Изучение роли протеинкиназы pho85p в регуляции функций митохондрий у дрожжей saccharomyces cerevisiae и pichia pastoris

На правах рукописи

ФИЗИКОВА Анастасия Юрьевна ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ПРОТЕИНКИНАЗЫ PHO85p В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ МИТОХОНДРИЙ У ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE И PICHIA PASTORIS Специальность 03.02.07- генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете, в лаборатории биохимической генетики кафедры генетики и селекции.

Научный консультант: доктор биологических наук Самбук Елена Викторовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Сойдла Тыну Рихович Институт цитологии РАН кандидат биологических наук Сайфитдинова Алсу Фаритовна Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН Ведущее учреждение: Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН

Защита диссертации состоится "11" марта 2010 г. в 14 часов на заседании совета Д 212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт Петербург, Университетская наб. 7/9, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета

Автореферат разослан "_" 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 212.232. кандидат биологических наук Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В основе адаптации микроорганизмов к условиям среды лежат изменения уровня экспрессии генов, которые влияют как на метаболизм, так и на структурную организацию клетки. Химический состав цитоплазмы оказывает существенное влияние на функцию эндосимбионтов.

Митохондрии, в свою очередь, определяют пластичность метаболизма эукариотической клетки и обеспечивают адаптацию к воздействиям физических или химических факторов за счет регуляции синтеза АТФ, накопления активных форм кислорода и апоптоза. Изучение генетических механизмов, регулирующих функционирование митохондрий и стабильность митохондриальной ДНК (мтДНК), является актуальным направлением фундаментальных исследований.

Изучение дрожжей-аскомицетов позволяет исследовать механизмы регуляции функций митохондрий в зависимости от метаболического состояния эукариотической клетки. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris отличаются способом утилизации углерода: S. cerevisiae являются факультативными анаэробами, а метилотрофные дрожжи P. pastoris – облигатными аэробами.

Центральную роль в процессе передачи сигнала об изменениях окружающей среды играет фосфорилирование белков. Циклин-зависимые протеинкиназы (CDK), в том числе Pho85р, выступают важными регуляторами как клеточного цикла, так и транскрипции, обеспечивая прохождение клетки через фазу G1/S, контроль полярности клеток, экспрессию генов метаболизма фосфата и передачу сигналов об изменениях окружающей среды (Carroll a.

O’Shea, 2002).

Для большинства облигатных аэробов необходимым условием выживания является наличие функционально активных митохондрий. У человека делеции, дупликации или точковые мутации мтДНК могут стать причиной наследственных и спорадических заболеваний. В клетках дрожжей S. cerevisiae структура митохондриальных нуклеоидов подвергается ремоделированию с помощью метаболически регулируемых бифункциональных белков (Hsp60p, Kgd2p, Ilv5p). В настоящее время механизмы поддержания стабильности мтДНК, а также клеточные процессы, опосредованные ядерно митохондриальными генетическими взаимодействиями, исследованы недостаточно.

Целью исследования являлось изучение сигнальной системы, обеспечивающей адаптацию митохондрий к изменениям концентрации фосфата у дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris. В ходе работы решали следующие задачи: (1) сравнительная характеристика фенотипов мутантов pho85 дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris;

(2) определение частоты возникновения спонтанных мутаций мтДНК на фоне pho85 и динамики накопления дыхательно некомпетентных (Gly-/[pet-]) клонов у штаммов pho85;

(3) изучение влияния дизрупции гена PHO85 на поляризацию, транспорт митохондрий, а также на стабильность нуклеоидов;

(4) поиск супрессорных мутаций и мультикопийных супрессоров дыхательной некомпетентности, возникающей на фоне мутаций pho85.

Научная новизна исследования. Впервые продемонстрирована роль компонентов PHO-регулона в контроле стабильности мтДНК дрожжей S.

cerevisiae. Показано, что дыхательная некомпетентность, возникающая на фоне дизрупции гена PHO85, обусловлена нарушением распределения нуклеоидов между материнской и дочерней клетками, и селективным преимуществом клеток [rho0] на среде с глюкозой и высокой концентрацией фосфата.

