Сравнительный молекулярно-генетический анализ генов wx у различных видов трибы пшеницевых
На правах рукописи
Климушина Марина Вячеславовна СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ WX У РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ТРИБЫ ПШЕНИЦЕВЫХ Специальность 03.02.07 – генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена в научно-образовательном Центре молекулярной биотехнологии ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева»
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Карлов Геннадий Ильич
Официальные оппоненты:
Хавкин Эмиль Ефимович, доктор биологических наук, профессор, Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук, заведующий лабораторией ДНК маркеров растений Драгович Александра Юрьевна, доктор биологических наук, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, лаборатория генетики растений, главный научный сотрудник
Ведущая организация: Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
Защита состоится 23 октября 2013 г. в 14-30 часов на заседании диссертационного совета Д220.043.10 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15, тел/факс (499) 976-24-92, e-mail:
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
Автореферат разослан 23 сентября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Л.С. Большакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Мягкая пшеница (Triricum aestivum L.) – является ведущей зерновой культурой во многих странах мира, включая Россию.
Основным компонентом зерновки пшеницы, определяющим большинство ее технологических свойств, является крахмал. Функциональные и физико химические свойства крахмала, прежде всего, зависят от соотношения содержания амилозы и амилопектина. Пониженное или повышенное содержание амилозы в крахмале обусловлено различными аллельными вариантами генов Wx, кодирующих фермент Granule Bound Starch Synthase I (GBSSI). Данные гены локализованы у мягкой пшеницы на хромосомах: 7AS (Wx-A1), 4AL (Wx-B1) и 7DS (Wx-D1) (Chao et al., 1989). У мягкой пшеницы с одним или двумя нефункциональными генами Wx (так называемые нуль-аллели) синтезируется крахмал с пониженным содержанием амилозы (Yasui et al., 1996;
Vrinten et al., 1999;
Takeshi, 2006). Функциональные аллельные варианты генов Wx (Takeshi, 2006;
Vanzetti et al., 2009;
Guzmn et al., 2011) у мягкой пшеницы, как правило, не столь значительно, как нуль-аллели, изменяют содержание амилозы. В целом разнообразие аллельных вариантов генов Wx, выявленных у пшеницы по всем трем генам, довольно низкое (Yamamori et al., 1994;
Vanzetti et al., 2009). В связи с этим сейчас идет активный поиск и изучение различных генов Wx у дикорастущих сородичей пшеницы с целью их последующей интрогрессии в её геном (Monari et al.,2005;
Yamamori et al., 2009;
Huang X.Q et al., 2010;
Guzmn et al., 2012;
Alvarez and Guzmn, 2013). Кроме того, все более широкое распространение получает привлечение различных генов дикорастущих сородичей пшеницы для ее улучшения (Friebe et al., 1996;
Давоян, 2006;
Ji et al, 2012). Также немаловажное значение имеет изучение генов Wx у дикорастущих видов для понимания эволюции данных хозяйственно-ценных генов и видов в целом (Mason-Gamer et al., 1998;
Shapter et al., 2005;
Mahelka et al., 2011).
Поэтому актуальным вопросом является получение нуклеотидных последовательностей генов дикорастущих злаков для их последующей молекулярно-генетической характеристики. Наконец, изучение генов Wx мягкой пшеницы и возможность идентификации их аллельных вариантов является важным этапом в селекции сортов с варьируемым, в зависимости от целей производства, содержанием амилозы без химической модификации крахмала.
Цель и задачи исследования. Цель работы – выполнить молекулярно генетический анализ генов Wx у различных видов трибы пшеницевых.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Оценить применимость существующих в настоящее время ДНК-маркеров на гены Wx пшеницы для скрининга коллекционного материала и селекции с помощью молекулярных маркеров (MAS-селекции).
2. Изучить аллельное разнообразие генов Wx у мягкой и твердой пшеницы отечественной селекции.
3. Дать молекулярную характеристику аллеля Wx-B1e мягкой пшеницы.
4. Исследовать аллельное состояния генов среди Wx аллоцитоплазматических гибридов пшеницы и оценить влияние типа цитоплазмы на формирование крахмальных гранул.
5. Клонировать и секвенировать нуклеотидные последовательности генов Wx у видов Thinopyrum intermedium, Th. ponticum, Th. bessarabicum Pseudoroegneria stipifolia и Dasypyrum villosum.
6. Создать молекулярный маркер на гены Wx пырейного происхождения.
7. Изучить коллекции пшенично-пырейных гибридов на аллельное состояние генов Wx пырейного происхождения.
Научная новизна. Впервые проведена молекулярно-генетическая характеристика коллекций мягкой и твердой пшеницы сортов отечественной селекции по генам, отвечающим за синтез амилозы. На основе полученных результатов создан набор линий краснозерной мягкой пшеницы с различным аллельным составом генов Wx, который может быть использован как в изучении проявления данных генов, так и в качестве доноров в практической селекции. Выявлены недостатки ряда молекулярных маркеров, используемых для оценки мировых коллекций пшеницы. Секвенирован и охарактеризован аллель Wx-B1e мягкой пшеницы. Получены и охарактеризованы нуклеотидные последовательности генов Wx у видов Th. intermedium, Th. ponticum, Th.
bessarabicum Ps. stipifolia и D. villosum.
