Использование антагонизма pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens при создании экспериментального биопрепарата и его влияние на состояние микробоценоза почвы

На правах рукописи

Хархун Екатерина Викторовна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТАГОНИЗМА PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS SUBSP. AUREOFACIENS ПРИ СОЗДАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО БИОПРЕПАРАТА И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА СОСТОЯНИЕ МИКРОБОЦЕНОЗА ПОЧВЫ 03.02.08 – экология (биологические наук

и)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» доктор биологических наук, профессор,

Научный консультант:

Внуков Валерий Валентинович Официальные Симонович Елена Ильинична, доктор биологических наук, старший научный оппоненты:

сотрудник лаборатории радиобиологии и экологической генетики отдела экологических инноваций Научно-исследовательского института биологии Южного федерального университета Жаркова Мария Геннадьевна, кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры безопасности жизнедеятельности и защиты окружающей среды Донского государственного технического университета

Ведущая организация: Институт аридных зон Южного научного центра РАН, г. Ростов-на-Дону

Защита диссертации состоится 1 марта 2013 г. в 17.00 на заседании диссертационного совета Д 212.208.32 по биологическим наукам при Южном федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б.Садовая, 105, ЮФУ, ауд. 304, e-mail: [email protected], факс: (863)263-87-23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан 24 января 2013 г. и размещен в сети Интернет на сайте ЮФУ www.sfedu.ru и на сайте Минобрнауки России www.vak.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Денисова Т.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Ускоренные темпы научно технического прогресса и совершенствование сельскохозяйственного производства расширяют степень воздействия человека на биосферу в целом и особенно на агробиоценозы. Интенсификация приемов возделывания сельскохозяйственных культур приводит к сдвигу баланса между микроорганизмами в сторону патогенов. Одной из главных причин заболеваний растений является нарушение их питания из-за снижения плодородия почв, которое существенно зависит от состояния почвенной биоты (Шуляковская, Сасова, 2012). В сложившихся условиях современного аграрного производства для получения биологически полноценной продукции растениеводства и сохранения плодородия почв необходимо экологически целесообразное хозяйствование (Новикова, 2005). Глобальное нарушение экологического равновесия в природе и появление патогенов, толерантных к большинству современных химических средств защиты растений, требуют разработки биологических препаратов на основе ризосферных микроорганизмов – естественных антагонистов фитопатогенных бактерий и грибов (Кравченко и др., 2006). Среди различных таксономических групп широким набором полезных для растений свойств выделяются грамотрицательные ризосферные бактерии рода Pseudomonas (Боронин, 1998;

Боронин, Кочетков, 2000), которые являются одной из наиболее изученных групп микроорганизмов с точки зрения объектов биологического контроля почвенных фитопатогенов (Рубан, 1986;

Смирнов, Киприанова, 1990;

Логинов, 2005;

Горбунов, 2008;

Benizri et al., 2001). Недостаток знаний о взаимоотношениях ризобактерий с другими компонентами экосистем существенно снижает эффективность применения этих препаратов в земледелии.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в исследовании антагонизма Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens с целью создания на его основе экспериментального биопрепарата, а также проверка его влияния на микробоценоз почвы.

Задачи исследования:

идентифицировать культуру Pseudomonas sp., выделенную из почв г.

Ростова-на-Дону;

исследовать антагонистическую активность Pseudomonas в sp.

отношении различных видов бактерий и плесневых грибов;

оптимизировать состав питательной среды для культивирования исследуемого штамма псевдомонады с целью повышения синтеза антагонистических веществ;

разработать основные принципы получения экспериментальных биопрепаратов в жидкой форме и на основе носителей (торфа, вермикулита и перлита) в лабораторных условиях;

установить оптимальные температурные режимы хранения биопрепаратов;

определить влияние разработанного биопрепарата на почвенную микрофлору (численность основных физиологических групп: бактерий, актиномицетов, грибов, олигонитрофилов, содержание аэробных и анаэробных азотфиксаторов);

исследовать действие разных форм экспериментального биопрепарата (жидкая форма, на торфе, вермикулите, перлите) на рост и развитие ярового ячменя в условиях полевого мелкоделяночного эксперимента.

Основные положения, выносимые на защиту.

Культура Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens, выделенная из 1.

почв г. Ростова-на-Дону, обладает способностью к синтезу метаболитов с антибактериальными и антифунгальными свойствами.

Экспериментальные биопрепараты, полученные на основе 2.

Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens, как в жидкой форме, так и на твердых носителях (торф, перлит, вермикулит), сохраняют потребительские качества в течение двух - шести месяцев.

