Динамика выживания бактерий в цепи взаимосвязанных природных субстратов

На правах рукописи

КУПРИЯНОВ Алексей Александрович ДИНАМИКА ВЫЖИВАНИЯ БАКТЕРИЙ В ЦЕПИ ВЗАИМОСВЯЗАННЫХ ПРИРОДНЫХ СУБСТРАТОВ Специальность 03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2009

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

Научный консультант:

доктор биологических наук Семёнов Александр Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ушакова Нина Александровна доктор биологических наук, профессор Кураков Александр Васильевич

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К. А. Тимирязева

Защита диссертации состоится 11 декабря 2009 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете имени М. В.

Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет МГУ имени М. В. Ломоносова, ауд. 557.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 10 » ноября 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Н. Ф. Пискункова А к т у а л ь н о с т ь п р о бл е м ы. И с с л е д о в а н и е п у т е й р а с п р о с т р а н е н и я микроорганизмов в природных средах и их активности, прослеживание судьбы популяций в естественных субстратах, контаминация почвы и других природных местообитаний, определение риска попадания микроорганизмов, в том числе патогенных, в организм человека и животных с пищей, в частности с овощной продукцией, продолжает оставаться актуальной задачей (Заварзин, 1989;

Кожевин, 1989;

Добровольская, 2002;

Ranjard, 2001;

Natvig, 2002;

Ingham, 2004;

Semenov, 2004;

Franz, 2005;

Van Bruggen, 2008).

Тр а д и ц и о н н ы м м е т од и ч е с к и м п р и е м ом и с с л е д о в а н и я в ы ж и в а н и я микроорганизмов в естественных субстратах является интродукция их в такие субстраты и прослеживание популяционной динамики в конкретном субстрате. Закономерности поведения сапротрофных микроорганизмов при их интродукции и динамика выживания в одном субстрате неоднократно исследовались (Звягинцев, 1987;

Звягинцев и Голимбет, 1983;

Кожевин, 1989;

Семенов, 2005;

Ahn, 2001;

Zelenev, 2005). Исследования выживания микроорганизмов, а тем более энтеропатогенов, при последовательном перемещении их из одного в другой или третий субстрат все еще редки (Шустрова и др., 1992;

Semenov, 2004).

В подавляющем большинстве работ, связанных с выявлением динамики микроорганизмов в природе и особенно патогенных микроорганизмов, исследователи ограничиваются прослеживанием их наличия и численности только в одном природном субстрате или местообитании (Wang, 1996;

Kudva, 1998;

Himathongkham, 1999;

Jiang, 2002). Однако существует проблема перемещения микроорганизмов из одного местообитания в другие, а тем более перемещения через несколько разных местообитаний в виде цепи и даже с образованием цикла (Семенов, 2005).

Закономерности именно такого распространения сапротрофных, а особенно патогенных, микроорганизмов остаются малоизученными, хотя указания на существование такого цикла высказывались давно, а само явление несомненно и интереснее, и важнее, чем просто динамика выживания микроба в одном субстрате (Мишустин и др., 1979;

Литвин и др., 1997;

Семенов, 2005).

В настоящее время в разных странах широко развернулось движение за производство «экологически чистых » продуктов, охрану природы от бесконтрольной химизации и, в том числе, от распространения генетически модифицированных организмов и, в частности, микроорганизмов (ГММ). В повседневной практике внесение некомпостированного или недостаточно компостированного навоза в почву – нередкость, особенно при использовании «экологически чистых» технологий производства продуктов. Это несет в себе серьезную опасность для человека быть инфицированным такими штаммами бактерий как E. coli O157:H7, Salmonella spp., Campilobacter jejuni, Listeria monocytogenes и другими. Бактерии Salmonella spp., Esсherichia coli О157:Н являются наиболее распространенными возбудителями пищевых отравлений в мире, связанных с употреблением инфицированных мясных и молочных продуктов, фруктов, овощей и их производных, в частности, соков и пюре (Altwegg, 1998;

Brackett, 1999;

Rangel et al., 2005).

Резервуарами и распространителями упомянутых энтеропатогенов традиционно рассматривают животных. Однако последние исследования показывают, что энтеропатогены успешно выживают и вне желудочно-кишечных трактов (ЖКТ) животных (Van Bruggen et al., 2008). Именно этими фактами вызваны те массированные исследования, развернувшиеся в зарубежных научных центрах (Natvig, 2002;

Solomon, 2002;

Ingham, 2004;

Franz, 2005).

Энтеробактерии способны проникать в ткани растений, выживая в них, и поэтому опасность распространения инфекций существенно возрастает (Люлин, 2007;

Solomon, 2002;

Klerks, 2007).

Таким образом, как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения изучение явления многократного перемещения микроорганизмов через различные, но взаимосвязанные местообитания, способность конкретной популяции проходить по цепи взаимосвязанных субстратов, в том числе в виде цикла и количественные закономерности таких перемещений являются важными и нужными.

Целью работы являлось изучение выживания бактерий, сапротрофных и аналогов энтеропатогенных, при перемещении в цепи природно-связанных субстратов с образованием цикла : животные - экскременты животных – почва – растения и опять животные и выявление количественных закономерностей динамики перемещающихся популяций.

Для выполнения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. В лабораторных экспериментах изучить закономерности выживания аналогов энтеропатогенных Salmonella Тyphimurium MAE 110 gfp, Escherichia coli O157:H7 gfp и сапротрофных Pseudomonas fluorescens 32 gfp бактериальных популяций в краткосрочных экспериментах при интродукции их в экскременты крупного рогатого скота (ЭКРС) и последующем перемещении в серии природных субстратов в зависимости от исходной численности бактерий.

2. Определить длительность выживания исследуемых популяций бактерий в краткосрочных и долгосрочных экспериментах при интродукции их в ЭКРС и после перемещения в почву при циклически изменяющейся и постоянной температуре, а также при дальнейшем перемещении на растения, через ЖКТ животных и в экскрементах животных.

3. Определить способность избранных бактерий расти в комбикорме, используемом для кормления разных сельскохозяйственных животных.

4. Изучить способность исследуемых бактерий проходить через ЖКТ коров при попадании таких бактерий в пищеварительный тракт с кормами, динамику выживания бактерий в экскрементах и при последующем перемещении бактерий в почву, на растения и через ЖКТ других животных.

5. Исследовать способность бактерий проходить через ЖКТ птиц (кур) при попадании в ЖКТ с кормами, динамику их выживания в экскрементах и в воде при инокуляции воды такими экскрементами.

Научная новизна. Впервые в серии лабораторных и натурных экспериментов на примере представителей энтеропатогенных и сапротрофных бактерий проведены сравнительные исследования возможно сти перемещений индивидуальных бактериальных популяций через серию природных местообитаний: животные – их экскременты – почва – растения и опять животные с фактическим образованием цикла.

