Коррекция перфтораном структурно-функционального гомеостаза при синдроме длительного сдавливания
На правах рукописи
Магомедов Камиль Курбанович КОРРЕКЦИЯ ПЕРФТОРАНОМ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ГОМЕОСТАЗА ПРИ СИНДРОМЕ ДЛИТЕЛЬНОГО СДАВЛИВАНИЯ 03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону 2013 1
Работа выполнена в НИИ экологической медицины при ГБОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия».
Научный консультант: Эмирбеков Эмирбек Зиядович доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты: Чистяков Владимир Анатолиевич доктор биологических наук, заведующий лабораторией экспериментального мутагенеза НИИ биологии ФГАОУ ВПО «ЮФУ» (г. Ростов-на-Дону) Горошинская Ирина Александровна доктор медицинских наук, профессор руководитель лаборатории биохимии ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России (г. Ростов-на-Дону)
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет»
Защита диссертации состоится «13» ноября 2013 г. в «13.00» часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1, акт. зал).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148.
Автореферат разослан «_» 2013г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, с.н.с. Е.В. Асланян Актуальность исследования Синдром длительного сдавливания (СДС) или травматический токсикоз – это патологическое состояние, развивающееся у пострадавших в результате длительного (4-5 ч. и более) раздавливания мягких тканей конечностей обломками разрушенных зданий, сооружений, грунтом при обвалах и т.д. Общая реакция организма в ответ на освобождение пострадавших из-под развалин и восстановление кровообращения в пораженной конечности была описана еще в 1918 г. как токсемический шок. Особенность подобных повреждений заключалась в том, что у людей в течение нескольких часов после извлечения развивалось тяжелое прогрессирующее нарушение гомеостаза, которое в 85-90% случаев приводило к гибели. В настоящее время сложилось определенное представление о комплексном механизме развития процесса, включающего нейрорефлекторный и нейрогуморальный факторы, обусловленные длительным болевым раздражителем, плазмопотерей и токсемией.
Несмотря на большое количество публикаций, посвященных изучению патогенеза, клинической картины и лечения СДС [Бородин Ю.И. и др., 1997;
Мкртчян Г.Л., 2001;
Азнаурян A.B., Саакян К.Т., 2001;
Данюкина Н.В., 2002;
Авакян Т.Г., 2004;
Гранкин В.И., Хорошилов С.Е., 2005], эти вопросы все еще далеки от окончательного решения. В то же время, вероятность стихийных бедствий и катастроф по-прежнему сохраняется на высоком уровне, и поэтому проблема изучения СДС не только не потеряла своей актуальности, но в последние годы выдвигается в число приоритетных, в связи с высокой сейсмической активностью на земле и повышением роли антропогенных факторов.
В настоящее время, одной из наиболее актуальных проблем медицины остается поиск средств эффективной профилактики и лечения острой ишемии органов и тканей, имеющей место при СДС. К сожалению, в хирургической практике различные формы ишемий сопровождаются высокими показателями летальности [Калиниченко A.B., 1998;
Бирюков Д.Л., 2001;
Кротовский Г.С., 2005;
Кузьмин. В.В., 2007;
Кузьмин В.В., 2008;
Абрамов Ю.Г., Корочанская С.П., 2009] и, несмотря на значительные успехи в изучении патогенеза процессов ишемии и реперфузии, в арсенале клиницистов пока отсутствует столь необходимый набор эффективных противоишемических средств. Следует отметить, что у больных с тяжелыми травматическими повреждениями возмещение кровопотери предусматривает нормализацию гемодинамики путем восстановления объема циркулирующей крови и оптимизацию кислородного недостатка [Чернышева Г.А. и др., 2000]. Однако, традиционная заместительная терапия кровопотери не всегда оказывается эффективной. При этом многие исследователи [Мороз В.В и др., 2001;
Мчедлишвили Г.И., и др., 2002;
Байбородов Б.Д., Додхоев Д.С. 2003;
Конорова И.Л., и др., 2007] акцентируют внимание на том, что улучшение газообмена при гипоксии возможно и за счет улучшения условий переноса кислорода от эритроцитов к тканям, которое может быть достигнуто улучшением микрореологических свойств крови [Ройтман Е. В., Морозов Ю. А., 2003].
Исследования, проведенные многими авторами, показали, что препарат перфторан (ПФ), обладающий полифункциональными свойствами, может быть полезным в остром периоде травматического токсикоза. В частности, активное изучение в последнее 10-летие механизма действия перфторана в биологических системах позволило отнести это соединение, помимо основной функции кровозаменителей с газотранспортными свойствами, в группу средств, дающих и противоишемический эффект [Лазаренко Д. Ю. и др., 2003;
Сафронов Г.А., Селиванов Е.А., 2003]. Проведено исследование, в котором изучалось влияние перфторана на динамику микроциркуляторного русла фиброзных мембран, показатели гемодинамики и реологии крови при СДС [Османова А.А.
2010]. Работы, посвященные экспериментальному моделированию СДС, изучению тонких механизмов его развития, в частности, в эритроцитах и плазме крови, на сегодняшний день немногочисленны.
Следует также отметить особый интерес исследователей к изучению перекисного окисления липидов (ПОЛ) при СДС. Он связан с тем, что в генезе нарушения проницаемости капилляров и отека в ходе развития процесса одним из важнейших механизмов является усиление генерации свободных радикалов [Ланкин В. З. и др., 2001;
Петрович Ю.А., Гуткин Д.В. 2005].
В связи с этим, целью работы явилось изучение действия перфторана на биохимические показатели крови и печени при экспериментальном СДС.