Выявлено, что дизрупция гена PHO85 приводит к нарушению структуры цитоскелета в клетках дрожжей S. cerevisiae, вызывая качественные и количественные изменения в составе фракции термостабильных белков цитоскелета. Показано, что у дрожжей S. cerevisiae дополнительные мутации в генах PHO4, PHO81, PHO84 и PHO87, возникающие на фоне дизрупции pho85, нормализуют транспорт фосфата в клетку и восстанавливают дыхательную компетентность. Отсутствие протеинкиназы Pho85р у дрожжей S. cerevisiae приводит к снижению рН матрикса митохондрий, что свидетельствует об изменении мембранного потенциала митохондрий. Выявлено, что сверхпродукция белка внутренней мембраны митохондрий Dic1p, обеспечивающего выведение фосфата из матрикса митохондрий, приводит к стабилизации мтДНК у штаммов pho85 дрожжей S. cerevisiae. Показано, что ген ILV5, кодирующий белок компактизации мтДНК, является мультикопийным дыхательной некомпетентности мутантов PHO85. В ходе супрессором выполнения диссертационной работы были получены штаммы Р. pastoris с делецией гена PHO85 и проведена фенотипическая характеристика полученных мутантов. Делеция гена РНО85 у P. pastoris приводит к конститутивному синтезу кислой фосфатазы (КФ), чувствительности к ионам кальция, повышенному уровню гликогена, но, в отличие от S. cerevisiae, не влияет на частоту возникновения термочувствительных мутаций и на стабильность мтДНК.

Практическая ценность. Чувствительность штаммов с делецией pho85 к повышенным концентрациям кальция позволяет использовать ген PHO85 в качестве нового селективного маркера при создании штаммов-продуцентов гетерологичных белков дрожжей Р. pastoris.

Штаммы и плазмиды, полученные в данной работе, используются при выполнении исследовательских работ студентами и аспирантами биолого почвенного факультета.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях «Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting» (Гётебург, Швеция 2003;

Братислава, Словакия 2005;

Торонто, Канада 2008;

Манчестер, Великобритания 2009);

международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, Пущино, 2006);

III и V cъездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004 и 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 – в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Работа изложена на 183 страницах и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы ( наименований). Работа содержит 9 таблиц и 46 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы. Генотипы штаммов дрожжей, использованных в работе, приведены в таблице 1.

Таблица 1. Основные штаммы, использованные в работе Штамм Генотип S. cerevisiae:

МАТа ade2–101 ura3–52 his3–200 leu2–3, 112 lys2–801 trp1– YM gal4–542 gal 1-GRF18 MAT his3–1-11,15 leu2-3,112 pho BWG1-7a MAT ade1–100 his1 leu2 ura MATa his7-2 leu2-3, 112 ura3 bik1::ura3-29RL trp1-1UAG ade2 8C-YUNI 1UAA 1Г-П4405 MAT his7–1 met13-A1 ura3 leu2- P. pastoris:

his GS his4 leu 3-GS Плазмиды. Для получения дизрупции и делеции гена PHO85 у штаммов S.

cerevisiae и P. pastoris использовали плазмиды pDEL85–URA3, pDEL85-LEU2 и pFA3 (Самбук и др., 2003;

Физикова и др., 2009). Для конструирования использовали плазмиды pYGIB (URL:http://www.unipat.pu.ru/Patents/description.php?numberin=1660388), pEGFP C3 (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) и pRS426 (URL:http://www.genome www.stanford.edu/vectordb/vector_descrip). Принцип конструирования плазмиды pMM-EGFP был предложен ранее (Okamoto et al., 1998). Для поиска мультикопийных супрессоров дыхательной некомпетентности на фоне дизрупции pho85 использовали банк на основе плазмиды pGP564 (Yeast Genomic Tiling Collection, Open biosystems).

Методы. В работе использовали традиционные методы генетики дрожжей и стандартные среды (Захаров и др., 1984;

Evans, 1996). Для отбора колоний eryR использовали среду ERY: 3% глицерин, 1% дрожжевой экстракт, 0,5% пептон, 25 мМ натрий-фосфатный буфер (pH 6.5), эритромицин 4 г/ л. Отбор гомоплазмических eryR мутантов и оценку частоты мутаций мтДНК на одно клеточное деление проводили по методикам, предложенным ранее (Foury, 2007). Оценку частот возникновения дыхательно-некомпетентных клонов на фоне pho85 проводили по методике, предложенной ранее (Phadnis et al., 2006).

Выделение ДНК, генетическую трансформацию, гидролиз эндонуклеазами рестрикции, выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей, лигирование и гель-электрофорез проводили в стандартных условиях (Sambrook, 2001;

Остерман, 2002). Для получения последовательности CIT1, кодирующей промотор и сигнальный пептид цитратсинтазы, и последующего конструирования плазмиды pMM-EGFP проводили ПЦР с праймерами к CIT1:5/-acgcgtcgacgttcacattgccttttt-3/ и 5/-gctcgccactatagtagcgccatggcatg-3/. Для конструирования мультикопийной плазмиды pRS426-ILV5 проводили ПЦР с 5/-ccgctcgagcgggagttaactg-3/ 5/ ILV5:

праймерами к гену и cgggatccgcttggttttctggtc-3/. Для подтверждения сохранения дизрупции штаммов [pho85::URA3/ pho85::LEU2] проводили ПЦР с праймерами к гену PHO85: 5/ gccctaggacgtagactcgtaagcccgtagctt-3/, 5/-atgaaatcagagtagaatgctggagatctcg-3/. Для фенотипической характеристики штаммов с дизрупцией гена PHO85 (PhoC) использовали методику качественного определения активности КФ (Самсонова и др., 1975). Качественное определение уровня гликогена проводили по методике, предложенной ранее (Zurita-Martinez a.Cardenas, 2005).

