Елена вячеславовна функциональная интерпретация единичных нуклеотидных замен в интроне 2 гена k-ras мыши, связанных с развитием рака легких
На правах рукописи
УДК 575.224.22:577.214 Антонцева Елена Вячеславовна ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ЕДИНИЧНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН В ИНТРОНЕ 2 ГЕНА K-ras МЫШИ, СВЯЗАННЫХ С РАЗВИТИЕМ РАКА ЛЕГКИХ 03.00.15 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
НОВОСИБИРСК 2006
Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Научный консультант: доктор биологических наук Т.И. Меркулова
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Т.М. Хлебодарова Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск кандидат химических наук А.А. Бондарь Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение:
Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН г. Санкт-Петербург
Защита диссертации состоится « » 2006 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц-зале Института по адресу 630090, г. Новосибирск, 90, Проспект академика Лаврентьева, 10, т/ф (3832)331278;
e-mail:
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.
Автореферат разослан «» 2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Груздев А.Д.
Актуальность темы. Ген K-ras является одной из наиболее перспективных моделей для изучения механизмов наследственной предрасположенности к развитию опухолей легких, поскольку он идентифицирован как ген, детерминирующий чувствительность к пульмоноканцерогенезу, и у человека и у экспериментальных животных. У мышей получено множество инбредных линий, различающихся по чувствительности к спонтанному и химически индуцированному раку легких. В результате генотипирования большого числа таких линий была установлена связь между единичными нуклеотидными заменами (Single nucleotide polymorphisms, SNPs) в интроне 2 гена K-ras и предрасположенностью к развитию опухолей легких. Показано, что у чувствительных к пульмоноканцерогенезу линий (A, GR, ICR) в позициях 288 и 296 п.н. относительно старта трансляции располагаются нуклеотиды C и A, у резистентных линий (AKR, DD, PT, UT, C3H, C57BL) - G и C, а у линии с промежуточным фенотипом (СВА)- С и С.
Стремительно возрастающий в последние годы интерес к выявлению и исследованию SNPs в различных генах вызван тем, что они часто оказываются связанными с разнообразными фенотипическими проявлениями, включающими предрасположенность ко многим заболеваниям. При этом наиболее интенсивно изучаются SNPs, расположенные в кодирующих районах генов, что обусловлено относительной простотой их интерпретации, в особенности, в тех случаях, когда SNPs приводят к заменам аминокислот. Начинают развиваться и работы по исследованию потенциально регуляторных SNP, расположенных в промоторных районах генов. Среди SNPs, расположенных в интронах, наиболее изученными являются варианты, влияющие на сплайсинг мРНК.
Расположенные в интронах SNPs, способные хотя бы потенциально влиять на интенсивность экспрессии генов, остаются почти не исследованными.
Поскольку имеются уже достаточно много данных об энхансерах, сайленсерах и отдельных регуляторных элементах, расположенных в интронах генов, логично предполагать, что SNPs в интронах также могут затрагивать регуляторные районы. В связи с этим изучение молекулярных механизмов, посредством которых SNPs в интроне могут оказывать влияние на фенотипические признаки, представляется весьма актуальным и перспективным направлением.
Ген K-ras является одним из наиболее известных протоонкогенов, мутации в котором (как спонтанные, так и индуцированные химическими канцерогенами) локализованы почти исключительно в трех «горячих» точках – кодонах 12, 13 и 61. Подобную направленность мутагенеза связывают, главным образом, с особенностями локальной структуры ДНК в местах предпочтительного возникновения мутаций. Однако такое объяснение является далеко не всеобъемлющим. Например, при анализе мутаций, затрагивающих кодоны 12, 13 и 61 гена K-ras, в опухолях легких у гибридных мышей, полученных скрещиванием чувствительных и резистентных линий, было показано, что мутация происходит только в «чувствительном» аллеле этого гена, несмотря на полную идентичность нуклеотидной последовательности обоих аллелей в местах образования мутаций. Известен также феномен тканевой специфичности направленного мутагенеза. Например, под действием канцерогена уретана в печени и коже возникают мутации в 61-м кодоне гена H-ras, а в легких - в 61-м кодоне гена K-ras. Такие закономерности дают основание думать об участии еще каких-то механизмов в обеспечении избирательности мутационного процесса. В частности, поскольку для гена K-ras установлено, что чувствительность мышей разных линий к развитию рака легких коррелирует с SNP в его втором интроне, можно предполагать, что эти нуклеотидные замены могут приводить к специфическим, характерным только для чувствительного аллеля изменениям в структуре хроматина и/или конформации ДНК в районе 12-го и 13-го кодонов (экзон 1), что может способствать образованию аддуктов ДНК-канцероген и в последующем мутаций именно в этих позициях. Так как известно, что в формировании и/или поддержании определенной структуры хроматина участвуют транскрипционные факторы, связывающиеся с ДНК, можно думать, что сопряженные с чувствительностью к пульмоноканцерогенезу SNP затрагивают сайты связывания таких белков.
Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов, посредством которых единичные нуклеотидные замены во втором интроне протоонкогена K-ras могут влиять на формирование чувствительности к спонтанному и индуцированному раку легких у мышей, а также выяснение механизма высокой избирательности возникновения мутаций в кодоне 12 этого гена.