Показана возможность существования укороченных цепей и циклов. Результаты дают основание полагать, что циркуляция микроорганизмов может происходить не только в виде замкнутой цепи-цикла, но и в виде замкнутой сети. Выявлена возможность активного роста энтеропатогенных и сапротрофных бактерий в комбикорме с последующим прохождением этих бактерий через ЖКТ разных животных. Установлено, что циклически меняющаяся температура, соответствующая природному режиму день ночь, более негативно действует на выживание энтеропатогенных и сапротрофных бактерий, как в ЭКРС, так и смеси ЭКРС-почва, чем традиционно применяемая в исследованиях постоянная температура. Этот факт необходимо принимать во внимание при оценке риска выживания и распространения микроорганизмов в природе. В круговороте или цикле микроорганизмов имеются местообитания, в которых может происходить увеличение численности микроорганизмов. Показано, что на растениях, может происходить «подращивание» популяций патогенных микроорганизмов. Получено подтверждение положению о том, что численность интродуцента, сравнимая или несколько меньшая численности культивируемых аборигенов, является более оптимальной для прохождения по цепи субстратов, чем очень высокая или очень низкая численности. Установлено, что при интродукции микроорганизмов в природные субстраты имеет место не ограниченный акт существования конкретного микроорганизма в том конкретном местообитании, а скорее последовательная многоступенчатая интродукция с возможными отдаленными последствиями для экосистемы.

Практическая значимость. Полученные результаты найдут применение при разработке методик оценки риска распространения энтеропатогенных микроорганизмов в природе, а также для разработки методических пособий и рекомендаций по предотвращению неконтролируемого распространения генетически модифицированных микроорганизмов в природе. Результаты исследований следует направить в органы санэпидемнадзора для использования при разработке мер и правил санитарно эпидемиологического контроля пищевой продукции и, в первую очередь, для разработки мер и правил выращивания, хранения и переработки овощной продукции.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на конференциях и симпозиумах: «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», Саратов, 2005;

«Автотрофные микроорганизмы», Москва, 2005;

«Микроорганизмы и биосфера», Москва, 2007.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ: экспериментальные статьи, 3 тезисов конференций, 2 статьи приняты в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, списка литературы, который содержит 222 наименований работ. Материалы диссертации изложены на 141 страницах текста и включают 19 рисунков и 4 таблицы.

Место проведения работы, сотрудничество и благодарности. Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Исследования поддержаны NWO – RFBR (Dutch – Russia) collaborative grants (Dossier numbers 047.014.001 and 047.0147.011) for A.H.C. van Bruggen and A.M. Semenov. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю Семенову А.М., д.б.н, проф. Нетрусову А.И., д.б.н. Захарчуку Л.М., к.б.н. Пискунковой Н.Ф., а также всем сотрудникам и аспирантам кафедры микробиологии биофака МГУ. Особая благодарность и признательность к.б.н., доц. Семёновой Е.В.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Микроорганизмы, их выявление и культивирование. Объектами исследований были генетически маркированные бактерии, способные синтезировать зеленый флуоресцирующий белок (GFP). Исследования проводились с антибиотикоустойчивыми и авирулентными штаммами (гены вирулентности удалены).

Salmonella enterica var. Т yphimurium MAE 110 gfp получена от д- ра Ю. Ремлинг (микробиологический центр, Каролевский институт, Стокгольм, Швеция). Escherichia coli O157:H7 штамм В 6-914 gfp-91 получена из лаборатории проф. А. Ван Бругген, Университет Вагенингена, Нидерланды. Pseudomonas fluorescens 32 gfp получена от Dr.

J.M. Raaijmakers, Университет Вагенингена, Нидерланды.

Gfp-меченые бактерии учитывали прямым учетом под люминесцентным микроскопом (МИКМЕД 2 ЛЮМАМ РПО 11, СПб ОМО ) и посевом на селективные среды с последующим освещением колоний голубым светом лампы (PL-S, Philips, Eindhoven, The Netherlands).

S. Typhimurium gfp выявляли на среде, содержащей г/л: дрожжевой экстракт - 5, бактопептон - 10, агар – 17, с добавлением налидиксовой кислоты (50 мг/л ) и канамицина (50 мг/л). E. coli O157:H7 gfp выявляли на среде, содержащей г/л: дрожжевой экстракт - 5, бактопептон - 10, NaCl - 10, агар – 17 с добавлением ампициллина (50 мг/л).

P. fluorescens 32 gfp выявляли на среде, содержащей г/л : бактопептон – 2;

К 2НРО4 - 1,4;

МgSO4·7H2O - 1,5;

глицерин - 15 мл/л ;

агар – 17 с добавлением канамицина (50 мг/л ) и рифампицина (50 мг/л ). Для предотвращения роста грибов во все среды добавляли циклогексимид (100 мг/л). Учет аборигенных копиотрофных бактерий проводили посевом на среду: 0.5 г MgSO4*7H2O, 0.5 г KNO3, 1.3 г K2HPO4*3H2O, 0.06 г Ca(NO3)2*4H2O, 2.5 г глюкозы, 0.2 г гидролизата казеина, 17 г агара в 1 л дистиллированной воды. Олиготрофные бактерии учитывали на той же среде при уменьшении концентрации глюкозы и гидролизата казеина в 100 раз.

Биомассу бактерий выращивали в тех же, но на жидких средах с последующим центрифугированием, отмыванием и доведением до требуемого титра.

Для изучения перемещения популяций бактерий и выживания их в разных природных субстратах использовали: экскременты крупного рогатого скота (ЭКРС), дерново-подзолистую почву, прудовую воду, комбикорм.

При определении выживания бактерий в филосфере и ризосфере растений использовали кресс-салат (Lepidium sativum L.) и овес (Avena sativa L.) В экспериментах по выживанию бактерий при перемещении через ЖКТ животных использовали коров (Bos taurus taurus L.), мышей (Mus musculus cf.), морских свинок (Cavia aperea L.), кур (Gallus gallus domesticus L.) и беспозвоночных животных – виноградных улиток (Helix pomatia L.).

Для выявления хищников (протозоа и нематод) в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва использовали метод предельных разведений.

Определение водорастворимого органического углерода (ВОУ) в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва производили бихроматным методом.

