Активные формы кислорода в гибели клеток растений: роль митохондрий, nadph-оксидазы плазматической мембраны и апопластной пероксидазы

На правах рукописи

НЕСОВ Артем Владимирович АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА В ГИБЕЛИ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ:

РОЛЬ МИТОХОНДРИЙ, NADPH-ОКСИДАЗЫ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ И АПОПЛАСТНОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ 03.01.05 – физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

Работа выполнена на кафедре иммунологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Самуилов Виталий Дмитриевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Егор Юрьевич Плотников

Ведущая организация: институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева

Защита состоится 15 февраля 2013 г. в на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, дом 1, строение 12, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, аудитория _.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н. М.А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы В отличие от животных, у растений нет специализированных клеток, поглощающих и обезвреживающих патогенов. Каждая клетка растения обладает способностью к защите от патогена. При распознавании инфекционных возбудителей или их сигнальных соединений включается гиперчувствительный ответ (ГО), сопровождающийся продукцией активных форм кислорода (АФК), гибелью клеток растения и гибелью патогенного микроорганизма, вторгшегося в ткани растения. Это препятствует распространению инфекции на другие клетки. Программируемая клеточная смерть (ПКС) играет важную роль в онтогенезе и поддержании тканевого гомеостаза организма. Являясь составляющей иммунитета, ПКС вовлечена в защиту от инфекционных возбудителей как у животных, так и у растений. Важную роль в ПКС играют биоэнергетические структуры клетки. Для реализации ПКС необходимы АФК: анаэробиоз или антиоксиданты предотвращают ПКС (Самуилов и др., 2002;

Васильев и др., 2009). Митохондрии – поставщики ряда белков, участвующих в ПКС.

Дыхательная цепь митохондрий животных является одним из источников АФК, вызывающих клеточную гибель. АФК у растений образуются в электронтранспортных цепях хлоропластов и митохондрий, NADPH-оксидазой плазматической мембраны клеток и апопластной пероксидазой.

Принятные сокращения: АФК – активные формы кислорода;

ГО – гиперчувствительный ответ;

ДНФ – 2,4-динитрофенол;

ДХФ – 2,4-дихлорфенол;

ПК – пальмитиновая кислота;

ПКС – программируемая клеточная смерть;

ПХФ – пентахлорфенол;

СК – салициловая кислота;

УК – устьичные клетки;

ХКФ – м-хлоркарбонилцианидфенилгидразон;

ЭК – эпидермальные клетки;

– додецилтрифенилфосфоний;

– C12TPP+ DCF 2',7'-дихлорфлуоресцеин;

DCFH – 2',7'-дихлорфлуоресцин;

DPI – дифенилениодоний;

PCB– – фенилдикарбаундекаборан;

SkQ1 – 10-(6-пластохинонил) децилтрифенилфосфоний;

SkQR1 – 10-(пластохинонил)децилродамин TB– – тетрафенилбор;

– этиловый эфир тетраметилродамина;

– TMRE+ TPP+ 19;

тетрафенилфосфоний;

– трансмембранная разность электрических потенциалов.

Перспективно исследование влияния митохондриально-направленных антиоксидантов-катионов, способных накапливаться в клетках и митохондриях в соответствии с мембранным потенциалом, который генерируется на цитоплазматической и митохондриальной мембранах (знак «минус» – на внутренней стороне). Их концентрация в митохондриях может увеличиваться на несколько порядков. Это позволяет их использовать в низких концентрациях, которые не являются токсичными. Первый антиоксидант такого типа – MitoQ (Murphy et al., 2007). Это убихинон, связанный с катионом децилтрифенилфосфония. Он может восстанавливаться компонетами дыхательной цепи и проявлять таким образом многократное действие. В.П.Скулачев предложил заменить убихинон в составе липофильного антиоксиданта на пластохинон, более сильный антиоксидант.

Полученные производные пластохинона получили название SkQ, где Sk – проникающий катион, связанный через декановый или пентановый линкер с Q – пластохиноном (Скулачев, 2007). Митохондриально-направленные липофильные антиоксиданты позволяют исследовать образование АФК в митохондриях и их участие в гибели клеток.

Цель и задачи исследования Цель работы – исследовать роль дыхательной цепи митохондрий, NADPH оксидазы плазматической мембраны и апопластной пероксидазы в образовании АФК в ПКС у растений. Были поставлены и решены следующие задачи:

1. Исследовать защитное действие хинона, ковалентно связанного с проникающими через мембраны митохондриально-направленными катионами (SkQ), на ПКС у растений, вызванную хитозаном и цианидом.

(ТРР+), 2. Выяснить действие катионов тетрафенилфосфония додецилтрифенилфосфония (С12TPP+) и этилового эфира тетраметилродамина (TMRE+), входящих в состав синтетических хинонов SkQ, на ПКС у растений.