Экспериментальные биопрепараты оказывают стимулирующее 3.

действие на микробоценоз почвы.

Научная новизна работы. Установлена антагонистическая активность штамма Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens в отношении бактерий и плесневых грибов, в том числе и фитопатогенных. Впервые выполнены исследования по изучению возможностей использования перспективных носителей: перлита и вермикулита, для ризосферной бактерии Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens с целью создания технологичной и эффективной формы микробного биопрепарата. Изучена динамика жизнеспособности исследуемой псевдомонады при хранении в лабораторных условиях в составе экспериментальных биопрепаратов разных форм (жидкой, вермикулитной, перлитной и торфяной). Дана сравнительная характеристика влияния экспериментального биопрепарата и химического препарата «Дивиденд Стар» на структуру урожая ярового ячменя и микробоценоз почвы.

Теоретическая и практическая значимость. Подобраны питательные среды и сроки для культивирования Pseudomonas chlororaphis subsp.

aureofaciens, оптимальные для синтеза метаболитов, обладающих антибактериальной и антифунгальной активностями. Проведены испытания экспериментального биопрепарата на культуре ярового ячменя. Результаты исследования позволяют судить о том, что Pseudomonas chlororaphis subsp.

aureofaciens может быть использован для стимуляции роста и защиты растений. Результаты работы могут быть применены для оздоровления и повышения плодородия почв, а также для производства экологически чистой сельскохозяйственной продукции.

Полученные результаты используются в учебном процессе при чтении общих курсов («Микробиология», «Биология почв»), специальных курсов («Техническая микробиология», «Промышленная микробиология» и др.) и элективного курса «Микроорганизмы и окружающая среда» в Южном федеральном университете.

Личный вклад автора. Тема, цель, задачи, объекты, методы и план исследования определены автором совместно с научным руководителем.

Полевые исследования, отбор образцов почвы, лабораторные опыты осуществлены лично автором. Анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и основных защищаемых положений сделаны лично автором при направляющем и корректирующем участии научного руководителя.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на III, IV международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009, 2011);

8-й Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь XXI века – будущее Российской науки» (Ростов-на-Дону, 2010);

Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микологии (XIII Кашкинские чтения) (Санкт Петербург, 2010);

Всероссийской научной конференции «Модернизация науки и образования». Секция 1: «Биологические науки» (Махачкала, 2011);

5-й международной конференции молодых ученых «Биоразнообразие.

Экология. Адаптация. Эволюция» (Одесса, 2011);

I международной научно практической конференции «Современные проблемы отечественной медико биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (Пенза, 2011);

50-й юбилейной международной студенческой научной конференции «Студент и научно-технический прогресс». Биология. (Новосибирск, 2012);

научной конференции «Неделя науки 2012» студентов и аспирантов факультета биологических наук Южного федерального университета (Ростов-на-Дону, 2012);

научно-практической конференции “Адаптационные стратегии живых систем» (Крым, 2012);

II Всероссийской с международным участием молодежной научной школе-конференции: «Биология будущего:

традиции и новации» (Екатеринбург, 2012);

третьем съезде микологов России (Москва, 2012);

II международной научно-практической конференции «Молодежь и наука: модернизация и инновационное развитие страны» (Пенза, 2012);

VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012);

молодежной конференции «Миссия молодежи в науке» (Ростов-на-Дону, 2012).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано научных работ, объемом 1 п.л., из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Личный вклад автора составил 85 %.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах. Состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы. Работа содержит 8 таблиц и 22 рисунка. Список литературы включает 214 источников, из них 55 на иностранных языках.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность и благодарность доценту кафедры биохимии и микробиологии ЮФУ, к.б.н.

А.В. Поляковой за постоянное внимание и большую помощь в работе, а также профессору, д.б.н. И.В Корниенко. за помощь в идентификации Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens. Автор благодарит доцента кафедры ботаники ЮФУ, к.б.н. В.А. Русанова за консультации при работе с плесневыми грибами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Проведен анализ литературы, раскрывающий сущность и значение биологического метода защиты растений. В главе описано систематическое положение бактерий рода их морфологические, Pseudomonas, физиологические и культуральные особенности, экология. Представлен подробный обзор влияния биопрепаратов на основе псевдомонад на микробиологическую активность почвы и на рост и развитие растений.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования являлся штамм бактерий Pseudomonas sp., выделенный в 2009 году из почв города Ростова-на-Дону.