В соответствии с поставленной целью, были определены следующие задачи:
1. Исследовать содержание продуктов ПОЛ - диеновых коньюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА) и шиффовых оснований (ШО) в эритроцитах и плазме крови крыс в динамике развития экспериментального синдрома длительного сдавливания и при введении перфторана.
2. Изучить состояние антиоксидантной системы (АОС) по активности ферментативных антиоксидантов в плазме крови, эритроцитах и печени животных в динамике развития СДС и при введении перфторана.
3. Исследовать влияние ПФ на содержание фракций основных групп белков крови при СДС в профиле диск-электрофореза.
4. Оценить уровень гипоксии по уровню молочной кислоты при развитии СДС и при введении перфторана.
5. Оценить уровень эндогенной интоксикации по содержанию среднемолекулярных пептидов при развитии СДС и при введении перфторана.
6. Определить содержание внеэритроцитарного гемоглобина в плазме крови крыс при развитии СДС и при введении перфторана.
7. Определить эффективность действия ПФ на эритроциты человека, находящиеся в среде перекиси водорода различной концентрации in vitro.
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые проведена сравнительная оценка содержания продуктов ПОЛ - диеновых коньюгатов, малонового диальдегида и шиффовых оснований в различные сроки развития СДС при инфузии перфторана.
Впервые показано, что введение перфторана снижает интенсивность процессов гипоксии и эндогенной интоксикации в динамике развития СДС.
Впервые показана положительная динамика активности ферментных антиоксидантов в эритроцитах, плазме крови и печени при инфузии перфторана в динамике развития СДС.
При исследовании содержания низкомолекулярных - альбумина и преальбумина, а также высокомолекулярных - трансферрина и 2-глобулина белков плазмы крови впервые установлен положительный эффект инфузии ПФ в раннем периоде развития СДС.
Основные положения, выносимые на защиту.
При СДС наблюдается активация процессов свободнорадикального окисления, которая имеет выраженную этапность, а именно, наблюдается ранний рост содержания диеновых коньюгатов, тогда как концентрация шиффовых оснований и малонового диальдегида увеличивается на промежуточном и позднем этапах развития синдрома.
Эмульсия перфторана обладает высокой биологической активностью. Его регулирующий эффект обусловлен газотранспортным, сорбционным и мембранопротекторным действием.
Изменения гомеостаза в организме подопытных животных, вызванные СДС, могут коррегироваться введением перфторана, что выражается в снижении интенсивности гипоксии, процессов ПОЛ, нормализации активности ферментов антиоксидантной системы.
В начальном и промежуточном периоде СДС отмечается значительный рост внеэритроцитарного гемоглобина ВЭГ в плазме крови. Инфузия ПФ снижает его содержание, что служит подтверждением выраженного мембранопротекторного действия ПФ.
Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом плане выполненная работа вносит существенный вклад в понимание роли процессов ПОЛ, антиоксидантной системы (АОС) крови и печени в поддержании гомеостаза при экспериментальной ишемии, а также позволяет углубить и расширить представления о биохимических и патоморфологических механизмах СДС.
Установленная в работе положительная динамика развития процесса при использовании перфторана, проявляющаяся в подавлении инициации свободнорадикальных реакций и усилении антиоксидантных свойств белков плазмы крови, позволяет предложить использование препарата в комплексе лечебных мероприятий на ранних этапах посткомпрессионного периода СДС.
Проведенные в работе исследования низкомолекулярных и высокомолекулярных белков плазмы крови позволят приблизится к пониманию их участия в патологических процессах, связанных с гипоксией и интоксикацией.
Апробация. Материалы диссертации были представлены на региональной научно-практической конференции «Молодые ученые медицине» (Махачкала, 2012);
научной конференции с международным участием, посвященной памяти профессора Р.И. Асфандиярова “Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье человека.
Актуальные проблемы биологии и медицины” (Астрахань, 2012);
6 1 - й научно практической конференции студентов и молодых учёных (Махачкала, 2013);
на заседании кафедры биохимии и микробиологии Южного федерального университета.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 6 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Общий объем публикаций составил 1, п.л., личный вклад – 84%.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 217 отечественных и 85 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 21 рисунком.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
В работе использовались белые лабораторные крысы массой 190-230 г. в количестве 210. Животные содержались в стандартных условиях вивария;
опыты с животными проводились натощак.
Для выполнения поставленных задач животные распределялись на группы: I – интактная (30);
II – модель посткомпрессионного периода СДС без коррекции (60);
III – модель посткомпрессионного периода СДС + коррекция физиологическим раствором (ФР) (60);
IV – Модель СДС + коррекция инфузией перфторана (60). Интактная группа в свою очередь подразделялась на подгруппы – контроль (10), контроль + ФР (10), контроль + ПФ (10). На подгруппах «контроль + ПФ» и «контроль + ФР», исследовалось действие внутривенного введения ПФ или ФР без моделирования СДС. Проводилось внутривенное введение ПФ в хвостовую вену из расчета 2 мл/кг массы животного, исследование крови проводилось через сутки.
Синдром длительного сдавливания (СДС) у крыс воспроизводили компрессией мягких тканей бедра под этаминал-натриевым наркозом (40 мг/кг) специальными металлическими тисками в течении 4 часов [Кулагин В.К., Ефремов А.В., 1982;
Ардашева Е.И., 2002]. Площадь сдавливающей поверхности составляла около 5 см2. Силу и время сдавления подбирали в эксперименте таким образом, что в результате возникала клиническая картина СДС средней степени тяжести. Это позволяло унифицировать условия проведения исследований и проследить процессы, как повреждения, так и восстановления. В III и IV группе животных физиологический раствор или ПФ вводили в хвостовую вену после декомпрессии из расчета 2 мл/кг массы.