Сравнить действие катионов с действием проникающих анионов тетрафенилбора (TB–) и фенилдикарбаундекаборана (PCB–).

3. Используя ингибиторы флавиновых ферментов (хинакрин и дифенилениодоний), исследовать роль NADPH-оксидазы в ПКС.

4. Исследовать действие фенольных соединений, субстратов апопластной пероксидазы, на ПКС у растений. Сопоставить действие фенольных соединений и протонофорных разобщителей окислительного фосфорилирования.

Научная новизна Митохондриально направленный синтетический проникающий хинон SkQ предотвращает программируемую гибель клеток растений индуцированную CN– или хитозаном. Проникающие катионы ТРР+, С12TPP+ и TMRE+, входящие в состав митохондриально-направленных липофильных антиоксидантов SkQ, в фемто- и пикомолярных концентрациях предотвращали хитозан-индуцированное разрушение ядер в эпидермальных клетках эпидермиса из листьев гороха. Выявлено защитное TB– PCB–, действие проникающих анионов и предотвращающих хитозан индуцированное разрушение ядер клеток. Их эфективность ниже, чем у проникающих катионов. Установлено, что ингибиторы флавиновых ферментов хинакрин и дифенилениодоний (DPI) предотвращают хитозан- и CN–-индуцированное разрушение ядер клеток растений. В тех же концентрациях они не оказывали влияние на дыхание и фотосинтетическое выделение О2 нарезками листьев. Эти данные свидетельствовуют о NADPH-оксидазе плазматической мембраны в качестве источника Фенольные соединения, которые являются АФК для ПКС у растений.

регенерируемыми субстратами пероксидазы, оказывают защитный эффект при хитозан-индуцированной клеточной гибели. Сходным действием обладают фенольные разобщители окислительного фосфорилирования.

Практическое значение работы Полученные данные расширяют представления об участии митохондрий, NADPH-оксидазы плазматической мембраны, апопластной пероксидазы и АФК в программируемой гибели клеток растений, действии митохондриально-направленных антиоксидантов. Результаты могут быть использованы в курсах лекций и практикумах по клеточной биологии, цитологии, биоэнергетике, физиологии растений и биохимии. Поскольку ПКС играет важную роль в фитоиммунитете, полученные данные могут в перспективе использоваться для создания новых сортов сельскохозяйственных растений, обладающих повышенной устойчивостью к патогенам.

Апробация работы и публикации Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании кафедр иммунологии и физиологии растений биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова в 2012 г. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), международной конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), международной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2005), международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), международной 14-ой Европейской биоэнергетической конференции (Москва, 2006), международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), IV съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008). По материалам диссертации опубликованы 6 работ в журналах, входящих в список ВАК РФ.

Структура и объем диссертации Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 36 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 259 отечественных и зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объекты исследования Объектом исследования был горох посевной Pisum sativum L. сорта Альфа. В экспериментах использовали пленки эпидермиса листьев 817-суточных проростков гороха. Пленки эпидермиса листьев – монослои из клеток двух типов: фототрофных устьичных (замыкающих клеток устьиц) и хемотрофных эпидермальных (покровных). Этот выбор обусловлен удобством исследований клеток посредством световой микроскопии. Эпидермальные клетки (ЭК) разнообразны по форме. Их основная функция – покровная и защитная.

Пленки эпидермиса отделяли от нижней поверхности листа пинцетом и помещали в полистирольные культуральные планшеты со средой инкубации таким образом, чтобы поверхность пленки, покрытая кутикулой, была обращена вверх. В опытах с оксиметрией 40 мг листьев нарезали квадратами 2–3 мм бритвенным лезвием.

Каждый опыт проводили в двух-трех повторностях. В каждой из повторностей обследовали не менее 300–500 клеток, определяли долю клеток с разрушенными ядрами и клеток, лишенных ядер (Samuilov et al., 2003). На рисунках представлены среднеарифметические данные, полученные на 300–500 клетках с указанием доверительного интервала. Математическая обработка проводилась в программе Microsoft Excel, для оформления и представления данных использовали CorelDraw.

Оксиметрия Фотосинтез и дыхание нарезок листьев гороха регистрировали полярографически по изменению парциального давления О 2 в закрытой ячейке.

Изменение содержания кислорода измеряли в ячейке объемом 1,5 мл Pt-электродом Кларка закрытого типа при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке.