Для идентификации штамма морфолого-культуральные признаки, физиологические и биохимические свойства изучали по общепринятым методам (Скворцова, 1983;

Лысак, Желдакова, 2002;

Практикум по микробиологии, 2005). Кроме этого, для определения таксономического положения было проведено частичное секвенирование последовательности генов 16S рРНК на ДНК-анализаторе ABI Prism 3130xl фирмы Applied Biosystems (США) (Woo et al., 2003).

При изучении динамики роста Pseudomonas chlororaphis subsp.

aureofaciens определяли фазы роста и их продолжительность.

При подборе питательной среды, оптимальной для синтеза антибиотических веществ, антагонистическую активность штамма Pseudomonas chlororaphis subsp. аureofaciens изучали методом агаровых блочков и методом колец (Егоров, 1986).

Для постановки первого метода было выбрано шесть агаризованных сред (мясо-пептонный агар (МПА) (1:10);

мясо-пептонный агар (МПА) (1:100);

крахмало-аммиачный агар (КАА);

почвенный агар (ПА);

среда №1;

среда №2) (Практикум по микробиологии, 1976).

Для получения культуральной жидкости при постановке метода «колец» было выбрано восемь сред – это указанные выше шесть сред в жидкой консистенции и дополнительно среды №3 и №4, используемые для получения антибиотических веществ при культивировании актиномицетов (Практикум по микробиологии, 1976).

В качестве тест-культур было взято шесть штаммов микроорганизмов, отличающихся по морфологии, окраске по Граму, способности к спорогенезу: Proteus sp., Micrococcus sp. (из музея живых культур лаборатории микробиологии кафедры биохимии и микробиологии ЮФУ), Bacillus subtilis, Bacillus pumilis, Bacillus cereus и Erwinia herbicola (выделенные с поверхности листовых пластинок пшеницы).

Кроме того, определялась антагонистическая активность к эндемичным видам бактерий почв Ростовской области методом агаровых блочков.

Антагонистическую активность штамма Pseudomonas chlororaphis subsp. аureofaciens по отношению к плесневым грибам изучали на среде Чапека со стрептомицином методом агаровых блочков (Егоров, 1986). В качестве тест-объектов для определения спектра антагонистического действия псевдомонад служили следующие тест-культуры: Aspergillus niger Varga, Frisvad & Samson, Aspergillus amylovorus Panas, Penicillium sp. (1), Penicillium sp. (2), Fusarium moniliforme J. Sheld (из коллекции плесневых грибов кафедры биохимии и микробиологии и кафедры ботаники ЮФУ), Cladosporium cucumerinum Elis & Arthur (выделенный с пораженных листьев и стеблей сортовых огурцов, идентифицирован к.б.н. В.А. Русановым), а также культуры грибов из Всероссийской коллекции микроорганизмов:

Penicillium ochrochloron ВКМ 2032 Biourge, Penicillium chrysogenum ВКМ 245 Thom, Penicillium brevicompactum ВКМ 234 Dierckx, Aspergillus terreus ВКМ 1025 Thom.

Изучение влияния псевдомонады на прорастание спор фитопатогенных грибов проводили методом микрокультуры (Методы экспериментальной микологии, 1982).

Экспериментальные партии биопрепарата получали глубинным культивированием бактерий Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens в колбах при температуре 27оС в течение 2 суток на оптимизированных питательных средах №1 и №2. Титр готового бактериального препарата составлял 6,0±0,08*109 кл/мл. Изучалась эффективность следующих форм биологических препаратов: жидкая форма 1, жидкая форма 2, торф 1, торф 2, вермикулит 1, вермикулит 2, перлит 1 и перлит 2. При создании биопрепаратов использовали вермикулит вспученный (получают путем обжига минерала вермикулита), торф низинный древесно-моховой высокой степени разложения (умеренно-кислый рН 4,5-5,5) и перлит вспученный (горная порода вулканического происхождения, пористый минерал снежно белого цвета, полностью лишенный органики, однороден по своим физическим и химическим характеристикам).

Изучение выживаемости штамма в биопрепаратах проводили при разных температурных режимах: в холодильнике (5-8°С) и при комнатной температуре (22-25°С) в течение 6 месяцев. Контроль численности клеток осуществляли высевом из серийных разведений на МПА. После 3- суточного культивирования проводили подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ).

Полевые исследования проводились на опытном участке в Ботаническом саду Южного Федерального университета на делянках площадью 1 м2, повторность трехкратная. Почва опытного участка чернозем обыкновенный карбонатный (Моисеева, Безуглова, Морозов, 2011).

Экспериментальные образцы биологических препаратов на носителях перлит и вермикулит вносили в почву по 20 г на 3 м2, а на носителе торф – по 100 г. Семена обрабатывали биопрепаратом в жидкой форме в норме 10 л/т.