Постановка экспериментов. Для выявления динамики прогревания ЭКРС в зависимости от его массы 0,5, 1,0 и 2,0 кг ЭКРС помещали в емкости и инкубировали в течение 10 сут. при циклическом режиме: 8 ч при 25С и 16 ч при 15С. При интродукции в ЭКРС суспензии бактерий исходная инокуляционная доза бактерий составляла от кл/г сух. ЭКРС до 105 КОЕ/г сух. ЭКРС в зависимости от цели эксперимента. ЭКРС инкубировали при постоянной и/или циклически изменяющейся температуре, инкубирование ЭКРС проводили от 10 до 55 сут. Момент смешивания ЭКРС, содержащего интродуцированные бактерии, с почвой в каждом конкретном случае определяли экспериментально. При этом половину объема ЭКРС отбирали и смешивали с почвой в соотношении 1:6, что в пересчете на сухую массу составляло 1:16. Эту часть экспериментов мы называем краткосрочными. Оставшуюся часть ЭКРС продолжали инкубировать в тех же условиях, периодически определяя численность интродуцентов, а смешивание с почвой производили только через несколько недель. Эту вторую часть экспериментов мы называем долгосрочными. Смеси ЭКРС-почва инкубировали при тех же условиях, что и ЭКРС. После инкубирования в смесь ЭКРС-почва производили посев семян кресс-салата. В филосфере и ризосфере выросшего кресс-салата определяли численность интродуцентов, а часть его скармливали виноградным улиткам с последующим определением численности бактерий в экскрементах улиток.

Для определения роста бактерий в кормах, применяемых для кормления с/х животных, использовали комбикорм. Готовили суспензию 12 г комбикорма в 100 мл нестерильной водопроводной воды, инокулировали суспензию исследуемыми бактериями в количестве ~102 КОЕ/г сух. вещ. и культивировали на качалке при 250 об/мин в течение 30 ч при температуре 25С для P. fluorescens 32 gfp и 37С для S. Тyphimurium MAE gfp и E. coli O157:H7 gfp. В динамике отбирали пробы и учитывали КОЕ с пересчетом на г сух. комбикорма.

Выживание бактерий при прохождении через ЖКТ коров с пищей исследовали путем скармливания коровам 1,5 кг предварительно “запаренного” (смесь 1 кг комбикорма с 500г горячей воды) и охлажденного комбикорма, содержащего ~107 КОЕ/г сух. комбикорма соответствующих бактерий. Через сутки после кормления собирали образцы ЭКРС и учитывали в них искомые бактерии посевом на селективные питательные среды. Для определения динамики выживания бактерий в собранных ЭКРС, навески ЭКРС помещали в емкости и инкубировали при 18С в течении 11 сут. с отбором проб для учета интродуцентов. После этого проводили смешивание ЭКРС с почвой в соотношении 1:6 и продолжали инкубировать в тех же условиях, определяя динамику численности. Затем в эту смесь высевали семена овса. В филосфере и ризосфере семидневных всходов овса определяли численность меченых бактерий и далее скармливали проростки мышам и морским свинкам с выявлением исследуемых бактерий в их экскрементах.

Проверку выживания бактерий при прохождении через пищеварительный тракт птиц с пищей исследовали путем скармливания курам 1,5 кг комбикорма, содержащего ~107 КОЕ/г сух. комбикорма соответствующих бактерий. Через сутки после скармливания проводили сбор экскрементов и определяли в них исследуемые бактерии.

Собранные экскременты помещали в емкости и инкубировали при 18С в течение 8 сут. с регулярным определением динамики численности бактерий, после чего проводили смешивание экскрементов с водой в соотношении 1:10 и определяли динамику выживания исследуемых бактерий в течение 18 сут.

Все эксперименты проведены три раза в трех повторностях. Результаты представлены усредненными значениями. Сравнение выживания разных бактерий и разных условий проводили с использованием t-теста. Данные динамики выживания бактерий в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва были подвергнуты аппроксимации логистическими уравнениями. Статистический анализ проводили с помощью программ в Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Модельные эксперименты по выживанию бактерий в разных природных субстратах в зависимости от популяционной плотности бактерий и колебаний температуры. Настоящий раздел работы имел своей целью изучить динамику выживания представителей энтеропатогенных и сапротрофных бактерий при перемещении их в серии природных субстратов при разной исходной численности испытуемых микроорганизмов, а также при циклически изменяющейся температуре, соответствующей смене дня и ночи.

1. 1. Динамика прогревания ЭКРС. В природных условиях температура изменяется, нередко циклически, в первую очередь, при смене дня и ночи.

Следовательно, важны знания закономерностей выживания бактерий не столько в условиях стабильной температуры, сколько при циклически изменяющейся.

Температурный режим был избран на основе анализа собственных трехлетних данных среднелетней дневной и ночной температур в Московской области (Талдомский район). В наших экспериментах стабильно повторяющиеся результаты были достигнуты через часов после начала эксперимента. Было установлено, что температура ЭКРС при его массе 0,5 кг колебалась наиболее близко к задаваемым значениям 25С “днем” и 15С “ночью” по сравнению с массами 0,1 и 2 кг. В связи с этим, для дальнейших экспериментов была избрана масса 0,5 кг ЭКРС.

1. 2. Выживание бактерий, интродуцированных в разной концентрации в ЭКРС, их динамика в смеси ЭКРС-почва, на растениях кресс-салата и в экскрементах виноградных улиток. Эксперименты имели своей целью сравнение популяционной динамики бактерий в зависимости от инокуляционной (инфекционной) дозы.

1. 2. 1. Динамика выживания интродуцентов в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва.

Популяционная динамика выживания S. Typhimurium gfp и E. coli O157:H7 gfp в ЭКРС в краткосрочных экспериментах была довольно сходной и мало зависела от исходной инокуляционной дозы. Как при самой высокой инокуляционной дозе 9,5·108 кл/г ЭКРС для S. Typhimurium gfp и E. coli O157:H7 gfp, так и при самой низкой 7,1·104 КОЕ/г ЭКРС и 6,8·104 КОЕ/г ЭКРС для S. Typhimurium gfp и E. coli O157:H7 gfp соответственно, их численность через 10 сут. осталась довольно стабильной (5,5·108 кл/г и 5,8·104 КОЕ/г ЭКРС). Популяционная динамика P. fluorescens 32 gfp в целом была схожа с энтеробактериями, однако, при наивысшей концентрации снижение численности за наблюдаемые 10 сут было более выраженным (рис. 1).

Динамика энтеробактерий в смеси ЭКРС-почва была, в целом, сходна с таковой в ЭКРС, хотя снижение численности интродуцентов было более интенсивным, чем это наблюдалось в ЭКРС. При этом наиболее заметное снижение численности для энтеробактерий имело место при наибольшей и наименьшей инокуляционных дозах (рис.

1).

Заметное снижение численности интродуцентов в смеси ЭКРС-почва может быть объяснено несколькими причинами. В первую очередь, снижением субстратов, о чем косвенно свидетельствует уменьшение концентрации ВОУ в этих субстратах. Если в ЭКРС было обнаружено 7,8·104 мкг ВОУ/г сухого вещества, то в смеси ЭКРС-почва только 1,2·103 мкг ВОУ/г сухого вещества.

При выявлении хищников бактерий было установлено, что в пробах разведений ЭКРС только в первом разведении обнаруживались простейшие. В смеси ЭКРС-почва обнаруживаются еще и незначительная численность нематод. В других разведениях ни простейшие, ни нематоды никогда не обнаруживались, следовательно, выедание бактерий хищниками крайне незначительно.