Электрический сигнал от электрода Кларка регистрировали на компьютере через аналого-цифровой преобразователь с помощью программы Record 4. В стандартных условиях при температуре 25 С концентрация О2 в дистиллированной воде – 220 мкМ. Концентрацию кислорода в полярографической ячейке, содержащей среду инкубации, определяли добавлением дитионита, приводящим к полному исчезновению О2 в растворе. Скорость выделения/поглощения О2 выражали в нмолях О2, выделенного/поглощенного в расчете на 1 мг хлорофилла за 1 ч.

Инфильтрация и инкубация с реагентами Пленки эпидермиса помещали в полистирольные 6- или 12-луночные культуральные планшеты и инкубировали в 2 мл бидистиллированной воды (контроль). Для обеспечения быстрого проникновения реагентов в клетки использовали метод их инфильтрации под вакуумом. Эпидермальные пленки инкубировали в растворах в условиях вакуума (58 мм рт. ст.) в течение 1 мин. Время «вакуумирования» подбирали с таким расчетом, чтобы инфильтрация не вызывала повреждений клеток в образце. Дальнейшую инкубацию клеток проводили в стандартных условиях в темноте или на свету в зависимости от задач эксперимента.

Инкубация с KCN составляла 2223 ч.

Поскольку хитозан (Fluka, Швейцария) малорастворим в воде, пленки эпидермиса предварительно обрабатывали взвесью хитозана (100 мкг/мл) в бидистиллированной воде при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в полипропиленовых сосудах в течение 30 мин. Пленки помещали на поверхность взвеси так, чтобы поврежденная сторона контактировала с хитозаном. Инкубация с хитозаном составляла 36 ч.

Световая микроскопия После инкубации образцы обрабатывали в течение 5 мин фиксатором Батталья (хлороформ, 96% этанол, ледяная уксусная кислота, 40%-ный формалин в соотношении 5:5:1:1). Затем образцы отмывали этанолом в течение 10 мин. После инкубации в воде в течение 5 мин, образцы окрашивали ядерным красителем гематоксилином Карацци в течение 40 мин.

Для приготовления красителя Карацци последовательно смешивали 0,5 г гематоксилина, 25 г KAl(SO4)2·12H2O, 100 мл глицерина, 400 мл Н2О, 0,1 г KJ и инкубировали при дневном освещении в открытой колбе в течение 2 недель.

Гематоксилин относится к основным красителям, он окрашивает клеточное ядро.

Окрашенные эпидермальные пленки отмывали водопроводной водой и затем исследовали на световых микроскопах Carl Zeiss Primo Star и Carl Zeiss Laboval (Германия).

Конфокальная микроскопия Конфокальную микроскопию проводили на микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200M (Германия), оборудованном конфокальной сканирующей приставкой Zeiss LSM510Meta. Для регистрации образования АФК пленки эпидермиса обрабатывали 20 мкМ диацетатом 2',7'-дихлорфлуоресцина в течение 10 мин в темноте.

Флуоресценцию образовавшегося 2',7'-дихлорфлуоресцеина возбуждали при 488 нм (аргоновый лазер) и регистрировали при 500–530 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Дыхательная цепь митохондрий как источник АФК для ПКС Митохондрии играют важную роль в ПКС. Их дыхательная цепь является одним из основых источников АФК, принимающих участие в клеточной гибели (Ravagnan et al., 2002;

van Gurp et al., 2003;

Saelens et al., 2004).

Действие SkQ Исследованы хиноны, ковалентно связанные с синтетическими проникающими катионами (Скулачев, 2007). Одно из таких соединений – 10-(6-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний (SkQ1), состоящий из пластохинона и Рис. 1. Действие SkQ1 на хитозан-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток (ЭК) (а) и KCN-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток (УК) (б) в эпидермисе из листьев гороха в темноте. В опыте (а) пленки эпидермиса в 2 мл дистиллированной воды дополняли SkQ1, инкубировали 2 ч в темноте, добавляли хитозан (100 мкг/мл), где отмечено, и инкубировали на магнитной мешалке 30 мин и затем 5 ч без перемешивания в темноте. В опыте (б) пленки эпидермиса в 2 мл дистиллированной воды дополняли SkQ1, проводили вакуум инфильтрацию в течение 1 мин, инкубировали 2 ч в темноте, добавляли 2,5 мМ КCN, вновь проводили вакуум-инфильтрацию в течение 1 мин, инкубировали 22 ч в темноте. Разрушение ядер в контроле (без добавок) в опыте (а) составляло 7,8 ± 1,4%, а в опыте (б) отсутствовало.

Прерывистой линией обозначены концентрации SkQ1, вызывающие полумаксимальный защитный эффект.