В эксперименте использовался яровой ячмень – сорт «Одесский 100». Перед севом семена ячменя обрабатывали биопрепаратами вручную. Контроль семена без обработки биопрепаратами. В качестве химического препарата был взят комбинированный протравитель для защиты семян зерновых колосовых культур от грибных заболеваний «Дивиденд Стар», который вносился в соответствии с рекомендованными нормами расхода (10 л рабочего раствора на тонну семян). В каждый из 10 вариантов вносились минеральные удобрения в виде аммиачной селитры (NH4NO3) в соответствии с рекомендованными нормами.

Для определения структуры урожая ячменя с каждой делянки отбирали сноповые образцы по 10-15 растений равномерно по всей площади.

Количество отобранных растений с каждого варианта составляло 100- экземпляров. После просушки снопов определяли: высоту растений, длину колоса, число зерен в колосе, массу зерна с одного колоса и массу 1000 зерен.

Для изучения состояния микробоценоза отбор почвенных образцов осуществляли с глубины 0-20 см после уборки ячменя по общепринятой методике (ГОСТ 17.4.3.01-83. Общие требования к отбору проб почвы).

Микробиологические исследования проводили в день отбора проб, параллельно осуществляя определение влажности почвы (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Для выделения и учета основных физиологических групп микроорганизмов, таких как бактерии, актиномицеты, грибы и олигонитрофилы, использовали метод посева на агаризованные питательные среды. Численность исследуемых групп выражали в КОЕ/г почвы.

Относительное содержание свободноживущих аэробных азотфиксаторов определяли методом обрастания почвенных комочков и выражали в процентах. Анаэробного азотфиксатора Clostridium pasteurianum, выделяли на жидкой питательной среде, количественный учет осуществляли, используя таблицы Мак-Креди (Практикум по микробиологии, 2005).

Из санитарно-гигиенических показателей оценивался коли-титр и количество термофильных бактерий (Руководство по медицинской микробиологии, 2008).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета MS Excel 2010. Для оценки статистически значимых различий между сравниваемыми группами использовали t-критерий Стьюдента. При p0,05 различия считали статистически значимыми, при 0,05p0,1 предполагали тенденцию к статистической значимости различий.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Идентификация бактерии Pseudomonas sp. и изучение её антагонистической активности. В процессе изучения по морфологическим, культуральным и физиолого-биохимическим признакам данная культура псевдомонады была идентифицирована как Pseudomonas chlororaphis subsp.

аureofaciens. Таксономическое положение подтверждено частичным секвенированием генов 16S рРНК.

Для Pseudomonas chlororaphis subsp. аureofaciens изучен такой тип межпопуляционных взаимоотношений как антагонизм. Для исследуемой псевдомонады был осуществлен подбор питательной среды оптимальной для синтеза антибиотических веществ. Анализ полученных данных показал, что степень антагонизма P. chlororaphis по отношению к исследуемым тест культурам зависела от состава питательных сред: высокая степень антагонизма для трех видов рода Bacillus наблюдалась на агаризованной среде №1, где она составляла 10-12 мм (рис. 1а).

При оценке антагонистической активности методом колец в толще агара было установлено, что на питательных средах №3 и №4 не обнаружено антагонистической активности ни к одной тест-культуре, из чего можно сделать вывод, что эти среды не подходят для синтеза вторичных метаболитов штаммом (рис.1б). Максимальная P. chlororaphis антагонистическая активность была зафиксирована на среде № 2, на которой зоны отсутствия роста составили 9-11 мм.

а) 14 Зона отсутствия роста, мм 12 10 10 10 МПА (1:10) МПА (1:100) КАА 8 7 ПА 6 среда № 4 среда № 0 000 0 0 000 0 0 0 0000 Bacillus Bacillus Bacillus Erwinia Proteus sp. Micrococcus subtilis pumilis cereus herbicola sp.

Тест-культуры б) 10 Зона отсутствия роста, мм МПБ (1:10) МПБ (1:100) ПВ 7 КАС 6 Среда № 5 Среда № 4 Среда № Среда № 0 00 00 0 000 0 0 000 0 0 0 0 0 0 00 0 00 0 Bacillus Bacillus Bacillus Erwinia Proteus sp. Micrococcus subtilis pumilis cereus herbicola sp.

Тест-культуры Рис. 1. Результаты исследования антибактериальной активности Pseudomonas chlororaphis subsp.

аureofaciens: а) метод агаровых блочков;

б) метод колец.

