Владимир владимирович люминесцентные показатели листьев растений в зависимости от антропогенных экологических факторов
На правах рукописи
УДК 577.355 Францев Владимир Владимирович ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЛИСТЬЕВ РАСТЕНИЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ АНТРОПОГЕННЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ 03.00.02 – биофизика 03.00.16 – экология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Москва – 2006
Работа выполнена на кафедре общей физики физического факультета Мос ковского государственного университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители:
доктор физико-математических наук, профессор Владимир Александрович Караваев кандидат физико-математических наук, доцент Михаил Константинович Солнцев
Официальные оппоненты:
доктор физико-математических наук, профессор Валерий Алексеевич Смирнов кандидат физико-математических наук, доцент Екатерина Александровна Кузнецова
Ведущая организация:
Институт фундаментальных проблем биологии РАН (г.Пущино)
Защита диссертации состоится 21 декабря 2006 года в _ часов на заседании диссертационного совета К 501.001.08 в МГУ им. М.В. Ломоносова по адре су: 119899, ГСП, г.Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, фи зический факультет, аудитория ЮФА.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова
Автореферат разослан «_» _2006 года
Ученый секретарь диссертационного совета К 501.001. кандидат физико-математических наук Г.Б. Хомутов 1.
Общая характеристика работы
Постановка проблемы, ее актуальность Фотосинтез – это процесс преобразования солнечной энергии в энер гию химических связей. Если бы не было фотосинтеза, то жизнь на Земле в ее сегодняшнем многообразии была бы невозможна, от его эффективности напрямую зависит урожайность различных сельскохозяйственных культур.
Особый интерес представляют первичные процессы фотосинтеза, в которых происходит поглощение квантов света, миграция энергии возбуждения на ре акционный центр, первичное разделение зарядов, разложение молекул воды с выделением О2 и перенос электронов по цепи электронного транспорта.
Освещая фотосинтетические объекты при пониженной температуре, а затем нагревая их в темноте, можно наблюдать явление термолюминесцен ции, связанное с рекомбинацией положительных и отрицательных зарядов, образовавшихся на донорной и акцепторной стороне второй фотосистемы.
Изучение термолюминесценции предоставляет важную информацию о меха низмах трансформации энергии света и эффективности ее запасания в про цессе фотосинтеза, позволяет контролировать протекание in situ тех физико химических реакций, которые связаны с работой второй фотосистемы выс ших растений – комплекса, наиболее чувствительного к факторам внешней среды.
В последние годы предпринимаются попытки использовать термолю минесценцию в качестве одного из методов при решении целого ряда при кладных задач: исследовании влияния различных химических агентов на фо тосинтетический аппарат, сравнительном анализе гербицидной активности, выяснении механизмов устойчивости растений к заболеваниям и т.д. Ослож няющими обстоятельствами на этом пути являются, во-первых, отсутствие однозначной интерпретации кривых термолюминесценции и во-вторых, – значительная вариабельность биологических объектов. В этой связи необхо димы систематические исследования термолюминесценции в комплексе с другими биофизическими методами, такими, как методы медленной индук ции флуоресценции и электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), в том числе при обработке растений биологически активными веществами с широ ким спектром действия, как ингибирующими, так и активирующими фото синтез. Результаты таких исследований важны для понимания природы тер молюминесценции и могут быть использованы при проведении экологиче ского мониторинга растительных объектов биофизическими методами. Осо бенно важным для экологических исследований может оказаться изучение природы полосы С, происхождение которой в последнее время изучается особенно активно. Одно из предположений о происхождении пика С заклю чается в том, что он связан с разрушением мембран, и по его величине можно оценивать влияние неблагоприятных факторов на растения.
Цель работы Целью данной работы является изучение влияния антропогенных экологиче ских факторов на фотосинтетический аппарат растений люминесцентными методами.
Задачи исследования 1. Исследовать действие на фотосинтетический аппарат веществ, повышаю щих устойчивость растений к заболеваниям, методами термолюминесцен ции и медленной индукции флуоресценции.
2. Изучить действие препарата BION® на термолюминесценцию листьев рас тений в области пика С в зависимости от концентраций препарата, спосо бов и сроков обработки.
3. Методом медленной индукции флуоресценции провести исследование влияния крупных транспортных магистралей на функционирование фото синтетического аппарата растений.
4. Исследовать действие солевого антифриза ХКМ (хлористый кальций мо дифицированный), используемого для борьбы с гололедом, на фотосинте тический аппарат растений методами термолюминесценции и медленной индукции флуоресценции.
5. Люминесцентными методами изучить совместное действие солевого анти фриза ХКМ и природного полисахарида хитозана.
Научная новизна работы Научная новизна работы заключается в систематическом изучении влияния на фотосинтетический аппарат препаратов, повышающих устойчи вость растений к заболеваниям. Впервые изучено действие препарата BION® в зависимости от концентрации, сроков и способов обработки, а также вод ного экстракта из горца гигантского Reynoutria sachalinensis на люминес центные показатели листьев растений. Такое исследование, проведенное с использованием ряда биофизических методов, позволило установить харак тер воздействия этих препаратов на фотосинтетический аппарат растений и дать рекомендации по их практическому применению.