По сравнению с динамикой интродуцентов, как P. fluorescens 32 gfp, так и энтеробактерий и в ЭКРС, и в смеси ЭКРС-почва, которая была довольно стабильной, динамика аборигенов была волнообразной, как это имеет место у природных популяций бактерий (Кожевин, 1989;

Zelenev et al, 2004;

Semеnov, 2005). В динамике КОЕ аборигенов, учитываемых на богатой среде - копиотрофов и на бедной - олиготрофов, в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва имели место пики возрастания и снижения численности (рис.

2). Усредненная численность аборигенов в целом соответствовала тем «промежуточным» начальным численностям интродуцентов (108 и 107) в наших экспериментах, которые оказались наиболее оптимальными при выживании исследуемых интродуцентов в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва.

Рис. 1. Динамика выживания: А - S. Typhimurium MAE 110 gfp;

Б - E. coli O157:H7 gfp;

В - P. fluorescens 32 gfp при интродукции в ЭКРС с последующим перемещением в почву в зависимости от исходной концентрации клеток;

стрелкой показано время смешивания с почвой. Исходная концентрация: 1 - 109 кл/г сух. ЭКРС, 2 108 кл/ г сух. ЭКРС, 3- 107 кл/г сух. ЭКРС, 4 - 105 КОЕ/г сух. ЭКРС.

Численность интродуцентов на растениях и в экскрементах 1. 2. 2.

виноградных улиток после скармливания растений улиткам. Судьба энтеробактерий и псевдомонады при разных исходных инокуляционных дозах была прослежена на растениях и в экскрементах животных после скармливания этих растений беспозвоночным (рис. 3). Закономерности выживания популяций интродуцентов, по крайней мере энтеробактерий, в филосфере и ризосфере кресс-салата отличались от таковых в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва. Если в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва, хотя и медленно, но происходило снижение численности, то на растениях, как в ризосфере, так и в филосфере обнаружено увеличение численности всех исследованных бактерий.

Таким образом, растения кресс-салата как местообитание оказалось благоприятным и для энтеробактерий, и для сапротрофной псевдомонады, условия которого способствовало их росту или концентрированию.

Таким образом, оптимальной концентрацией бактерий для интродукции в природные субстраты и успешного прохождения по цепи разных субстратов в краткосрочных исследованиях при постоянной температуре является такая, которая более или менее совпадает с концентрацией, выявляемых на средах аборигенов.

Рис. 2. Динамика численности аборигенных бактерий в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва на богатой и бедной средах;

стрелкой показано время смешивания с почвой.

1.3. Краткосрочная и долгосрочная динамика выживания бактерий, интродуцированных в ЭКРС при циклически меняющейся температуре, и их численность в смеси ЭКРС-почва, на растениях кресс-салата и в экскрементах виноградных улиток.

В этой серии экспериментов решались задачи как определения длительности выживания популяций в цепи природных субстратов, так и влияние циклически изменяющейся температуры по сравнению с постоянной на выживание исследуемых бактерий.

1.3.1. Краткосрочная и долгосрочная динамика выживания бактерий в ЭКРС и в смеси ЭКРС-почва при циклически меняющейся температуре. Сразу после внесения суспензии каждого конкретного интродуцента с ЭКРС количество бактерий составляло в среднем 1010 кл/г сух. ЭКРС.

Рис. 3. Динамика выживания: А - S. Typhimurium MAE 110 gfp;

Б - E. coli O157:H gfp;

В - P. fluorescens 32 gfp, интродуцированных в ЭКРС при разной исходной численности и в последующих ключевых точках при перемещении интродуцентов в почву, на растения кресс-салата и через ЖКТ улиток после скармливания им выращенного кресс-салата. Исходная концентрация: 1 - 109 кл/г сух. ЭКРС, 2 - 108 кл / г сух. ЭКРС, 3 - 107 кл/г сух. ЭКРС, 4 - 105 КОЕ/г сух. ЭКРС.

Со временем численность E. coli О157:Н7 gfp и P. fluorescens 32 gfp постепенно снижалась и через 15 сут составила 5·107 кл/г сух. ЭКРС для P. fluorescens 32 gfp и 3,0· кл/г сух. ЭКРС для E. coli O157:H7 gfp. Численность S. Тyphimurium gfp в течении первых 8 сут после интродукции также снизилась до 2,6·108 кл/ г сух. ЭКРС, но затем произошла стабилизация и даже некоторое увеличение численности. На 15-й день динамики численность S. Тyphimurium gfp составляла 3,4·108 кл/г сух. ЭКРС (рис. 4).

Для изучения динамики выживания бактерий в серии разных субстратов необходима их достаточно высокая популяционная плотность. Хотя в динамике численности S. Тyphimurium gfp наступила стабилизация, но численность E. coli О157:Н gfp и P. fluorescens gfp уменьшалась, то в связи с этим через 15 сут после интродукции было произведено смешивание ЭКРС с интродуцентами с почвой (рис. 4). Чтобы не допустить уменьшения численности интродуцентов ниже детектируемого уровня, а с другой стороны, чтобы как можно дольше проследить динамику выживания интродуцентов, было проведено разделение массы ЭКРС так, чтобы динамика численности каждой бактерии в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва была бы исследована и при краткосрочном инкубировании, и при долгосрочном.

После смешивания ЭКРС с почвой численность интродуцентов из- за разведения, естественно, резко уменьшилась в среднем на порядок и составила 2,9·107, 2,5·107 и 3,4·107 кл/ г сух. вещ. для S. Тyphimurium gfp, E. coli O157:H7 gfp и P. fluorescens 32 gfp соответственно. В дальнейшем, в течение последующих 20 сут, имело место плавное уменьшение численности интродуцентов, которое было более выражено у E. coli O157:H7 gfp, слабее у S. Тyphimurium gfp и практически не наблюдалось у P. fluorescens 32 gfp (рис. 4).

В долгосрочных экспериментах при инкубировании ЭКРС до 55 сут у всех бактерий наблюдалось снижение численности, однако скорость снижения была разной.

Наибольшее снижение, более порядка, как при учете КОЕ, так и клеток, выявлено в популяции E. coli O157:H7 gfp, а минимальное снижение – в популяции сальмонеллы.

Смешивание ЭКРС с почвой в долгосрочном эксперименте, как это было и в краткосрочном, сначала привело к скачкообразному уменьшению численности интродуцентов, которое составило 1,2·106, 4,0·105 и 1,1·106 кл/ г сух. вещ. для S.