Практическая значимость работы. Результаты работы имеют важное теоретическое и практическое значение и могут быть использованы в селекции пшеницы. Разработаны рекомендации по использованию молекулярных маркеров для скрининга аллельного состояния генов Wx коллекций и MAS селекции. На основе полученных нуклеотидных последовательностей дикорастущих видов разработан молекулярный маркер Wx-TH1/HaeIII, позволяющий отличать гены Wx пырейного происхождения от генов Wx мягкой пшеницы. С помощью разработанного молекулярного маркера оценена коллекция пшенично-пырейных гибридов, которые могут служить селекционным мостиком для создания интрогрессивных форм пшеницы, несущих гены Wx пырея.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных Ломоносов-2011, секция «Биология» (Москва, 2011);
XI Молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии - 2011» (Москва, 2011);
X съезде Белорусского общества генетиков и селекционеров «Генетика и Биотехнология XXI века» (Минск, 2012);
XII Международном симпозиуме по генетике пшеницы (IWGS) (Йокогама, Япония, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 5 из перечня рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 150 страницах машинописного текста и включают 51 рисунок, 25 таблиц.
Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список цитируемой литературы включает 170 наименований, из них 155 иностранных.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Материалом исследования служили краснозерных сортов мягкой пшеницы и 22 сорта твердой пшеницы селекции КНИИСХ имени П.П. Лукьяненко, предоставленные академиком РАСХН Л.А.
Беспаловой;
30 сортов и линий мягкой и твердой пшеницы, предоставленные проф. В.П. Нецветаевым (ГНУ БелНИИСХ);
образцов аллоцитоплазматических гибридов пшеницы, созданных проф. О.Г. Семеновым (РУДН);
5 дикорастущих видов злаковых (Th. intermedium (PI 383573), Th.
ponticum (1158А/19), Th. bessarabicum (W6 21890), D. villosum (W6 21717) и Ps.
stipifolia (W6 21759));
100 образцов пшенично-пырейных гибридов, предоставлены В.П. Упелниеком, В.И. Беловым и Л.И. Глуховой (Отдел отдаленной гибридизации ГБС РАН им. Н.В. Цицина);
набор дополненных линий по хромосомам Th. elongatum созданных проф. J. Dvorak (Университет Калифорнии, Дэвис, США).
Выделение ДНК. ДНК выделяли согласно методике Bernatsky & Tanksley (1986) с некоторыми модификациями.
ПЦР-анализ. Оценку коллекций на аллельное состояние генов Wx осуществляли с помощью следующих праймеров: AFC/AR2 (Nakamura et al., 2002), Wx-A1b-F-MH/Wx-A1b-R-MH (Vanzetti et al., 2009), Sun1F/Sun1R (Sharoflou and Sharp, 1999), BDFL/BRD (Nakamura et al., 2002), 4F/4R (McLauchlan et al., 2001), BDFL/BRC1/BRC2/BFC (Saito et al., 2009), Wx B1L/Wx-B1R (Vanzetti et al., 2009), Wx-D1-2F/Wx-D1-2R (Shariflou et al., 2001), Wx-D1-1F/Wx-D1-1R (Vrinten et al., 1999), BDFL/DRSL (Nakamura et al., 2002).
Клонирование нуклеотидных последовательностей. Лигирование амплифицированной ДНК осуществлялось с помощью системы pGEM®-T Easy Vector. Трансформацию осуществляли в штамм E.coli DH10B методом электропорации или теплового шока. Отбор клонов проводили с помощью бело-голубой селекции и праймеров M13.
Секвенирование. Для секвенирования нуклеотидных последовательностей аллеля Wx-B1e и генов Wx дикорастущих сородичей пшеницы использовали праймеры WxVT1F, WxVTR, WxBAF, WxBAR, WxF3 и WxVT1R (Monari et al., 2005). На дикорастущих видах использовали так же праймеры, разработанные Huang и Brul-Babel (2010) и Guzmn и Alvarez (2012). Секвенирование ПЦР-продуктов осуществляли на секвенаторе ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) с помощью набора Big Dye v 3.1 в соответствии с рекомендациями производителя.
Анализ нуклеотидных последовательностей. Анализ секвенированных последовательностей проводили с помощью программного обеспечения GenDoc (Ver. 2.6.002, сopyright © by K. Nicholas);
Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 5.2.;
Lasergene ver.7.1, Comprehensive Software for DNA & Protein Sequence Analysis, «ClustalW2 Phylogeny» сервиса.
Поиск гомологичных последовательностей и их анализ проводили в открытой базе генетических данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 Оценка коллекции сортов мягкой и твердой пшеницы на аллельное состояние генов Wx В связи с потребностью пищевой и непищевой промышленности в сортах, имеющих определенные технологические показатели крахмала, зависящие напрямую от содержания амилозы, был изучен полиморфизм по генам, контролирующим синтез амилозы, у сортов мягкой и твердой пшеницы на примере коллекций КНИИСХ им. П.П. Лукьяненко и ГНУ БелНИИСХ.
1.1 Применимость ДНК-маркеров для идентификации аллелей генов Wx для скрининга коллекций и MAS-селекции Тестирование ряда маркеров показало, что не все из них одинаково эффективны для задач селекции и использования в первичном скрининге коллекций.
1.1.1 Ген Wx-A1.Vanzetti с соавт. (2009), Nakamura с соавт. (2002) и Sharoflou с соавт. (1999) были разработаны молекулярные маркеры, позволяющие отличать нуль-аллель гена Wx-A1 от нормального (дикого) типа аллеля. Апробация и оптимизация условий ПЦР показала, что для использования в MAS-селекции и скрининге коллекции наиболее эффективным является молекулярный маркер, предложенный Nakamura с соавт. (2002). А для верификации полученных результатов при общем скрининге коллекции нами рекомендуется дополнительно использовать маркер, разработанный Vanzetti с соавт. (2009).