В опытах с хитозаном и солевым антифризом ХКМ биофизическими методами впервые было показано, что при их совместном внесении в почву хитозан полностью нейтрализует негативное действие антифриза. При этом внесение одного только хитозана не вызывает негативного воздействия на растения. Эти данные, совместно с данными об увеличении хитозаном скоро сти фиторемедиации, позволяют дать рекомендацию по его использованию для улучшения состояния зеленых насаждений и почв в городах.
Для анализа полученных данных была разработана новая методика об работки кривых термолюминесценции, написана программа анализа данных по новой методике.
Практическое значение работы Разработана новая методика обработки кривых термолюминесценции, позволяющая получать достоверную информацию об изменении термолю минесценции при обработке растений биологически активными веществами, используемыми на практике.
Изучение действия на растения хитозана позволяет предложить его ис пользование для компенсации вредного воздействия антифризов и ускорения процесса фиторемедиации. Опыты с веществами, повышающими устойчи вость растений к заболеваниям (препарат BION®, экстракт из Reynoutria sa chalinensis), позволили выявить их влияние на фотосинтетический аппарат и дать рекомендации по их практическому использованию.
Апробация работы Основные результаты диссертации были доложены на III Всероссий ской научной конференции «Физические проблемы экологии (экологическая физика)» (Москва, 2001), международной конференции «Актуальные вопро сы экологической физиологии растений в XXI веке» (Сыктывкар, 2001), VI конференции Европейского общества фитопатологов (Прага, 2002), V меж дународном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2003), III съезде биофизиков (Воронеж, 2004), международной конференции «Экология и биология почв» (Ростов-на-Дону, 2005), международных конференциях студентов, аспирантов и молодых уче ных «Ломоносов - 2005» и «Ломоносов - 2006» (Москва, 2005, 2006).
Основные результаты диссертации изложены в 13 публикациях, в том числе 5 статьях.
Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, 4 глав с изложением литературных данных и собственного экспериментального материала и выводов. Диссерта ция содержит 111 страниц, включая 41 рисунок и 16 таблиц. Список литера туры включает 101 ссылку на работы отечественных и зарубежных авторов.
2. Содержание работы Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и основные задачи работы, охарактеризована научная новизна полученных ре зультатов.
Первая глава диссертации представляет собой обзор литературных данных.
В разделе 1.1 дано описание структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата высших растений. В разделе 1.2 изложены ос новы метода термолюминесценции, а в разделе 1.3 описана структура ком плекса второй фотосистемы. В разделе 1.4 приведены современные пред ставления о механизмах возникновения различных пиков термолюминесцен ции фотосинтезирующих объектов (таблица 1). Раздел 1.5 посвящен описа нию математических моделей, описывающих термолюминесценцию расте ний. В разделе 1.6 приведены основные методы получения и обработки кри вых термолюминесценции. Раздел 1.7 посвящен основам методов медленной индукции флуоресценции и спектров флуоресценции.
Таблица 1. Температуры максимумов и источники основных пиков термо люминесценции фотосинтезирующих объектов при температуре выше –300С. QA, QВ – первичный и вторичный хиноновый акцепторы электронов комплекса второй фотосистемы. S2, S3 – состояния кислород-выделяющей системы при различной степени окисленности;
TyrD – вспомогательный донор электронов комплекса второй фотосистемы.
Температура максимума, 0С Наименование пика Пара зарядов A (Rubin, Venediktov, S3QA- ~ - 1969, Inoue, 1996) His+QA AT (Inoue et al., 1977, ~ - Inoue, 1996) S2QA D (Кукушкин, 1968;
~ + Rubin, Venediktov, 1969, Inoue, 1996) B1 (Arnold, Azzi, 1968;
S3QB- ~ + Ichikawa et al., 1975;
Rubin, Venediktov, 1969, Inoue, 1996) B2 (Arnold, Azzi, 1968;
S2QB- ~ + Кукушкин, 1968;
Ichi kawa et al., 1975;
Rubin, Venediktov, 1969, Inoue, 1996) C (Arnold, Azzi, 1968;
TyrD+QA- (Demeter et ~+ Rubin, Venediktov al., 1993), 1969) продукты деструк ции мембран (Солн цев, 1989) Высокотемпературная Хемилюминесценция От ~ +50 до ~ +70 (Vavilin термолюминесценция et al., 1998;
Rzsa et al., 1989) ~+125 (Vavilin et al., 1998) Во второй главе дано описание объектов исследований и методик экс периментов. В работе использовали проростки пшеницы сорта «Любава» и бобов сорта «Русские Черные». Термолюминесценцию возбуждали непре рывным светом. Сначала высечку из листа растения подвергали предвари тельному освещению светом с длиной волны 720 нм в течение 1 минуты при комнатной температуре для окисления вторичных хиноновых акцепторов.