Выделение тропомиозина в составе фракции термостабильных белков проводили по методике, предложенной ранее (Drees et al., 1995). Определение pH матрикса и межмембранного пространства митохондрий проводили по методике предложенной ранее (Saliola et al., 2004). Электрофорез белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях проводили по стандартной методике (Laemmli, 1970;

Остерман, 2002). Визуализацию актина дрожжей родамин-фаллоидином и мтДНК с помощью DAPI проводили по стандартным методикам(Johnson а. Nogueira, 1981;

Massardo et al., 2000).

Цитологические препараты анализировали в условиях, указанных ранее (Самбук и др., 2005). Для подсчета количества актиновых бляшек на клетку использовали стандартные методы вычисления медиан и доверительных интервалов для медиан, достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (U-критерий). Оценку ошибок и разности средних и относительных величин рассчитывали при помощи стандартных методов, с использованием параметрического критерия Стъюдента (Гланц, 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.Фенотипическая характеристика мутантов pho85Pp у дрожжей P. pastoris.

Штамм дрожжей P. pastoris 3-GS115 трансформировали плазмидой pFA3/ PvuII и отбирали трансформанты His-Leu+. У трансформантов определяли активность рКФ. Все трансформанты характеризовались конститутивным синтезом рКФ, что соответствует фенотипическому проявлению мутации гена pho85 S. cerevisiae.

У дрожжей S. cerevisiae на фоне мутаций pho85 наблюдается накопление гликогена, отсутствие роста на средах с высокой концентрацией кальция и средах с пролином в качестве единственного источника азота, а также накопление термочувствительных и дыхательно-некомпетентных клеток (Самбук и др., 2003). При изучении аналогичных фенотипических проявлений у мутантов pho85Pp дрожжей P. pastoris оказалось, что к общим проявлениям мутаций генов-ортологов дрожжей P. pastoris и S. cerevisiae можно отнести конститутивный синтез КФ, накопление гликогена на средах с высокой концентрацией фосфата, чувствительность к повышенной концентрации хлорида кальция в среде, зависимость роста от источника азота в среде. В отличие от сахаромицетов, у дрожжей P. pastoris делеция в гене РНО85 не оказывает выраженного влияния на частоты возникновения дыхательно некомпетентных и термочувствительных мутаций, что, возможно, объясняется особенностями метаболизма двух видов дрожжей (Рис. 1).

Изучение роли Pho85p в 2.

наследовании мтДНК дрожжей S.

Pанее при изучении cerevisiae.

плейотропных эффектов мутаций pho было продемонстрировано неядерное наследование признака [pet-] (Самбук и др., 2003).

Клетки [pet-] возникают на фоне pho85 на среде с глюкозой, когда функции митохондрий репрессированы и могут быть результатом как мутаций в мтДНК, так и нарушения распределения нуклеоидов в матриксе митохондрий, а также митохондрий между материнской и дочерней клетками.

Изучение влияния дизрупции гена PHO85 на частоту мутаций в мтДНК.

(erySGly+Pho+) Штамм 8C-YUNI101 трансформировали фрагментом pho85::LEU2 плазмиды pDEL85-LEU2/ PvuII и отбирали трансформанты PhoCLeu+ (pho85::LEU2) и Pho+Leu+ (PHO85) для контроля. Отобранные трансформанты инкубировали в течение 2 суток на среде с глицерином для селекции дыхательно-компетентных клеток, после чего клетки рассевали на среды с глюкозой для получения индивидуальных колоний. Через 3 дня с чашек смывали по 23-35 колоний каждого штамма и высевали полученные суспензии отдельных колоний на сектора одинаковой площади на чашки с полной средой.

Штаммы инкубировали в течение ночи и печатали на среду ERY. Через 10 дней подсчитывали частоту eryR клонов. Для штамма 8C-YUNI101 частота возникновения eryR на клеточное деление (a) соответствовала (4,4±4,3)*10-6, а для штамма 85-8C-YUNI101(pho85::LEU2) a=(2,8±1,3)*10-6 (t=0,35;

p0,02).

Таким образом, отсутствие киназы Pho85p не влияет на частоту возникновения спонтанных мутаций eryR в гене 21S_RRNA мтДНК.