1.1.2 Ген Wx-B1. По гену Wx-B1 было проанализировано четыре различных молекулярных маркера (рис. 1).
Рисунок 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами: а – Wx-B1L и Wx-B1R (Vanzetti et al., 2009);
б – BDFL и BRC1 (Saito et al., 2009);
в – BDFL и BRD (Nakamura et al., 2002);
г – 4F и 4R (McLauchlan et al., 2001).1 – образец Hokkai 252 (Wx-A1a;
Wx-B1b;
Wx D1a);
2 – сорт Безостая 1 (Wx-A1a;
WxB1a;
Wx-D1a);
3 – сорт Коротышка (Wx-A1a;
Wx-B1e;
Wx-D1a). Стрелкой отмечен бэнд, амплифицирующийся у дикого типа аллеля Wx-B1а Vanzetti с соавт. (2009) было показано, что с помощью молекулярного маркера, разработанного McLauchlan с соавт. (2001), невозможно различить аллель Wx-B1e и нуль-аллель (Wx-B1b). После апробации и тестирования всех приведенных выше маркеров нами на сорте мягкой пшеницы Коротышка продемонстрировано, что это относится и к другому широко применяемому молекулярному маркеру, разработанному Nakamura с соавт. (2002). В обоих случаях у образцов, несущих Wx-B1е или Wx-B1b, наблюдается схожая амплификация, не позволяющая различить данные аллели между собой. При этом данные молекулярные маркеры наиболее часто использовались для оценки мировых коллекций мягкой пшеницы, что могло привести к неточным данным по распространению нуль-аллеля гена Wx-B1. Например, среди сортов индийской селекции с помощью маркера Nakamura et al. (2002) было показано, что 60% сортов являются носителями этого аллеля (Ram and Sharma, 2013).
Маркер, разработанный Saito c соавт. (2009) позволяет идентифицировать нуль-аллель Wx-B1b, но отличить аллели Wx-B1e и Wx-B1а в агарозном геле с его помощью затруднительно (рис. 1, б).
При использовании маркера, разработанного Vanzetti с соавт. (2009), в случае нуль-аллеля амплификация отсутствует, что может приводить к ошибкам при некачественном выделении ДНК и ингибировании ПЦР в отдельных образцах.
Таким образом, не удалось выявить один наиболее подходящий маркер, как для MAS-селекции, так и для оценки аллельного состояния (скрининга) генов Wx среди коллекции мягкой пшеницы. Нами была предложена схема использования нескольких комбинаций маркеров для различных случаев. В качестве маркера, используемого при первичном скрининге коллекции на аллельное состояние генов Wx, мы рекомендуем молекулярные маркеры McLauchlan с соавт. (2001) или Nakamura с соавт. (2002). Далее, на образцах, имеющих амплификацию, отличную от амплификации на аллелях дикого типа (Wx-B1a), следует использовать молекулярные маркеры, разработанные Saito с соавт. (2009) и Vanzetti с соавт. (2009). При проведении MAS-селекции на поколениях, полученных от образцов с уже идентифицированными аллеями генов Wx, в случае селекции на нуль-аллель Wx-B1b мы рекомендуем использовать систему кодоминатных маркеров, разработанную Saito с соавт.
(2009). Данная система маркеров, в отличие от всех остальных, позволяет произвести четкую идентификацию гетерозиготных растений при наличии в их геноме Wx-B1a и Wx-B1b аллелей.
1.1.3 Ген Wx-D1. Shariflou с соавт. (2001), Vrinten с соавт. (1999) и Nakamura с соавт. (2002) разработали молекулярные маркеры, выявляющие нуль-аллель по гену Wx-D1. После апробации данных маркеров на нашем материале было обнаружено, что только молекулярный маркер, разработанный Shariflou с соавт. (2001), дает четкую и воспроизводимую амплификацию на всех образцах. Во второй и третьей системах амплификация на Wx-D1а шла нестабильно.
1.2 Распределение аллелей генов Wx в коллекциях мягкой и твердой пшеницы Скрининг коллекций пшеницы КНИИСХ имени П.П. Лукьяненко и ГНУ БелНИИСХ на аллельное состояние гена Wx-A1 проводили с помощью молекулярного маркера, разработанного Nakamura с соавт. (2002). Для верификации полученных результатов на образцах, у которых продукты амплификации отличались от дикого типа, мы использовали молекулярный маркер, модифицированный Vanzetti c соавт. (2009). Выявлено, что из проанализированных сортов мягкой пшеницы только два, Старшина и Сила, имеют нуль-аллель по данному гену. Все остальные сорта мягкой и твердой пшеницы несли аллель дикого типа гена Wx-A1.
С использованием четырех различных систем молекулярных маркеров, выявляющих аллели гена Wx-B1, было установлено, что 3 сорта мягкой пшеницы – Коротышка, Нота и Ласточка – несут в своем геноме аллель Wx-B1e.
Сортов, несущих нуль-аллель в локусе Wx-B1, выявлено не было. Все сорта твердой пшеницы имели аллель только дикого типа.
С помощью молекулярного маркера, разработанного Shariflou с соавт.
(2001), было показано, что все сорта мягкой пшеницы исследуемой коллекции несли аллель Wx-D1а.