Потом образец освещали белым светом при –300С в течение 3 минут и реги стрировали свечение при нагреве от –800С до 800С со скоростью. 300 в мину ту.
В работе был применен новый метод для анализа кривых термолюми несценции. При обработке данных находили разность кривых термолюми несценции обработанных и контрольных растений. В той области темпера тур, где разностная кривая отличалась от нуля, находили светосумму – Sp(T1,T2). Полученные таким образом светосуммы подвергали статистиче ской обработке. Для упрощения анализа кривых термолюминесценции была написана программа, позволяющая обрабатывать сразу несколько файлов.
Медленную индукцию флуоресценции возбуждали 1 минута широкополосным синим све том (50 Вт/м2), а регистриро Флуоресценция вали на длине волны 686 нм. В FM качестве основного параметра использовали отношение (FM – –FT)/FT = FM /FT – 1 (или FM/FT), где FM – интенсивность флуоресценции, соответст FT вующая второму максимуму индукционной кривой (рис.1), FT – ее стационарный уровень.
Включение Время регистрации Фотоиндуцированные измене света ния величины сигнала ЭПР I регистрировали на спектро Рис. 1. Характерная кривая медленной метре Е-4 (“Varian”, США) индукции флуоресценции зеленого лис при освещении высечек из ли та.
стьев дальним красным ( нм) и белым светом. Харак терная кривая фотоиндуциро ванных изменений величины сигнала ЭПР I, принадлежа щего окисленным центрам P700+, представлена на рис.2. В качестве параметра, характе ризующего взаимодействие двух фотосистем, использова Время регистрации ли отношение P/P0, где Р и Р0 – стационарные значения сигна Рис. 2. Характерная кривая фотоин- ла ЭПР I соответственно на дуцированнях изменений величины сиг- белом и дальнем красном све ту.
нала ЭПР I.
Третья глава посвящена изучению биофизическими методами препа ратов, повышающих устойчивость растений к заболеваниям.
В разделе 3.1 исследованы люминесцентные характеристики (термо люминесценция, медленная индукция флуоресценции и спектры флуорес ценции) проростков пшеницы и бобов, обработанных препаратом BION® (действующее вещество – бензо [1,2,3] тиадиазол – 7 – тиокарбоновой кисло ты S – метил эфир) – активатором системной приобертенной устойчивости у растений.
Обработку проростков пшеницы производили спустя две недели после посадки и повторно – еще через неделю. Обработку производили опрыскива нием растений раствором препарата в дистиллированной воде в пропорции 20 мг препарата на 100 мл воды;
контрольные растения опрыскивали дистил лированной водой. Измерения производили дважды: перед второй обработ кой и через неделю после второй обработки.
В этих опытах было установлено, что препарат оказывает различное действие на проростки пшеницы с различным сроком хранения семян. На проростки пшеницы со сроком хранения семян 1 год препарат не оказал ни какого влияния после первой обработки (рис.3). После второй обработки он вызвал появление пика С термолюминесценции и небольшое увеличение в области полосы А (рис.4).
Контроль BION 0, Интенсивность ТЛ, усл.ед.
0, 0, 0, 0, 0, 0, -50 -30 -10 10 30 50 Температура, С Рис. 3. Кривые термолюминесценции листьев пшеницы с 1 - летним сро ком хранения семян после однократной обработки препаратом BION®.
В случае семян с 11 – летним сроком хранения полоса С появилась уже после первой обработки, а после второй обработки ее интенсивность увели чилась в 2 раза (рис. 5 и 6).
В опытах с пшеницей, выращенной из семян со сроком хранения 1 год, измеряли также медленную индукцию флуоресценции и спектры флуорес ценции листьев растений. Однократное опрыскивание препаратом, как и в случае термолюминесценции, не привело к изменению параметра (FM - FT)/FT медленной индукции флуоресценции, тогда как повторное вызвало его уве личение. Увеличение параметра (FM - FT)/FT у обработанных растений свиде тельствует о повышении их фотосинтетической активности в расчете на хло рофилл (Караваев и др.,1998).
Контроль BION 0, Интенсивность ТЛ, усл.ед.
0, 0, 0, 0, 0, 0, -50 -30 -10 10 30 50 Температура, С Рис. 4. Кривые термолюминесценции листьев пшеницы с 1 - летним сро ком хранения семян после двукратной обработки препаратом BION®.
Контроль BION 0, Интенсивность ТЛ, усл.ед.
0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, -50 -30 -10 10 30 50 Температура, С Рис. 5. Кривые термолюминесценции листьев пшеницы с 11 - летним сроком хранения семян после 1-ой обработки препаратом BION®.
В спектрах флуоресценции листьев растений при комнатной темпера туре были хорошо различимы два максимума при 680 нм и 730 нм. Предпо лагается, что максимум флуоресценции при 680 нм связан с фотосистемой 1, а при 730 нм – с фотосистемой 2 (Krause, Weis,1991, Peterson et al., 2001).
