов для этих объектов. На наш взгляд, в ближайшем будущем следует сосредоточить усилия на получении такой коллекции.

Это позволит «привязать» существующие в настоящий момент маркеры с неизвестной локализацией к определенным микрохромосомам, что безусловно станет важнейшим шагом на пути создания полной генетической карты хромосом курицы.

ВЫВОДЫ.

Локализация маркера LEI0336 в микрохромосоме 21 позволяет отнести группу 1.

сцепления Е50С23 к данной хромосоме.

Выявленная множественная локализация маркера LEI0345 указывает на 2.

невозможность использования его в качестве молекулярного маркера хромосом курицы.

ДНК–последовательность cw01, микросателлит LEI0342 и ген fzf курицы 3.

расположены на хромосомах W, 17 и 20, соответственно.

Микросателлит ADL0254 в геноме курицы имеет два сайта локализации: в 4.

микрохромосоме 28 и микрохромосоме бльшего размера.

Показано, что гены maf, aldh1a1, pno и микросателлит MCW0330 отсутствуют 5.

в хромосомах курицы 11, 15, 19 и 17, соответственно.

Локализация генов–ортологов fzf, последовательности cw01 и микросателлита 6.

LEI0342 полностью совпадает у курицы и перепела;

микросателлита ADL — совпадает только частично;

а генов–ортологов maf, aldh1a1, pno и микросателлита MCW0330 — различается.

Высказано предположение, что различие в локализации маркеров связано с 7.

наличием перестроек в микрохромосомах перепела.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Trukhina A.V., Smirnov A.F. Localization of markers from E26C13 and E50C linkage groups in chicken genome // Chromosome Research. Abstracts 18th international colloquium of animal cytogenetics and gene mapping. Bucharest.

Romania. 2008. V.16. P.1053.

2. Трухина А.В., Смирнов А.Ф. Сравнительное картирование некоторых функциональных генов и микросателлитов курицы (Gallus domesticus) на митотических хромосомах перепела (Coturnix japonica) // Материалы V съезда ВОГиС, Москва, МГУ, 21–27 июня 2009. С.107.

3. Trukhina A.V., Smirnov A.F. Comparative mapping of chicken (Gallus domesticus) genes and microsatellites on quail (Coturnix japonica) metaphase chromosomes// Chromosome Research. Abstracts 17th International Chromosome Conference. Boone, North Carolina. 2009. V.17, №4. P. 576.

4. Трухина А.В., Смирнов А.Ф. Микросателлит LEI0345 из группы сцепления E26C13 локализован на микрохромосоме 20 Gallus domesticus // Вестник СПбГУ. 2010. Сер. 3, вып. 4. С. 39–46.

5. Трухина А.В., Смирнов А.Ф. Микросателлиты из групп сцепления E26C и E50C23 локализованы на микрохромосомах 20 и 21 Gallus domesticus // Генетика. 2010. Т.46, №4. С. 509– 6. Трухина А.В., Смирнов А.Ф. Сравнительная локализация пяти функциональных генов и трех микросателлитов курицы на митотических хромосомах перепела методом двухцветной FISH // Цитология. 2010. Т.52, №3. С. 248–253.

7. Trukhina A. V., Smirnov A. F. Microchromosomes of Aves are genetically changeable // Abstracts 2nd International Conference Molecular Phylogenetics MolPhy–2, Moscow, Russia, May 18–21, 2010.