проникающего катиона С10ТРР+. Хиноны SkQ накапливаются в митохондриях по градиенту мембранного потенциала (), генерируемому при дыхании или гидролизе АТP. SkQ являются регенерируемыми антиоксидантами многократного действия. На клетках HeLa и фибробластов человека установлено, что они в чрезвычайно низких концентрациях блокируют апоптоз, вызванный Н2О2 (Скулачев, 2007). Хиноны MitoQ и SkQ предотвращают ПКС у растений (Васильев и др., 2011).

Рис. 1 показывает, что SkQ1 в значительной мере предотвращает разрушительное действие хитозана и CN– на ядра эпидермальных и устьичных клеток (ЭК и УК). Аналогично действует 10-(пластохинонил)децилродамин 19 (SkQR1) (Васильев и др., 2011). Какое действие окажут катионные компоненты, входящие в состав синтетических производных хинонов, на ПКС?

Действие проникающих ионов на ПКС Образование АФК в митохондриях зависит от мембранного потенциала, его уменьшение на 10–15% снижает скорость образования АФК в 10 раз (Korshunov et al., 1997). На рис. 2, а, б додецилтрифенилфосфоний (С12ТРР+) в низких концентрациях подавляет образование АФК, регистрируемое по флуоресценции C12TPP+ дихлорфлуоресцеина (DCF). предотвращает хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК (рис. 2, в). Его защитное действие максимально при 10-10–10-9 М и снижается при дальнейшем увеличении концентрации. Разрушение ядер ЭК предотвращалось также катионами тетрафенилфосфония (TPP+) и этилового эфира тетраметилродамина (TMRE+), защита была максимальна соответственно при 10-12–10-11 и 10-11–10-8 М и снималась при 10-6 М (данные не представлены).

Защитное действие проникающих катионов снималось при увеличении их концентрации. Эти соединения, во-первых, могут оказывать детергентное действие в повышенных концентрациях, которое приводит к нарушению липидного бислоя мембран. Во-вторых, может происходить подавление окислительного фосфорилирования в митохондриях, которое приводит к включению программы гибели клеток по пути некроза.

Рис. 2. Действие С12ТРР+ на выход флуоресценции DCF и хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха. В вариантах а, б к кусочкам листовой пластинки добавляли С12ТРР+, инкубировали 30 мин, добавляли 10 мкМ диацетата дихлорфлуоресцина и инкубировали 10 мин. Флуоресценцию DCF регистрировали у края кусочков листовой пластинки. (а) – суммарная картина (максимальная проекция) флуоресценции DCF с 20–30 оптических срезов;

(б) – флуоресценция DCF в митохондриях.

В варианте (в) пленки эпидермиса в 2 мл дистиллированной воды обрабатывали хитозаном (100 мкг/мл) на магнитной мешалке 30 мин, дополняли С12ТРР+ в виде солей с Br– и инкубировали 3 ч без перемешивания в темноте. Состояние клеточных ядер регистрировали в 300–500 клетках в каждом из вариантов опыта. Молярная концентрация катионов, при которой наблюдается полумаксимальный защитный эффект, отмечена прерывистым перпендикуляром к абсциссе.

Испытаны также проникающие синтетические анионы тетрафенилбора (TB–) (PCB–).

и фенилдикарбаундекаборана Эти соединения, не способные к электрофоретическому перемещению в митохондриальный матрикс и, напротив, отторгаемые им, также предотвращали хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК (Васильев и др., 2012). Максимальное действие ТВ– и PCB– регистрировалось при 10-7–10-6 М и выше, то есть в концентрациях, на несколько порядков превышающих концентрации проникающих катионов (рис. 3).

Рис. 3. Действие анионов TB– и PCB– на хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха. TB– и PCB– использовали в виде солей с Na+.

Условия опыта, как на рис. 2 в.

катионы C12TPP+ или SkQ1 в комбинации с анионами Проникающие жирных кислот являются митохондриально-направленными протонофорами (Severin et al., 2010). Протонированная жирная кислота пересекает мембрану, перенося H+ в митохондриальный матрикс (рис. 4, а). Затем жирная кислота диссоциирует на внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий и возникший анион связывается с катионом C12TPP+. Образованная катион-анионная пара диффундирует через мембрану наружу, где ионная пара распадается, катион C12TPP+ возвращается назад по градиенту, генерируемому дыхательной цепью или АТPазой. Пальмитат (2 мкМ) в комбинации с C12TPP+ предотвращает хитозан индуцированное разрушение ядер ЭК (рис. 5, а).

Проникающие анионы могут снизить и pH, транспортируясь через мембраны совместно с NH4+ (рис. 4, б). Защитное действие TB– на хитозан индуцированное разрушение ядер ЭК усиливается NH4Cl (рис. 5, б). В клетках эпидермиса, изолированного из листьев, содержатся эндогенные жирные кислоты и NH4+, вследствие чего защитное действие проникающих катионов и анионов может проявляться и без их добавления.