Проведенное нами исследование спектров флуоресценции показало, что ни первая, ни вторая обработка не вызвали изменений в соотношении максиму мов флуоресценции. Таким образом, можно сделать вывод, что распределе ние энергии между первой и второй фотосистемами после обработки препа ратом не изменилось.
Контроль BION 1, Интенсивность ТЛ, усл.ед.
1, 0, 0, 0, 0, -50 -30 -10 10 30 50 Температура, С Рис. 6. Кривые термолюминесценции листьев пшеницы с 11 - летним сро ком хранения семян после 2-ой обработки препаратом BION®.
Опыты с проростками пшеницы, выращенными в условиях гидропони ки (измерения проводили спустя три недели после посадки), показали, что в случае проростков с 11 - летним сроком хранения семян величина пика С из менялась прямо пропорционально концентрации препарата (рис.7). Для про ростков семян с 1 - летним сроком хранения также наблюдали появление пи ка С под действием препарата BION®, но величина пика при различных кон центрациях была в пределах погрешности одинаковой (рис.8).
Оценка состояния проростков пшеницы по их внешнему виду показала, что с увеличением концентрации препарата (в области от 1 мг/30 мл до 4 мг/ 30 мл) состояние растений ухудшается.
В работах (Golovina, Tikhonov, 1994;
Golovina et al., 1997) приведены данные, что длительное хранение семян вызывает нарушение в структуре ци топлазматических мембран. Можно предположить, что увеличение ТЛ в об ласти полосы С связано с разрушением мембран при замораживании, и ис точником пика С является реакция продуктов деструкции мембран с кисло родом, протекающая при нагреве. Обработка проростков препаратом BION®, как предполагается, приводит к усиленной наработке активных форм кисло рода, которые, по-видимому, оказывают дополнительное негативное влияние на структурные характеристики мембран.
0 0 0 0 0 Sр(-15 C,10 C) Sр(10 C,35 C) Sр(35 C,80 C) Sр, усл.ед.
- - 1/30 2/30 3/30 4/30 5/ Концентрация препарата, мг/мл Рис. 7. Зависимость параметра Sp(T1,T2) от концентрации препарата BION®. Пшеница «Любава» с 11 - летним сроком хранения семян.
Опыт с бобами проводили аналогично опытам с пшеницей, выращен ной в почвенной культуре. Семена бобов сорта «Русские черные» высажива ли в горшки с землей после двух часов замачивания в воде. Обработку про водили спустя две недели после посадки и повторно – еще через неделю.
При опрыскивании проростков бобов препаратом BION® пик С после первой обработки не увеличился (рис.9). Вторая привела лишь к небольшому увеличению термолюминесценции в области пика С и появлению «герби цидного» пика D в области +50С, который свидетельствует о частичном ин гибировании фотосинтеза (рис.10). Таким образом, можно констатировать, что препарат BION® обладает видоспецифичностью и по-разному действует на однодольные (рекомендован фирмой – изготовителем) и двудольные рас тения.
В разделе 3.2 описаны опыты с салициловой кислотой – сигнальным веществом в реакциях системной приобретенной устойчивости. Так же, как и в случае с препаратом BION®, было проведено исследование ее действия на термолюминесценцию при опрыскивании проростков пшеницы и при выра 0 0 0 0 0 Sр(-15 C,10 C) Sр(10 C,37 C) Sр(37 C,80 C) Sp, усл.ед.
- - 1/30 2/30 3/30 4/30 5/ Концентрация препарата, мг/мл Рис. 8. Зависимость параметра Sp(T1,T2) от концентрации препарата BION®.
Пшеница «Любава» с 1 - летним сроком хранения семян.
Контроль BION 0, Интенсивность ТЛ, усл.ед.
0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, -50 -30 -10 10 30 50 Температура, С Рис. 9. Кривые термолюминесценции листьев бобов после од нократной обработки препаратом BION®.
щивании их на гидропонике. В опытах использовали семена пшеницы сорта «Любава» со сроком хранения 1 год. Растения опрыскивали раствором сали циловой кислоты в разведении 20 мг на 100 мл дистиллированной воды (pH=3,4). Первое опрыскивание проводили для двухнедельных проростков пшеницы, второе – спустя неделю после первого. Измерение термолюминес ценции проводили через неделю после обработки.
Контроль BION 0, Интенсивность ТЛ, усл.ед.
0, 0, 0, 0, 0, 0, -50 -30 -10 10 30 50 Температура, С Рис. 10. Кривые термолюминесценции листьев бобов после двукратной об работки препаратом BION®.
Опрыскивание салициловой кислотой вызвало увеличение термолюми несценции в области полосы А, но не изменило интенсивность термолюми несценции в области пика С (рис. 11 и 12).