Выбранные сроки исследования соответствовали общепринятым периодам развития СДС: от 1 до 3 суток – ранний период;
от 3 до 7 суток – промежуточный период;
от 7 до 21 суток – поздний (восстановительный период) [Нечаев Э.А. 1993]. Животные выводились из эксперимента по прошествии исследуемого срока СДС: через 1 час;
1-й день;
3-й день;
7-й день;
14-й день;
21-й день.
После декапитации кровь собирали в центрифужные пробирки. В качестве антикоагулянта использовали гепарин 5000 МЕ/мл из расчёта 0,1 мл гепарина на 10 мл крови. Извлекали печень и немедленно помещали в физиологический раствор при +4С. Из гепаринизированной крови получали плазму, путём центрифугирования 15 мин при 3000 об/мин.
Полученный в результате центрифугирования гепаринизированной крови осадок эритроцитов ресуспендировали в 10 мл охлаждённого физиологического раствора, затем центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. Процедуру повторяли трижды. Отмытый осадок эритроцитов использовали для получения 1% гемолизата. Эритроциты лизировали дистиллированной водой в соотношении 1:10 путём энергичного встряхивания содержимого пробирки при +4С. Полученный 1% гемолизат использовали для дальнейших исследований.
Печень промывали в физиологическом растворе при +4С и высушивали фильтровальной бумагой. Для получения 10%-ных гомогенатов тканей, навески печени после предварительного размельчения, гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 10-ти кратном объёме физиологического раствора при +4С. Затем полученные гомогенаты обрабатывали 0,1% раствором тритона Х-100 и инкубировали в течение минут при 37С на водяной бане, затем центрифугировали 15 мин при об/мин. Для исследований активности ферментов использовали супернатант.
Методы определения биохимических показателей. Интенсивность ПОЛ определяли по содержанию его продуктов: первичных – диеновых конъюгатов (ДК) [Стальная И.Д., 1977], вторичных – малонового диальдегида (МДА) [Стальная И.Д., 1977] и конечных – шиффовых оснований (ШО) [Bidlack W,R 1973]. Определение гемоглобина в гемолизате эритроцитов осуществляли с помощью стандартного набора реактивов производства ЗАО «ЭКОлаб» (Россия) [Меньшиков В.В., 1987].
Для определения состояния мембран и уровня прооксидантов в исследуемых тканях определяли содержание внеэритроцитарного гемоглобина [Каракашов А.В., 1973].
О состоянии антиоксидантной защиты судили по активности антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы [Fried R., 1975], каталазы (КТ) [Королюк М.А. 1988], оксидазной активности церулоплазмина [Колб В.Г., 1982].
Уровень эндотоксикации при синдроме длительного сдавливания определяли по содержанию среднемолекулярных пептидов в плазме крови [Осипович В.К., Тупикова З.А., 1987].
Критерием гипоксии являлось, определение по содержанию в плазме крови молочной кислоты [Меньщикова и др. 1987].
Фракционирование белков плазмы крови проводили методом диск электрофореза в полиакриламидном геле [Маурер Г. 1971]. Для выявления общего спектра белков плазмы гелевые полоски окрашивали 1% раствором амидового черного в 7% растворе уксусной кислоты.
Относительное содержание белков плазмы крови, определяли методом денситометрирования [Дорохова и др., 1991;
Горячковский А.М., 2005]. Для этой цели электрофореграммы анализировали на денситометре БИАН-170.
Оценка влияния перфторана на эритроциты человека in vitro в среде перекиси водорода.
Для оценки влияния H2O2 на состояние эритроцитов, находящихся в среде с ПФ в соотношении 10/1, были выбраны концентрации препарата :
66104 % ;
33104 % и 66105 %.
Свежезаготовленную донорскую кровь, стабилизированную гепарином, в количестве 5 мл смешивали с ПФ (0,5) и инкубировали в течении часа при 37С.
По истечении этого срока в смесь добавляли H2O2 в указанных концентрациях.
Оценка влияния H2O2 на состояние мембраны эритроцитов проводилась по Филёву Л.В. с соавторами (1989) путем подсчета эхиноцитов в мазке крови (в %), содержащихся на определенное число (1000) эритроцитов.
Гемолиз эритроцитов после инкубации смеси кровь/ПФ с H2O2 оценивали в соответствии с инструкцией, принятой в Службе крови (1989), предусматривающей «отсутствие видимого гемолиза».
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с применением пакета прикладных программ Statistica-6. Для количественных данных, полученных в ходе исследования, предварительно оценивался вид распределения с применением критерия согласия Колмогорова-Смирнова. Все выборки экспериментальных данных соответствовали нормальному распределению. Данные представлены в форме М, где М – среднее арифметическое, а – стандартное отклонение. Для проверки статистических гипотез (при условии применимости критерия) использовали t-критерий Стьюдента. Критическим считался уровень статистической значимости р=0,05.
Данные, полученные в различные сроки СДС без коррекции и при введении ПФ животным на которых не воспроизводили СДС, сравнивали с показателями соответсвующей контрольной подгруппы. Показатели полученные при введении ФР или ПФ при СДС, сравнивали с данными СДС без коррекции.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Полученные в ходе исследования результаты свидетельствуют о том, что в тканях экспериментальных животных при СДС развивается гипоксия (Рис. 1).
