Пегилирование рекомбинантной l-аспарагиназы erwinia carotovora с целью усиления ее терапевтически значимых свойств
На правах рукописи
Кучумова Анастасия Владимировна ПЕГИЛИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ ERWINIA CAROTOVORA С ЦЕЛЬЮ УСИЛЕНИЯ ЕЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ СВОЙСТВ 03.00.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2007 1
Работа выполнена в ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН Научные руководитель:
доктор биологических наук, профессор Соколов Николай Николаевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Ребров Леонид Борисович доктор биологических наук Иванов Юрий Дмитриевич
Ведущая организация: Российский университет дружбы народов
Защита диссертации состоится « 29 » марта 2007 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01 при ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н.
Ореховича РАМН по адресу: 119121, г. Москва, Погодинская ул., д.10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН
Автореферат разослан «_26_»февраля_ 2007 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Былинкина В.С.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Биологические катализаторы, каковыми являются ферменты, обладают чрезвы чайно высокой специфичностью и мощным каталитическим воздействием на различ ные стороны метаболизма в организме. Поэтому они представляют собой уникальные лекарственные средства, используемые в медицине для лечения заболеваний различ ной этиологии (Holcenberg J., 1982;
Goldberg D., 1992).
L-аспарагиназа (L-аспарагинамидогидролаза КФ 3.5.1.1), являющаяся предста вителем ферментов класса треониновых амидогидролаз, катализирует превращение L-аспарагина до L-аспарагиновой кислоты и аммиака. Бактериальные аспарагиназы более 30 лет применяются в онкологической практике при комбинированной химио терапии различных видов лейкозов, меланом и миелом (Perel et al., 2002). Механизм противоопухолевого действия аспарагиназы заключается в расщеплении аминокисло ты аспарагин, находящейся во внеклеточном пространстве. Для опухолевых лим фобластов аспарагин является незаменимой аминокислотой, без поступления которой в клетку извне нарушается синтез белков и клетка становится неспособной к даль нейшему делению. Таким образом, реализация цитотоксичности аспарагиназы не подразумевает контакта или проникновения активного вещества в опухолевую клет ку, что принципиально отличает этот фермент по механизму действия от других ци тостатиков (Тимаков и др., 2000). Сниженная или полностью отсутствующая актив ность аспарагинсинтетазы – фермента, синтезирующего L-аспарагин, является отли чительной чертой не только лейкемических лимфобластов, но и миелобластов, и це лого ряда клеток других опухолей. Большинство здоровых, в том числе гемопоэтиче ских, клеток способно синтезировать собственный аспарагин. Это определяет вторую, крайне важную характеристику фермента, а именно минимальное миелотоксическое действие.
Целый ряд аспарагиназ из различных бактериальных штаммов обладает проти воопухолевым действием. Однако использование препаратов аспарагиназы в проти воопухолевой терапии ограничено различными побочными эффектами, поэтому только два наименее токсичных фермента, а именно L-аспарагиназы из Esherichia сoli (ЕсА2) и Erwinia chrysanthemi (ErA), нашли применение в онкотерапии (Duval et al., 2002). Причем, наименее токсичными признаны препараты, полученные из Erwinia chrysanthemi, что указывает на важность исследования аспарагиназ рода Erwinia. Тем не менее, даже аспарагиназы штаммов Erwinia вызывают развитие иммунологической гиперчувствительности к L-аспарагиназе, проявляющееся в диапазоне от слабых ал лергических реакций до анафилактического шока (Muller et al., 1998). Помимо этого, эффективность применения аспарагиназ в противоопухолевой терапии ограничена довольно низкой стабильностью фермента в физиологических условиях.
Таким образом, представляется актуальным получение модифицированных форм L-аспарагиназ штаммов Erwinia устойчивых к протеолитической деградации в крови, обладающих низкой иммунологической активностью при сохранении высокой ферментативной активности.
В настоящее время существует ряд различных методов модификации терапев тически значимых ферментов. Одним из наиболее эффективных является химическая модификация белка полиэтиленгликолем (ПЭГ), т.н. пегилирование (Veronese et al., 2005). Она заключается в физико-химической трансформации, достигаемой соедине нием нативной молекулы белка с ПЭГ. Применение этого метода позволяет значи тельно повысить терапевтическую эффективность фармакологических препаратов пептидной структуры.
Цель и задачи исследования Цель работы состояла в получении модифицированной полиэтиленгликолем рекомбинантной L-аспарагиназы Еrwinia carotovora, обладающей повышенной ста бильностью и пониженной иммуногенностью.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. модификация полиэтиленгликолем L-аспарагиназы Erw. carotovora и опти мизация процесса пегилирования;
2. детальная характеристика физико-химических свойств пегилированной L-аспарагиназы Erw. carotovora (pI, каталитические параметры, термодина мическая стабильность);
3. определение цитотоксичности пегилированной аспарагиназы на чувстви тельных к ней клетках лейкоза человека;
4. оценка иммуногенности модифицированной полиэтиленгликолем аспараги назы Erw. carotovora.
Научная новизна работы Впервые в качестве объекта для получения пегилированной формы аспарагиназы использован генно-инженерный фермент Erw. carotovora, на основе которого в настоящее время в лаборатории медицинской биотехнологии ГУ НИИ БМХ РАМН проводятся работы по созданию отечественного лекарственного препарата рекомбинантной аспарагиназы.
Впервые разработана и оптимизирована методика модификации полиэтилен гликолем рекомбинантной Получены L-аспарагиназы Erw. carotovora.
экспериментальные данные для пегилированной аспарагиназы о ее физико химических и каталитических свойствах, иммуногенности и цитотоксическом действии на опухолевые клетки различных линий.