Увеличение термолюминесценции в области полосы А было отмечено и в случае действия препарата BION® (рис. 4). При неизменной полосе В это свидетельствует о том, что салициловая кислота стимулирует перенос элек тронов на первичный хиноновый акцептор второй фотосистемы. Стимули рующее действие на фотосинтетический аппарат было отмечено и при изуче нии воздействия на проростки пшеницы поражения ложномучнистой росой (Юрина и др., 1992). Авторами было показано, что параметр (FM - FT)/FT сна чала увеличивается (на 2 – 4 сутки после поражения), а затем уменьшается (5 – 6 день). В этой же работе было отмечено, что поражение грибом сначала (2 – 4 день) приводит к увеличению термолюминесценции в области пика А, а затем (на 5 – 6 день) к ее уменьшению. Был сделан вывод о том, что на ран них стадиях поражения фотосинтетическая активность увеличивается, а за тем, возможно, из-за разрушения хлоропластов, уменьшается. Такое стиму лирующее действие на работу комплекса второй фотосистемы можно связать с тем, что фотосинтетический аппарат и вторая фотосистема, в частности, принимают активное участие в генерации активных форм кислорода (Asada, 2006), необходимых для защиты растения от грибной инфекции.
контроль салициловая кислота 0, Интенсивность ТЛ, усл. ед.
0, 0, 0, 0, 0, -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 Температура, С Рис. 11. Кривые термолюминесценции листьев пшеницы после однократ ной обработки салициловой кислотой.
контроль салициловая кислота 0, 0, Интенсивность ТЛ, усл. ед.
0, 0, 0, 0, 0, 0, -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 Температура, С Рис. 12. Кривые термолюминесценции листьев пшеницы после двукратной обработки салициловой кислотой.
В разделе 3.3 приведены результаты опытов с экстрактом из горца ги гантского Reynoutria sachalinensis (F. Schmidt) Nakai. Ранее было показано, что водный экстракт Reynoutria sachalinensis эффективно защищает сельско хозяйственные культуры от фитопатогенных грибов (Daayf et al., 1995, Kon stantinidou-Doltsinis, Schmitt, 1998). Механизм действия экстракта предполо жительно связан с усилением естественных защитных реакций растений на заражение (индуцированная устойчивость) (Seddon, Schmitt, 1999). Обработ ка растений экстрактом приводила к увеличению содержания в листьях пе роксидазы и хитиназы (Herger, Klingauf, 1990), стимулировала синтез фитоа лексинов после заражения растений (Daayf et al., 1997).
Проростки пшеницы обрабатывали 1% водным экстрактом из Rey noutria sachalinensis два раза – на седьмой и одиннадцатый день после посад ки семян. При каждой обработке использовали свежеприготовленный экс тракт. Для приготовления препарата брали 2 г сухого порошка Reynoutria sa chalinensis и добавляли 200 мл дистиллированной воды при 500С. Суспензию перемешивали в течение 1 часа, фильтровали, и полученный экстракт ис пользовали для опрыскивания растений. Измерения производили через 2- дня после второй обработки.
Опрыскивание проростков пшеницы водным экстрактом из Reynoutria sachalinensis вызвало небольшое увеличение содержания хлорофилла (табли ца 2). Эти данные согласуются с данными (Herger, Klingauf, 1990). Интересен тот факт, что увеличение содержания хлорофилла сопровождалось уменьше нием отношения хлорофилл а/хлорофилл b (таблица 2). Известно, что хлоро филл а преимущественно входит в состав коровых комплексов реакционных центров первой и второй фотосистемы, тогда как хлорофилл b преимущест венно связан с светособирающим комплексом второй фотосистемы (Vermaas, 1993). Таким образом, уменьшение соотношения хлорофилл а/хлорофилл b в обработанных растениях свидетельствует об увеличении числа светособи рающих пигментов в расчете на количество реакционных центров.
Таблица 2. Физиологические и биофизические показатели листьев пшеницы, обработанной водным экстрактом из Reynoutria sachalinensis. Все отличия являются достоверными с уровнем значимости 0,05.
Показатель Контроль Reynoutria sachalinensis Содержание хлорофилла мг/г сырой 0,79 0, биомассы Отношение хлорофилл а/хлорофилл b 2,80 2, Скорость выделения O2, мл О2/(мг 1,10 1, хлорофилла в час) (FM - FT)/FT (медленная индукция 0.89 1. флуоресценции) P/P0 (фотоиндуцированные изменения 1,0 0, величины сигнала I ЭПР) Было установлено увеличение фотосинтетической активности (скоро сти выделения О2 в расчете на хлорофилл) в листьях растений, обработанных экстрактом из Reynoutria sachalinensis (таблица 2). Опрыскивание растений экстрактом привело к увеличению отношения (FM - FT)/FT медленной индук ции флуоресценции (таблица 2), которое было обусловлено возрастанием FM.