Задачи работы включали:
1) изучение влияния сопряженных с развитием рака легких мононуклеотдных замен в позициях 288 и 296 п.н. интрона 2 К-ras у M.
musculus на связывание с ядерными белками и идентификацию транскрипционных факторов, взаимодействующих с полиморфным районом;
2) изучение влияния замены в позиции 311 п.н. интрона 2 К-ras, отличающей мышей устойчивого к пульмоноканцерогенезу вида M. spretus от чувствительных линий M.musculus, на связывание с транскрипционными факторами и их идентификацию;
3) изучение влияния различных вариантов SNP на картину связывания ядерных белков с потенциальным композиционным элементом в начале интрона 2 гена K-ras, охватывающим область расположения всех трех сопряженных с чувствительностью к раку легких мононуклеотидных замен;
4) идентификацию белков экстракта ядер клеток легких, взаимодействующих с областью первого кодирующего экзона гена K-ras мыши, включающей кодоны 12 и 13, которые являются «горячими» точками возникновения мутаций в гене K-ras;
5) после того как нами были получены данные о том, что с областью локализации кодонов 12 и 13 гена K-ras мыши и с районом расположения связанных с чувствительностью к раку легких мононуклеотидных замен взаимодействуют транскрипционные факторы NF-Y и GATA-6, была поставлена также задача определения влияния пульмоноканцерогенов на активность этих факторов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что сопряженные с предрасположенностью к развитию рака легких у мышей SNPs во втором интроне гена K-ras являются потенциально регуляторными. Установлено, что СА вариант полиморфизма в позициях 288 и 296 п.н., характерный для чувствительных линий мышей вида M.musculus, соответствует комплексному сайту связывания транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6, а в случае "устойчивого" GС и "промежуточного" СС вариантов этот сайт оказывается разрушенным.
Показано также, что в результате замены СТ в позиции 311 п.н. у мышей M.spretus, устойчивых к пульмоноканцерогенезу, происходит повреждение сайта связывания NF-Y и это отличает их от мышей чувствительных линий M.musculus. Полученные данные предполагают существование трех гаплотипов, определяющих предрасположенность к пульмоноканцерогенезу: двух устойчивых - GCС и CAT и одного чувствительного - CAC.
Впервые продемонстрировано, что горячая точка мутагенеза в протоонкогене К-ras - область кодонов 12 и 13 - является сложным сайтом связывания белков NF-Y и GATA-6. Получены оригинальные данные о том, что под действием пульмоноканцерогенов 3-метилхолантрена (3-МХ) и нитрозоэтилмочевины (НЭМ) происходит усиление связывания факторов NF-Y и GATA-6 с районом кодонов 12 и 13 и областью полиморфизма в начале интрона 2 гена К-ras, что является новым свидетельством вовлеченности регуляторных систем клетки в механизм действия химических канцерогенов.
Полученные результаты открывают новые перспективы для изучения молекулярных механизмов сайт-направленных генных мутаций, а также для развития представлений о роли регуляторных систем клетки в инициации и развитии канцерогенного процесса. Полученные данные также имеют значение для выяснения молекулярных основ генетической предрасположенности к пульмоноканцерогенезу.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторных семинарах ИЦиГ, на 7-ой Пущинской школе конференции молодых ученых (Пущино, 2003) и на международных конференциях: “Физико-химическая биология” (Новосибирск, 2006);
“Genomics, proteomics, bioinformatics and nanotechnologies for medicine” (Novosibirsk, 2006);
“Genome Sequencing & Biology” (New York, 2001);
“Mathematics and Engineering Techniques in Medicine and Biological Sciences” (Las Vegas, 2001).
Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы.
Диссертация изложена на 108 страницах, содержит 21 рисунок. В списке литературы приводится 141 работа.
Работа проводилась при финансовой поддержке грантов РФФИ №№ 01-04-49860 и 04-04-48136.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали 0,5-3 месячных мышей устойчивых к пульмоноканцерогенезу линий C57BL/6J, С3H/A, AKR, DD и чувствительных линий ICR, A/He, GR разведения вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Геномная ДНК мышей M.spretus была любезно предоставлена Евгенией Пак (NIH, USA). Связывание ядерных белков с участками гена K-ras и ДНК-связывающую активность факторов транскрипции в экстрактах ядер изучали методом задержки ДНК-пробы в геле. Двуцепочечные олигонуклеотиды, используемые в качестве ДНК проб были синтезированы зав. сектором химии нуклеиновых кислот В.Ф.
Кобзевым, ИЦиГ СО РАН. Фрагменты длиной 84 п.н. были получены с помощью метода ПЦР с праймеров KE-Up и KE-Low. Экстракты ядер получали согласно (Gorski et al., 1986) в модификации (Shapiro et al., 1988).
Идентификацию факторов транскрипции осуществляли с использованием специфических антител “Santa Cruz Biotechnology Inc.”. Содержание факторов транскрипции в ядерных экстрактах оценивали методом Вестерн блот гибридизации, для визуализации результатов использовали ECL систему фирмы “Amersham”.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Изучение связывания ядерных белков с районом локализации сопряженых с развитием рака легких однонуклеотидных замен в интроне 2 гена K-ras мыши.