Достоверное увеличение концентрации маркера гипоксии – молочной кислоты наблюдается уже через час после декомпрессии и достигает 84%, относительно показателей интактных животных. По прошествии 24 часов содержание молочной кислоты в плазме крови увеличивается в 2,7 раза. К началу второй недели уровень молочной кислоты выше значений интактной группы на 155%.
В начале и в конце третьей недели её содержание превышает показатели интактной группы на 54% и 49%.
Изучение влияния внутривенного введения ПФ на уровень гипоксии в различные периоды СДС показало, что содержание молочной кислоты в плазме крови снижается в сравнении с животными второй группы. Наиболее высокая степень коррекции ПФ наблюдается на 1-е и 21-е сутки. В эти периоды содержание молочной кислоты снизилось на 39% и 33% (относительно показателей СДС без коррекции). На 7-е и 14-е сутки снижение составило 29% и 21%, соответственно.
В проведенном исследовании было показано, что внутривенное введение ПФ крысам в различные периоды СДС вызывает достоверное снижение гипоксии. Это происходит благодаря улучшению снабжения кислородом ишемизированных тканей при непосредственном участии ПФ. Так же ПФ, обладая мембранопротекторными свойствами, способствует стабилизации мембран эритроцитов, препятствует гемолизу, улучшая, таким образом, кислородно-транспортную функцию эритроцитов.
Рис. 1. Содержание молочной кислоты в плазме крови в различные дни декомпрессионного периода СДС при инфузии физиологического раствора и ПФ (мкмоль/мл).
Обозначения: - достоверные отличия (p 0,05) по сравнению с контролем (для СДС);
* - по сравнению с соответствующими сроками СДС (для ФР и ПФ).
По классификации, предложенной М.В. Биленко, СДС относится к полной (тотальной) ишемии, которая развивается как на местном уровне, так и в других органах. В этих условиях дефицит кислорода играет главную роль в патогенезе повреждений, ведущих к чрезмерному образованию его активных форм, которые, в свою очередь, усиливают реакции свободнорадикального окисления, т.е. образования продуктов ПОЛ.
Образование ДК, являющихся первичными продуктами ПОЛ, резко возрастает при патологических состояниях, в основе которых лежит окислительный стресс. В частности, авторами (Мальцев А.Н и др., 2010;
Курашвили Л.В и др., 1992) были выявлены существенные сдвиги, в сторону роста, при экспериментальном эмоционально-болевом стрессе, язвенной болезни, хронической почечной недостаточности и др. В наших исследованиях рост содержания ДК в эритроцитах и плазме крови отмечался уже с первых суток эксперимента и достигал максимального уровня на 3-4 сутки (Рис. 2).
Последующие наблюдения показали их постепенное снижение, хотя концентрация продукта не достигает исходного уровня даже по истечении 3-х недель. При введении экспериментальным животным физиологического раствора содержание ДК не меняется, тогда как при инфузии ПФ, концентрация продукта снижается по сравнению с СДС без коррекции, причем эта разница сохраняется на всех последующих этапах декомпрессии. уже через час после декомпрессии. Надо полагать, что скорость антиоксидантного действия ПФ на первичные продукты ПОЛ достаточно высока.
Рис. 2. Содержание ДК в эритроцитах и плазме крови крыс в различные дни декомпрессионного периода СДС при инфузии физиологического раствора и ПФ (в эритроцитах - нмоль/мг Hb;
в плазме крови - нмоль/мл) Обозначения: - достоверные отличия (p 0,05) по сравнению с контролем (для СДС);
* - по сравнению с соответствующими сроками СДС (для ФР и ПФ).
У животных первой опытной группы (экспериментальный СДС без коррекции) содержание МДА в эритроцитах сохраняется без заметных сдвигов в первые 2 периода после декомпрессии (Рис. 3). Достоверный его рост был выявлен на 1-й день и сохранялся в последующие 2 недели. В плазме крови уровень МДА был достоверно выше исходных значений уже на 1-е сутки.
Рис. 3. Содержание МДА в эритроцитах и плазме крови в различные дни декомпрессионного периода СДС при инфузии физиологического раствора и ПФ (в эритроцитах - нмоль/мг Hb;
в плазме крови - нмоль/мл) Обозначения: - достоверные отличия (p 0,05) по сравнению с контролем (для СДС);
* - по сравнению с соответствующими сроками СДС (для ФР и ПФ).
По данным некоторых авторов [Данюкина Н.В., 2002], достоверный рост концентрации МДА начинается только на 3-и сутки после декомпрессии. Более сложную динамику сдвигов описывают другие исследователи [Мальцев А.Н. и др., 2010] при экспериментально - болевом синдроме. Ими было выявлено, что концентрация МДА повышается через несколько часов после острого стресса с последующим снижением через сутки. Эти данные согласуются с результатами наших исследований, где также был отмечен ранний рост концентрации продукта ПОЛ. При введении ФР не было выявлено заметных изменений концентрации МДА в эритроцитах по сравнению с контрольными значениями.
Инфузия ПФ повышает содержание продукта уже через час.
Содержание шиффовых оснований в эритроцитах в первые 7 дней после декомпрессии повысилось по сравнению контрольной группой, однако, к концу 1-й недели разница между ними начала постепенно уменьшаться, оставаясь тем не менее выше нормы.
Введение ПФ также приводит к снижению содержания ШО. Как следует из приведённых иллюстраций (Рис. 4), при использовании ПФ изменения концентрации ШО в плазме крови в разные сроки декомпрессионного периода снижается, особенно сильное падение уровня наблюдается в эритроцитах.