Оценка частоты и динамики возникновения дыхательно-некомпетентных клонов у штаммов с дизрупцией гена PHO85. Для исключения возможных штаммоспецифических эффектов, в качестве исходных были выбраны штаммы различного происхождения: BWG1-7a, 8C-YUNI101, 1-GRF18. Для дизрупции гена РНО85 использовали плазмиды pDEL85–URA3 и pDEL85–LEU2 (в зависимости от генотипа штамма). Частоту появления клеток [pet-] оценивали в рассевах трансформантов pho85 штаммов 85-BWG1-7a, 85-8C-YUNI101 и 85-1 GRF18 в трех повторностях (Рис. 2). В качестве контроля были выбраны трансформанты Leu+Pho+ (PHO85).

Как видно, отсутствие Pho85р достоверно повышает частоту накопления дыхательно 3 некомпетентных клонов по 50 сравнению с трансформантами Pho+ Leu+/ Pho+ Ura+ и не зависит от 5 происхождения штаммов.

0 Для определения динамики %[pet-] накопления дыхательно Рис. 2. Накопление [pet-] клонов на фоне некомпетентных клеток выбрали дизрупции pho85:

штамм 8С-YUNI101. Трансформанты 1 – BWG-1-7a Leu+Pho+ (PHO85), 2 – РНО85, с дизрупцией гена + C BWG-1-7a Leu Pho (pho85::LEU2), 3 – полученные на 8С-YUNI101, + + 8C-YUNI101 Leu Pho (PHO85), 4 – 8C + C выращивали в среде с глицерином для YUNI101 Leu Pho (pho85::LEU2), 5 – 1 GRF18 Leu+Pho+ (PHO85), 6 – 1-GRF18 селекции дыхательно-компетентных Leu+PhoC (pho85::LEU2) клеток, а затем переносили в полную среду с глюкозой и в ходе культивирования высевали суспензии на среды с глицерином или глюкозой и подсчитывали выросшие колонии (Риc. 3).

OD550 % % % OD 14 OD 12 100 10 80 8 60 40 20 0 0 0 11 14 17 20 23, ч 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30, ч 1 3 1 85-8С-YUNI101 (pho85::LEU2) 8C-YUNI101(PHO85) Рис. 3. Динамика накопления дыхательно-некомпетентных клеток на фоне pho85 у штамма 8C-YUNI101: 1, 3 – Доля дыхательно-некомпетентных клеток в %;

2, 4 – усредненные кривые роста культур: OD550 – оптическая плотность клеточной суспензии при 550 нм;

Как видно, уже на стадии поздней lag-фазы и при переходе к логарифмической фазе роста культуры 85-8С-YUNI101, дыхательно некомпетентные клетки вытесняли в популяции клетки [rho+] и, в среднем, составляли 98,6±1,0 %, в отличие от штамма 8С-YUNI101. Полученные результаты свидетельствуют о высокой скорости накопления [pet-] в ходе митотических делений у штаммов с дизрупцией pho85 и об их селективном преимуществе на среде с глюкозой (Физикова и др., 2009).

Оценка стабильности ДНК митохондрий на фоне дизрупции гена PHO85. У штаммов 8C-YUNI101 и BWG1-7a (PHO85) отбирали спонтанно возникшие клоны eryR. У полученных штаммов eryR 1еr-8C-YUNI101 и 1еr-BWG1-7a получали дизрупцию гена РНО85. Штаммы трансформировали рестрикционной смесью pDEL85/PvuII и отбирали по шесть трансформантов каждого штамма: по три Leu+ PhoС (leu2 pho85::LEU2) и по три трансформанта Leu+ Pho+ (LEU2 PHO85), в качестве контроля, и рассевали на среду YEPD.

Субклоны трансформантов характеризовали по способности роста на среде с эритромицином. Отсутствие роста служит характеристикой потери мтДНК в ходе клеточных делений (Рис. 4).

1er-8C-YUNI Gly- eryS (PHO85) 85-1er-8C YUNI 50 (pho85::LEU2) % 40 1er-BWG1-7a (PHO85) 85-1er-BWG1-7a (pho85::LEU2) Рис. 4. Влияние дизрупции гена PHO85 на потерю признака eryR Как видно, у штаммов с дизрупцией гена РНО85 дыхательно некомпетентные и эритромицин-чувствительные клоны (eryS Gly-) возникают с достоверно бльшей частотой. Следовательно, в отсутствие киназы Pho85р в ходе митотических делений накапливаются либо клоны [rho-], либо [rho0].

Точковые мутации или микроделеции мтДНК обычно не приводят к исчезновению нуклеоидов, тогда как нарушение распределения мтДНК влечёт за собой быстрое накопление в популяции клеток [rho0] (Friddle et al., 2004).