Тyphimurium gfp, E. coli O157:H7 gfp и P. fluorescens 32 gfp соответственно. Дальнейшая динамика интродуцентов несколько различалась. Происходило уменьшение численности КОЕ в популяции сальмонеллы и E. coli O157:H7 gfp, а численность клеток оставалась довольно стабильной. В популяции P. fluorescens 32 gfp в смеси ЭКРС-почва наблюдалась, фактически, противоположная закономерность (рис. 4). Было выявлено, что E. coli O157:H7 gfp и, особенно, P. fluorescens 32 gfp выживают лучше при постоянной температуре (данные не приводятся), а выживание S. Тyphimurium gfp не зависело от изменений температуры.

Для уточнения закономерностей выживания исследуемых бактерий в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва нами была проведена аппроксимация данных динамики различными моделями. В краткосрочных экспериментах в ЭКРС снижение численности E. coli O157:H7 gfp и P. fluorescens 32 gfp более соответствовало экспоненциальному закону, в то время как в популяции S. Тyphimurium gfp наблюдалась или линейная зависимость (отсутствие снижения), или флуктуации численности. После смешивания ЭКРС с почвой экспоненциальная закономерность снижения наблюдалась у E. coli O157:H7 gfp и S.

Тyphimurium gfp, в популяции P. fluorescens 32 gfp наблюдалась стабилизация численности (линейная зависимость).

1. 3. 2. Численность бактерий на растениях и в экскрементах виноградных улиток после скармливания растений улиткам в краткосрочных и долгосрочных экспериментах.

Для получения количественных показателей выживания исследуемых бактерий на растениях, а, следовательно, определения возможности контаминации овощной продукции, в смеси ЭКРС-почва провели выращивание кресс-салата. Перед посевом численность интродуцентов в смеси ЭКРС-почва составляла 8,2·105, 7,0·105 и 5,0·106 кл./ г сухого вещества в краткосрочном и 9,5·105, 3,0·105 и 4,7·105 кл./ г сухого вещества в долгосрочном эксперименте для S. Тyphimurium gfp, E. coli O157:H7 gfp и P. fluorescens 32 gfp соответственно (рис. 5).

В случае с S. Typhimurium gfp и E. coli O157:H7 gfp имело место некоторое увеличение численности интродуцента в филосфере до 1,1·107 и 2,8·106, а в ризосфере до 5,9·106, 1,4·106 кл./ г сухого вещества в краткосрочном эксперименте, а в долгосрочном эксперименте в филосфере до 4,4·106 и 4,3·105 кл./ г сухого вещества и в ризосфере до 5,4·106 и 5,6·105 кл./г сухого вещества соответственно. Численность P. fluorescens 32 gfp в филосфере составила 2,9·106 и 4,2·105, а в ризосфере - 1,5·106 и 5,6·105 кл./ г сухого вещества в краткосрочном и долгосрочном экспериментах соответственно, то есть несколько уменьшилась. Последний факт несколько неожиданный, так как некоторые исследователи склонны рассматривать P. fluorescens как типично ризосферную бактерию (рис. 5 А-В), однако большую приспособленность к «ризосфере–филосфере» продемонстрировали энтеропатогены, а не сапротроф.

Инфицированные растения кресс-салата были скормлены виноградным улиткам. В их экскрементах методом посева на среды были также выявлены искомые бактерии (рис.

5 А-В). Численность gfp-бактерий в экскрементах улиток, по сравнению с численностью на растениях, заметно уменьшилась и составила для S. Typhimurium gfp 4,7·105 и 5,2·104, для E. coli O157:H7 gfp 1,7·105 и 1,8·105, для P. fluorescens 32 gfp 1,8·105 и 1,7·105 КОЕ/г сухого вещества в краткосрочном и долгосрочном экспериментах соответственно. Однако численность исследуемых бактерий оставалась достаточно высокой и, таким образом, беспозвоночные, в нашем случае виноградные улитки, могут являться активными переносчиками энтеропатогенов в природе.

Рис. 4. Динамика выживания: А - S. Typhimurium MAE 110 gfp;

Б - E. coli O157:H gfp;

В - P. fluorescens 32 gfp при интродукции в ЭКРС с последующим перемещением в почву в краткосрочных (А, Б, В ) и в долгосрочных (Г, Д, Е ) экспериментах при циклически меняющейся температуре;

стрелкой показано время смешивания с почвой.

2. Ч исленность микроорганизмов при перемещении по цепи местообитаний:

коровы – их экскременты – почва – растения – грызуны и их экскременты. При изучении динамики выживания бактерий в модельных экосистемах было установлено, что бактерии успешно выживают в разных естественных субстратах. Далее была поставлена задача провести натурные эксперименты, используя крупный рогатый скот (коров) и других млекопитающих, которые традиционно считаются резервуарами, инкубаторами, переносчиками и др. микроорганизмов, в том числе патогенных.

Рис. 5. Динамика выживания: А - S. Typhimurium MAE 110 gfp;

Б - E. coli O157:H7 gfp;

В - P. fluorescens 32 gfp, интродуцированных в ЭКРС при циклически изменяющейся температуре и в последующих ключевых точках при перемещении интродуцентов в почву, на растения кресс-салата и через ЖКТ улиток после скармливания им выращенного кресс-салата в краткосрочном и долгосрочном экспериментах.

2. 1. Динамика роста бактерий в суспензии комбикорма. Наиболее простой вариант инфицирования животных различными микроорганизмами – это поступление микроорганизмов с кормом и, в частности, с комбикормом. Комбикорма дают животным в разной форме: в сухом виде, влажном, а в некоторых случаях и в виде довольно жидкой суспензии. Мы исследовали динамику роста энтеропатогенов и сапротрофа в суспензии комбикорма. С некоторыми вариациями, но фактически для всех бактерий, была выявлена традиционная кривая роста с выходом на стационарную фазу через сутки. S.

Typhimurium gfp и E. coli O157:H7 gfp имели короткий лаг-период, а P. fluorescens 32 gfp росла без такового. Через сутки численность клеток бактерий составила 1.2106 для S.

Тyphimurium gfp, 5.8106 для P. fluorescens 32 gfp и 6.9105 для E. coli O157:H7 gfp на грамм сухого комбикорма.

2. 2. Численность исследуемых бактерий в экскрементах коров после скармливания коровам инокулированного комбикорма и после смешивания ЭКРС с почвой. Определение численности меченых бактерий в ЭКРС проводили через 24 ч после скармливания коровам инокулированного комбикорма. В свежесобранных образцах было обнаружено 7.0103, 3.2102 и 7.1103 КОЕ/г сух. вещ. S. Тyphimurium gfp, P.

fluorescens 32 gfp и E. coli O157:H7 gfp соответственно. Далее собранные экскременты инкубировали в течение 11 сут в лабораторных условиях, как и в предыдущих экспериментах. Схема эксперимента приведена на рис. 6. При инкубировании экскрементов произошло некоторое увеличение численности меченых бактерий, составив через 11 сут 2.5104, 5.9103 и 1.1104 КОЕ/г сух. вещ. S. Тyphimurium gfp, P. fluorescens 32 gfp и E. coli O157:H7 gfp соответственно (рис. 7). В предыдущих экспериментах, когда проводили искусственную интродукцию бактерий в свежесобранные ЭКРС, такого факта не наблюдалось. Выявленный факт представляется очень важным с точки зрения экологии и эпидемиологии бактерий в целом и энтеропатогенов в частности. По видимому, увеличение численности энтеропатогенов при прохождении ЖКТ животных происходит не только и не столько в самом ЖКТ, а в свежевыделенных экскрементах.