Полученные результаты согласуются с работами, проводимыми на европейских коллекциях, также имеющих низкую вариативность по генам, отвечающим за синтез амилозы (Marcoz-Ragot et al., 2000). Например, в сортах украинской селекции нуль-аллелей обнаружено не было (Петрова, 2007), в сортах селекции ТатНИИСХ 92,8 % сортов несли аллели дикого типа (Абдулина с соавт., 2012). В то же время в коллекциях азиатских и австралийских сортов обнаруживалось до двадцати процентов сортов, несущих нуль-аллели по генам Wx-А1 и Wx-B1 (Nakamura et al., 1992;
Yamamori et al., 1994). Относительно высокую частоту встречаемости нуль-аллелей в азиатских коллекциях можно объяснить тем, что пониженное содержание амилозы оказывает выраженное положительное влияние на качество лапши удон, основного традиционного продукта. На основании полученных нами данных совместно с отделом селекции и семеноводства пшеницы и тритикале КНИИСХ им. П.П. Лукьяненко созданы линии со следующими аллельными вариантами:
Wx-A1b/Wx-В1b/Wx-D1b;
Wx-A1b/Wx-В1е/Wx-D1b;
Wx-A1b/Wx-В1b/Wx-D1а;
Wx A1b/Wx-В1e /Wx-D1a. Они могут быть использованы как для изучения проявления генов Wx у мягкой пшеницы в различных условиях и различном генетическом окружении, так и в качестве доноров аллелей генов Wx.
2 Молекулярная характеристика аллеля Wx-B1e мягкой пшеницы С помощью молекулярных маркеров и одномерного электрофореза белков было показано, что сорт мягкой пшеницы Коротышка является носителем аллеля Wx-B1е. Известно, что различные типы аллелей генов Wx по разному экспрессируются и влияют на содержание амилозы, поэтому изучение функционального аллеля Wx-B1е представляет теоретический и практический интерес.
Для секвенирования полноразмерной последовательности аллеля Wx-B1e ген был условно поделен на три части и с помощью трех пар праймеров, разработанных Monari с соавт. (2005), мы амплифицировали, клонировали и секвенировали каждую часть по отдельности. Общая длина секвенированной последовательности Wx-B1e составила 2725 пн, она включает 11 экзонов и интронов. Размер и структура полученной последовательности является типичной и консервативной для других генов Wx пшеницы.
Сравнение полученной последовательности (GenBank KF305522) с последовательностью аллеля Wx-B1a (GenBank AB019623) показало, что размеры экзонов между Wx-B1a и Wx-B1e совпадают за исключением первого экзона (рис. 2).
Рисунок 2. Выравнивание ДНК последовательностей аллелей Wx-B1e –первая строка, Wx-B1a (EU719610.1) – вторая строка, мРНК аллеля Wx-B1 (EU719610.1) – третья строка.
Стрелка указывает на границу между сигнальным пептидом и зрелым белком. Числами обозначены номера экзонов В экзонной части Wx-B1e была выявлена инсерция-делеция по участку, который соответствует нуклеотидам 160-163 Wx-B1a (что соответствует глутамину-54);
показано 43 однонуклеотидных замены, из которых 27 (62,8%) являются транзициями, а 16 (59,3%) – трансверсиями. При этом 12 из них привели к замене одних аминокислот на другие, синонимичные им.
Интронная часть Wx-B1e содержала следующие изменения по сравнению с аллелем Wx-B1а: первый интрон имел четыре однонуклеотидные замены и три инсерции-делеции, второй – семь и две, третий – двадцать и шесть, четвёртый – пятнадцать и восемь, пятый – десять и одну, шестой – три и одну, седьмой – семь и одну соответственно. В целом в интронной области нами было выявлено 85 однонуклеотидных замен и 29 инсерций-делеций.
Основываясь на результатах BLASTN анализа и построенного филогенетического дерева, можно предположить, что аллель Wx-В1е мог быть привнесен в мягкую пшеницу из T. aestivum ssp. spelta или T. turgidum ssp.
durum в результате спонтанной или искусственной гибридизации.
3 Изучение генов Wx аллоцитоплазматических гибридов пшеницы В настоящее время проф. О.Г. Семеновым создана коллекция самофертильных линий аллоцитоплазматической пшеницы T. aestivum L., сочетающих ядерный геном различных сортов яровой и озимой пшеницы с цитоплазмой от Secale cereale, Aegilops ovata, T. timopheevii. Вследствие того, что крахмальные гранулы синтезируются в амилопластах, возможно, что на их формирование оказывают влияние пластидные гены.
Первоначально необходимо было выявить аллельные варианты генов Wx у АЦПГ. Для этого использовали несколько молекулярных маркеров, тестированных нами ранее. Было обнаружено, что 17 образцов несут в своем геноме аллель Wx-A1а – аллель дикого типа. У 11 образцов отсутствовала амплификация фрагмента, свойственного гену Wx-A1. Внутренний полиморфизм по амплификации данного маркера показали 2 образца.
Для детекции аллельных вариантов гена Wx-B1 использовали четыре различных молекулярных маркера (рис. 3).
Рисунок 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами: а – BDFL и BRD;
б – BDFL, BRC1, BRC2, BFC;
в – 4F и 4R;
г – Wx-B1L и Wx-B1R. 1 – образец 14/09;
2 – образец 12/09;
3 – образец 17/08;
4 – T. timopheevii;
5 – образец 12/10с;
6 – сорт Сила (Wx-A1b, Wx B1a, Wx-D1a);
7 – Hokkai 252 (Wx-A1a, Wx-B1b, Wx-D1a);
М – маркер длины фрагментов ДНК. Стрелками отмечены ампликоны генов Wx T. timopheevii Было выявлено, что 5 гибридов имеют нуль-аллели по гену Wx-B1. Нуль аллель по генам Wx встречается редко, а в случае получения аллоцитоплазматических гибридов в ходе насыщающих беккроссов возможны различные интрогрессии в ядерный материал, что может приводить к получению ложноположительных результатов при проведении ПЦР. В связи с этим нами был секвенирован продукт амплификации с праймеров BFC/BRC2 у образца 16/09, показавшего наличие нуль-аллеля по Wx-B1. В результате полученная нами нуклеотидная последовательность полностью совпала с нуклеотидной последовательностью, фланкирующей делецию гена Wx-B (AB426607.1). Таким образом, у пяти образцов АЦПГ присутствует истинный нуль-аллель Wx-B1b.