Показано, что модифицированная аспарагиназа оказывает более выраженное цитотоксическое действие на опухолевые клетки лимфобластной Т-клеточной лимфомы и лимфомы Беркитта по сравнению с нативным ферментом. Выявлено возрастание устойчивости ПЭГ-аспарагиназы к протеолизу и повышение термостабильности по сравнению с исходным белком. Установлено, что пегилированная форма рекомбинантной L-аспарагиназы Erw. carotovora обладает пониженной иммуногенностью.
Практическая значимость исследования В настоящее время в клинической практике используется лишь единственный пегилированный препарат бактериальной аспарагиназы «Онкоспар», получаемый на основе фермента E. coli. Наличие нескольких препаратов аспарагиназ со сниженной иммуногенностью позволит проводить заместительную терапию различных видов лейкозов у пациентов, в особенности у детей, обладающих повышенной аллергенностью к существующим препаратам бактериальных аспарагиназ. В этом отношении не вызывает сомнения высокая практическая значимость получения пегилированной формы аспарагиназы Erw. carotovora.
Результаты данной работы могут быть использованы в качестве основы для создания нового лекарственного препарата пегилированной рекомбинантной аспарагиназы Erw. carotovora для лечения ряда форм лейкозов, и в первую очередь острого лимфобластного лейкоза.
Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих конференциях: II научно-практической конференции «Актуальные проблемы меди цинской биотехнологии» (Анапа, 2005), «Фундаментальные науки – биотехнологии и медицине» (Новосибирск, 2006), Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярные основы и клинические проблемы рези стентности к лекарственным средствам» (Киев, 2006). По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов докладов. Апробация диссертации состоялась на межлабораторном семинаре ГУ НИИ БМХ РАМН 21 декабря 2006 года.
Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания ма териалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 122 источника. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 4 таблицы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Культивирование штамма-продуцента и экспрессия фермента.
В работе был использован рекомбинантный штамм E. coli BL21(DE3)/ pPACYC177_LANS, сконструированный ранее сотрудниками лаборатории медицин ской биотехнологии совместно с М.А.Эльдаровым (Центр «Биоинженерия», К.В. Си доруком и В.Г.Богушем (ГосНИИгенетика). В 200 мл LB-среды, содержащей мкг/мл ампициллина, вносили 3 мл ночной культуры и выращивали при 37°С и перемешивании 150-180 об/мин до оптической плотности OD600=1,5-2,0. Затем в среду добавляли индуктор синтеза L-аспарагиназы ИПТГ в конечной концентрации 0,1 мМ и клетки инкубировали в течение 16-20 часов при тех же условиях. Клетки собирали центрифугированием (15 мин;
5000 об/мин) и хранили при -20°С.
Очистка и выделение L-аспарагиназы Ультразвуковая дезинтеграция клеток. Все стадии очистки проводили при 4С. 10 12 г биомассы E. coli суспендировали в 20 мМ калий-фосфатном буфере, рН 5,5 (бу фер А) до общего объема смеси 85 мл. Клетки разрушали ультразвуком на дезинте граторе УЗДН-2Т (Россия) в течение 5 минут при режиме: 30 с озвучивания, 30 с пе рерыв. Разрушение клеток проводили на ледяной бане, поддерживая температуру +2-+4С. После этого рН суспензии доводили до значения 5,5 с помощью 0,1 М HCl и оставляли при 4С и непрерывном перемешивании на 30 мин для преципитации части балластных белков.
Хроматография на колонке с SP-Сефарозой. Растворимую фракцию клеточного экстракта получали 30 минутным центрифугированием при 18000 об/мин (34 х 103 g) и наносили на колонку с SP-Сефарозой FF (2.5 см х 10 см), уравновешенную буфером А. После нанесения белка SP-Сефарозу последовательно промывали колоночным бу фером с рН 5,5 до исчезновения следов белка в элюате. Скорость нанесения образца и промывки колонки составляла соответственно 1 и 2 мл/мин. Белок элюировали ли нейным градиентом KCl в интервале концентраций 0-0,8 М. Также в ряде случаев элюцию проводили 100 мл буфера А с рН 7,0, при скорости потока 1 мл/мин. Фрак ции, содержащие L-аспарагиназу (0,3–0,35 М KCl), объединяли.
Концентрирование и обессоливание фермента. Объединенные фракции с SP Сефарозы помещали в ячейку-концентратор Amicon объемом 12 мл, содержащую фильтр Millipore (Ultrafiltration membrane NMWL 30000) и центрифугировали (Beck man, JA-25,5 4000 об/мин). Обессоливание белка проводили ультрафильтрацией на ячейке Amicon, либо с помощью гель-фильтрации на колонках PD10 с Сефадекс G-25.
Лиофилизация препарата. Сконцентрированный материал разливали по 1 мл в био виалы объемом 4 мл, замораживали при -80°С и лиофилизировали в течение ночи.
Фермент хранили при -20С.
Определение концентрации белка.
Белок определяли модифицированным методом Лоури (Hartree E., 1991), а также че рез коэффициент экстинкции 0,1%280=0,56 (expasy.org). Концентрацию пегилирован ного белка определяли биуретовым методом (Элиот Д. и др., 1981), измеряя оптиче скую плотность растворов в 96-ти луночных планшетах при длине волны 540 нм на многоканальном спектрофотометре «Multiscan EX». В качестве стандарта использо вали раствор нативной аспарагиназы в интервале концентраций 1-10 мг.
Электрофорез белков в денатурирующих условиях осуществляли в соответ ствии с методикой (Laemmli, 1970), аспарагиназную активность определяли по мето ду Несслера (Wriston J., 1973), изоэлектрическое фокусирование проводили, как опи сано (Остерман М., 1983).