Увеличение FM, в свою очередь, может быть связано с частичным снятием нефотохимического тушения флуоресценции за счет более активного синтеза АТФ и уменьшения градиента протонов на мембране тилакоидов. Увеличе ние синтеза АТФ, с одной стороны, ведет к ускорению транспорта электро нов, а с другой, – к общему увеличению фотосинтетической активности. Об ускорении электронного транспорта между фотосистемами свидетельствеут также уменьшение параметра P/P0 фотоиндуцированных изменений величи ны сигнала ЭПР I от окисленных реакционных центров первой фотосистемы P700+ (таблица 2, данные получены Б.В. Трубициным) Типичные кривые термолюминесценции контрольных и обработанных экстрактом растений приведены на рис.13. У обработанных растений возрас тала интенсивность термолюминесценции в области пика А и уменьшалась в области пиков B и С. Эти данные указывают на то, что экстракт оказывает стимулирующее действие на кислород-выделяющую систему, ускоряя пере ход S2 – S3.
Рис. 13. Термолюминесценция листьев пшеницы, обработанной водным экстрактом из Reynoutria sachalinensis: а – контроль, б – обработанные растения.
В разделе 3.4 приведены данные по действию на термолюминесценцию хлоропластов бобов пероксида водорода, – одного из веществ, участвующих в реакциях системной приобретенной устойчивости растений к патогенам.
Увеличение термолюминесценции в области пика А (рис.14) свиде тельствует о стимулирующем действии пероксида водорода на комплекс вто рой фотосистемы (увеличении скорости восстановления первичных хиноно вых акцепторов).
В четвертой главе приведены результаты опытов с растениями, нахо дящимися в неблагоприятных экологических условиях: (1) произрастающи ми вблизи крупных транспортных магистралей и (2) подверженными воздей ствию солевых антифризов, используемых для борьбы с гололедом.
контроль пероксид водорода 0, Интенсивность ТЛ, усл. ед.
0, 0, 0, 0, 0, 0, -50 -30 -10 10 30 50 Температура, С Рис. 14. Термолюминесценция суспензии хлоропластов из листьев бобов при добавлении пероксида водорода.
В разделе 4.1 исследованы биофизические показатели листьев двух- и трехлетних сеянцев клена остролистного Acer platanoides L. в зависимости от расстояния до крупных транспортных магистралей: Университетского про спекта и проспекта Вернадского г. Москвы.
Установлено, что отношение FM/FT медленной индукции флуоресцен ции претерпевает немонотонные изменения по мере удаления от перекрестка проспектов вглубь парка (рис.15, кривая 1). При этом содержание хлорофил ла на единицу сырой массы листа монотонно увеличивалось (кривая 2), а ко личество реакционных центров первой фотосистемы, оцениваемое по вели чине сигнала ЭПР I от окисленных центров Р700+, оставалось приблизительно на одном уровне (Караваев и др., 2001). Можно сделать вывод, что низкое содержание хлорофилла и пониженные значения FM/FT вблизи перекрестка (5-35 м) обусловлены негативным влиянием выхлопных газов автомобилей, останавливающихся у светофора. Уменьшение FM/FT вдали от перекрестка (50-65 м) может быть связано с ослаблением фотосинтеза, обусловленным постепенным затенением сеянцев деревьями (кривая 3, освещенность на уровне сеянцев определяли с помощью фотодиода).
В качестве параметра термолюминесценции использовали относитель ные светосуммы полосы А (SA/Sобщ) в интервале температур от –300С до 00С и полосы С (SC/Sобщ) в интервале от 400С до 800С. Установлено, что по мере приближения к перекрестку значения SA/Sобщ, как и FM/FT, уменьшались, а значения SC/Sобщ увеличивались (Солнцев и др., 2001). Кинетику фотоинду цированных изменений величины сигнала ЭПР I характеризовали временем 1/2 роста сигнала ЭПР I после включения белого света. Было показано, что значения 1/2 понижались от 2 мин. для растений, удаленных на расстояние м от перекрестка, до 10 с для самых близких к дороге образцов (Солнцев и др., 2001) (данные получены В.В. Птушенко). Предполагается, что эти изме нения также обусловлены неблагоприятным влиянием транспортных магист ралей с интенсивным движением автомобилей.
FM/FT;
содержание хлорофилла, мг/г сырой биомассы;
освещенность, усл.ед.
1 0 10 20 30 40 50 60 Расстояние от перекрестка, м Рис.15. Изменения параметра FM/FT медленной индукции флуоресцен ции (1), содержания хлорофилла в листьях клена (мг на 1 г биомассы) (2) и освещенности листьев (усл. ед.) (3) при удалении вглубь парка от пересечения Университетского проспекта и проспекта Вернадского.
В разделе 4.2 представлены результаты по исследованию действия на фотосинтетический аппарат растений солевого антифриза ХКМ и природно го полисахарида хитозана. Хитозан был выбран по двум причинам: из-за его элиситорных свойств (Кривцов и др., 1996) и возможности его использования для фиторемедиации – очистки почв от тяжелых металлов с помощью расте ний (Азовцева, 2004).
Измерения медленной индукции флуоресценции и термолюминесцен ции проводили на трехнедельных проростках пшеницы, выращенных в сле дующих условиях. В смешанные образцы городской почвы, классифициро ванной как урбанозем – реплантозем (по Строгановой, 1997), массой по 200 г было посеяно по 20 зерен пшеницы сорта «Любава». В первом варианте опы та в почвенный образец был внесен водный раствор солевого антифриза ХКМ в количестве 0,4% антифриза от массы почвы. Во втором варианте в почву было внесено 10 мл 0,05% раствора хитозана. В третьем варианте в почву были внесены одновременно ХКМ и хитозан в указанных количествах.