С помощью праймеров BDFL/BRD и 4F/4R было выявлено, что у линий отсутствует амплификация с гена Wx-A1 мягкой пшеницы и они имеют фрагмент, идентичный по размеру ампликону с T. timopheevii (рис. 3 а, в). Ген Wx-A1 у T. timopheevii (Wx-Ti), так же как и у мягкой пшеницы, локализован в 7А хромосоме. Мы предполагаем, что при получении данных линий произошла интрогрессия гена Wx-Ti в геном мягкой пшеницы. В исследованиях Трубачеевой с соавт. (2008) методом SSR-анализа показано предпочтительное замещение хромосомы 7 на гомеологичные хромосомы ячменя H. marinum subsp. gussoneanum у самофертильных аллоплазматических эуплоидных линий (2n = 40w + 2b). Таким образом, имеется тенденция замещения гомеологичной группы при формировании самофертильных АЦПГ.
В результате проведенного анализа на аллельное состояние гена Wx- D1 в изучаемой коллекции АЦПГ не было выявлено нуль-аллелей.
Так как фракционный состав крахмальных гранул оказывает влияние на технологические свойства зерна, у образцов АЦПГ были проанализированы размеры и площадь гранул на микрофотографиях срезов зерновок, полученных А.С. Беэром на кафедре высших растений МГУ с помощью электронного микроскопа. В общей сложности было проанализировано 13 образцов с тремя типами цитоплазмы. Какой-либо статистически значимой связи между типом цитоплазмы образцов и размером крахмальных гранул выявлено не было.
Таким образом, тип цитоплазмы не оказывает существенного влияния на размер формируемых крахмальных гранул. Также не было обнаружено значимых различий между крахмальными гранулами у образцов с разным типом аллелей.
4 Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов Wx некоторых представителей родов Thinopyrum, Dasypyrum и Pseudoroegneria Как и в случае секвенирования аллеля Wx-B1e, получаемые нами нуклеотидные последовательности дикорастущих видов относились к трем различным частям генов Wx.
4.1 Часть I: экзоны 1-3, интроны 1- Для части I генов Wx были получены следующие нуклеотидные последовательности: Th. bessarabicum – 617 пн;
Th. intermedium – 607 и 618 пн;
Th. ponticum – 618 пн, Ps. stipifolia – 618 и 615 пн. Во всех полученных нами последовательностях не было выявлено стоп-кодонов и сдвига рамки считывания в экзонах. Интроны имели типичные начало и конец (GT/AG).
В целом нуклеотидные последовательности в области экзонов были консервативны и отличались высокой степенью сходства с последовательностями пшеницы. Имеющиеся однонуклеотидные замены, как правило, были синонимичными. Только у одной последовательности, полученной на Ps. stipifolia, была выявлена делеция триплета GGC. Интроны, как и следовало ожидать, были значительно вариативнее экзонов: выявлены как однонуклеотидные замены, так и делеции (от 1 до 7 пн), а так же ряд инсерций относительно генов мягкой пшеницы.
При сравнении потенциальных аминокислотных последовательностей, полученных в нашей работе, с известными последовательностями пшеницы была выявлена вариативность, как в области сигнального пептида, так и в области гликозилтрансферазной группы 5, включающей в себя первые четыре экзона. В области высококонсервативного домена злаковых и предполагаемого активного центра синтеза амилозы замен не было (рис. 4).
Рисунок 4. Выравнивание потенциальных аминокислотных последовательностей, полученных в нашей работе, с аминокислотными последовательностями мягкой пшеницы, экспрессируемых генами Wx. Красными стрелками отмечена область сигнального пептида.
Желтая заливка – высококонсервативная область злаковых (Baldwin, 2001). Красная заливка – предполагаемый активный центр синтеза амилозы (Mason-Gammer et al., 1998;
Denyer et al., 2001) 4.2 Часть II: экзоны 3-6, интроны 3- Для части II генов Wx секвенированы следующие нуклеотидные последовательности: Th. bessarabicum – 949 и 959 пн;
Th. intermedium – 937, и 937 пн;
Th. ponticum – 946, 938 и 942 пн, Ps. stipifolia – 937, 937 и 937 пн, D.
villosum – 973 пн.
У восьми из двенадцати последовательностей была выявлена делеция в пн нуклеотидов в начале пятого экзона, приводящая к сдвигу рамки считывания, а соответственно получению нефункционального белка.
Вследствие этого данные последовательности были отнесены нами к псевдогенам и анализ потенциальных аминокислотных последовательностей не проводился.
4.3 Часть III: экзоны 6-11, интроны 6- Для части III генов Wx были получены следующие нуклеотидные последовательности: Th. bessarabicum – 1152 пн;
Th. intermedium – 1152 пн;
Th.
ponticum – 1160, 1181, 1163, 1167 и 1173 пн, Ps. stipifolia – 1177 и 1153 пн, D.
villosum – 1157 пн.