Для визуализации мтДНК клоны PhoC [res-] штаммов 85-1-GRF18, 85-BWG1-7a, 85-YM954 и 85-1Г–П4405, выращивали до середины логарифмической фазы роста на среде с глюкозой в качестве источника углерода и обрабатывали клетки DAPI. Большинство клеток не содержали мтДНК, следовательно, являлись [rho0].

3. Изучение структуры цитоскелета на фоне дизрупции pho85 у дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris Известно, что нарушение структуры цитоскелета может влиять на транспорт митохондрий и нуклеацию митохондриальных нуклеоидов. Для изучения структуры цитоскелета на фоне pho85 клетки штаммов с дизрупцией PHO85 обрабатывали актин-специфичным красителем родамин-фаллоидином (Rh-Ph) и для визуализации мтДНК ДНК-специфичным красителем DAPI (Рис.

5).

Оказалось, что помимо нарушения морфологии клеток и распределения мтДНК, у клеток 85-YM954 наблюдается увеличение числа актиновых заплат.

Число актиновых заплат у исходного штамма YM954 (Me=2) достоверно меньше такового 85-YM954 (Me=11, U=562,5;

p0,0001), что свидетельствует о нарушении структуры цитоскелета и, возможно, служит одной из причин неправильного распределения мтДНК или митохондрий.

Известно, что штаммы S. cerevisiae с делецией гена TPM1, кодирующего один из основных белков цитоскелета тропомиозин Tpm1p (23,5 кДа), нежизнеспособны в сочетании с pho85, что свидетельствует об участии продуктов этих генов в одном и том же процессе (Huang et al., 2002). Мутации tpm1 приводят к накоплению клонов [rho0] и дестабилизации актиновых тяжей с образованием множества актиновых заплат (Liu a. Bretscher, 1989). Для изучения возможного влияния а. дизрупции гена PHO85 на уровень тропомиозинов выделяли термостабильную фракцию белков из штаммов YM954 и 85–YM954 в трёх б. повторностях (Drees et al., 1995).

Полученные фракции разделяли электрофоретически в полиакриламидном геле с в. додецилсульфатом натрия. Анализ электрофореграмм проводили с помощью программы ImageJ1.32a (Рис. 6). Как видно, дизрупция pho г. приводит к изменениям структуры и состава белков цитоскелета, что может влиять на распределение нуклеоидов в пределах матрикса и 116 66 45 35 25 16,4 14,4, кДа приводить к дефектам транспорта Рис. 6. Влияние дизрупции PHO85 на митохондрий в дочернюю клетку.

спектр термостабильных белков (денситограмма термостабильных Проведение аналогичных белков): а – суммарная фракция экспериментов на дрожжах P.

термостабильных белков, выделенных из pastoris показало, что протеинкиназа YM954, б – маркёр молекулярной массы Pho85p участвует в регуляции белков (Fermentas: 116;

66,2;

45;

35;

25;

структуры цитоскелета, хотя её 18,4;

14,4 кДа), в – суммарная фракция отсутствие оказывает не такое термостабильных белков, выделенных из 85-УМ954;

г–наложение денситограмм выраженное влияние на УМ954 (темно–серый) на 85-УМ954 качественный и количественный pho85::URA3 (светло–серый) состав белков цитоскелета, как у дрожжей S. cerevisiae.

4. Изучение распределения митохондрий и их морфологии у штаммов с дизрупцией гена РНО Для изучения распределения митохондрий в ходе митотических делений на фоне отсутствия киназы Pho85p была сконструирована плазмида pMM-EGFP, позволяющая метить матрикс митохондрий GFP. Были выбраны по независимых трансформанта штаммов 85-BWG1-7a и 85-8С-YUNI101, с дизрупцией в гене РНО85. Трансформанты культивировали в селективной среде с рафинозой в качестве источника углерода до середины логарифмической фазы роста и оценивали долю клеток с нарушениями транспорта и поляризации органелл. Учитывали отклонения от ретикулярной структуры и, как наиболее контрастное изменение морфологии, появление округлых, деполяризованных органелл, характерных, например, для мутантов по гену mdm12, кодирующему белок мембранного митохора (Berger et al., 1997), (Рис. 7).

На рисунке видно, что штаммы BWG1-7a и 85-BWG1-7a, 8C-YUNI и 85-8C-YUNI101 достоверно не различаются по количеству клеток с круглыми, деполяризованными органеллами и с нарушенным транспортом митохондрий (Физикова и др., 2009).

Таким образом, дизрупция гена PHO85 не влияет на поляризацию и распределение митохондрий между материнской и дочерней клетками, а дыхательная некомпетентность является следствием потери мтДНК.