Хотя такое заключение является предварительным и нуждается в специальных исследованиях.

Рис. 6. Схема эксперимента исследования перемещения бактерий по цепи местообитаний-субстратов: корм – желудочно-кишечный тракт животных – экскременты животных – почва – растения и опять животные с фактическим образованием цикла.

После выявленной стабилизации численности gfp-бактерий в ЭКРС было произведено смешивание ЭКРС с почвой в соотношении 1:16 по сух. вещ. (рис. 7).

Численность бактерий после смешивания составила 2.2103, 6.4102 и 5.2103 КОЕ/г сух.

вещ. S. Тyphimurium gfp, P. fluorescens 32 gfp и E. coli O157:H7 gfp соответственно. При определении численности бактерий в смеси ЭКРС-почва через 3 сут было установлено, что их численность не снизилась, в отличие от предыдущих экспериментов. Таким образом, условия в ЭКРС, возможно из-за присутствия воздуха, являются более благоприятными для выживания исследуемых бактерий, чем в ЖКТ.

Рис. 7. Динамика численности S. Typhimurium MAE 110 gfp;

E. coli O157:H7 gfp;

P.

fluorescens 32 gfp в ЭКРС, полученного после скармливания коровам инокулированного комбикорма и после смешивания ЭКРС с почвой;

стрелкой показано время смешивания с почвой.

2. 3. Численность исследуемых бактерий на растениях и в экскрементах мышей и морских свинок после скармливания им растений. Для выявления возможности инфицирования исследуемыми бактериями кроме кресс-салата и других растений, через 3 сут. после смешивания ЭКРС с почвой в эту смесь был посеяны семена овса. Перед посевом овса численность меченых бактерий в смеси ЭКРС-почва составила 3.8103, 8.0103 и 9.5103 КОЕ/г сух. вещ. S. Тyphimurium gfp, P. fluorescens 32 gfp и E.

coli O157:H7 gfp соответственно.

Через 7 сут после появления всходов был произведен учет численности бактерий в филосфере и ризосфере проростков овса. В филосфере растений овса было обнаружено 4.4103, 1.3104 и 1.5104 КОЕ/г сух. стеблей S. Тyphimurium gfp, P. fluorescens 32 gfp и E. coli O157:H7 gfp соответственно, а в ризосфере – 8.9103, 2.4104 и 6.2104 КОЕ/г сух.

корней S. Тyphimurium gfp, P. fluorescens 32 gfp и E. coli O157:H7 gfp соответственно, то есть как в филлосфере, так и в ризосфере выявлено увеличение численности меченых бактерий.

Для определения выживания бактерий при прохождении через ЖКТ животных, инфицированные растения овса скормили грызунам. Одна наземная часть растений овса была скормлена мышам, а другая морским свинкам. В собранных экскрементах мышей было обнаружено 5.8103, 2.5104 и 2.1104 КОЕ/г сух. экскрементов S. Тyphimurium gfp, P. fluorescens 32 gfp и E. coli O157:H7 gfp соответственно, а в экскрементах морских свинок было обнаружено 1.6103, 1.9104 и 1.8104 КОЕ/г сух. экскрементов S.

Тyphimurium gfp, P. fluorescens 32 gfp и E. coli O157:H7 gfp соответственно. Таким образом, популяции исследованных бактерий смогли два раза пройти через ЖКТ разных млекопитающих и тем самым фактически совершив полный цикл. Кроме этого, настоящими экспериментами еще раз было показана способность грызунов служить активными векторами распространения различных бактерий и инфицировать разные природные местообитания.

Таблица 1. Выживание исследуемых бактерий в серии природных субстратов после скармливания их крупному рогатому скоту.

Исследуемые бактерии, КОЕ/г сухого субстрата S. Тyphimurium MAE E. coli O157:H7 gfp P. fluorescens 32 gfp Субстрат 110 gfp Количество 7 7 2,0±0,8*10 2,2±0,5*10 2,2±0,6* инокулюмав ком б и ко рм е п р и скармливании коровам ЭКР С чере з сутки 7,0±2,7*103 7,1±2,4*103 3,2±0,9* после скармливания ЭКРС перед 2,5±1,6*104 1,1±0,4*104 5,9±0,6* смешиванием с почвой Смесь ЭКРС - почва 2,2±1,0*103 5,2±1,8*103 6,4±1,3* Смесь ЭКРС - почва 3,8±1,1*103 9,5±3,3*103 8,0±1,2* перед посевом овса Надземная часть овса 4,4±1,6*103 1,5±0,4*104 1,3±0,7* Корни овса 8,9±1,4*103 6,2±1,1*104 2,4±0,7* Экскременты мышей 5,8±0,3*103 2,1±0,4*104 2,5±0,2* Экскременты морских 1,6±0,8*103 1,8±0,2*104 1,9±0,1* свинок Рис. 8. Численность S. Typhimurium MAE 110 gfp;

E. coli O157:H7 gfp;

P.

fluorescens 32 gfp в экскрементах кур после скармливания курам инокулированного комбикорма и после смешивания экскрементов с водой;

стрелкой показано время смешивания с водой.

3. Перемещение микроорганизмов в цепи природных субстратов: птицы – их экскременты – вода. Птицы являются наиболее мобильными векторами в распространении микроорганизмов. С одной стороны, они часто питаются вблизи различных животных, нередко питаясь их экскрементами, а затем во время миграции перемещаются не только над сушей, но и над водными объектами. При этом суша и вода могут контаминироваться различными, в том числе и патогенными, бактериями, что впоследствии может привести к инфицированию разных животных и людей. Целью исследования было изучение выживания исследуемых бактерий при прохождении через ЖКТ птиц и возможность выживания в водной среде после ее контаминирования.

3. 1. Численность исследуемых бактерий в экскрементах кур после скармливания курам инокулированного комбикорма и контаминирования этими экскрементами воды. После скармливания курам комбикорма, содержащего 107 кл.

меченых бактерий/г сух. комбикорма, в собранных через сутки экскрементах кур было обнаружено до 1,2*104 меченых клеток энтеробактерий и 104 клеток P. fluorescens 32 gfp в грамме сухого вещества (рис. 8).

Наблюдение динамики численности меченых бактерий проводили в течение 8 сут.