Предрасположенность мышей к раку легких определяется тремя генетическими локусами, имеющими общее название Pas (pulmonary adenoma susceptibility). Известно, что локус Pas1 расположен на хромосоме 6 и включает ген К-ras. Исследования на трансгенных мышах показали, что наличие мутаций в кодонах 12, 13 и 61 протоонкогена K-ras приводит к трансформации клеток и развитию различных опухолей, включая опухоли легких. Кроме того, известно, что различная чувствительность инбредных линий мышей к развитию аденом легкого сопряжена с однонуклеотидными заменами (SNPs), в начале интрона 2 ген K-ras в позициях 288 и 296 п.н.
относительно старта трансляции. Так у мышей чувствительных линий в указанных позициях стоят нуклеотиды C и A, соответственно, у резистентных линий - G и C, а у линий с промежуточным фенотипом - С и С (Chen et al., 1994;
Тимофеева и др., 2002).
Мы предположили, что наблюдаемые нуклеотидные замены могут затрагивать участок связывания какого-либо регуляторного белка. Для проверки этого предположения, олигонуклеотиды, соответствующие трём аллельным состояниям участка от 278 до 307 п.н. относительно стартового кодона гена K-ras мыши (CA, CC и GC олигонуклеотиды, Рис. 1А), были использованы в экспериментах по задержке в геле белками ядерного экстракта легких мыши. Оказалось, что картина связывания в случае СА варианта SNPs существенно отличается от таковой для GC и CC вариантов наличием мощной полосы задержки, соответствующей комплексу СА олигонуклеотида с неким белком/белками (Рис. 1Б).
СА: 5’-cagtGTGCAAGAAA CTCCACTT ATCATGAGAGCT-3’ А) GС: 5’-cagtGTGCAAGAAA GTCCACTT CTCATGAGAGCT-3’ СС: 5’-cagtGTGCAAGAAA CTCCACTT CTCATGAGAGCT-3’ Б) CA CC GC Рис. 1. А) Последовательности олигонуклеотидов, охватывающих область от 278 до 307 п.н. интрона гена K-ras и воспроизводящих " чувствительный" СА, "промежуточный " СС и "устойчивый " GС аллели.
Мононуклеотидные замены подчеркнуты.
Б) Связывание белков экстракта ядер клеток легких мышей с олигонуклеотидами CA (1, 2), CC (3, 4) и GC ( 5, 6). 1, 3, 5- свободный зонд;
2, 4,6- связывание б е л ко в э кс т р а кт а я д е р к л е то к л е г к о г о с олигонуклеотидами. 1 2 3 4 5 С помощью компьютерного метода распознавания сайтов связывания факторов транскрипции Пономаренко М.П. из лаборатории теоретической генетики ИЦиГ СО РАН, было сделано предположение, что СА вариант SNP приводит к образованию сайта связывания транскрипционного фактора семейства GATA. В результате экспериментов по задержке ДНК-пробы в геле в присутствии конкурентных олигонуклеотидов, соответствующих природным сайтам связывания белков GAТA и Ets (контроль), а также антител против GATA-6 (основного представителя семейства GAТA в легких) мы полностью подтвердили данное предположение (Рис. 2). Таким образом, "чувствительный" СА вариант SNP интрона 2 гена K-ras соответствует сайту связывания фактора транскрипции GATA-6, а в случае "устойчивого" GС и "промежуточного" СС вариантов этот сайт разрушен.
конкуренты Антитела к GATA- TA Ets Рис. 2. Иде нтификация белка, образующего GA комплекс с олигонуклеотидом СА. 1 - подвижность свободного зонда в геле;
2 - связывание зонда с белками экстракта ядер клеток легких;
3, 4, 5 связывание после инкубации экстракта ядер с антителами к белку GATA-6 (2, 3 и 4 мкг антител соответственно);
6 - связывание в присутствии 100х избытка олигонуклеотида GATA;
7 - связывание в присутствии 100х избытка олигонуклеотида Ets.
1 2 3 4 5 6 Поскольку GATA-6 является ключевым фактором в дифференцировке легочной ткани и тканеспецифической регуляции экспрессии генов в легких можно думать, что наблюдаемые различия в связывании этого фактора с разными аллельными состояниями интрона гена K-ras имеют отношение к формированию чувствительного или устойчивого к пульмоноканцерогенезу фенотипа. Однако, обнаружение "чувствительного" СА варианта SNP в интроне 2 гена K-ras у мышей другого вида - M.spretus, устойчивых к пульмоноканцерогенезу, поставило под сомнение саму мысль об участии этого полиморфизма в формировании предрасположенности к канцерогенезу в легких (Manenti et al., 1995). Но мы обратили внимание, что у M.spretus в непосредственной близости от уже известных SNPs в позициях 288 п.н. и 296 п.н., приводящих к появлению или исчезновению сайта связывания фактора GATA6, имеется ещё одна мононуклеотидная замена С (M.musculus) Т (M.spretus) в позиции 311 п.н., характерная для этого вида. Мы предположили, что эта замена также может затрагивать сайт связывания какого-то фактора транскрипции, и таким образом может быть связана с устойчивостью к раку легких M.spretus. Методом задержки ДНК-зонда в геле было показано, что замена С (олигонуклеотид 311-mus) Т (олигонуклеотид 311-spret) в позиции 311 п.н. интрона 2 гена K-Ras, приводит к ослаблению наименее подвижной полосы задержки (Рис. 3Б), т.е. SNP, характерный для М.spretus, ухудшает сайт связывания некого транскрипционного фактора.