Определение кинетических параметров аспарагиназы.
Скорости гидролиза L-аспарагина и L-глутамина рекомбинантным и модифициро ванным ферментом определяли спектрофотометрически по убыванию поглощения амидной связи при 215 нм (215=102,5) с помощью спектрофотометра «Hewllet Packard» (Howard et al., 1972). Для этого 27-1350 мкМ фермента добавляли к 2 мл 12, мМ боратного буфера, содержащего субстраты в концентрации 30-3600 мкМ. Реак цию проводили при 37С.
Модификация аспарагиназы метоксиполиэтиленгликоль-п-нитрофенилкарбо натом.
Метоксиполиэтиленгликоль-п-нитрофенилкарбонат с молекулярной массой (mPEG-pNP) любезно предоставлен А.Ю. Суровым (Институт Биоорганической хи мии, РАН). Лиофилизированный препарат аспарагиназы (10 мг) растворяли в 4 мл 100 мМ боратного буфера, рН 9,0-9,5 и смешивали в различном молярном соотноше нии с mPEG-pNP. Реакционную смесь инкубировали при непрерывном перемешива нии от 1 до 24 часов. По окончании реакции полученный продукт отделяли от не про реагировавшего mPEG-pNP и побочного продукта гель-фильтрацией на колонке PD с Сефадекс G-25, уравновешенной 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,0. Фракции, со держащие L-аспарагиназу, объединяли и определяли суммарную активность фермен та. Полученный препарат фермента хранили при -20°С.
Определение цитотоксической активности аспарагиназы in vitro*.
В опытах использовали чувствительные к аспарагиназе клеточные линии K-562 (хро ническая миелогенная лейкемия), MOLT-4 (лимфобластная Т-клеточная лимфома), Raji (лимфома Беркитта). Культивирование проводили в течение 72 часов при 37°С в СО2 инкубаторе. Для культивирования клеток использовали 96-ти (48-ми) луночные планшеты (фирм «Nunc» и «Costar»). В каждую лунку помещали 0,1 мл (0,3 мл) среды и достигшие логарифмической фазы роста клетки в количестве 40000 клеток/лунку MOLT-4 и 50000 клеток/лунку (для линий K-562 и Raji). Планшеты, содержащие * Работа проводилась совместно с к.б.н. Посыпановой Г.А. (ММА им. Сеченова) и д.б.н. Абакумовой О.Ю. (ГУ НИИ БМХ РАМН) клетки, преинкубировали в течение 24 часов перед добавлением препаратов аспара гиназы. Выживаемость опухолевых клеток, инкубировавшихся с различными концен трациями препаратов аспарагиназы, определяли в МТТ-тесте (Hubeek et al., 2006).
После 72 часов инкубации к клеткам добавляли МТТ реактив («Sigma») и инкубиро вали клетки еще 4 часа. После этого, образовавшиеся кристаллы формазана растворя ли в изопропаноле и измеряли оптическую плотность при длине волны 570 нм. В от рицательном контроле присутствовала только культуральная среда. Зависимость ин гибирования роста клеток от концентрации белка выражали в % и рассчитывали сле дующим образом:
OD 570 (клетки, инкубируемые с ферементом) Выживаемость % = OD 570 (контрольные клетки ) Для характеристики цитотоксического эффекта использовали значение LC50 – концентрация препарата, приводящая к гибели 50% клеток.
Определение иммуногенности аспарагиназы.
Получение специфических поликлональных антител. В эксперименте использова ли беспородных белых мышей-самцов с массой тела 19-22 г. Антиген вводили с по мощью внутрибрюшинных инъекций в количестве 25 мкг в 0,2-0,3 мл физиологиче ского раствора. Мышей иммунизировали ежедневно в течение 7-10 суток. В экспери менте было 3 группы животных: по 5 мышей на нативную и модифицированную ас парагиназы, и 3 мыши в контрольной группе. Животным контрольной группы вводи ли физиологический раствор. Непосредственно перед введением препарата, лиофили зированные нативную и модифицированную аспарагиназы разводили стерильным физиологическим раствором до необходимой концентрации. На 10-е сутки мышей декапитировали и получали сыворотки периферической крови.
Определение уровня выработки антител методом прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В лунки планшетов высокой сорбционной ем кости («Nunc», марки «Polysorp»), наносили по 100 мкл антигена в 0,1 М карбонат бикарбонатном буфере, pH 9,6, в концентрации 20 мкг/мл и инкубировали в течение ночи. Жидкость из лунок стряхивали и вносили по 100 мкл блокирующего раствора (50%-ное молоко 0,5%-ной жирности в 0,01 М фосфатно-солевом буфере, рН 7, (PBS)), и инкубировали 1 час при перемешивании, при комнатной температуре. Затем лунки промывали три раза по 200 мкл буфером для промывки – 0,01 М фосфатно солевой буфер рН 7,4, содержащий 0,05% Твин 20 (PBST). Далее, в ряды лунок вно сили по 100 мкл индивидуальной антисыворотки в серии из восьми последовательных разведений в два раза. Начальное разведение антисывороток варьировало от 1:2 до 1: в зависимости от титра специфических антител. Оптимальное начальное разведение (для достижения конечной точки титрования) определяли по результатам предвари тельного эксперимента, проводимого в тех же условиях, начиная с разведения 1:2.