При этом в экскрементах выявили значительное увеличение численности S. Typhimurium gfp – почти на два порядка, несколько меньше для E. coli O157:H7 gfp и отсутствие прироста у P. fluorescens 32 gfp. После этого провели смешивание экскрементов со стерильной и нестерильной водой. Определение численности исследуемых бактерий в нестерильной и в стерильной воде выявило монотонно убывающую динамику популяций бактерий. При этом в стерильной воде снижение было несколько медленнее, чем в нестерильной, что может быть связано с конкурентным давлением со стороны водных аборигенов.

ОБСУЖДЕНИЕ Нашими исследованиями показано, что три вида бактерий: сапротрофная P.

fluorescens 32 gfp и две энтеробактерии - потенциальные энтеропатогены - S. Typhimurium gfp и E. coli O157:H7 gfp при разной исходной численности способны успешно и длительно выживать в различных природных субстратах. Даже при самой низкой исходной популяционной плотности бактерии способны проходить сложную и длинную цепь местообитаний, указывая тем самым на не единоместное существование в природе каждой конкретной популяции микроорганизмов, а на последовательное и многократное перемещение всей или части популяции в ряду субстратов, что можно, по- видимому, назвать многоступенчатой интродукцией или инокуляцией.

В естественных экосистемах температура крайне редко бывает стабильной. При исследовании влияния колебаний температуры на динамику выживания бактерий интенсивное уменьшение численности бактерий имело место при циклически меняющейся температуре по сравнению с постоянной. Колебания температуры, по видимому, увеличивают расход субстратов и энергии клетками, в частности, энергозатраты на поддержание.

Было отмечено, что популяционная плотность интродуцентов, сравнимая или несколько меньшая плотности вырастающих на средах аборигенов, является более оптимальной для прохождения интродуцентов по циклу субстратов, по сравнению с очень высокой или очень низкой популяционной плотностью. Это вероятно связано с тем, что при интродукции бактерий в ЭКРС с высокой исходной численностью быстро наступает недостаток питательных веществ, что и приводит к значительному уменьшению численности бактерий до установления определенной равновесной концентрации. Неоднократным определением ВОУ в ЭКРС, перед интродукцией туда бактерий, а также перед и после смешивания ЭКРС с почвой было выявлено более чем на порядок снижение этого показателя. С другой стороны, при исходной низкой интродуцируемой концентрации бактерии, особенно энтеропатогены, могут испытывать сильное конкурентное давление со стороны автохтонных микроорганизмов, что может привести к снижению популяционной плотности ниже детектируемого уровня.

Общей целью экспериментов было прослеживание динамики исследуемых бактерии в цепи природных местообитаний, в частности на растениях. На растениях кресс-салата как в ризосфере, так и в филосфере выявлено увеличение численности всех исследованных бактерий. То же самое было выявлено и для проростков овса.

Следовательно, экониша растений благоприятна и для сапротрофной псевдомонады, и для энтеробактерий, способствуя их росту или концентрированию. В связи с этим, использование недокомпостированных органических смесей, а тем более свежего навоза, при выращивании таких “зеленых” витаминов и других овощей может приводить к серьезным последствиям в виде пищевых отравлений и даже эпидемий.

Для выявления возможности прохождения энтеропатогенов и сапротрофа через ЖКТ животных, растения кресс-салата скармливали виноградным улиткам, которые, как известно, являются активными потребителями растительного материала и тем самым активными переносчиками различных микроорганизмов. Хотя в экскрементах улиток выявлено некоторое уменьшение численности бактерий на грамм их сухих экскрементов, по сравнению с кресс-салатом, тем не менее, главным является то, что исследуемые бактерии способны преодолевать этот серьезный экологический барьер. Кроме того, вполне очевидно, что исследованные беспозвоночные являются активными распространителями микроорганизмов в природе, действительно играя роль векторов в эпидемиологическом смысле.

После того как была изучена динамика выживания бактерий при искусственном инокулировании ЭКРС с последующим прослеживанием перемещения бактерий через серию субстратов и выявления способности интродуцентов сохранять популяционную плотность длительно и на высоком уровне, было решено проследить выживание исследуемых бактерий при непосредственном попадании их в ЖКТ коров и способности прохождения через ЖКТ коров. При успешном исходе первой части такого эксперимента предполагалось проследить дальнейшую судьбу интродуцентов, определяя их численность в экскрементах, почве после смешивания с ЭКРС, на растениях, выращиваемых в такой смеси, а также и в экскрементах животных после скармливания таких растений разным животным.

Перед скармливанием коровам инокулированного исследуемыми бактериями корма было определено выживание этих бактерий в суспензии комбикорма. Попадание патогенных микроорганизмов с комбикормом в ЖКТ животных реально при кормлении животных. Было выявлено, что комбикорм при достаточной температуре и влажности может являться хорошим субстратом для размножения разных, в том числе и патогенных, бактерий, и, следовательно, приводить к инфицированию сельскохозяйственных животных.

Выявленное уменьшение численности меченых бактерий в экскрементах коров позволяет отметить то, что условия ЖКТ коров, по- видимому, не совсем благоприятны для исследованных бактерий, но и не смертельны. Исследуемые бактерии успешно выживали в собранных и инкубируемых в лаборатории экскрементах даже с некоторым увеличением численности, успешно выживали в смеси ЭКРС с почвой, на растениях овса и были способны проходить через ЖКТ других теплокровных животных (мышей и морских свинок), преодолевая специфические условия, связанные с изменением температуры, рН, кислородного режима и доступности субстратов.

Показано, что в ЖКТ грызунов происходит, хотя и не столь значительное, но вполне заметное увеличение численности бактерий E. coli O157:H7 gfp, а также и P.

fluorescens 32 gfp. Этот интересный факт, несомненно, нуждается в дальнейших исследованиях, особенно учитывая следующий важный аспект. При выживании энтеропатогенов в ЖКТ грызунов, с учетом высокой подвижности последних, возникает серьезная опасность контаминации больших площадей крайне опасными бактериями E.

coli O157:H7, вызывающих энтерогеморрагический синдром с высокой смертностью заболевших.

Помимо слежения за перемещением исследуемых бактерий через серию твердых субстратов, была проверена судьба этих бактерий при попадании их с экскрементами в воду. Для этого были выбраны наиболее мобильные векторы в перемещении микроорганизмов в природе – птицы, в нашем случае - куры. После скармливания инокулированного исследуемыми бактериями корма курам в их экскрементах были обнаружены искомые бактерии, то есть, исследуемые бактерии были способны проходить ЖКТ кур. Более того, при инкубировании экскрементов в лабораторных условиях наблюдалось увеличение численности маркированных бактерий. После смешивания (инокулирования) экскрементами кур воды сначала было выявлено уменьшение численности бактерий из-за разбавления. Однако в дальнейшем имел хотя и слабый, но прирост численности бактерий с дальнейшим плавным уменьшением численности.