Рис. 4. Схема действия комбинации пальмитиновой кислоты с С12ТРР+ (а;

по Severin et al., 2010) и комбинации NH4+ с TB– (б).

Концентрации С50 проникающих катионов, при которых хитозан индуцированное разрушение ядер ЭК снижается в 2 раза, находились в фемто- и пикомолярных диапазонах (таблица). Для проникающих анионов ТВ– и PCB– величины С50 были выше. Фенол и флуоресцеин обладали защитным действием от хитозана. Флуресцеин структурно сходен с родаминами, но в отличие от них содержит свободную гидроксильную группу, как у фенолов.

Рис. 5. Действие комбинации пальмитиновой кислоты (ПК) с С12ТРР+ (а) и комбинации NH4Cl с TB– (б) на хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха. Условия опыта, как на рис. 3. Добавки: 2 мкМ ПК, 10–10 М С12ТРР+, 10–5 М NH4Cl, 10–6 М TB–.

Таблица. Концентрации (C50) различных агентов для 50%-ного подавления разрушения ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха, вызванного хитозаном.

Защитный агент С50, М 1,210– SkQ 6,010– ТРР+ 1,410– С12ТРР+ 1,110– TMRE+ 8,110– Флуоресцеин TB– 6,010– PCB– 5,110– 3,110– Фенол NADPH-оксидаза плазматической мембраны как источник 2.

АФК для ПКС NADPH-Оксидаза – ферментный комплекс плазматической мембраны клеток у животных, растений и грибов, катализирующий трансмембранный перенос · электронов от цитозольного NADPH на внеклеточный O2 с образованием О (Bedard et al., 2007). АФК, образованные NADPH-оксидазой растений, играют важную роль в фитоиммунитете (Bedard et al., 2007;

Sumimoto, 2008;

Marino et al, 2012). По-видимому, NADPH-оксидаза является источником АФК для реализации CN–-индуцированной клеточной смерти у гороха (Самуилов и др., 2006;

2008).

Ингибиторы NADPH-оксидазы клеток животных хинакрин и DPI также были эффективны на клетках растений (Van Gestelen et al., 1997).

Рис. 6. Действие дифенилениодония (DPI) на дыхание (а), фотосинтетическое выделение О2 (б) в нарезках листьев, на CN–-индуцированное разрушение ядер УК в темноте (в) и на свету (г) и на хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК в темноте (д) в эпидермисе из листьев гороха. Пленки эпидермиса после инфильтрации с DPI инкубировали 30 мин, затем проводили инфильтрацию с 2,5 мМ KCN и инкубировали 23, 15 и 3,5 ч в опытах (в-д) соответственно.

Действие ингибиторов флавиновых ферментов на ПКС DPI не влиял на дыхание и фотосинтетическое выделение О2 нарезок листьев гороха в концентрации до 100–200 мкМ (рис. 6, а, б), но в концентрации 50-100 мкМ предотвращал CN–-индуцированное разрушение ядер УК и хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК в пленках эпидермиса листьев в темноте и на свету (рис. 6, в-д).

Испытано также действие хинакрина, который, как и DPI, является ингибитором флавиновых ферментов. Хинакрин не влиял на поглощение О2 и фотосинтетическое выделение O2 нарезками листьев в концентрации меньше 0,1 мМ.

В концентрации 10–50 мкМ хинакрин подавлял разрушение ядер, вызванное CN– и хитозаном на свету и в темноте (данные не представлены). Ранее было показано, что хинакрин подавлял и предотвращал Н2О2- и менадион-индуцированное образование DCF из DCFH в пленках эпидермиса из листьев гороха (Самуилов и др., 2006).

3. Апопластная пероксидаза как источник АФК для ПКС Апопластная пероксидаза участвует в реализации гиперчувствительного ответа у растений как поставщик АФК (Grant et al., 2000;

Geiszt, Leto, 2004;

Lee et al., 2006;

Davies et al., 2006). Пероксидазы принимают участие в образовании лигнина и суберина, укрепляющих клеточные стенки и препятствующих продвижению патогена, синтезе фитоалексинов (Almagro et al., 2009). Пероксидаза может катализировать зависимое от H2O2 окисление салициловой кислоты (СК). При этом возникают свободные радикалы СК•, образующие СК+ и О2 (Kawano, 2003).

· Действие субстратов пероксидазы и разобщителей окислительного фосфорилирования на ПКС Мы исследовали влияние фенола и других фенольных соединений на ПКС, вызванную хитозаном. На рис. 7, а, б фенол в низких концентрациях предотвращал образование АФК, регистрируемое по флуоресценции DCF. Фенол, как субстрат пероксидазы, предотвращал действие хитозана на ЭК в концентрациях 10–10–10–6 М.