Во всех последовательностях не было выявлено стоп-кодонов и сдвига рамки считывания в экзонах. Интроны имели типичные начало и конец. По данному участку генов ранее уже были секвенированы частичные последовательности (Mason-Gamer et al., 1998;
Mahelka et al., 2011). В области перекрытия полученные нами последовательности совпали с ранее секвенированными у Th. bessarabicum и D. villosum (с несколькими заменами).
Секвенированная нами последовательность у Th. intermedium была высокогомологична последовательности Th. bessarabicum и таким образом может быть отнесена к субгеному J. В то же время полученные последовательности Ps. stipifolia отличались от секвенированных в других работах.
При выравнивании потенциальных аминокислотных последовательностей были выявлены ряд замен по сравнению с генами пшеницы (рис.5).
Рисунок 5. Выравнивание потенциальных АК последовательностей, полученных в нашей работе, с последовательностями генов мягкой пшеницы. Синяя стрелка – область гликозилтрансферазной группы 1. Желтая заливка – высококонсервативный С-конец (Dry et al, 1992). Зеленая заливка – мотив II (Baldwin, 2001). Красная заливка – мотив III/домен III потенциальный гликозилтрансферазный сайт (Baldwin, 2001;
Denyer, 2001) Следует отметить, что у одной последовательности, полученной из Ps.
stipifolia, и одной из Th. ponticum присутствовали замены и в такой высококонсервативной для всех злаков области, как C-конец гликозилтрансферазной группы 1. Данные замены могут привести либо к синтезу нефункционального фермента, либо к существенному изменению его свойств (Shapter et al., 2005).
5 Филогенетический анализ Филогенетический анализ проводился по каждой части гена отдельно.
В настоящее время для первых трех экзонов получены последовательности лишь у относительно небольшого числа видов.
Филогенетический анализ показал, что анализируемые последовательности формируют четыре клады, при этом 4 последовательности (1Ps.stipifolia, 2Th.
intermedium, Th. ponticum, Th. bessarabicum) кластеризуются вместе, что вполне ожидаемо с учётом малого количества последовательностей, имеющихся в базе данных по данному региону. А субгеномы видов Ps.stipifolia (St) и Th.
bessarabicum (J), либо близки друг к другу, либо являются донорами полиплоидных видов (Th. intermedium (JJsSt) и Th. ponticum (JJJJsJs)).
Последовательность 2Ps.stipifolia образует вместе с Hordeum bogdanii отдельный кластер, самый отдалённый от остальных видов.
Последовательность 1Th. intermedium близка к Elymus scaber и попадает в кластер с последовательностями, принадлежащими видам пшеницы и эгилопса.
Для филогенетического анализа по второй части гена мы использовали участки полноразмерных последовательностей генов Wx, имеющихся в базе данных. Последовательности 3Th. ponticum, 1Th. bessarabicum и 2Th.
bessarabicum попали в одну кладу с T.aestivum Wx-A1 и E. scaber, что позволяет отнести полученную нами последовательность 3Th. ponticum к J субгеному.
Последовательность D. villosum кластеризовалась отдельно, что в целом соответствует модели происхождения субгенома V, который несет данный вид.
Отдельным кластером, как и можно было ожидать, выделились последовательности с делецией в начале пятого экзона, отнесённые нами к псевдогенам (рис. 6).
По третьей части гена (экзоны 6-11, интроны 6-10) в филогенетическом анализе использовали порядка 100 известных последовательностей видов трибы пшеницевых. Последовательность, полученная нами для Th. intermedium была очень близка к последовательностям Th. bessarabicum, и в связи с этим была отнесена нами с субгеному J. Так же близко с ними кластеризовались последовательности, полученные нами для Th. ponticum. При этом последовательности для данного вида делились на две клады, одна из которых была ближе к последовательностям Th. bessarabicum и Secale sereale, а вторая – к последовательностям, полученным из субгенома D пшеницевых.
Последовательность D. villosum попадала в отдельную кладу с частью последовательностей Th. intermedium, полученных в работе, посвященной изучению происхождения субгеномов Th. intermedium (Mahelka et al., 2011).
Особое внимание обращают на себя последовательности, полученные нами на Ps.stipifolia. Одна из них попадает в кластер с другими видами псевдорогнерии, несущими субгеном St, а вторая последовательность попадает в кластер с последовательностями, которые относились к видам S. sereale, Th. ponticum, Th.
bessarabicum и Th. intermedium (1с и 3е), последние авторы интерпретировали, как относящиеся к субгеному J (Mahelka et al., 2011). Подобная картина так же встречается в построенном нами филогенетическом дереве для последовательностей D. villosum (Haynaldia villosum) AY556480.1 и AF079274.1. Два известных для него сиквенса кластеризуются с разными видами, несущими различные субгеномы, а при этом сам вид является диплоидным с субгеномом V.
Рисунок 6. Филогенетическое дерево, построенное методом максимального правдоподобия, для последовательностей экзоны 3-6, интроны 3-5. Квадратом отмечены полученные в данной работе последовательности В целом филогенетический анализ показал, что последовательности гена Wx D. villosum наиболее отдалены от всех остальных полученных последовательностей. Ряд последовательностей, полученных у Ps. stipifolia, кластеризовались с последовательностями Th. bessarabicum (а также Th.
intermedium и Th. ponticum), что может свидетельствовать в пользу возникновения рекомбинантного субгенома Js еще у одного из предковых видов.