Инкубацию продолжали 1,5 часа при комнатной температуре. После этого планшеты стряхивали и промывали четырежды PBST. В каждую лунку вносили по 100 мкл пре парата меченых пероксидазой хрена антимышиных антител козы («Stressgen») в раз ведении 1:2000 в PBS c 50%-ным обезжиренным молоком и 0,05% Tween 20. Планше ты инкубировали 1 час при перемешивании при комнатной температуре. Отмывку от несвязавшихся конъюгатов пероксидазы с антителами проводили PBST шесть раз. За тем для развития цветной реакции в лунки планшетов вносили 100 мкл раствора суб страта (0,5 мг/мл ABTS («Sigma») и 0,1% H2O2 в 0,1 М цитратном буфере, pH 4,0;
H2O2 добавляли непосредственно перед инкубацией) и инкубировали 45 мин в темно те при встряхивании, при 37°C. Реакцию останавливали внесением в лунки 100 мкл 1% раствора ДСН. Результаты учитывали, измеряя оптическую плотность при длине волны 405 нм на многоканальном спектрофотометре «Multiscan» EX.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программных продуктов «OriginLab Origin 7.0» и «Microsoft Excel 2003». Достоверность получен ных результатов определяли с помощью t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение препарата рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora.
На начальном этапе работы необходимо было получить препарат нативной ас парагиназы в количестве достаточном для проведения последующей модификации фермента полиэтиленгликолем и определения стабильности и цитотоксичности пре паратов пегилированного белка. Для получения бесклеточного экстракта, использова ли ультразвуковую обработку. Результаты очистки фермента представлены в табл. 1.
Аспарагиназная активность в бесклеточном экстракте составляла 29,8 МЕ/мг, что со ответствует 7-8% активного фермента от общего количества белка. При последую щем центрифугировании, вероятно, вследствие адсорбции L-аспарагиназы осадком разрушенных клеток, терялось 15-20% ферментативной активности, однако, на этой стадии происходило и удаление почти 50% балластных белков. Таким образом, выход фермента был достаточно высоким (более 80%). Нанесение растворимой фракции бесклеточного субстрата на SP-Сефарозу при рН 5,5 позволило избавиться от основ ной массы балластных белков. Значение pI рекомбинантной аспарагиназы, равно 8,5, что соответствует pI фермента дикого штамма Erw. carotovora (8,5-8,7 (Соколов и др., 2000)), поэтому более 95% аспарагиназы Erw. carotovora, нанесенной на сильный ка тионообменник SP-Сефарозу при рН 5,5, связывается с сорбентом, а большинство белков E. coli, имеющих pI в кислой области рН, обнаруживается в элюате (рис.1, треки 2 и 3). После промывки сорбента низкосолевым фосфатным буфером с рН 5, аспарагиназу элюировали линейным градиентом KCl. Хроматографическая очистка позволила получить фермент с удельной активностью 390 МЕ/мг, что в 13,1 раз пре вышает значение исходной активности.
Таблица 1. Очистка рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora Активность Общий Степень аспарагиназы Этап очистки Выход, белок очистки Общая, Удельная (%) (мг) (раз) (МЕ) (МЕ/мг) Бесклеточный экстракт 2432 72490 29,8 100 Растворимая фракция 897 59080 65,9 81,5 2, бесклеточного экстракта Хроматография на 139 52150 375,2 71,9 12, SP- Сефарозе Обессоливание и 130 50700 390 69,9 13, концентрирование Погрешность измерений составляет не более 20% На заключительном этапе выделения препарат L-аспарагиназы необходимо было обессолить и сконцентрировать. Для концентрирования белка идеально подхо дит метод с использованием ультрафильтрационных мембран. При его применении можно не только успешно проводить процедуру концентрирования аспарагиназы, но и одновременно освобождаться от низкомолекулярных примесных белков. После концентрирования объединенных фракций фермента, аспарагиназная активность практически не изменялась. Проблема обессоливания и одновременно смены буфера для лиофилизации была успешно решена путем гель-фильтрации концентрированно го образца на колонках PD10 с Сефадекс G-25. Электрофоретическая картина образ цов, после гель-фильтрации мало отличалась от таковой после ионообменной хрома тографии. Электрофоретический анализ очищенного препарата аспарагиназы в 12,5% полиакриламидном геле имеет один главный компонент с молекулярной массой кДа (рис 1, треки 4-6), что свидетельствует о более чем 90%-ной гомогенности выде ленного фермента. Также наблюдаются минорные компоненты с Mr 15 и 30 кДа (обо значены стрелками на рис.1), которые присутствуют и в препарате аспарагиназы Er winia chryzanthemi («Sigma») (рис 1, трек 7).
Рис. 1. Электрофоретическое разделение в 12,5% ПААГ/ДСН препаратов L-аспарагиназы на разных этапах очистки. 1 – бесклеточный экстракт;
2 – растворимая фракция бесклеточно го экстракта;
3 – проскок;
4, 5, 6 – очищенные препараты аспарагиназы соответственно мкг, 10 мкг, 3 мкг;
7 – L-аспарагиназа Erw. chrysanthemi 5 мкг;
8 – маркер молекулярного ве са.
Ингибиторы протеаз в процессе выделения не использовали, так как они явля ются высокотоксичными соединениями и их присутствие недопустимо в препарате, предназначенном для терапевтического применения. Лиофилизацию белка проводили без каких-либо добавок и через 6 месяцев хранения при -20°С препарат сохранял 85% исходной активности. Причиной такой стабильности фермента, вероятно, является его высокая степень очистки.
Получение пегилированной рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovorа и оптимизация процесса модификации.
Согласно литературным данным (Roberts et al., 2002) процесс коньюгирования белка с mPEG-pNP зависит от множества условий протекания реакции, таких как pH и ионная сила реакционного буфера, молярное соотношение белок/mPEG-pNP, темпе ратура и время инкубации, интенсивность перемешивания реакционной смеси и т.д.