В результате компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей для олигонуклеотидов 311-mus и 311-spret с помощью пакета программ TESS в качестве кандидатов на связывание с этим участком были отобраны транскрипционные факторы NF1, LKLF и NF-Y.
Из рисунка 3 Б видно, что добавление к реакционной смеси в качестве конкурентной ДНК олигонуклеотидов соответствующих известным сайтам связывания NF1 и LKLF в 100х избытке не меняет картины связывания. В то время как уже 50х избыток олигонуклеотида, содержащего сайт связывания фактора NF-Y приводит к существенному ослаблению полосы, различающей картины связывания для 311-mus и 311-spret. Эксперименты с использованием антител к NF-Y подтвердили, что верхняя полоса задержки действительно соответствует комплексу транскрипционного фактора NF-Y с олигонуклеотидами 311-mus/311-spret. Таким образом, наличие Т в позиции 311 п.н. у М.spretus приводит к заметному ослаблению сайта связывания NF-Y, по сравнению с M.musculus.
311-mus: 5'-cagtTCATGAGAGCTCAC CACAGAGAAAGAAAGT-3’ А) 311-spret: 5'-cagtTCATGAGAGCTCAC TACAGAGAAAGAAAGT-3’ Р и с. 3. А ) П о с л е д о в а т е л ь н о с т и Б) олигонуклеотидов, охватывающих область от 297 до 326 п.н. интрона 2 гена K-ras мышей Антитела кNF-Y LF - в и д а M. m u scu lu s и в и д а M.s pret us. 50x NF -Y LK NF Мононуклеотидные замены подчеркнуты.
Б) Идентификация белка, образующего комплекс с олигонуклеотидами 311-mus (1, 2, 3, 7, 8, 9) и 311-spret (4, 5, 6). 1, 4, 7 связывание соответствующих олигонуклеотидов с белками экстракта ядер клеток лег ки х;
2, 5- св я зыв ан и е в присутствии 50х избытка олигонуклеотида NF-Y;
3, 6 - связывание после инкубации экстракта ядер с антителами к белку NF-Y,8, 12 3 456 7 8 9- связывание в присутствии 100х избытков олигонуклеотидов LKLF и Nf1. 311-mus 311- mus 311-spret Вследствие близкого расположения выявленных нами в начале интрона 2 гена K-ras сайтов связывания транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y, мы предположили, что они образуют более сложную регуляторную единицу - композиционный элемент. В пользу такого предположения свидетельствует также обнаружение подобных регуляторных единиц, образованных сайтами связывания NF-Y и GATA-6, в других генах (Peng, Jahroudi, 2003).
Для исследования предполагаемого регуляторного элемента с геномной ДНК мышей чувствительной линии ICR и устойчивой линии DD вида M.musculus, а также устойчивого вида M.spretus методом ПЦР с праймеров КЕ-Up и КЕ-Low (рис. 4А) были амплифицированы последовательности длиной 84 п.н. (далее ICR, DD и SPRET) охватывающие область расположения этих сайтов. Оказалось, что при задержке таких фрагментов в геле белками ядерного экстракта во всех трех случаях наблюдаются разные картины связывания (Рис. 4Б), т.е. наличие SNPs, отличающих чувствительных животных от устойчивых, влияет на формирование белковых комплексов с этим районом. Видно, что при использовании ампликона SPRET происходит исчезновение полосы 5, наблюдаемой в случае ICR и DD, и появление двух других– 7 и 8. Кроме того, меняется интенсивность ряда других полос. С помощью программы Gel-pro 4.0 мы оценили интенсивность полос, присутствующих во всех трех случаях. За единицу была взята интенсивность полосы 1 в соответствующей дорожке. В случае фрагмента DD происходит усиление комплексов со 2-го по 6-ой по сравнению с ICR в 1,5-2,2 раза в зависимости от полосы. Заметим, что в случае ампликона SPRET интенсивность комплексов 2, 3, 4 и 6 также ослаблена по сравнению с таковой в случае DD и напоминает ICR вариант. Сходство этих полос задержки в картине связывания между SPRET и ICR может быть объяснено наличием у них СА варианта SNPs в позициях 288 и 296 п.н.
Наиболее показательным является эффект однонуклеотидной замены в 311 позиции, отличающей мышей вида M.spretus от M.musculus. Ранее, при исследовании влияния этой замены на связывание с белками ядерного экстракта легких в составе олигонуклеотидов 311-mus и 311-spret (длиной 30 п.н.), были получены данные лишь об ухудшении связывания последнего с фактором транскрипции NF-Y (Рис. 3Б). В случае же более длинных фрагментов отличия становятся радикальными (одна полоса исчезает, появляются две новых). Следовательно, можно полагать, что значительно более существенное изменение в картине связывания в случае ампликона SPRET (длиной 84 п.н.) является результатом сложного взаимодействия факторов транскрипции, как с последовательностью ДНК, так и друг с другом. Это служит косвенным доказательством наличия в данном районе композиционного регуляторного элемента.
12 3 4 5 6 1 2 3 45 - + - + - + Антитела к NF-Y - + - + - + Рис. 4. С вязывание белков экстракта ядер клеток легких с ампликонами SPRET (1, 2 ), ICR (3, 4 ) и DD (5, 6 ) и влияние антител к NF-Y. А) и Б) р а з н о е в р е мя э кс п о зи ц и и с рентгеновской пленкой. 1, 3, 4 связывание фрагментов с ядерными SPRET ICR SPRET ICR DD DD белками;
2, 4, 6 - связывание при Б) А) добавлении антител к NF-Y.