5. Поиск генов, мутации в которых стабилизируют наследование нуклеоидов на фоне дизрупции PHO Потеря мтДНК – процесс динамичный, и в популяции клеток трансформантов, не растущих на среде с глицерином, встречаются клетки как полностью утратившие мтДНК [rho0], так и клетки, которые не способны к дыханию, но при этом содержат остаточные количества нормальных копий мтДНК (Kaufman et al., 2003).

Для поиска генов, мутации в которых восстанавливают способность к дыханию штаммов pho85::LEU2(URA3), на среде с глюкозой в качестве источника углерода были получены трансформанты с дизрупцией гена РНО tr1 – tr8-85-8С-YUNI101 (8 шт.), tr1 – tr4-85-1-GRF18 (4 шт.), tr1 – tr7-85-YM (7 шт.), в рассеве которых отбирали независимые клоны с ослабленным ростом на среде с глицерином, которые затем облучали УФ. После 14 суток инкубирования при 30°С на среде с глицерином на некоторых клонах Gly появились колонии вторичного роста (tr1-, tr2-, tr3-, tr5-, tr6-85-8С-YUNI101, tr1 – tr4-85-1-GRF18, tr1 – t2-5-YM954), тогда как другие (tr4-, tr7-, tr8-85-8С YUNI101, tr3 – tr7-85-YM954) оказались стабильно неревертирующими.

Стабильные (tr4-, tr7- и tr8-85-8С-YUNI101) и ревертирующие трансформанты (tr1-, tr2-, tr3-85-8С-YUNI101) культивировали в селективной среде с рафинозой в качестве источника углерода и окрашивали DAPI. Цитологический анализ показал, что штаммы tr4-, tr7-, tr8-8C-YUNI101 не содержат мтДНК и являются истинными [rho0], что подтвердилось при скрещивании трансформантов на штамм [rho0] 43-Д553: все диплоиды не росли на среде с глицерином. При этом клетки штаммов tr1-, tr2-, tr3-8C-YUNI101 содержали мтДНК. Для сравнения подсчитывали среднее количество нуклеоидов на клетку у штаммов 8С YUNI101 и 85-8C-YUNI101 (Рис. 8). При этом оказалось, что клетки штамма 85-8С-YUNI101 (pho85::LEU2) в среднем содержали 3,8±0,9 нуклеоидов на клетку, в то время как, у исходного штамма 8С-YUNI101 (PHO85) этот показатель составил 14,7±1,4, что достоверно больше, чем на фоне дизрупции pho85 (t=6,57;

p0,02).

Тот факт, что дополнительные мутации, возникшие на фоне pho85::LEU (URA3), восстановили рост на среде с глицерином, свидетельствует о постепенном снижении количества мтДНК в дочерних клетках на фоне дизрупции гена РНО85, что не обеспечивает полноценный рост штаммов на среде с глицерином (Физикова и др., 2009).

Полученные ревертанты были охарактеризованы в отношении активности рКФ на средах с высокой и низкой концентрацией фосфата (Фн), (табл. 2). Для установления доминантности или рецессивности возникающих мутаций, ревертанты Gly+ скрещивали со штаммами 1-GRF18 и 8C-YUNI101. Оказалось, что большая часть ревертантов возникла за счет рецессивных мутаций, что позволило провести тест на аллелизм с мутантами pho4, pho80, pho81, pho84, pho87, используя тестерные штаммы (табл. 2).

Таким образом, восстановление роста клеток pho85 на среде с глицерином, и стабилизация мтДНК происходит за счет мутаций в генах, кодирующих пермеазы фосфата (PHO84, PHO87), и в генах, регулирующих их транскрипцию (PHO81, PHO4), а также в не идентифицированных генах, которые могут оказывать влияние на экспрессию генов регулона PHO (Физикова и др., 2009). Таким образом, стабильность наследования мтДНК зависит от концентрации фосфата в цитоплазме.

Таблица Характеристика ревертантов Gly+ Активность кф Штаммы Количество Дом-ть или Аллельность* [res ] ревертантов 30мг/л 1г/л Фн рец-ть Фн pho84 pho 9 + + рец pho 1 - - рец pho 1 - - рец 85-8C-YUNI pho 2 + + рец (tr1-tr3, tr5-tr6) 1 + + дом ?

PHO 1 + - pho85 ?

2 + - pho 85-1-GRF18 26 - - рец (tr1-tr4) ?

15 - - рец pho 85-YM954 2 - - рец (tr1-tr2) 1 + + дом ?

pho84 pho 23 + + рец pho 1 + + рец *Сохранение конструкции pho85::LEU2/ pho85::URA3 подтверждали ПЦР 6. Поиск мультикопийных супрессоров дыхательной некомпетентности, возникающей на фоне дизрупции PHO85.