Тем не менее, за исключением работы (Xiong et al., 2005), систематизированные дан ные по оптимизации пегилирования белков практически отсутствуют. Известно, что реакция связывания mPEG-pNP с протеином протекает при рН 8,3-9,5. В связи с отно сительно низкой реакционной способностью mPEG-pNP выбор рН был остановлен на значении 9,5. В щелочном диапазоне pH депротонированные -аминогруппы лизино вых остатков фермента ковалентно связываются с карбонатной группой активирован ного мПЭГ с образованием конъюгата мПЭГ-фермент.
На начальном этапе исследования было проведено три реакции, отличавшиеся количеством активированного мПЭГ производного. Для этого к раствору аспарагина зы добавляли mPEG-pNP в 1,5, 3,0 и 4,5 – кратных молярных избытках и проводили реакцию в течение 24 часов при 22С. С целью качественного определения степени пегилирования выполняли электрофоретический анализ образцов реакционной смеси в 10% ПААГ/ДСН.
Рис. 2. Электрофоретический анализ в 10% ПААГ/ДСН препарата ECAR_LANS, инкуби ровавшегося в течение 24 часов с mPEG-pNP. 1 – нативная ECAR_LANS;
2 – маркер молеку лярного веса 14, 20, 30, 45, 90 кДа;
3-5 конъюгаты mPEG-pNP/ECAR_LANS в молярном со отношении соответственно 1,5:1, 3:1 и 4,5:1.
Результаты электрофореза, представленного на рис.2, свидетельствуют об эф фективной модификации препарата аспарагиназы с помощью mPEG-pNP. Даже при 1,5-кратном молярном соотношении mPEG-рNP/ECAR_LANS наблюдается полная модификация рекомбинантной аспарагиназы (рис. 2, трек 3), что подтверждается от сутствием на электрофореграмме полосы, соответствующей ECAR_LANS. Как видно из рис.3, А, наблюдается прямая зависимость активности пегилированного белка от количества модифицирующего реагента. Так при молярном соотношении mPEG pNP/ECAR-LANS 4,5/1 сохраняется почти 60% удельной активности аспарагиназы.
Это, по-видимому, обусловлено стабилизацией тетрамерной структуры конъюгиро ванного фермента, которая быстрее достигается при использовании высоких концен траций ПЭГ.
В процессе эксперимента также было установлено, что помимо прямой зависи мости от соотношения количеств реагирующих веществ активность фермента нахо дится в обратной зависимости от продолжительности инкубации с ПЭГ. Как видно из рис.3, Б, даже в молярном соотношении mPEG-pNP/ECAR_LANS 4,5/1 при увеличе нии времени инкубации активность аспарагиназы снижается.
Б А Активность % Активность % 0 0/1 1,5/1 3/1 4,5/1 0 5 10 15 20 Время инкубации с mPEG-pNP, ч mPEG-pNP/ECAR_LANS, M Рис. 3. Зависимость активности пегилированной аспарагиназы от (А) молярного соотно шения mPEG-pNP/ECAR_LANS и (Б) времени инкубации.
Чтобы повысить эффективность пегилирования, представлялось важным выяснить причину снижения активности фермента с увеличением времени реакции.
Для этого исследовали, является ли деградация аспарагиназы результатом жестких условий реакции модификации, или сама по себе ECAR_LANS представляет собой менее стабильный белок по сравнению с коммерческими препаратами аспарагиназ.
Было проведено сравнение результатов пегилирования препарата ECAR_LANS и применяемой в клинической практике коммерческой L-аспарагиназы Escherichia coli (EcA;
«Medac» Германия). К растворам аспарагиназ добавляли mPEG-pNP в 4, кратном молярном избытке. Реакцию пегилирования проводили в боратном буфере со сниженным значением pH равным 9,0, как при 22°С, так и 4°С, варьируя при этом время инкубации. Параллельно определяли активность аспарагиназы и аликвоты реакционной смеси наносили на 12% ПААГ/ДСН. В качестве контроля служили пробы ECAR_LANS и Medac, инкубировавшиеся в тех же условиях, но в отсутствии mPEG-pNP. Как видно из рис. 4, через 4 часа инкубации при комнатной температуре степень пегилирования обеих аспарагиназ достаточно высока и весь белок модифицирован (рис. 4, треки 6 и 7).
Рис. 4. Электрофореграмма аспарагиназ ECAR_LANS и Medac в 12% ПААГ/ДСН после часов инкубации с mPEG-pNP. 1 – маркер молекулярного веса («Bio-Rad»);
2,4 и 3,5 – соот ветственно, нативные Medac и ECAR_LANS, инкубация при 22°С и 4°С;
6,7 – соответствен но, пегилированные Medac и ECAR_LANS, инкубация при 22°С;
8,9 – соответственно, пеги лированные Medac и ECAR_LANS, инкубация при 4°С.
При этом у пегилированных ECAR_LANS и Medac активность сохраняется практически в равной степени 78,8% и 82,9%, соответственно. Для реакционных проб, инкубировавшихся при 4°C, модификация проходит не так эффективно, и в смеси присутствуют следы нативного белка (рис. 4, треки 8 и 9). В течение 16 часов при 4°С происходила полная модификация аспарагиназ и электрофоретическая картина в ПААГ/ДСН в последующие 8 часов не изменялась. Энзиматическая активность в контрольных и опытных образцах снижалась примерно в одинаковой степени и ее значения не отличались.
Таким образом, было установлено, что ECAR_LANS не является менее стабильным ферментом по сравнению с препаратом коммерческой аспарагиназы.
Кроме того, было выявлено, что время реакции можно сократить до 4 часов, получая при этом PEG-ECAR_LANS с 78,8% активности.