Рис. 4. Содержание ШО в эритроцитах и плазме крови в различные дни декомпрессионного периода СДС при инфузии физиологического раствора и ПФ (в эритроцитах - ед. фл./мг Hb;
в плазме крови - ед. фл./мл) Обозначения: - достоверные отличия (p 0,05) по сравнению с контролем (для СДС);
* - по сравнению с соответствующими сроками СДС (для ФР и ПФ).
Рост содержания продуктов ПОЛ, отражающий активизацию свободнорадикальных реакции, обнаруживается при различных патологических состояниях и заболеваниях, в механизме развития которых доминирующее место занимает окислительный стресс. Из этого можно сделать заключение, что естественным результатом действия таких этиологических факторов, как гипоксия и интоксикация, является активация процессов ПОЛ – неспецифического последовательного цикла реакции организма, который включается всегда при дефиците кислорода в тканях.
Более медленное накопление продуктов ПОЛ при использовании ПФ указывает на меньшую выраженность гипоксии, как одной из причин их роста.
Можно предположить, что газотранспортная способность ПФ достаточно велика, чтобы путём диффузии обеспечить поступление в ткани заметного количества кислорода.
Рост активности ЦП отмечается уже через час на 58%, на 3-й день после декомпрессии на 125% превышает значения интактной группы. К началу второй недели активность ЦП превышала показатели интактной группы в 1, раза. В дальнейшем (14-е и 21-е сутки) активность ЦП незначительно превышали значения в норме (Рис. 5).
Рис. 5. Активность церулоплазмина в плазме крови в различные дни декомпрессионного периода СДС при инфузии физиологического раствора и ПФ (мкмоль/л) Обозначения: - достоверные отличия (p 0,05) по сравнению с контролем (для СДС);
* - по сравнению с соответствующими сроками СДС (для ФР и ПФ).
При введении ПФ уровень ЦП наиболее сильно снижается к концу первого периода СДС.
Таким образом, содержание ЦП, который играет существенную роль в антиоксидантной защите, в промежуточные и конечные сроки СДС, при инфузии ПФ сохраняется на достаточно высоком уровне. Это можно объяснить тем, что ПФ приводит к значительной активации ферментов антиоксидантной защиты, а именно, СОД, каталазы, и надо полагать, ЦП. Последнее свидетельствует о том, что данный препарат является модулятором свободно радикальных процессов в клетках организма.
В отличие от ЦП, активность СОД в различные периоды СДС снижается:
на 1-е и 3-и сутки уровень фермента падает на 35% и 30%, соответственно.
Уровень активности КТ также снижается в первые 3 срока исследований, на 39%, 33% и 26%, соответственно. В последующие периоды активность КТ восстанавливается и даже превышает фоновые значения.
Введение ПФ повышает содержание СОД на 36% уже через час после декомпрессии. Самая высокая степень коррекции перфтораном активности СОД при СДС наблюдается на 3-й день эсперимента: активность фермента возрастает на 68%. К началу 2-й недели уровень СОД не претерпевает существенных изменений. Тем не менее, на 7-й день наблюдается рост активности СОД на 35%, а на 14-й и 21-й день содержание СОД снижается и составляет 19% по сравнению с СДС без коррекции (Рис. 6).
Рис. 6. Содержание СОД в эритроцитах крови у крыс в различные дни декомпрессионного периода СДС, при инфузии физиологического раствора и ПФ (усл.ед/мг Hb) Обозначения: - достоверные отличия (p 0,05) по сравнению с контролем (для СДС);
* - по сравнению с соответствующими сроками СДС (для ФР и ПФ).
При инфузии перфторана крысам, не перенесших СДС, отмечалось повышение активности каталазы в эритроцитах крови на 33% в сравнении со значениями интактных животных (Рис. 7). Это подтверждает результаты исследования [Жукова А.Г. и др 2006], в котором был обнаружен рост содержания фермента при воздействии перфторана. При введении ПФ, показатели активности КТ через час были выше чем при некомпенсированом СДС на 28%.
Наибольшее повышение уровня КТ при введении ПФ (на 71% относительно данных СДС без коррекции) отмечается на 3-й день эксперимента.
К началу 2-й и 3-й недели концентрация фермента не отличается от значений контроля и варианта с введением ФР. И только на 21-е сутки происходит повышение содержания антиоксиданта на 10%. Активация ферментов АОЗ при введении перфторана свидетельствует о том, что этот препарат является модулятором свободно-радикальных процессов в клетке.
Рис. 7. Содержание каталазы в эритроцитах крови в различные дни декомпрессионного периода СДС при инфузии физиологического раствора и ПФ (нмоль Н2О2/мг Hb) Обозначения: - достоверные отличия (p 0,05) по сравнению с контролем (для СДС);
* - по сравнению с соответствующими сроками СДС (для ФР и ПФ).
Снижение активности КТ в печени на 13% отмечается через 1 час после декомпрессии (Рис. 8). Указанным изменениям может способствовать понижение эффективности функционирования ферментативной системы первой линии антиоксидантной защиты в печени при воздействии острого окислительного стресса.
По-видимому, снижение активности исследованных ферментов может быть следствием ингибирующего эффекта активных форм кислорода (АФК), которые накапливаются в клетках печени при стрессе. Указанные тенденции наблюдаются в течение всего первого периода декомпрессии. Это может быть связано как с усилением генерации АФК, так и с ростом количества продуктов свободно-радикального окисления. На 1-е и 3-и сутки эксперимента уровень фермента снижается на 37% и 58%, соответственно. Надо полагать, что для модуляции антиоксидантных систем требуется более продолжительный промежуток времени. Как следует из приведенных данных, на второй неделе декомпрессионного периода отмечается рост активности СОД, а к концу 3-й показатели возвращаются к таковым у интактной группы.