Бактерии в течение всего эксперимента (25 сут) успешно выявлялись. Наши результаты указывают на серьезную опасность распространения с экскрементами кур не только Salmonella ssp., что является твердым фактом, но и штаммов E. coli O157:H7, что является новым фактом. Учитывая, что инфекционная доза шига-токсин продуцирующих (STEC)/ энтерогемморагических (EHEC) штаммов E. coli O157:H7 крайне низка – менее 100 кл., то выявленные в наших экспериментах численности E. coli O157:H7 в экскрементах кур до 3,6*104 представляются впечатляющими.

Нашими исследованиями твердо показано, что именно одна и та же популяция бактерий может проходить весь цикл без привнесения дополнительно такой же популяции извне, хотя вполне реалистично предположить возможность и попутной инокуляции сходной популяцией микроорганизмов того или иного природного субстрата.

Вместе с тем нами показано, что в некоторых нишах, в частности на растениях и в ЖКТ грызунов, происходит, хотя и не столь значительное, но вполне заметное увеличение численности бактерий E. coli O157:H7 gfp и P. fluorescens 32 gfp. Этот интересный факт, несомненно, нуждается в дальнейших исследованиях.

В связи с тем, что исследованные микроорганизмы вызывают различные заболевания человека и обнаружена их высокая выживаемость в различных эконишах, то современные представления эпидемиологии о резервуарах, источниках, «носительстве» и прочее нуждаются в соответствующей корректировке.

Помимо практической значимости нашими исследованиями обосновывается и такой важный теоретически факт как существование круговорота микроорганизмов в виде перемещения отдельных популяций микроорганизмов или в комплексе с разными популяциями через ряд взаимосвязанных природных субстратов в виде цикла. При «расщеплении» или «диссипации» таких популяций с перемещением сразу в несколько новых местообитаний, по- видимому, можно говорить не только о круговороте микроорганизмов в виде цепи, но и в виде сети. Этот факт с одной стороны вполне естественен, однако с другой, далеко не для всех и всегда очевидный. Именно благодаря подобным перемещениям, как это было показано в настоящей работе, в природе, по видимому, сохраняются большинство не только энтеропатогенных, но и сапротрофных микроорганизмов. Полученные результаты показывают, что сохранение и поддержание популяции того или иного микроорганизма в природе зависит не только от того, как долго он может выживать в том или ином субстрате, но и от того, как успешно он может выживать при перемещении из одного субстрата в другой, третий и т.д.

ВЫВОДЫ 1. Сапротрофные и энтеропатогенные бактерии способны активно расти в кормах животных и проходить через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) животных, длительно (до 70 сут) выживать и увеличивать численность в экскрементах животных, сохранять популяционную численность при попадании в почву и/ или воду и перемещаться на растения, при этом даже увеличивая численность на растениях по сравнению с почвой, повторно проходить через ЖКТ других животных при поедании животными этих растений. Полученные результаты свидетельствуют о способности каждой индивидуальной популяции бактерий к циклическим перемещениям в экосистеме.

Циклическое перемещение популяций бактерий возможно через разное количество промежуточных звеньев.

2. Соответствующие суточному циклу изменения температуры в режиме день-ночь более негативны для выживания бактерий в экскрементах животных и смеси экскременты почва, чем традиционно применяемая в исследованиях постоянная температура. Этот факт необходимо учитывать при оценке риска выживания и распространения микроорганизмов, особенно патогенных, в природе.

3. Популяционная плотность интродуцентов, сравнимая или несколько меньшая плотности выявляемых на средах «аборигенных» бактерий является более подходящей для прохождения интродуцентов по цепи разных природных субстратов, по сравнению с очень высокой или очень низкой популяционной плотностью.

4. При интродукции микроорганизмов в природные местообитания имеет место не краткосрочный и одиночный акт существования микроорганизма в конкретном субстрате или местообитании, а последовательное многоступенчатое внедрение микроорганизма в экосистему. Показано, что генетически модифицированные микроорганизмы (ГММ) способны к длительной циркуляции в разных местообитаниях. Обильное и неконтролируемое применение ГММ в практике может привести к их длительному внедрению в экосистемы с положительными или отрицательными последствиями для компонентов этих экосистем.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. Куприянов А.А., Семенов А.М., Куненкова Н.Н., Ван Бругген А.Х.К.

Многоступенчатая интродукция бактерий в природные субстраты при разной исходной инокуляционной численности // Почвоведение. 2009. № 9. С. 1119-1127.

2. Куприянов А.А., Семенов А.М., Ван Бругген А.Х.К., Нетрусов А.И., Семенова Е.В.

Динамика выживания энтеропатогенных и сапротрофных бактерий при прохождении через пищеварительный тракт птиц, в их экскрементах и в воде // Вестник Московского университета. Биология. 2009. Т. 64. № 3. С. 102-106.

3. Куприянов А.А., Куненкова Н.Н., Ван Бругген А.Х.К., Семенов А.М. Перемещение бактерий из экскрементов животных в почву и сопряженные с ней местообитания // Почвоведение. 2009. № 11. С. 76-83.

4. Семенов А.М., Куприянов А.А., Куненкова Н.Н., Семенова Е.В., Ван Бругген А.Х.К.

Круговорот микроорганизмов в наземных экосистемах // Доклады ТСХА. 2007. Выпуск 279. Ч. 2. С. 208-212.

5. Куприянов А.А., Семенов А.М., Ван Бругген А.Х.К. Перемещение энтеропатогенных и сапротрофных бактерий в цикле экониш // Известия РАН. Серия биологическая. Принята к опубликованию.

6. Semenov A.M., Kuprianov A.A. & van Bruggen A.H.C. Transfer of enteric pathogens to successive habitats within microbial cycles // Microbial Ecology (submitted).

7. Куприянов А.А., Семенов А.М., Van Bruggen A.H.C. Генетически модифицированные микроорганизмы в естественных субстратах: многоступенчатая интродукция или неконтролируемая контаминация? // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды. Материалы международной конференции. Саратов.

14-16 сентября 2005 г. Тезисы докладов. C. 138-139.

8. Куприянов А.А., Семенов А.М., Семенова Е.В., Van Bruggen A.H.C. Возможность преодоления экологических барьеров аналогом энтеропатогенного микроорганизма Salmonella Typhimurium MAE 110 gfp при интродукции в естественные субстраты // Автотрофные микроорганизмы. Всероссийский симпозиум с международным участием, Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, 21-24 декабря 2005 г.

Тезисы докладов. C. 94.

9. Куприянов А.А., Семенов А.М., Семенова Е.В., Нетрусов А.И., Van Bruggen A.H.C.

Закономерности перемещения бактерий в системе естественных местообитаний:

животные – экскременты – почва – растения – животные // Микроорганизмы и биосфера.

Материалы международной научной конференции. Москва. 19-20 ноября 2007 г. Тезисы докладов. C. 73-74.