В качестве контроля использовали почву в естественном состоянии. Хитозан и антифриз вносили в почву три раза с недельным интервалом. Первый раз эти вещества вносили непосредственно перед посадкой семян.
Результаты измерений медлен ной индукции флуоресценции листь 1, ев растений, обработанных ХКМ и 1, хитозаном, представлены на рис. 1,00 (уровень значимости 0,2). При вне (FM-F T)/FT сении в почву солевого антифриза 0, ХКМ наблюдалось уменьшение па 0, раметра (FM – FT)/FT медленной ин 0, дукции флуоресценции, что свиде 0,60 тельствует о понижении фотосинте тической активности. Внесение в 0, почву хитозана вызывало увеличение 0, значений (FM – FT)/FT (повышению хитозан и антифриз хитозан антфриз фон фотосинтетической активности). При одновременном внесении в почву ХКМ и хитозана значения (FM – FT)/FT были понижены по сравнению Рис. 16. Изменения параметра с фоном, но выше, чем при внесении (FM - FT)/FT медленной индукции в почву только антифриза.
флуоресценции листьев пшеницы Внесение в почву солевого ан при внесении в почву антифриза и тифриза приводило к уменьшению хитозана. термолюминесценции в области по лосы А и сильному росту пика В (рис.17). При этом происходило смещение температуры максимума пика В в область более высоких температур. Это смещение можно объяснить, исходя из представлений о составной природе пика В (он состоит из пиков В1 (низ котемпературный компонент) и В2 (высокотемпературный компонент)). При добавлении в почву ХКМ происходило усиление пика В2 и ослабление В (рис.17). Можно предположить, что этот эффект вызван частичным блокиро ванием перехода кислород-выделяющей системы из состояния S2 в состояние S3. Подтверждением этого предположения служит уменьшение термолюми несценции в области полосы А, источником которой является рекомбинация пары зарядов QA-S3+. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об угнетающем воздействии солевого антифриза на фотосинтетический аппарат растений.
Внесение в почву хитозана приводило к общему уменьшению интен сивности термолюминесценции листьев растений (рис.17), связанному, как предполагается, с увеличением скорости безизлучательной дезактивации энергии. При одновременном внесении в почву солевого антифриза ХКМ и хитозана наблюдалась практически такая же кривая термолюминесценции, как и у контрольных образцов. Интенсивности пиков А и В не изменились, но сами они незначительно сместились в область более низких температур.
Предполагается, что это связано с восстановлением и даже небольшим уско рением (по сравнению с фоном) скорости перехода кислород-выделяющей системы из состояния S2 в состояние S3.
контроль ХКМ хитозан хитозан и ХКМ 1, Интенсивность ТЛ, усл.ед.
0, 0, 0, 0, -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 Температура, С Рис. 17. Термолюминесценция листьев пшеницы при внесении в почву антифриза и хитозана.
Таким образом, внесение в почву хитозана нейтрализует действие со левого антифриза. По всей видимости, это происходит еще в почве, так как их действие на ТЛ листьев растений не аддитивно. По отдельности они уменьшают термолюминесценцию в области пика А, а действуя совместно влияют на него мало. На основании полученных данных можно рекомендо вать использование хитозана для компенсации негативного действия солево го антифриза ХКМ на растения.
Выводы 1. Установлены закономерности в изменении люминесцентных показателей листьев растений, обработанных препаратом BION® в зависимости от кон центрации, способов и сроков обработки. При малых дозах препарата (от мг до 20 мг на 100 мл) наблюдалось увеличение интенсивноси пика А тер молюминесцении в области –100С и параметра (FM – FT)/FT медленной ин дукции флуоресценции, что свидетельствует о стимулирующем действии препарата на фотосинтетический аппарат.
2. Обработка проростков пшеницы препаратом BION® приводила к увеличе нию термолюминесценции в области 40-700С (полоса С);
у проростков с большим сроком хранения семян наблюдалась более интенсивная полоса С. Предполагается, что полоса С связана с нарушением целостности мем бран при замораживании хлоропластов.
3. Обработка проростков пшеницы экстрактом из горца гигантского Rey noutria sachalinensis приводила к увеличению значений (FM – FT)/FT мед ленной индукции флуоресценции и увеличению пика А термолюминес ценции. Эти изменения коррелируют с увеличением фотосинтетической активности (скорости выделения О2 в расчете на хлорофилл) и свидетель ствуют о стимулирующем действии экстракта на фотосинтетический аппа рат растений.
4. Установлены закономерности в изменении люминесцентных показателей листьев клена остролистного в зависимости от расстояния до крупных транспортных магистралей. Пониженные значения (FM – FT)/FT медленной индукции флуоресценции и повышенные значения интенсивности термо люминесценции в области полосы С свидетельствуют о негативном воз действии выхлопных газов автомобилей на фотосинтетический аппарат растений на расстояниях вплоть до 30 метров от магистрали.