Эксперименты с использованием антител к NF-Y показали, что комплекс 2 образован этим белком (Рис. 4). Представляется удивительным, что этот комплекс не ослаблен в случае ампликона SPRET, тогда как ранее при использовании коротких фрагментов ДНК интрона 2 гена K-ras (297/ п.н.) (Рис. 3Б), нами были получены данные о повреждении NF-Y сайта у M.
spretus. В связи с этим мы предположили, что в составе длинных фрагментов имеется еще один, возможно более сильный, сайт связывания данного транскрипционного фактора. Этот дополнительный NF-Y сайт был экспериментально найден в составе СА олигонуклеотида (278/307 п.н.) (Рис.
5), где, как оказалось, он перекрывается с сайтом связывания GATA-6 (Рис.
2). Поскольку добавление антител как к GATA-6, так и к NF-Y приводит к полному исчезновению комплекса, представляется вероятным, что связывание этих транскрипционных факторов с районом от 278 до 307 п.н.
интрона 2 гена K-ras мыши носит взаимозависимый характер.
Полученные данные позволяют предполагать, что у мышей чувствительных линий M.musculus в интроне 2 имеется регуляторный композиционный элемент, образованный двумя NF-Y сайтами и одним сайтом для GATA-6, а связанные с устойчивостью к пульмоноканцерогенезу SNPs разрушают его различные компоненты.
Рис. 5. Идентификация сайта связывания транскрипционного фактора NF-Y внутри олигонуклеотида СА. 1- связывание олигонуклеотида СА с белками ядерного экстракта легких;
связывание с экстрактом в присутствии антител к NF-Y;
3- в п ри сут ств и и 50х и з б ытк а оли гон ук леоти д а, соответствующего сайту связывания NF-Y.
1 2 Это находит отражение в существенном усложнении картин связывания ядерных белков с более длинными участками интрона (ампликонами) (Рис. 4), по сравнению с олигонуклеотидами, входящими в их состав (Рис. 1Б, 3Б). Так, последовательности ампликонов ICR и DD, как и последовательности ранее исследованных олигонуклеотидов (СА и GC, п.н.), отличаются лишь двумя мононуклеотидными заменами, соответствующими позициям 288 и 296 п.н. в интроне 2 гена K-ras. Однако, если СА олигонуклеотид в отличие от GC олигонуклеотида образует мощную дополнительную полосу задержки за счет связывания с GATA-6 и NF-Y, то включающий этот олигонуклеотид более протяженный фрагмент ICR, напротив, характеризуется выраженным ослаблением полос задержки по сравнению с DD (Рис. 1Б и Рис. 4). Однонуклеотидная замена в позиции 311 п.н., отличающая мышей устойчивого вида M. spretus от мышей устойчивых и чувствительных линии M. musculus, при исследовании в составе олигонуклеотидов 311-mus и 311-spret приводит к существенному ослаблению сайта NF-Y, тогда как в ампликона SPRET такого ослабления не заметно (Рис. 3Б и Рис. 4). Известно, что в результате связывания фактора транскрипции NF-Y с ДНК происходит изгиб двойной спирали на 60-800 в зависимости от фланкирующей последовательности (Liberati et al., 1998).
Такие изменения в конформации ДНК могут влиять на доступность сайтов для других белков ядерного экстракта. Наличие же двух рядом расположенных сайтов связывания NF-Y в случае ICR может приводить 1) к компенсаторному эффекту за счет двойного изгибания ДНК, 2) механическим затруднениям в посадке этих факторов.
Таким образом, комбинация нуклеотидных замен C (288п.н.), A ( п.н.) и C (311 п.н.) в интроне 2 гена K-ras у мышей предрасположенных к пульмоноканцерогенезу линий вида M. musculus формирует потенциальный композиционный элемент, содержащий два сайта связывания NF-Y и один сайт связывания GATA-6. SNPs, присущие устойчивым линиям M. musculus (G 288 п.н. и С 296 п.н) или устойчивому виду M. spretus (Т 311 п.н.) разрушают различные компоненты этого композиционного элемента: GATA 6 сайт у M. musculus и NF-Y сайт у M. Spretus (Рис. 9). Связывающиеся с выявленными сайтами факторы транскрипции, по видимому, находятся в сложной системе взаимодействий (как синергических, так и антагонистических) между собой, а также с другими белками, которые могут взаимодействовать с данным районом. По-видимому, любое изменение в связывании индивидуальных факторов транскрипции в этом регуляторном узле может приводить к существенным изменениям в этих взаимодействиях, что находит косвенное отражение в связи различных SNPs в районе от 278 до 307 п.н. интрона 2 гена K-ras мыши с чувствительностью/устойчивостью к пульмоноканцерогенезу. Видимо, в данном случае можно говорить о существовании трех гаплотипов: двух устойчивых GCС и CAT и одного чувствительного к развитию рака легких CAC.
Идентификация транскрипционных факторов, взаимодействующих с областью 12-ого кодона гена K-ras мыши.