Резюмируя рассмотренные выше данные, следует отметить, что оптимальными условиями пегилирования рекомбинантной L-аспарагиназы Erw. carotovora, позволяющими получить полностью модифицированный фермент с 80% исходной активности являются: инкубация при 22С в течение 4-х часов в реакционном буфере с pH 9,0.
Физико-химическая и кинетическая характеристика модифицированной L-аспарагиназы Erwinia carotovora.
В результате исследования определен ряд физико-химических свойств пегилированного и нативного фермента и проведен сравнительный анализ полученных данных. При изоэлектрофокусировании пегилированной L-аспарагиназы Erw. carotovora на колонке с амфолинами («Pharmacia») в интервале рН 4-10 и 7- было установлено, что изоэлектрическая точка белка сдвигается в область кислых значений pH по сравнению с pI нативного фермента равной 8,5 и находится в диапазоне значений рН 7,9±0,05. Уменьшение изоэлектрической точки может объясняться блокированием полиэтиленгликолем -аминогрупп остатков лизина белковой молекулы аспарагиназы. В литературе упоминается о подобном изменении pI, например, при модификации антагониста рецептора интерлейкина-1 человека с использованием полиэтиленгликоля и метода активированных эфиров для образования ковалентной связи (Мартюшин и др., 2000).
Установлено, что оптимум рН гидролиза L-аспарагина для пегилированного и нативного фермента практически не отличается и находится в интервале значений рН от 7,5 до 9,0, что согласуется с известными из литературы данными на примере химически модифицированной аспарагиназы E. coli. Оптимум температуры для ECAR_LANS лежит в диапазоне 37-55°С, а для PEG-ECAR_LANS этот диапазон несколько шире и составляет 37-60°С.
Кинетические параметры модифицированной аспарагиназы представлены в табл. 2, и сопоставлены с соответствующими характеристиками ECAR_LANS.
Таблица 2. Кинетические свойства ПЭГ-аспарагиназы.
L-аспарагин L-глутамин Белок Km, мкМ Vmax, МЕ/мг Km, мкМ Vmax, МЕ/мг PEG-ECAR_LANS 108±14 377±11 1456±115 11±0, ECAR_LANS 106±18 467±18 1453±146 14±0, Рассчитанные значения Km пегилированного и нативного фермента для L-аспарагина и L-глутамина практически не отличаются. Однако при этом отмечается понижение значения константы Vmax модифицированной аспарагиназы.
При пегилировании белковой молекулы для сохранения ее каталитической активности важно, чтобы аминокислоты, входящие в состав активного центра фермента, не участвовали в ковалентном связывании с ПЭГ (Roberts et al., 2002).
В мономере аспарагиназы Erw. carotovora из 20 аминокислотных остатков лизина 14 расположены на поверхности и открыты для пегилирования, один остаток – Lys 30 находится в непосредственной близости от активного центра фермента (рис. 5).
Рис. 5. Мономер рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora. 1 – остатки лизина, расположенные на поверхности фермента;
2 – остатки лизина, расположенные в области контакта субъединиц фермента.
Однако, вследствие того, что каталитический сайт ECAR_LANS стерически ограни чен размером молекулы глутамина, даже при связывании Lys30 с ПЭГ можно исклю чить влияние полимера на связывание белка с субстратом. Оставшиеся 5 остатков ли зина расположены в области контакта субъединиц аспарагиназы. Это означает, что при олигомеризации они окажутся внутри тетрамера. При пегилировании -аминогрупп данных лизиновых остатков фермент не способен образовывать тетра мерную структуру. Вероятно, этим и можно объяснить уменьшение величины Vmax для PEG-ECAR_LANS.
Важной характеристикой аспарагиназы с точки зрения ее токсичности для ор ганизма, является отношение L-глутаминазной активности к L-аспарагиназной. В ре зультате эксперимента по оценке активности аспарагиназы в отношении L-глутамина не выявлено значительных различий в субстратной специфичности нативной и моди фицированной аспарагиназ. Отношение глутаминазной активности к аспарагиназной для пегилированного фермента составляет 2-3%. Полученные данные коррелируют с результатами Monfardini с соавт. (1995) также не обнаружившими существенных раз личий в субстратной специфичности, значениях Km и Vmax между нативной и моди фицированной ПЭГ аспарагиназой из дикого штамма Erw. carotovora.
Стабильность модифицированного фермента.
Известно, что пегилирование белков приводит к повышению их устойчивости к воздействию денатурирующих агентов и биостабильности в организме за счет микро окружения создаваемого молекулами ПЭГ. Поэтому представляло интерес исследо вать устойчивость пегилированной аспарагиназы Erw. carotovora к воздействию раз личных денатурирующих факторов.
Термодинамическую стабильность аспарагиназы оценивали по изменению ферментативной активности в условиях повышенной и пониженной температур. В первом случае для постановки опыта была выбрана середина температурного опти мума ферментов, равная 45°С. Через 1 час инкубации активность нативного белка со ставила 30,7%, в то время как пегилированная аспарагиназа сохранила более 40% ак тивности (рис. 6, А). Более значительная разница между двумя формами фермента выявилась в результате определения стабильности аспарагиназ при циклах заморажи вания – оттаивания. Активность нативной аспарагиназы снижалась быстрее, по срав нению с пегилированным белком. После 50-го цикла ECAR_LANS сохранила 53% ак тивности от исходного значения, а PEG-ECAR_LANS – более 70% (рис. 6, Б).
Таким образом, результаты опытов, представленные на рис. 6, свидетельствуют о том, что полученный пегилированный белок обладает повышенной термодинамиче ской стабильностью благодаря стерической защите, создаваемой высоко гидрофиль ными цепями полимера.