5. Методами термолюминесценции и медленной индукции флуоресценции показано, что внесение в почву солевого антифриза на основе CaCl2 оказы вает негативное воздействие на фотосинтетический аппарат проростков пшеницы, а природного полисахарида хитозана, напротив, стимулирует фотосинтетическую активность. При совместном внесении в почву этих препаратов хитозан компенсирует действие антифриза.
Основные результаты диссертации представлены в следующих публи кациях.
1. Солнцев М.К., Караваев В.А., Кузнецов А.М., Птушенко В.В. Трубицин Б.В., Францев В.В., Тихонов А.Н. Изменения биофизических показателей листьев растений в зависимости от удаленности от транспортных магист ралей. Тезисы докладов III всероссийской научной конференции "Физи ческие проблемы экологии (Экологическая физика)". Москва, 2001, с.180.
2. Солнцев М.К., Караваев В.А., Кузнецов А.М., Птушенко В.В., Трубицин Б.В., Францев В.В., Тихонов А.Н. Биофизические показатели листьев дре весных пород вблизи транспортных магистралей. Тезисы докладов меж дународной конференции "Актуальные вопросы экологической физиоло гии растений в XXI веке". Сыктывкар, 2001, с.113-114.
3. Караваев В.А., Солнцев М.К., Кузнецов А.М., Полякова И.Б., Птушенко В.В., Трубицин Б.В., Францев В.В., Юрина Т.П., Юрина Е.В., Тихонов А.Н. Изменения медленной индукции флуоресценции листьев клена вбли зи транспортных магистралей. Биофизика, 2001, т.46, вып.2, с.381-382.
4. Karavaev V.A., Schmitt A., Solntsev M.K., Yurina T.P., Frantsev V.V., Kuznetsov A.M., Polyakova I.B., Trubitsin B.V. and Tikhonov A.N. Stimula tion of photosynthetic activity in wheat leaves treated with aqueous extracts from Reynoutria sachalinensis. In: Modern fungicides and antifungal com pounds III (ed. by H.-W. Dehne, U. Gisi, K.H. Kuck, P.E. Russel and H. Lyr).
Gelsenkirchen, Verlag Th. Mann, 2002 p.379-385.
5. Solntsev M.K., Karavaev V.A., Yurina T.P., Yurina E.V., Kuznetsov A.M., Polyakova I.B. and Frantsev V.V. Stimulant effect of plant activator BION on photosynthesis and its inhibitory effect on pathogenic fungi. Plant Protection Science, 2002, v.38, №2, p.497-501.
6. Solntsev M.K., Karavaev V.A., Frantsev V.V., Kuznetsov A.M. Effect of plant activator BION on the luminescent characteristics of green leaves. Abstracts of the 6th conference of European foundation for plant pathology "Disease resis tance in plant pathology". Prague, 2002, p.87.
7. Karavaev V.A., Solntsev M.K., Kuznetsov A.M., Polyakova I.B., Frantsev V.V., Yurina T.P. Plant extracts as the source of physiologically active com pounds suppresing the development of pathogenic fungi. Plant Protection Sci ence, 2002, v.38, №1, p.200-204.
8. Францев В.В., Солнцев М.К., Караваев В.А. Влияние биологически ак тивного препарата BION на термолюминесценцию листьев бобов и пше ницы. Тезисы докладов V международного симпозиума "Новые и нетра диционные растения и перспективы их использования". Пущино, 2003, т.1, с.361-363.
9. Францев В.В., Солнцев М.К., Караваев В.А. Термолюминесценция листь ев растений, обработанных препаратом BION. Тезисы докладов III съезда биофизиков России. Воронеж, 2004, т.2, с.476.
10. Азовцева Н.А., Смагин А.В., Лазарева Е.В., Францев В.В. Оценка влияния солевых антифризов на экологическое состояние почв и растительного покрова в городской среде. Материалы международной научной конфе ренции «Экология и биология почв». Ростов-на-Дону, 2005, с.12-16.
11. Францев В.В., Солнцев М.К., Караваев В.А. Влияние препарата BION активатора системной устойчивости растений против фитопатогенов на термолюминесценцию листьев бобов и пшеницы. Тезисы докладов меж дународной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ло моносов 2005», Москва, 2005, т.1, с.56-58.
12. Solntsev M.K., Frantsev V.V., Karavaev V.A., Yurina T.P., Yurina E.V.
Thermoluminescence of wheat leaves treated with the plant activator BION. In:
Modern fungicides and antifungal compounds IV (ed. by H.-W. Dehne, U.
Gisi, K.H. Kuck, P.E. Russel and H. Lyr). The British Crop Protection Council, 2005, p.287-292.
13. Францев В.В. Возбуждение термолюминесценции зеленого листа 18 нс лазерными вспышками. Тезисы международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2006», Москва, 2006, с.31-33.