У мышей, как и у человека, мутации гена K-ras наблюдаются преимущественно в кодонах 12, 13 и 61, причём как в спонтанных, так и химически индуцированных опухолях, включая опухоли лёгких.
Предполагается, что избирательность образования аддуктов ДНК-канцероген в кодоне 12 может быть связана как с особенностями первичной структуры ДНК в районе расположения этого кодона и/или ее модификациями, так и с особенностями локальной структуры хроматина в этом районе. В то же время известно, что в формировании и/или поддержании определенной структуры хроматина участвуют транскрипционные факторы, связывающиеся с ДНК.
В связи с этим нами была проверена возможность связывания каких либо ядерных белков с районом расположения кодона 12 в экзоне 1 гена K ras. Был синтезирован олигонуклеотид 12 длиной 30 п.н., соответствующий району 12 и 13 кодонов (Рис. 6А). Методом задержки ДНК пробы в геле было показано, что некий белок/белки ядерного экстракта легкого мыши образует/ют комплекс с 12-mus олигонуклеотидом (Рис. 6Б).
В результате компьютерного анализа последовательности ДНК 1-ого экзона гена K-ras, были отобраны несколько белков- кандидатов на связывание с исследуемым районом GATA, NF-Y, LKLF, Ets. Использование синтетических двуцепочечных олигонуклеотидов, соответствующих известным сайтам связывания этих белков, в качестве конкурентов в опытах по задержке ДНК-пробы в геле позволило предположить, что комплекс образуется как минимум двумя белками: NF-Y и представителем семейства GATA. Эксперименты с использованием специфических антител против NF Y и GATA6 (основного представителя семейства GATA в легких) полностью подтвердили это предположение (Рис. 6Б). Так как добавление и тех и других антител приводило к практически полному исчезновению комплекса, представляется вероятным кооперативное связывание транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 с районом расположения кодона 12 гена K-ras мыши.
А) 12: 5'cagtTGGTGGTTGGAGCT GGTGGCGTAGGCAAGA G3’ Б) Антитела Антитела к NF-Y к GATA- - + - + Рис. 6. А) П оследовательность олигонук леотида, охватывающего область от 20 до 50 п.н. экзона 1 гена K-ras мыши (кодон 12 подчеркнут). Б) Идентификация белков образующих комплексы с олигонуклеотидом 12 с помощью специфических антител. 1,3-связывание с экстрактом, 2- связывание с экстрактом в присутствии антител к NF-Y, 4- в присутствии антител к GATA-6. 12 Согласно последним данным избирательность образования аддуктов в кодоне 12 гена K-ras при обработке различными канцерогенами обусловлена как особенностями первичной структуры ДНК в районе расположения этого кодона, так и с ее неустановленными пока модификациями, которые имеют место в составе нативного хроматина. Известно, что и NF-Y и представители семейства GATA способны инициировать процессы разрушения или ремоделирования нуклеосом. Поэтому представляется вероятным, что связывание этих факторов с местом расположения горячей точки мутагенеза в гене K-ras и районом полиморфизма вызывает локальное изменение структуры хроматина, что может играть определенную роль в обеспечении доступности ДНК как для реакционно-способных канцерогенных соединений, так и для модифицирующих ферментов, и таким образом вносить свой вклад в механизм избирательности аддуктообразования.
Влияние легочных канцерогенов 3-метилхолантрена и нитрозоэтилмочевины на ДНК-связывающиую активность транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y.
Известно, что NF-Y является одним из ключевых регуляторов клеточного цикла, а GATA-6 входит в число основных факторов, контролирующих онтогенез легочной ткани. Показано, что как недостаточная, так и избыточная экспрессия GATA-6 приводит к серьезным нарушениям морфогенеза легких. В связи с этим можно предполагать, что связывание транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 с местом расположения горячей точки мутагенеза в экзоне 1 гене K-ras и районом полиморфизма в начале интрона 2 может быть вовлечено в события, инициирующие развитие опухолей в этом органе. Опираясь на такое предположение, мы изучили влияние сильных легочных канцерогенов 3 метилхолантрена (3-МХ) и нитрозоэтилмочевины (НЭМ) на активность этих факторов и их способность взаимодействовать с районами кодона 12 и SNPs в начале интрона 2.
Оказалось, что после введения канцерогена 3-МХ мышам линии ICR, высокочувствительной к пульмоноканцерогенезу, в экстрактах ядер легких заметно увеличивалась ДНК-связывающая активность и GATA-6 и NF-Y (Рис. 7А) и, соответственно, их взаимодействие с олигонуклеотидами, воспроизводящими области локализации кодона 12 и СА варианта полиморфизма гена K-ras мыши. Существенно более сильное влияние канцерогена на связывание NF-Y и GATA-6 с районами кодона 12 и SNP в интроне 2 по сравнению с олигонуклеотидами, соответствующими сайтам связывания этих транскрипционных факторов, указывает на их кооперативное взаимодействие с этими районами. Наблюдаемый эффект является специфическим, так как под действием 3-МХ не наблюдалось изменения ДНК-связывающей активности транскрипционного фактора SRF, который в данном случае может рассматриваться в качестве внутреннего контроля. При введении 3-МХ мышам линии С57BL/6J, устойчивой к развитию опухолей легкого, увеличения активности NF-Y и GATA-6 не наблюдалось (Рис. 7Б).