А 100 100 Б Активность, % Активность, % 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 Число циклов замораживания-оттаивания при -20С Время инкубации, мин Рис. 6. Зависимость активности нативной () и пегилированной () аспарагиназы от (А) времени инкубации при 45°С и (Б) числа циклов замораживания-оттаивания. (А) Аспараги назу (0,5-0,75мг/мл) в 0,02М фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,0) инкубировали при 45С, отбирали пробы, охлаждали до комнатной температуры и измеряли ферментатив ную активность. (Б) Аспарагиназу (1 мг/мл) замораживали при -20°C, затем оттаивали при 37oC, отбирали пробы и измеряли активность.
Устойчивость фермента к протеолитической деградации определяли по изме нению активности аспарагиназы при инкубации с трипсином. Нативная аспарагиназа теряет половину своей активности уже через 12,5 минут инкубации (рис 7, А). В тех же условиях эксперимента пегилированный белок сохраняет более 80% своей актив ности. Через 1 час активность ECAR_LANS составила около 13%, а PEG ECAR_LANS – 34,8%.
Известно, что каталитическое действие трипсина отличается высокой специ фичностью: он гидролизует пептидные связи, в образовании которых участвуют кар боксильные группы лизина (Ленинджер А., 1985). Следовательно, высокая устойчи вость модифицированной аспарагиназы к трипсину возможна благодаря ковалентно му связыванию молекул ПЭГа с -аминогруппами лизина, являющимися сайтами расщепления трипсином. Таким образом, можно предположить, что пегилированная аспарагиназа будет более устойчива по сравнению с нативным ферментом и к про теолитической деградации под действием трипсиноподобных протеаз плазмы. Чтобы это проверить, было исследовано изменение активности белка при его инкубации в присутствии плазмы крови человека. Как следует из (рис. 7, Б) через 48 часов инкуба ции PEG-ECAR_LANS сохраняет в 3 раза более высокую активность по сравнению с исходным ферментом. Такое существенное различие в устойчивости к протеолизу между двумя формами аспарагиназы доказывает стабилизирующий белок эффект пе гилирования. Вследствие этого, модифицированная аспарагиназа будет способна к более длительной циркуляции в кровяном русле человека, другими словами будет об ладать большим временем полужизни.
А 100 Б Активность, % Активность, % 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 50 Время, мин Время, час Рис. 7. Протеолитическая стабильность нативной () и пегилированной () аспарагиназы при инкубации с (А) трипсином и (Б) плазмой крови человека. (А) Аспарагиназу (150 мкг) инкубировали с трипсином (20 мкг) в 0,02 М фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,4) при 37°С;
добавляли 10-кратное количество STI-ингибитора и определяли ферментативную активность. (Б) Аспарагиназу (50 мкг) инкубировали в 400 мкл раствора, содержащего мкл плазмы и равное количество фосфатно-солевого буфера (pH 7,4);
отбирали пробы и из меряли активность.
Таким образом, результаты опытов, представленные на рис.7, указывают на то, что пегилированная аспарагиназа Erw. carotovora обладает повышенной протеолити ческой стабильностью по сравнению с нативным ферментом. Учитывая перспективу клинического применения препарата ПЭГ-аспарагиназы Erw. carotovora, это повысит его терапевтическую эффективность.
Оценка цитотоксической активности ПЭГ-аспарагиназы in vitro.
Увеличение стабильности пегилированной аспарагиназы позволяет предполо жить усиление ее цитотоксических свойств. Противоопухолевую активность in vitro определяли на нескольких клеточных линиях, чувствительных к аспарагиназе.
В ходе экспериментов было установлено, что максимальная антипролифера тивная активность аспарагиназы Erw.carotovora проявляется на клеточных линиях MOLT-4 и Raji. При концентрации фермента 2 МЕ/мл выживаемость опухолевых клеток линии Raji составила не более 7%, а для клеток линии MOLT-4 выживаемость была практически нулевой.
Как видно из рис. 8, пегилированная аспарагиназа обладает более выраженной противоопухолевой активностью, по сравнению с исходным белком. Значение LC для клеток Raji составило 0,4 МЕ/мл и 0,3 МЕ/мл для нативного и модифицированно го фермента, соответственно. Для клеток MOLT-4 величина LC50 оказалась равной 1, МЕ/мл для ECAR_LANS и 0,8 МЕ/мл для PEG-ECAR_LANS. Другими словами, зна чение LC50 пегилированной аспарагиназы для этих клеточных линий примерно на треть ниже по сравнению с LC50 исходного фермента.
Выживаемость, % от контроля Выживаемость, % от контроля Б А 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2, Аспарагиназа, МЕ/мл Аспарагиназа, МЕ/мл Рис. 8. Цитотоксическая активность нативной () и пегилированной () аспарагиназы для лимфобластной Т-клеточной лимфомы MOLT-4 (А) и лимфомы Беркитта Raji (Б).
Таким образом, пегилирование аспарагиназы привело к повышению цитоток сической активности фермента, что можно объяснить повышением ее стабильности по отношению к действию клеточных протеаз.
Следует отметить, что полученный модифицированный белок, также как и на тивный, не является токсичным для нормальных клеток. В опытах на эмбриональных фибробластах человека показано, что рост клеток в присутствии аспарагиназы прак тически не изменяется, выживаемость клеток не менее 90-95%.
Характеристика иммуногенности пегилированной L-аспарагиназы Erwinia carotovora.
На заключительном этапе работы был проведен сравнительный анализ иммуногенности препаратов исходной и модифицированной аспарагиназ Erw.
carotovora. С помощью прямого твердофазного ИФА определяли титр антител в сыворотках, полученных в результате иммунизации мышей нативной и пегилированной аспарагиназой.