На первые сутки эксперимента уровень активности каталазы в печени снижается на 26%. В следующий период отмечается более значительное падение её содержания (на 36%). Надо полагать, что причиной этого является большая концентрация продуктов ПОЛ и АФК в тканях печени, при нейтрализации которых антиоксидантная система истощается. К концу первой недели наблюдается тенденция к повышению показателей активности фермента с достижением максимальных значений на 14-й день, которые на 47% превышают величины в норме.
Рис. 8. Активность антиоксидантной системы в печени крыс в различные дни декомпрессионного периода СДС при инфузии физиологического раствора и ПФ (СОД – ед/мг белка, КТ – нмоль Н2О2 /мг белка) Обозначения: - достоверные отличия (p 0,05) по сравнению с контролем (для СДС);
* - по сравнению с соответствующими сроками СДС (для ФР и ПФ).
Следует отметить, что влияние инфузии ПФ на сдвиги активности КТ и СОД в печени было менее выражено, в сравнении с данными исследования ферментов АОС при СДС в крови. Наиболее значительная коррекция активности СОД, в сравнении со значениями СДС без коррекции, отмечается на 3-и сутки и составляет 32%. Коррекция уровня каталазы при введении ПФ через час и на 1-е сутки после декомпрессии составляет 18% и 25%, соответственно. Положительным действием применения ПФ при СДС следует считать тот факт, что показатели уровня КТ в ткани печени при СДС восстанавливаются до нормы уже на 3-й день декомпрессионного периода, тогда как в условиях обычного СДС это наблюдается только к концу первой недели.
Полученные в ходе эксперимента результаты о влиянии ПФ активность АОС при СДС подтверждают данные исследования, в котором показано, что у больных с тяжелой травмой и кровопотерей введение ПФ способствует нормализации показателей АОС [Остапченко Д.А. и др., 2003].
В проведенном исследовании установлено повышение содержания ВЭГ в плазме крови крыс в различные периоды СДС. Уже через сутки после компрессии уровень ВЭГ увеличивается на 228%. Наиболее высокие показатели ВЭГ отмечались на 3-и сутки, содержание свободного гемоглобина увеличивается в 3,4 раза. В последующие периоды СДС концентрация ВЭГ снижается, но даже к концу 3-й недели его уровень остается выше показателей интактных животных (Рис. 9).
Рис. 9. Содержание внеэритроцитарного гемоглобина в крови в различные дни декомпрессионного периода СДС, при инфузии физиологического раствора и ПФ (мкмоль/л) Обозначения: - достоверные отличия (p 0,05) по сравнению с контролем (для СДС);
* - по сравнению с соответствующими сроками СДС (для ФР и ПФ).
При исследовании влияния ПФ на крыс, не подвергавшихся компрессии, отмечается достоверное снижение содержания ВЭГ на 28%. Внутривенное ведение ПФ экспериментальным животным в различные периоды СДС приводит к снижению уровня ВЭГ. Наиболее сильное влияние ПФ оказывает на 1-й и 3-й период СДС, где коррекция составила 25% и 34%. В дальнейшие периоды, на 7-й и 21-й день коррекция была равна 30% и 36%, соответсвенно. К концу 3-й недели уровень ВЭГ не превышал показателей интактной группы.
Таким образом, в результате проведенного исследования, было установлено, что применение ПФ в различные периоды СДС способствует стабилизации структурного состояния мембран эритроцитов.
При исследовании уровня эндогенной интоксикации в различные дни декомпрессионного периода, было установлено достоверное повышение содержания средне-молекулярных пептидов (СМП) в плазме крови. Наиболее значительное повышение уровня СМП отмечалось в первые 3 дня, на это время приходится первый период СДС. На 1-й и 3-й день содержание СМП повышается на 64% и 89%, соответственно. К концу первой недели показатели маркера интоксикации остаются все еще высокими (прирост составляет 73%). В дальнейшие 2 недели декомпрессионного периода содержание приближается к значениям, которые получены в норме (Рис. 10). Увеличение содержания СМП у экспериментальных животных при СДС является прямым следствием накопления продуктов деградации белков в результате протеолиза.
Рис. 10. Содержание СМП в плазме крови в различные дни декомпрессионного периода СДС при инфузии физиологического раствора и ПФ (г/л).
Обозначения: - достоверные отличия (p 0,05) по сравнению с контролем (для СДС);
* - по сравнению с соответствующими сроками СДС (для ФР и ПФ).
Применение ПФ оказало наиболее значительный эффект на 1-е и 3-и сутки. Уровень интоксикации уменьшился на 33% и 24% относительно значений контрольной группы. В дальнейшем содержание СМП снижается и к концу 3-й недели достигает контрольных значений. Важным положительным эффектом применения ПФ при окислительном стрессе, вызванном СДС, является снижение показателей эндогенной интоксикации. Этот факт является объяснением мембранопротекторного действия ПФ, так как инфузия ПФ при СДС приводила к достоверному снижению уровня СМП, а пептидные компоненты способны адсорбироваться на поверхности эритроцитов, оказывая разрушительное действие на структуру мембраны.
Как было отмечено ранее, в результате нарушения кровоснабжения, которое имеет место при СДС, возникает гипоксия тканей. Этот процесс сопровождается глубокими метаболическими процессами, нарушениями в работе антиоксидантных систем крови и тканей, развивается эндотоксикоз.
По результатам проведенных диск-электрофоретических исследований, относительное содержание (в %) фракции альбумина в плазме крови, которая на фореграммах имеет самую большую подвижность, в первые 3 дня декомпрессионного периода находится ниже значений, полученных в норме.