Защитное действие фенола снижалось при увеличении концентрации и снималась при концентрации 1 мМ. Сходное защитное действие оказывают другие фенольные соединения – дихлорфенол, катехол, салициловая кислота.

Рис. 7. Действие фенола на выход флуоресценции DCF в УК, обработанных хитозаном, и на хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК эпидермиса из листьев гороха. В вариантах (а, б) пленки эпидермиса 30 мин окрашивали 20 мкМ диацетата DCFH, отмывали от излишков красителя в дистиллированной воде, добавляли фенол и 20 мин обрабатывали мг/мл хитозаном на магнитной мешалке. Флуоресценцию DCF возбуждали при 488 нм и регистрировали при 500–530 нм. Фл – флуоресценция DCF, ПС – изображение в проходящем свете. На диаграмме (б) отмечены средние значения максимального выхода флуоресценции DCF в устьичных клетках с доверительным интервалом (a=0,05) (флуоресценцию регистрировали в 45–63 клетках) по данным изображений клеток, как на рисунке (а). Масштабная линейка – 20 мкм. В варианте (в) пленки эпидермиса в 2 мл дистиллированной воды обрабатывали хитозаном (100 мкг/мл) на магнитной мешалке мин, дополняли фенолом и инкубировали 3 ч без перемешивания в темноте. Состояние клеточных ядер регистрировали в 300–500 клетках в каждом из вариантов опыта.

Концентрация фенола, при которой наблюдается полумаксимальный защитный эффект, отмечена прерывистым перпендикуляром к абсциссе.

Рис. 8. Действие ХКФ и ПХФ на выход флуоресценции DCF, на хитозан индуцированное разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха. Ломаной линией отмечены митохондрии, в который определяли выход флуоресценции DCF.

Условия опыта, как на рис. 2.

Предотвращение хитозан-индуцированной ПКС проникающими катионами связано с тем, что они снижают трансмембранную разность электрохимических потенциалов (p) в митохондриях, подавляя образование АФК. Поэтому мы исследовали действие протонофорных разобщителей окислительного фосфорилирования, снимающих p и подавляющих образование АФК в митохондриях (Korshunov et al., 1997).

На рис. 8, а, б м-хлоркарбонилцианидфенилгидразон (ХКФ) предотвращает образование АФК, регистрируемое по флуоресценции DCF. Хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК предотвращалось протонофорными разобщителями пентахлорфенолом (ПХФ), 2,4-динитрофенолом (ДНФ) и м-хлоркарбонилцианид фенилгидразоном (ХКФ) (рис. 8, в, г;

данные с ДНФ не представлены). Их защитное действие проявляется в концентрациях более низких, чем у фенола.

Действие доноров электронов для пероксидазы-оксидазы на ПКС Фенол – субстрат пероксидазы (Hauser, Olsen, 1998). Был испытан ряд соединений в качестве доноров электронов в реакции восстановления H2O2 с участием пероксидазы хрена. Непригодность соединений регистрировали по выделению O2 в ответ на последующее добавление каталазы.

Рис. 9. Фенол как субстрат пероксидазы. В полярографическую ячейку, содержащую 50 мМ фосфатный буфер, рН 7, добавляли 20 U/мл каталазы, 0,1 мМ Н 2О2, 10 U/мл пероксидазы хрена и 0,2 мМ фенола. Н2О2 регистрировали по выделению О2 после добавки каталазы.

В присутствии каталазы H2O2 регистрируется по выделению O2 (рис. 9, а). С фенолом в отсутствие пероксидазы в ответ на добавку H2O2 и каталазы также регистрируется выделение O2 (рис. 9, б). В присутствии 0,2 мМ фенола и пероксидазы не наблюдается выделения O2 после добавки каталазы (рис. 9, в). В пероксидазную реакцию вступают фенол, 2,4-дихлорфенол и флуоресцеин. ДНФ, TMRE, PCB, DCFH DA не поддерживают пероксидазную реакцию.

Рис. 10. (а) Действие различных соединений на окисление NADH с участием пероксидазы. К раствору 0,1 мМ NADH в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7, добавляли 10 ед. активности/мл пероксидазы хрена, 0,5 мМ Н2О2 и отмеченные соединения. Окисление NADH определяли по изменению оптической плотности при 340 нм, используя коэффициент молярной экстинкции при 339 нм 6200 М–1см–1. (б) Действие малата как субстрата малатдегидрогеназы на хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха. Пленки эпидермиса обрабатывали хитозаном (100 мкг/мл) на магнитной мешалке 30 мин, добавляли 5 мМ малата, 5 мМ сукцината и 0,1 мМ фенола и инкубировали 3 ч без перемешивания в темноте.