За титр принимали точку перегиба кривой, полученной аппроксимацией дан ных нескольких независимых экспериментов полиномом 5-й степени. Установлено, что титры антисывороток составляют 128 – для ECAR_LANS и 16 – для PEG ECAR_LANS (рис. 9).
Таким образом, пегилирование аспарагиназы приводит к восьмикратному сни жению антителообразования. Подобный эффект модификации на выработку антител описан во многих работах (Kamisaki et al., 1981;
Kawamura et al., 1985).
1, 1, 1, Поглощение (405нм) 1, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 1 2 4 8 16 32 64 128 1/разведение сыворотки Рис. 9. Сравнительная оценка иммуногенности нативной () и пегилированной () аспа рагиназы. -отрицательный контроль Можно сделать вывод о том, что применение пегилированной формы рекомбинант ной L-аспарагиназы Erw. сarotovora аспарагиназы будет более предпочтительно в связи с ее в значительной степени уменьшенной иммуногенностью.
ВЫВОДЫ 1. Впервые получена модифицированная полиэтиленгликолем рекомбинант ная аспарагиназа Erw. сarotovora. Разработанный метод пегилирования с использованием в качестве модифицирующего реагента метоксиполиэти ленгликоль-п-нитрофенилкарбоната с молекулярной массой 5000 позволяет сохранить около 80% активности модифицированного фермента.
2. Установлено, что пегилированная аспарагиназа обладает более высокой стабильностью к протеолизу под действием трипсина и трипсиноподобных протеаз плазмы крови, а также к воздействию температуры по сравнению с нативным ферментом.
3. В опытах in vitro показано, что модифицированная рекомбинантная аспара гиназа Erw. carotovora проявляет более высокую противоопухолевую ак тивность в отношении клеток линий MOLT-4 и Raji, по сравнению с натив ным ферментом. Значение LC50 пегилированной аспарагиназы для этих кле точных линий примерно на треть ниже LC50 немодифицированного фермен та.
4. В опытах на лабораторных животных установлено, что препарат пегилиро ванной аспарагиназы приводит к восьмикратному снижению антителообра зования по сравнению с нативным ферментом и, таким образом, обладает пониженной иммуногенностью.
5. Полученные в ходе изучения пегилированной рекомбинантной аспарагина зы Erwinia carotovora результаты – повышение устойчивости к протеолизу и температурному воздействию, снижение иммуногенности и высокая проти воопухолевая активность позволяют рассматривать модифицированный фермент в качестве перспективной основы для создания лекарственного препарата, более эффективного по сравнению с нативной аспарагиназой.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Linnea E. K. Wikman, Julya Krasotkina, Anastasia Kuchumova, Nikolay N.
Sokolov and Anastassios C. Papageorgiou. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of L-asparaginase from Erwinia carotovora. // Acta Crystallographica. – 2005. – Vol. 61(Pt 4). – P. 407-409.
2. А.В. Кучумова, Ю.В. Красоткина, П.З. Хасигов, Н.Н. Соколов.
Пегилирование рекомбинантной аспарагиназы Erwinia carotovora полиэтиленгликолем 5000. // Биомедицинская химия. – 2007. – Т. 53(1). – С. 107-111.
3. Ю.В. Красоткина, О.Ю. Абакумова, О.В. Подобед, С.М. Медников, А.В.
Кучумова, Н.Н. Соколов. Цитостатическая активность рекомбинантной L аспарагиназы Erwinia carotovora. // Сборник докладов II научно – практической конференции проблемы медицинской «Актуальные биотехнологии». – Анапа. – 2005. – С. 2.
4. Ю.В. Красоткина, О.Ю. Абакумова, О.В. Подобед, С.М. Медников, А.В.
Кучумова, Н.Н. Соколов. Влияние стабильности бактериальной аспарагиназы Erwinia carotovora на ее противоопухолевую активность in vitro. // Сборник докладов II научно – практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии». – Анапа. – 2005. – С. 3.
5. А.В. Кучумова, Ю.В. Красоткина, Н.Н. Соколов. Пегилирование аспарагиназы Erwinia carotovora повышает стабильность фермента. // Сборник трудов международной конференции «Фундаментальные науки – биотехнологии и медицине». – Новосибирск. – 2006. – С. 21.
6. Ю.В. Красоткина, А.В. Кучумова, Н.Н. Соколов. Цитотоксическая активность аспарагиназы зависит от ее глутаминазной специфичности.
Материалы Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярные основы и клинические проблемы резистентности к лекарственным средствам». – Киев. – 2006. – С. 31.
7. Ю.В. Красоткина, А.В. Кучумова, Н.Н. Соколов. Моделирование каталитических свойств рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora c целью создания эффективного противолейкозного препарата. Сборник трудов съезда общества биотехнологов России им. Ю.А.
4-го Овчинникова.– Пущино. – 2006. – С. 23.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта №2828 Международного научно-технического центра (США), и гранта № 06-04-49792 Российского фонда фундаментальных исследований.
Список сокращений ДСН – додецилсульфат натрия ИПТГ – изопропил--D-тиогалактопиранозид ИФА – иммуноферментный анализ мПЭГ – монометиловый эфир полиэтиленгликоля МТТ – 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид ПААГ/ДСН – полиакриламидный гель с добавлением додецилсульфата натрия ПЭГ – полиэтиленгликоль ABTS – 2,2-азино-бис-[3-этилбензотиазол-6-сульфонат]-аммония ECAR_LANS – рекомбинантная L-аспарагиназа Erw. carotovora Medac – коммерческий препарат L-аспарагиназы E. coli mPEG-pNP – метоксиполиэтиленгликоль-п-нитрофенилкарбонат PEG-ECAR_LANS– модифицированная полиэтиленгликолем рекомбинантная L-аспарагиназа Erw. carotovora pI – изоэлектрическая точка