Через час после декомпрессии относительное содержание снижается на 13%, на 1-е и 3-и сутки снижение составляет 16 и 20%, соответственно. В дальнейшем относительное содержание альбумина имеет тенденцию к росту, хотя даже к концу 3-й недели оно не достигает показателей интактной группы (Рис. 11).
Рис. 11. Диск-электрофоретическая характеристика альбумина и преальбумина в плазме крови у контрольных крыс в различные сроки декомпрессионного периода СДС (относительное содержание в %).
Обозначения: - достоверные отличия (p 0,05) по сравнению с контролем (для СДС);
* - по сравнению с соответствующими сроками СДС (для ФР и ПФ).
Снижение относительного содержания альбумина при СДС может быть связано, прежде всего, с развитием нефротического синдрома, который сопровождается увеличением фильтрации белков в почках и селективной протеинурией – потерей с мочой большого количества альбумина.
Представляется, что восстановление относительного содержания альбумина до значений нормы к концу 3-й недели декомпрессионного периода, следует объяснить уменьшением его клубочковой фильтрации. [Нечаев Э.А. и др., 1993]. Это также можно рассматривать как результат низкой концентрации циркулирующих токсических продуктов распада тканей и продуктов ПОЛ.
Относительное содержание фракции преальбумина в плазме крови при СДС, достоверно не изменяется.
Введение физиологического раствора животным в различные периоды СДС также не приводит к достоверным изменениям относительного содержания фракций альбумина и преальбумина.
При инфузии ПФ относительное содержание фракции альбумина сохраняется в пределах значений СДС без коррекции. Внутривенное введение ПФ при СДС не приводит к статистически достоверным изменениям относительного содержания фракции преальбумина в плазме крови.
Относительное содержание фракции глобулина в плазме крови в различные сроки декомпрессионного периода увеличивается на протяжении первой недели эксперимента, однако, на 2-й и 3-й неделе полученные данные приближаются к значениям в норме (Рис. 12). Достоверное повышение относительного содержания глобулина на 27% наблюдается уже через час после декомпрессии. На 1-е сутки СДС содержание белка составляет 24%.
Максимальная величина относительного содержания глобулина (44%) наблюдается на 3-и сутки декомпрессионного периода. К концу 1-й недели показатели глобулина достоверно превышают норму на 17%. На 14-е и 21-е сутки СДС относительное содержание глобулина колеблется в пределах значений нормы.
Рис. 12. Диск-электрофоретическая характеристика фракций глобулина и гемоглобин трансферрин в плазме крови у контрольных крыс в различные сроки декомпрессионного периода СДС (относительное содержание в %).
Обозначения: - достоверные отличия (p 0,05) по сравнению с контролем (для СДС);
* - по сравнению с соответствующими сроками СДС (для ФР и ПФ).
Относительное содержание фракции гемоглобин-трансферрина с 1-го часа после декомпрессии плавно увеличивается, достигая пика на 3-и сутки СДС.
Через час после декомпрессии относительное содержание фракции выросло на 27%, а к концу 1-х суток – на 39%. Максимальное повышение показателя (на 42%) отмечается на 3-и сутки. Далее, на 7-е и 14-е сутки декомпрессии происходит постепенное снижение, превышающее, однако, показатели СДС, полученные в норме на 31% и 25%, соответственно. К концу 3-й недели эксперимента, на 21-е сутки СДС, полученные результаты достигают значений, характерных для нормы.
Ведение физиологического раствора животным при СДС не приводит к достоверным изменениям относительного содержания фракций глобулина и гемоглобин-трансферина.
При инфузии ПФ животным, на которых не проводилось моделирование СДС, относительное содержание глобулиновой фракции достоверно повышается на 15% по сравнению с показателями в норме. Показатели относительного содержания глобулиновой фракции в плазме крови при введении ПФ в различные сроки декомпрессионного периода отличаются значительным разнообразием. Если в первые три дня после травмы относительное содержание фракции снижается, достигая минимальных значений на 3-и сутки, то к 3-й неделе СДС – возрастает (Рис. 12). Через 1 час после декомпрессии содержание глобулиновой фракции снижается на 15% по сравнению с показателями СДС без введения ПФ. На 1-е сутки декомпрессионного периода при введении ПФ достоверных изменений относительного содержания белка не наблюдаются. Относительное снижение глобулиновой фракции на 19% (по сравнению с СДС без коррекции) отмечается на 3-й день декомпрессионного периода. На 14-е сутки СДС при введении ПФ относительное содержание белка достоверно повышается на 21% по сравнению с СДС без коррекции. К концу 3-й недели достоверных изменений при введении ПФ не наблюдается.
Содержание гемоглобин-трансфериновой фракции в плазме крови при введении ПФ имеет ряд особенностей. У животных без воспроизведения СДС наблюдается достоверное снижение относительного содержания фракции на 14%. При моделировании СДС почти во все сроки декомпрессии, относительное содержание этой фракции у крыс, получавших ПФ, было ниже, чем при отсутствии коррекции. Через час после декомпрессии достоверных изменений содержания белковой фракции не отмечается. На 3-й день наблюдается снижение относительного содержания белка в плазме крыс на 20%. В последующие периоды (на 7-е и 14-е сутки) показатели приближаются к значениям, полученным при СДС без коррекции, оставаясь, тем не менее, ниже на 14 и 13% соответственно. К концу 3-й недели относительное содержание гемоглобин-трансферриновой фракции колеблется в пределах значений, полученных при СДС без коррекции.