Используя литературные данные (URL:http://www.yeastgenome.org), мы провели анализ уровня экспрессии генов, кодирующих структурные и регуляторные компоненты нуклеоидов, в зависимости от мутаций генов регулона PHO, и белок-белковых взаимодействий с протеинкиназой Pho85p и её циклинами. В результате, в качестве возможных кандидатов на роль мультикопийных супрессоров фенотипа [res-] штаммов pho85 мы выбрали гены ABF2, BCY1, DIC1, EGD1, ILV5, MHR1, MSH1, PIF1, VMA4 и отобрали соответствующие плазмиды из банка «Yeast Genomic Tiling Collection». Штаммы 85-8С-YUNI Ura+PhoCGly- (pho85::URA3) трансформировали плазмидами из банка и анализировали фенотипы полученных трансформантов Ura+Leu+PhoC.

Оказалось, что дыхательную компетентность восстанавливали плазмиды №№ 741, 1133, 1050, 1101, 678 и 1050. Для идентификации генов, выполняющих роль мультикопийных супрессоров, в банке генов были подобраны плазмиды, которые имели перекрывающиеся с ранее проанализированными плазмидами участки хромосом. Мы получили трансформанты штаммов 85-8С-YUNI Ura+PhoCGly- (pho85::URA3) и проанализировали их фенотип. Супрессорный эффект был выявлен для плазмид №1101, №678, №1050 и №1051. Так как нуклеотидные последовательности плазмид № 1101 и №1102, №678 и №679, № 1050 и №1051 частично перекрываются, это существенно облегчило анализ полученных результатов. Так, удалось выявить супрессорный эффект генов:

1) ORC1 и ORC6, кодирующих субъединицы комплекса ORC, участвующего в регуляции экспрессии генов, содержащих E-box (Takayama et al., 2000).

Увеличение копийности ORC1 приводит не только к блоку экспрессии гена PHO5, но и генов пермеаз фосфата PHO84, PHO87, что нормализует концентрацию фосфата в цитоплазме и приводит к восстановлению дыхательной компетентности штаммов pho85::URA3.

DIC1, кодирующего интегральный белок внутренней мембраны 2) митохондрий, который осуществляет антипорт дикарбоксилат-анионов цитоплазмы и фосфатов митохондрий (Kakhniashvili et al., 1997). Повышение концентрации Dic1p во внутренней мембране митохондрий приводит к выведению из матрикса органелл избытка Фн и стабилизирует мтДНК. Мы проводили измерение рН митохондрий в условиях избытка и недостатка Фн в среде (Boyle et al., 2000;

Orij et al., 2009) и показали, что отсутствие Pho85p приводит к уменьшению рН матрикса митохондрий на средах с высоким содержанием фосфата, что приводит к дестабилизации мтДНК. Таким образом, стабильность мтДНК может быть обеспечена восстановлением нормальной концентрации фосфата, как в цитоплазме, так и в матриксе митохондрий.

3) ILV5, кодирующего белок компактизации мтДНК. Для уточнения полученных результатов была сконструирована мультикопийная плазмида pRS426-ILV5, содержащая кодирующую и регуляторную области гена ILV5.

Штаммы Gly-PhoCLeu+ 85-8С-YUNI101 трансформировали плазмидой pRS426 ILV5, при этом все полученные трансформанты оказались Gly+ (Рис. 9).

Таким образом, накопление клеток [rho0] обусловлено потерей нуклеоидов на среде с глюкозой и высокой концентрацией фосфата, а также селективным преимуществом в этих условиях дыхательно-некомпетентных клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате проделанной работы удалось выявить несколько возможных механизмов влияния протеинкиназы Pho85p на стабильность мтДНК.

В отсутствие циклин-зависимой протеинкиназы Pho85p наблюдается активация транскрипции генов PHO-регулона комплексом Pho2p-Pho4p. В результате этого в клетке увеличивается синтез пермеаз фосфата, что ведёт к неконтролируемому росту концентрации Фн в цитоплазме. Если не происходит восстановления нормального транспорта Фн в клетку за счет мутаций в генах пермеаз или их регуляторах, то Фн транспортируется в митохондриальный матрикс, что приводит к снижению pH органелл и к изменению мембранного потенциала митохондрий. Изменение мембранного потенциала, в свою очередь, может служить причиной дестабилизации мтДНК (Jazwinski, 2004).

Протеинкиназа Pho85p также участвует в контроле экспрессии ILV5 и координации компактизации мтДНК в соответствии с изменениями условий окружающей среды.

Таким образом, в ходе эволюции эукариотической клетки сформировались регуляторные сети, управляющие функциями митохондрий не только в ответ на смену доступного источника углерода и азота, но и в ответ на изменение концентрации неорганического фосфата.