6 Разработка молекулярного маркера, позволяющего отличать гены Wx пырейного происхождения от генов Wx мягкой пшеницы Моделирование возможного поведения получаемых у данных видов полипептидов и их потенциального влияния на формирования крахмала и синтез амилозы с помощью только теоретических предпосылок представляется не совсем надежным. Хорошим объектом для предварительного изучения влияния генов дикорастущих сородичей на признаки мягкой пшеницы являются пшенично-пырейные гибриды (ППГ). ППГ сочетают в своем геноме субгеномы мягкой пшеницы и пырея.
На основе полученных нуклеотидных последовательностей, нами были разработаны праймеры, позволяющие отличить гены Wx Th. ponticum и Th.
intermedium от генов Wx мягкой пшеницы – WX-TH1F/WX-TH1R. Праймеры были подобраны таким образом, чтобы амплификация шла только с пырейного генома, а с генома пшеницы отсутствовала. При этом продукты амплификации у различных пыреев можно было отличить (рис. 7).
Рисунок 7. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами WXTH1F и WXTH1R:
1 – ППГ (ЗП26);
2 – ППГ (М169);
3 – Ps. stipifolia;
4 - Th. bessarabicum;
5 – Th. intermedium;
- Th. intermedium;
7 – T. aestivum С помощью набора дополненных линий по хромосомам Th. elongatum (субгеном J) с использованием маркера WX-TH1 была показана локализация гена Wx на седьмой гомеологичной группе.
С помощью данного молекулярного маркера была оценена коллекция из 100 образцов ППГ, которые могут служить селекционным мостиком для создания интрогрессивных форм пшеницы, несущих гены Wx пырея. Было показано наличие генов Wx пырейного происхождения в 73 образцах. Так как на всех образцах, имеющих гены Wx пырейного происхождения амплифицировались продукты близкого размера, незначительно отличающиеся друг от друга, для повышения эффективности выявления ДНК-полиморфизма мы преобразовали наш маркер в СAPS-маркер, используя эндонуклеазу рестрикции HaeIII. При скрининге коллекции пшенично-пырейных гибридов с помощью CAPS-маркера, было обнаружено, что у 40 образцов ППГ образуются два фрагмента (1 тип), у 20 образцов фрагменты отсутствовали (2 тип) – то есть ППГ не несли гены Wx пырейного происхождения, выявляемые с помощью разработанного нами маркера. У 18 образцов наблюдается 3 фрагмента, у образцов ППГ образуются четыре фрагменты (4 тип) и у 2 образцов – три фрагмента (5 тип). При этом 20 образцов были гетерогенными в повторности.
Таким образом, нами был выявлен полиморфизм по типу аллельных вариантов генов Wx пырейного происхождения среди коллекции образцов пшенично пырейных гибридов, что открывает широкие перспективы по оценке влияния генов Wx пырейного происхождения на формирование крахмала методами ассоциативной генетики.
ВЫВОДЫ Проведена валидация ДНК-маркеров для идентификации 1.
различных аллелей генов Wx пшеницы. Показано, что для выявления аллельных вариантов генов Wx-A1, Wx-B1 и Wx-D1 наиболее подходят молекулярные маркеры, разработанные Nakamura с соавт. (2002), Saito с соавт. (2009) и Shariflou с соавт. (2001) соответственно. Маркеры, разработанные Nakamura и McLauchlan, не позволяют отличить аллели Wx-B1е и Wx-B1b (нуль-аллель) друг от друга.
Проведена оценка 129 сортов мягкой и 22 сортов твердой пшеницы 2.
на аллельное состояние генов Wx. Выявлено, что два сорта мягкой пшеницы (Сила, Старшина) имеют нуль-аллель по Wx-A1b и три сорта несут аллель Wx B1e (Коротышка, Ласточка, Нота).
Секвенирована и охарактеризована последовательность аллеля Wx 3.
B1e мягкой пшеницы размером 2725 пн. Наибольшую гомологию данная последовательность показала к видам T. aestivum ssp. spelta, T. turgidum ssp.
durum.
Показано, что у 11 образцов аллоцитоплазматических гибридов 4.
произошло замещение гена Wx-A1 мягкой пшеницы на ген Wx T. timopheevii. У пяти образцов АЦПГ имеются нуль-аллели по гену Wx-B1. Выявлено, что у проанализированных образцов тип цитоплазмы значимо не влияет на размер крахмальных гранул.
Получены нуклеотидные последовательности функциональных 5.
генов Wx для следующих видов: Th. bessarabicum, Th. intermedium, Th. ponticum Ps. stipifolia и D. villosum и последовательности псевдогенов видов Th.
intermedium, Th. ponticum, Ps. stipifolia. Показано, что область сигнального пептида гена Wx у дикорастущих сородичей пшеницы является наиболее вариативной с наибольшим числом несинонимичных замен. В области предполагаемого центра синтеза крахмала не было выявлено ни одной замены.
Филогенетический анализ показал, что последовательности гена Wx 6.
D. villosum наиболее отдалены от всех остальных полученных последовательностей. Ряд последовательностей, полученных у Ps. stipifolia кластеризовались с последовательностями Th. bessarabicum (а также Th.
intermedium и Th. ponticum), что может свидетельствовать в пользу возникновения рекомбинантного субгенома Js у еще одного из предковых видов.
Создан CAPS маркер (Wx-Th1/HaeIII) на гены пырейного 7.
происхождения Wx Thinopyrum, позволяющий идентифицировать эти гены в геномном окружении субгеномов пшеницы и выявлять различные аллельные варианты генов Wx Thinopyrum.
Показан полиморфизм генов Wx Thinopyrum среди образцов 8.