Пероксидазы также катализируют реакции, в которых акцептором электронов является О2. Для этих реакций, называемых пероксидазно-оксидазными, пригодны немногие доноры электронов. Они включают NADH, дигидроксифумарат, индол-3-ацетат, нафтогидрохиноны.

Per2+ + O2 + 4H+ Per6+ (соединение III) + 2H2O, Per6+ + DH• Per5+ + D + H+.

Per6+ (соединение III) – каталитически неактивная форма фермента.

Фенольные соединения в сочетании с NADH переводят пероксидазу из состояния Per6+ в активную форму (Halliwell, 1978).

Рис. 10, а иллюстрирует действие различных соединений на окисление NADH с участием пероксидазы хрена. Лишь фенол и ДХФ поддерживали окисление NADH.

Проникающие катионы, как и катионные производные пластохинона, были не эффективны.

Малат, субстрат апопластной малатдегидрогеназы, пополняя фонд апопластного NADH, субстрата пероксидазы, предотвращал хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК и снимал повреждающее действие фенола в повышенной концентрации – 0,1 мМ (рис. 10, б). Сукцинат не обаладал защитным действием.

Восстановление NAD+ малатом реализуется посредством малатдегидрогеназы, прочно связанной с клеточной стенкой (Elstner and Heupel, 1976;

Mder and Fssl, 1982). Малат выделяется в апопласт УК мезофилла и может поглощаться УК из апопласта, регулируя СО2-зависимое движение устьиц (Kirk et al., 1978;

Lee et al., 2008).

Таким образом, фенольные соединения вместе с апопластной пероксидазой и малатдегидрогеназой защищают ЭК от губительного действия хитозана.

Предложена последовательность реакций (рис. 11), которая объединяет пероксидазные и пероксидазно-оксидазные реакции с участием NADH (Самуилов и др., 2010).

Рис. 11. Действие пероксидазы, использующей фенол как субстрат. PhOH – фенол, PhO• – радикал фенола. Цифры при Per отражают количество окислительных эквивалентов, которых недостает железу и гему фермента.

ВЫВОДЫ 1. Пластохинон, связанный с проникающим через мембраны катионом додецилтрифенилфосфония (SkQ1), предотвращал программируемую клеточную смерть (ПКС), регистрируемую по зависимому от активных форм кислорода (АФК) разрушению клеточных ядер, индуцированную хитозаном или CN–.

2. Проникающие катионы тетрафенилфосфония и додецилтрифенилфосфония входящие в состав SkQ1 и этиловый эфир тетраметилродамина, входящий в состав родаминового SkQR1, в субнаномолекулярных концентрациях и проникающие анионы тетрафенилбора и фенилдикарбаундекаборана в микромолярных концентрациях предотвращали хитозан-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток. Действие катионов усиливалось пальмитатом, а действие анионов – посредством NH4Cl. Предположительно проникающие катионы переносятся с жирными кислотами, а анионы – совместно с NH4+ через мембрану митохондрий, что сопровождается снижением p на внутренней мембране митохондрий, подавляющим образование АФК.

3. Хитозан-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток и CN– индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе из листьев гороха предотвращалось ингибиторами NADPH-оксидазы плазматической мембраны дифенилениодонием и хинакрином в концентрациях, не оказывающих влияние на дыхание и фотосинтетическое выделение О2 нарезками листьев гороха. Полученные данные свидетельствуют об участии NADPH-оксидазы плазматической мембраны в ПКС у растений.

4. Субстраты апопластной пероксидазы, соединения фенольной природы, предотвращали хитозан-индуцированное разрушение ядер эпидермальных клеток. Сходным действием обладали пентахлорфенол, 2,4-динитрофенол и м-хлоркарбонилцианидфенилгидразон. Субстрат малатдегидрогеназы малат, пополняя фонд апопластного NADH, способного восстанавливать фенольные соединения, предотвращал ПКС, индуцированную хитозаном.

5. Данные позволяют заключить, что вызванная хитозаном гибель клеток гороха, предотвращается митохондриально-направленными антиоксидантами-хинонами и проникающими через мембраны ионами.

Дыхательная цепь митохондрий, NADPH-оксидаза плазматической мембраны и апопластная пероксидаза могут служить источниками АФК при ПКС у растений.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ 1. Самуилов В.Д., Киселевский Д.Б., Синицын С.В., Шестак А.А., Лагунова Е.М., Несов А.В. Н2О2 усиливает CN––индуцированный апоптоз в листьях гороха (2006) Биохимия, 71, 481–492.

2. Васильев Л.А., Воробьев А.А., Дзюбинская Е.В., Несов А.В., Шестак А.А., Самуилов В.Д. Вызванная CN– гибель клеток в листьях растений (2007) Биохимия, 72, 707–713.