ВЫВОДЫ 1. Синдром длительного сдавливания сопровождается значительной активацией процессов ПОЛ в эритроцитах и плазме крови. Содержание ДК достоверно превышает контрольные значения в ранние сроки после декомпрессии, а МДА и ШО – в более поздние сроки.
2. Введение физиологического раствора опытным животным не приводит к существенным сдвигам содержания продуктов ПОЛ и ферментов АОС в плазме крови, эритроцитах и печени. При введении ПФ в различные периоды СДС наблюдается достоверное снижение содержания исследованных метаболитов в эритроцитах и плазме крови по сравнению с показателями СДС без коррекции.
3. Введение ПФ при СДС приводит к снижению уровня гипоксии тканей и продуктов перекисного окисления липидов.
4. Оксидазная активность церулоплазмина при введении ПФ достоверно отличается от таковой при СДС без коррекции. Этот факт свидетельствует о том, что перфторан улучшает реологические показатели крови и, тем самым, нормализует структурно-функциональные свойства эритроцитов.
5. Применение перфторана при СДС стабилизирует ферменты АОС крови, однако, влияние препарата на уровень антиоксидантов в тканях печени не столь выражено.
6. Установленное в экспериментах снижение уровня молочной кислоты, СМП и ВЭГ при введении перфторана в динамике развития СДС свидетельствует о том, что он значительно способствует уменьшению развития процессов гипоксии и эндотоксикоза, а также повышает стабильность мембран эритроцитов.
7. В модели СДС достоверный рост уровня глобулиновой и гемоглобин трансферриновой фракций наблюдается в 1-й и 2-й неделе декомпрессионного периода. Коррекция перфтораном приводит к достоверным изменениям относительного содержания этих фракций, не влияя на содержание альбумина и преальбумина.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК.
1. Магомедов К.К. Морфо-функциональная оценка влияния перфторана на эритроциты человека in vitro в среде перекиси водорода / К.К. Магомедов, М.М. Бакуев, Р.К. Шахбанов, М.А. Магомедов // Известия ДГПУ.
«Естественные и точные науки», - 2011, - №4 - С. 80-83. (0,16 п.л., личн.
вкл. 80%).
2. Магомедов К.К., Состояние антиоксидантных белков плазмы крови в динамике развития синдрома длительного сдавливания / Магомедов К.К., Бакуев М.М., Шахбанов Р.К., Арсаханова Г.А // Известия ДГПУ.
«Естественные и точные науки», - 2012. - №1. - С. 53-57. (0,20 п.л., личн.
вкл. 70%) 3. Магомедов К.К. Современные аспекты патогенеза синдрома длительного сдавливания в клинике и эксперименте / К.Я. Шугаева, М.А. Магомедов, К.К. Магомедов, Р.К. Шахбанов // Известия ДГПУ. «Естественные и точные науки», - 2012, - №2. - С. 101-105. (0,20 п.л., личн. вкл. 80%) 4. Магомедов К.К. Состояние антиоксидантных систем при различных патологических состояниях организма / М.М. Бакуев, К.К. Магомедов, Р.К. Шахбанов, М.А. Магомедов // Известия ДГПУ. «Естественные и точные науки», - 2012. - №3. - С. 63-67. (0,20 п.л., личн. вкл. 80%).
5. Магомедов К.К. Влияние перфторана на эритроциты, находящиеся в среде активной формы кислорода / Магомедов К К., Бакуев М.М., Шахбанов Р.К., Магомедов М.А //Астраханский медицинский журнал, - 2013. Том 8. - №1. - С. 155-157. (0,12 п.л., личн. вкл. 80%) 6. Магомедов К.К. Влияние перфторана на антиоксидантные ферменты в крови крыс при синдроме длительного сдавливания / К.К. Магомедов, Э.З. Эмирбеков, М.М. Бакуев, Р.К. Шахбанов // "Фундаментальные исследования" - № 10 (часть 4). - 2013. - C. 781-784. (0,16 п.л., личн. вкл.
70%) Список научных работ, опубликованных по теме диссертации 7. Магомедов К. К. Содержание малонового диальдегида в эритроцитах и плазме крови при синдроме длительного сдавливания и его коррекция инфузией перфторана / Сборник научных работ региональной научно практической конференции «Молодые ученые медицине» г. Махачкала.
2012. С. 27-31. (0,20 п.л., личн. вкл. 100%) 8. Магомедов К.К. Влияние перфторана на уровень среднемолекулярных пептидов в плазме крови при синдроме длительного сдавливания / Сборник материалов 61-й научной конференции молодых ученых и студентов. г. Махачкала - 2013. - С. 171–175. (0,20 п.л., личн. вкл. 100%) 9. Магомедов К.К. Содержание внеэритроцитарного гемоглобина в плазме крови при синдроме длительного сдавливания и его коррекция инфузией перфторана / Сборник материалов 61-й научной конференции молодых ученых и студентов. г. Махачкала 2013. - С. 176–180. (0,20 п.л., личн. вкл.
100%) ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АОЗ – антиоксидантная защита;
АОС – антиоксидантная система;
АФК – активные формы кислорода;
ВЭГ – внеэритроцитарный гемоглобин;
ДК – диеновые конъюгаты;
КТ – каталаза;
МДА – малоновый диальдегид;
ПОЛ – перекисное окисление липидов;
СДС – синдром длительного сдавливания;
СОД – супероксиддисмутаза;
СМП – среднемолекулярные пептиды ЦП – церулоплазмин;
ШО – шиффовы основания;
ПФ – перфторан;
ФР – физиологический раствор.
Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Таймс».
Формат 60х84/16. Объем 1.0 уч.-изд.-л.
Заказ № 3151. Тираж 120 экз.
Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-