Аналогичные результаты были получены на двух других линиях мышей, контрастных по чувствительности к развитию рака легкого, - A/He и C3H/A. Введение другого пульмоноканцерогена - НЭМ также приводило к увеличению ДНК-связывающей активности факторов NF-Y и GATA-6 в легких мышей линий, чувствительных к развитию опухолей легких (ICR, A/He), но не устойчивых линий (C57BL/6J, C3H/A).
12 34 5678 9 10 1 2 34 5 6 7 8 9 3’-МХ - + - + - + - + - + 3’-МХ - + - + - + - + - + Б) А) 12 CA GATA NF-Y SRE 12 CA GATA NF-Y SRE Рис. 7. Связывание белков экстракта ядер легких мышей чувствительной к развитию рака легких линии ICR (А) и мышей устойчивых к развитию рака легких линии C57BL (Б), получивших 3-МХ с олигонуклеотидами 12 ( 1, 2), СА (3, 4 ) GATA (5, 6 ), NF-Y (7, 8 ), SRE (9, 10 ). 1, 3, 5, 7, 9 контроль;
2, 4, 6, 8, под действием канцерогена.
С помощью Вестерн-блот гибридизации мы показали, что наблюдаемый эффект не связан с изменением концентрации транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 в ядерных экстрактах после введения животным пульмоноканцерогенов (Рис. 8). Поэтому можно предполагать, что увеличение их ДНК-связывающей активности под действием канцерогена в легких мышей чувствительных линий обусловлено какими-то модификациями этих белков, а не увеличением их концентрации.
Рис. 8. Вестерн блот гибридизация с антителами к NF-Y GATA- Антитела NF-Y (1, 2, 3, 4 ) и GATA-6 (5, 6, 7, 8 ). 1, 2, 5, 6 экстракт ядер легкого мышей линии ICR,3, 4, 7, 8 - Линии мышей ICR С57BL ICR С57BL - +- + - + - + экстракт ядер легкого мышей линии C57BL/6J. 3’-MX 1, 3, 5, 7 -контрольные животные, 2, 4, 6, 8 - 1 2 3 4 5 6 7 обработанные пульмоноканцерогеном3'-МХ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В современной молекулярной генетике уделяется большое внимание выявлению и изучению однонуклеотидных замен (SNPs). Завершение программы по секвенированию генома человека предоставило новые возможности в исследовании вариаций генома человека для понимания причин, лежащих в основе наследуемых заболеваний и лекарственной устойчивости.
Интерес к изучению протоонкогена K-ras у мышей вызван тем, что мутации в нем наблюдаются в тех же кодонах в спонтанных и химически индуцированных опухолях легкого, селезёнки и прямой кишки, что и у человека.
Устойчивые линии M.musculus --- GATA - 288 296 GC C 1 Нами впервые было показано, что район горячей NF-Y и мутагенеза -- точк кодонов Чувствительныегена M.musculusмыши- является местом кооперативного 12 и 13 линии K-ras связывания транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6. Было показано 288 296 также, что у мышей чувствительных линий M.musРис. 9. Предполагаемые culus в начале интрона CA C 1 композиционные элементы в имеется регуляторный композиционный элемент, образованный двумя NF-Y районах кодона 12 и сайтами и одним сайтом для GATA-6, а связанные с устойчивостью к полиморфизма в начале пульмоноканцерогенезуM.spretus разрушают его различные компоненты: GATA Устойчивый вид SNPs интрона 2 гена K-ras мышей 288 296 6 cайт у мышей устойчивых линий M.musculus и NF-Y сайт у вида M.spretus CA T 1 вида M.musculus и вида (Рис. 9).
M.spretus.
Из литературы известно, что наличие чувствительного к пульмоноканцерогенезу варианта полиморфизма в интроне 2 гена K-ras оказывает цис-эффект на образование или фиксацию мутаций в кодонах 12 и 61. Вероятнее всего, именно различия в связывании транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 с различными аллельными состояниями интрона гена K-ras мыши, лежат в основе событий, приводящих к формированию чувствительного или устойчивого к развитию рака легких фенотипа. Мы предполагаем, что, в результате наблюдаемых различий в связывании идентифицированных нами факторов с областью расположения SNPs изменяется архитектоника хроматина в данном районе гена, тем более, что транскрипционному фактору NF-Y свойственно изгибать нить ДНК на 60- в зависимости от фланкирующей последовательности. Изменения в структуре хроматина могут открывать кодон 12 действию кацерогенов или нарушать работу ферментов репарации в данном районе, и таким образом способствовать возникновению мутаций. Это предположение поддерживают полученные нами данные об увеличении ДНК-связывающей активности факторов NF-Y и GATA-6 и усилении их связывания с районами кодонов 12,13 и точкового полморфизма в начале интрона 2 гена K-ras в условиях in vitro после введения легочных канцерогенов нитрозэтилмочевины и 3 метилхолантрена мышам чувствительных линий.
Таким образом, SNPs в начале интрона 2 гена K-ras обладают выраженным регуляторным потенциалом и требуют дальнейшего всестороннего изучения.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что SNPs в интроне 2 гена K-ras в позициях 288 и 296 п.н., сопряженные с предрасположенностью мышей M.musculus к раку легких, формируют комплексный сайт связывания транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y. Взаимодействие GATA-6 и NF-Y с районом локализации SNPs (278/307 п.н.) носит взаимозависимый характер.