ВЫВОДЫ 1. Делеция гена РНО85 у P. pastoris приводит к конститутивному синтезу КФ, чувствительности к повышенным концентрациям ионов кальция, накоплению гликогена, но, в отличие от S. cerevisiae, не влияет на частоту возникновения термочувствительных мутаций и на стабильность мтДНК.

2. Дизрупция гена PHO85 приводит к нарушению структуры цитоскелета и у дрожжей S. cerevisiae, и у дрожжей P. pastoris, вызывая качественные и количественные изменения в составе белков цитоскелета.

3. Мутации в гене РНО85 у дрожжей S. cerevisiae не влияют на частоту возникновения спонтанных мутаций мтДНК, на транспорт и поляризацию митохондрий, но приводят к накоплению клеток [rho0] на среде с глюкозой и фосфатом из-за нарушения распределения нуклеоидов между материнской и дочерней клетками.

4. Мутации в генах PHO4, PHO81, PHO84 и PHO87, возникающие на фоне дизрупции pho85, нормализуют транспорт фосфата в клетку и восстанавливают дыхательную компетентность у дрожжей S. cerevisiae.

5. Отсутствие протеинкиназы Pho85р у дрожжей S. cerevisiae приводит к снижению рН митохондрий, что может быть причиной нарушения мембранного потенциала митохондрий.

6. Сверхпродукция белка внутренней мембраны митохондрий Dic1p, отвечающего за выведение фосфата из матрикса митохондрий, приводит к стабилизации мтДНК у штаммов pho85 дрожжей S. cerevisiae.

7. Дыхательная некомпетентность мутантов PHO85 компенсируется сверхэкспрессией гена ILV5, кодирующего белок компактизации мтДНК.

8. Впервые выявлены механизмы регуляции функционального состояния митохондрий в зависимости от метаболизма фосфата у дрожжей S.

cerevisiae.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1) Cамбук Е. В., Попова Ю. Г., Физикова А. Ю., Падкина М. В.

Генетический анализ плейотропных эффектов мутаций pho85 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae// Генетика. 2003. Т. 39. № 8. С. 1039–1045.

2) Самбук Е. В., Физикова А. Ю., Захарова К. В. и др. Отсутствие циклинзависимой фосфопротеинкиназы Pho85 приводит к нарушению распределения митохондриальных нуклеоидов у дрожжей S. cerevisiae// Цитология. 2005. Т. 47. № 10. С. 917–924.

3) Физикова А. Ю., Падкина М. В., Самбук Е. В. Отсутствие циклин зависимой протеинкиназы Pho85 влияет на стабильность митохондриальной ДНК у дрожжей Saccharomyces cerevisiae// Генетика. 2009. Т. 45. №9. С. 745– 752.

4) Физикова А. Ю., Падкина М. В., Самбук Е. В. Фенотипические проявления мутации pho85 у дрожжей Pichia pastoris// Вестник СПбГУ. 2009. Т.

4. С. 140–149.

5) Popova Y., Fizikova A., Sambuk E. Study of the temperature sensitivity and respiratory deficiency of pho85 mutants of Saccharomyces cerevisiae// XXIth YGM Conference. 2003. T. 10. P. 38.

6) Физикова А. Ю., Смирнов А. М., Захарова К. В., Самбук Е. В. Циклин зависимая фосфопротеинкиназа Pho85p участвует в поддержании митохондриального генома и морфологии митохондрий у дрожжей Saccharomyces cerevisiae// Конференция ВОГиС III, Москва. 2004. С. 357.

7) Fizikova A., Sambuk E., Zakharova K. The role of cdk pho85 in mitochondrial distribution in yeast S. cerevisiae// XXIIth YGM Conference. 2005. T.

10. P. 10.

8) Физикова А. Ю., Самбук Е. В. Изучение роли циклинзависимой протеинкиназы (CDK) РНО85 в наследовании митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae// Тезисы межд. школы-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология". 2006. C. 172.

9) Fizikova A. Y., Sambuk E. V. The role of CDK Pho85 in respiration maintenance of the yeast Saccharomyces cerevisiae// XXVth YGM Conference.

2008. P. 91.

10) Fizikova A. Y., Padkina M. V., Sambuk E. V. ILV5 is a new suppressor of mitochondrial DNA instability on pho85 background in yeast Saccharomyces cerevisiae//24th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology.

2009. P. 195.

11) Физикова А. Ю., Падкина М. В., Самбук Е. В. Фенотипические проявления мутации PHO85 у дрожжей Pichia pastoris// Конференция ВОГиС V, Москва, 2009, С. 54.

Подписано в печать «28» января 2010 года. Формат 60x84 1/16.

Усл. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 1748.

Отпечатано в Цифровом Копировальном Центре «Средний, 28» 199004, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., 28. Тел.: (812) 323-40-