коллекции из 100 пшенично-пырейных гибридов с помощью маркера WX TH1/HaeIII.
Благодарности.
Автор выражает благодарность академику РАСХН, д. с.-х.н., проф.
Беспаловой Л.А., к.б.н. А.В. Васильеву (Краснодарский НИИСХ имени П.П.
Лукьяненко);
проф. Семенову О.Г. (РУДН);
проф. В.П. Нецветаеву (БелНИИСХ РАСХН);
к.б.н. В.П. Упелниеку, к.б.н. В.И.Белову, к.б.н. Л.И. Глуховой (Отдел отдалённой гибридизации учреждения Российской академии наук Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН), проф. J. Raupp и B.Friebe (Cansas State University, USA).
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, Соглашение № 8137 от 23.07.2012.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 1. Климушина, М.В. Молекулярно-генетическая характеристика коллекции мягкой пшеницы по генам, отвечающим за хлебопекарные и технологические качества муки / М.В. Климушина, М.Г. Дивашук, Г.И. Карлов // Известия ТСХА. – 2009. – №3. – С.81-88.
2. Климушина, М.В. Молекулярно-генетическая характеристика коллекции мягкой пшеницы по генам, отвечающим за хлебопекарные качества / М.В. Климушина, М.Г. Дивашук, Г.И. Карлов // Съезд генетиков и селекционеров, посвящённый 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, V Съезд вавиловского общества генетиков и селекционеров.
Москва. – 2009. – Ч. 1. – С. 244.
3. Климушина, М.В. Подбор и тестирование молекулярных маркеров, для их использования в селекции на хлебопекарные качества мягкой пшеницы качества / М.В. Климушина, М.Г. Дивашук, Г.И. Карлов // Молодежь и инновации: Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых. В 2-х ч. / Гл. ред. А.П. Курдеко. – Горки:
Белорусская государственная сельскохозяйственная академия. – 2009. – Ч. 1. – С. 95-97.
4. Об оптимизации систем молекулярного маркирования WAXY-генов пшеницы для целей MAS-селекции / М.В. Климушина, П.Ю. Крупин, М.Г. Дивашук, Г.И. Карлов // Сельскохозяйственная биология. – 2010. – №5. – С. 36-41.
5. Гладких, Н.И. Оценка аллельного состояния генов Wx в коллекции мягкой озимой пшеницы / Н.И. Гладких, М.В. Климушина // Материалы II Международной конференции молодых учёных. Звенигород. – 2011. – С. 31.
6. Климушина, М.В. Молекулярно-генетическое изучение аллеля Wx-B1e у мягкой пшеницы и возможность идентификации с помощью молекулярных маркеров / М.В. Климушина, М.Г. Дивашук, Г.И. Карлов // Материалы XI Молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии - 2011». Москва. – С.24 25.
7. Климушина, М.В. Молекулярно-генетическое изучение аллеля Wx-B1e и возможность его идентификации с помощью молекулярных маркеров / М.В. Климушина // Материалы XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2011, секций «Биология». – Москва. – С. 8. Дивашук, М.Г. Молекулярно-генетическая характеристика аллеля Wx-В1е мягкой пшеницы и применимость ДНК-маркеров для его идентификации / М.Г. Дивашук, М.В. Климушина, Г.И. Карлов // Генетика. – 2011. – Т. 47. – № 12. – С. 1611-1615.
9. Климушина, М.В. Секвенирование и разработка ДНК маркеров генов Wx некоторых представителей родов и Thinopyrum, Dasypyrum Pseudoroegneria / М.В. Климушина // Материалы X съезда Белорусского общества генетиков и селекционеров. Международная научная конференция «Генетика и Биотехнология XXI века». – 2012. –Минск. – С.
71.
10.Распределение аллелей генов Wx в коллекции мягкой пшеницы краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко / М.В. Климушина, Н.И. Гладких, М.Г. Дивашук [и др.] // Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2012. – №1. – С. 187-191.
11.Климушина, М.В. Анализ аллоцитоплазматических гибридов пшеницы на аллельное состояние генов Wx / М.В. Климушина // Материалы XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2012, секций «Биология». – Москва. – С. 76.
12.Климушина, М.В. Секвенирование генов Wx некоторых представителей родов Thinopyrum, Dasypyrum и Pseudoroegneria / М.В. Климушина, М.Г.
Дивашук, Г.И. Карлов // Материалы XII Молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии – 2012». – Москва. С. 39-40.
13.Анализ аллельного состава генов, связанных с хлебопекарными качествами, у аллоцитоплазматических гибридов пшеницы / М.В.
Климушина, М.Г. Дивашук, Т.А.К. Мухаммед [и др.] // Генетика. – 2013. – T. 49. – № 5. – С. 617-625.
14. Molecular characterization and DNA markers development of Thinopyrum, Dasypyrum and Pseudoroegneria waxy genes / G.I. Karlov, M. Klimushina, M. Divashuk [et al.] // Материалы XII Международного симпозиума по генетике пшеницы IWGS (Япония). – Йокогама. – 2013. – C. 96.
15.Дивашук, М.Г. Секвенирование гаплотипов гена Wx пырея среднего (Thinopyrum intermedium) / М.Г. Дивашук, М.В. Климушина, Г.И. Карлов // Вестник Башкирского университета (в печати).
16.Молекулярная характеристика аллеля Wx-B1e у мягкой пшеницы / М.В.
Климушина, М.Г. Дивашук, П.Ю. Крупин, Г.И. Карлов // Известия ТСХА (в печати).