2. Мононуклеотидная замена в позиции 311 п.н. интрона 2 гена K-ras, отличающая чувствительные к развитию рака линии мышей вида M.musculus от мышей устойчивого вида M.spretus, приводит к ухудшению выявленного нами дополнительного сайта связывания NF-Y.
3. Набор SNP C (288п.н.), A (296 п.н.) и C (311 п.н.) в интроне 2 гена K-Ras у мышей чувствительных к раку легких линий M. Musculus формирует потенциальный композиционный элемент, включающий два NF-Y сайта и один сайт GATA-6. Мононуклеотидные замены, характерные для устойчивых линий, элиминируют различные компоненты этого композиционного элемента: GATA-6 сайт у M.Musculus и NF-Y сайт у M.Spretus.
4. Район экзона 1 гена K-Ras (от 20 до 50 п.н.), включающий кодон (горячая точка мутагенеза), также содержит комплексный сайт связывания транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y.
5. Показано, что при введении легочных канцерогенов 3-метилхолантрена и нитрозоэтилмочевины животным происходит увеличение ДНК связывающей активности NF-Y и GATA-6, а также усиление их связывания с обоими выявленными нами GATA-6/NF-Y комплексными сайтами в условиях in vitro. Эффект канцерогенов наблюдается у мышей чувствительных к развитию рака легких линий ICR, GR и A/He, но не у резистентных линий C57BL и C3H.
6. Происходящее под действием пульмоноканцерогенов увеличение ДНК связывающей активности NF-Y и GATA-6 не связано с изменением концентрации транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 в ядерных экстрактах, что предполагает какие-то модификации этих белков.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Е.В. Горшкова (Антонцева), В.И. Каледин, В.Ф. Кобзев, Т.И.
Меркулова. SNP в начале интрона 2 гена K-ras мыши, ассоциированные сразвитием рака легких, влияют на связывание с факторами транскрипции. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед, 2006, №6, с.681-684.
2. Е.В. Горшкова (Антонцева), В.И. Каледин, В.Ф. Кобзев, Т.И.
Меркулова. Область кодона 12 гена K-ras является местом связывания транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y in vitro. // Биохимия, 2005, т.70, №10, с.1432-1437.
3. Ponomarenko JV, Merkulova TI, Orlova GV, Fokin ON, Gorshkova (Antontceva) EV, Frolov AS, Valuev VP, Ponomarenko MP. rSNP_Guide: a database system for analysis of transcription factor binding to DNA with variations: application to genome annotation. // Nucleic Acids Res, 2003, V.31(1), p.118-121.
4. О.А. Тимофеева, Е.В. Горшкова (Антонцева), З.Б. Левашова, В.Ф.
Кобзев, М.Л. Филипенко, В.И. Каледин, Т.И. Меркулова. Aссоциированный с чувствительностью к канцергенезу в легких точковый полиморфизм в интроне 2 гена К-ras влияет на связывание с фактором GATA-6, но не на уровень экспрессии гена. // Мол биол. 2002, том 36, №5, c.817-824.
5. Julia Ponomarenko, Tatyana Merkulova, Galina Orlova, Oleg Fokin, Elena Gorshkova (Antontceva), Mikhail Ponomarenko. Mining DNA sequences to predict sites which mutations cause genetic diseases. // Knowlege-Based Systems, 2002, V.15, p.225-233.
6. Ponomarenko JV, Orlova GV, Merkulova TI, Gorshkova (Antontceva) EV, Fokin ON, Vasiliev GV, Frolov AS, Ponomarenko MP. rSNP_Guide: an integrated database-tools system for studying SNPs and site-directed mutations in transcription factor binding sites. // Hum Mutat, 2002, V.20(4), p.239-248.
7. Е.В. Горшкова (Антонцева), Т.И. Меркулова, В.И. Каледин.
Единичные нуклеотидные замены в интроне 2 гена K-ras мыши, сопряженные с развитием рака легких, влияют на связывание факторов транскрипции. // Международная конференция “Физико-химическая биология”, 2006, с.24-25.
8. Gorshkova (Antontceva) E.V., Medkulova T.I., Kaledin V.I. Functional interpretation of pulmonary carcinogenesis susceptibility-associated SNP in K-Ras intron 2. // 3rd International conference “Genomics, proteomics, bioinformatics and nanotechnologies for medicine”, 2006, p.105.
9. Горшкова (Антонцева) Е.В., Меркулова Т.И. Единичные нуклеотидные замены в интроне 2 гена K-ras мыши, ассоциированные с развитием рака легких. // 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2003, с.322.
10. Julia Ponomarenko, Galina Orlova, Tatyana Merkulova, Elena Gorshkova (Antontceva), Mikhail Ponomarenko. Predicting the transcription factor binding site-candidate which presence/absence in SNP alleles could explain the SNP related influence of genome sequence alterations on disease susceptibility/resistance. // Genome Sequencing & Biology, 2001, p.194.
11. J. Ponomarenko, T. Merkulova, O. Fokin, M. Ponomarenko, G. Orlova, E.
Gorshkova (Antontceva). By taking into account gel mobility shift assay data, knowledge discovery of regulatory protein binding site-candidate may explain disease penetration. // Proceedings of the International Conference of Mathematics and Engineering Techniques in Medicine and Biological Sciences, 2001, p.47-53.