3. Самуилов В.Д., Киселевский Д.Б., Шестак А.А., Несов А.В., Васильев Л.А.

Активные формы кислорода в программируемой гибели устьичных клеток гороха растений (2008) Биохимия, 73, 1344–1354.

4. Самуилов В.Д., Васильев Л.А., Дзюбинская Е.В., Киселевский Д.Б., Несов А.В.

Программируемая клеточная смерть у растений: защитное действие фенольных соединений от хитозана и H2O2 (2010) Биохимия, 75, 313–320.

5. Киселевский Д.Б., Кузнецова Ю.Е., Васильев Л.А., Лобышева Н.В., Зиновкин Р.А., Несов А.В., Шестак А.А., Самуилов В.Д. Действие Са2+ на программируемую гибель устьичных и эпидермальных клеток в листьях гороха (2010) Биохимия, 75, 717–726.

6. Васильев Л.А., Киселевский Д.Б., Дзюбинская Е.В., Несов А.В., Самуилов В.Д.

Программируемая гибель клеток у растений: защитное действие катионов тетрафенилфосфония и тетраметилродамина, используемых в качестве трансмембранных переносчиков хинонов (2012) Биохимия, 77, 454–462.

Тезисы конференций 1. Несов А.В., Синицын С.В., Самуилов В.Д. Жизнеспособные, но не культивируемые формы бактерий у растений. Материалы VIII молодёжной конференции ботаников в Санкт-Петербурге. 17-21 мая 2004 г. Санкт-Петербург.

Сборник тезисов, с. 131–132.

2. Синицын С.В., Несов А.В., Безряднов Д.В., Тимофеев К.Н., Федоренко Т.А., Самуилов В.Д. H2O2-индуцированное ингибирование фотосинтетического выделения O2 клетками Anabaena variabilis. Третий съезд биофизиков России.

24-29 июня 2004 г. Воронеж. Тезисы докладов. Том II. с. 456–457.

3. A.V. Nesov, Yu. V. Kusnetsova, A.A. Shestak, D.B. Kiselevsky. Reactive oxygen species and their sources in programmed death of pea guard cells. "Российская биоэнергетика: от молекул к клетке". 21-23 февраля 2005 г. Москва. Сборник тезисов, с. 54.

4. Киселевский Д.Б., Шестак А.А., Несов А.В., Кузнецова Ю.Е., Самуилов В.Д.

Влияние ингибиторов флавиновых ферментов и Ca2+ на индуцируемую цианидом гибель устьичных клеток гороха. Международная научная конференция "Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах" памяти проф. М.В. Гусева. 16-19 мая 2005 г. Москва. Материалы конференции, с. 78.

5. Nesov A.V., Shestak A.A., Kiselevsky D.B., Samuilov V.D. Effect of quinacrine and diphenylene iodonium, flavine enzymes inhibitors, on programmed cell death of pea guard cell. Материалы I(IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге. 21-26 мая 2006 г. Санкт-Петербург. Сборник тезисов, с. 228.

6. Kiselevsky D.B., Shestak A.A., Sinitsyn S.B., Nesov A.V., Samuilov V.D. Cyanide induced apoptosis in pea leafs. 14th European bioenergetics conference. Moscow State University, Moscow, Russian Federation. 22 July-27 July 2006. Biochim. Biophys. Acta, 14, 499.

7. Васильев Л.В., Несов А.В., Дзюбинская Е.В. CN--Индуцированная клеточная гибель в листьях растений. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2007". 11-14 апреля 2007 г. Москва. Секция "Биология". Тезисы докладов, с. 162.

8. Киселевский Д.Б., Шестак А.А., Несов А.В., Кузнецова Ю.Е., Васильев Л.А., Самуилов В.Д. Активные формы кислорода и их источники при программируемой гибели клеток гороха. IV съезд российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г. Новосибирск. Сборник тезисов, с. 323.

9. Кузнецова Ю.Е., Киселевский Д.Б., Несов А.В., Васильев Л.А., Шестак A.A., Самуилов В.Д. Действие Ca2+ на CN–- и хитозан-индуцированную гибель устьичных и эпидермальных клеток листьев гороха. Конференция «Экосистемы, организмы, инновации», 29 октября 2008 г. Москва. Сборник тезисов.

10. D.B. Kiselevskiy D.B., E.V. Dzyubinskaya, A.V. Nesov, L.A. Vasil’ev, V.D. Samuilov.

Mitochondria-addressed cations prevent programmed cell death in pea leaves and delay leaf senescence and death in Arabidopsis thaliana. Программируемая гибель клеток в биологии и медицине: 4-5 июня, 2012 г. Москва. Сборник тезисов, с. 25.