Анализ полученных результатов показал, что в методе агаровых блочков оптимальной средой для максимального синтеза антибиотических веществ является среда № 1, а в методе колец наибольшая антагонистическая активность зарегистрирована на среде № 2. Именно эти среды были использованы для дальнейшего изучения степени антагонизма P.

chlororaphis.

Для разработки производства биопрепаратов необходимо получение культуральной жидкости с высокой плотностью микробных клеток. Для этого была изучена динамика роста Pseudomonas chlororaphis subsp.

аureofaciens на жидкой среде №1.

Данные динамики роста исследуемой культуры псевдомонад свидетельствовали о том, что в условиях периодического культивирования регистрировалась короткая лаг-фаза (2-8 часов). Стадия экспоненциального роста была достаточно непродолжительной и длилась с 8-го по 48-й час культивирования. Достижение стационарной фазы роста, наиболее благоприятной для создания биопрепарата, происходило через 48 часов культивирования. С этими результатами согласуются данные ряда исследователей, в которых показано, что клетки P. chlororaphis 449 после 42 48 часов культивирования переходят в стационарную фазу роста (Липасова и др., 2009). К концу пятых суток наблюдали переход к фазе отмирания.

Известно, что синтез вторичных метаболитов осуществляется после прекращения роста, т.е. в стационарную фазу, поэтому в дальнейших экспериментах антагонистическую активность определяли на 2-5 сутки.

При исследовании антагонистической активности в отношении бактериальных культур, являющихся доминирующими в различных типах почв Ростовской области, установлено, что исследуемый штамм P.

chlororaphis проявлял антагонистическое действие ко всем штаммам, однако, степень выраженности антагонизма неодинакова, также как и механизм действия (бактерицидное или бактериостатическое) (табл. 1). В ходе анализа полученных данных установлено, что штаммы B. сereus на среде № 1, показали высокую степень чувствительности к действию антагониста. Зоны отсутствия роста составили 9-10 мм. При этом следует отметить, что B.

cereus входит в группу условно-патогенных микроорганизмов и может быть возбудителем токсикоинфекций (Гарцман, 2009), то есть, явление антагонизма в данном случае может играть положительную роль, подавляя развитие представителей данного вида.

Для B. panthotenticus суммарные зоны бактерицидной и бактериостатической активности достигали 8,7-10 мм.

Кроме того, следует отметить, что почти для всех видов рода Bacillus наибольшую антагонистическую активность фиксировали на среде №1, где зоны бактерицидного действия составили 3,7-11 мм, а на среде №2 – 0-8. мм, что свидетельствует о том, что среда № 1 более благоприятна для синтеза антибиотического вещества.

Таблица Антагонистическая активность Pseudomonas chlororaphis subsp. аureofaciens по отношению к доминирующим почвенным бактериям Зоны отсутствия и подавления роста от блока до начала бактериального роста, мм Среда №1 Среда № Тест-культуры на 2-е на 3-е на 5-е на 2-е на 3-е на 5-е сутки сутки сутки сутки сутки сутки 1. Bacillus pumilus А3 11+0* 4+5,3* 3,7+0* 2+2,7* 3+0* 0+3,7* 2.Bacillus cereus А4 5,7+4,3* 8,3+2* 5,7+2* 2+5,3* 0+5* 0+6* 3. Bacillus cereus А2 5,7+3,3* 8,3+0* 9+0* 7.3+0* 7,7+0* 7,3+0* 4.Bacillus cereus А6 4+3* 5,7+0* 10+0* 5,7+0* 5,3+0* 5+0* 5.Bacillus cereus Р1 6,3+0* 6,3+0* 7,7+0* 7,7+0* 4,7+4,7* 5,7+0* 6.Bacillus cereus Р2 6+0* 7,7+0* 9+0* 5,7+0* 3,7+2* 4+0* 7.Bacillus panthotenticus 6+2,7* 5,7+3,3* 6+3,3* 5,7+4* 7+0* 3,3+3* Р 8.Bacillus panthotenticus 5+5* 6,7+0* 9+0* 3,7+0* 3,3+5* 8,7+0* Р 9.Bacillus panthotenticus 5+3* 7+0* 7+0* 7+0* 3,3+4,7* 3,3+0* Р «*» - зона подавленного роста Из полученных результатов видно, что эффект антагонистического действия зависит от сроков культивирования P. chlororaphis. Так, при выращивании культуры антагониста на среде №1 наблюдается постепенное усиление антибиотической активности к пятым суткам в отношении большинства исследованных культур, хотя для Bacillus pumilus А3 максимум (11 мм) приходится на вторые, а для Bacillus cereus А4 (8.3 мм) - на третьи сутки.

Суммируя полученные данные, следует отметить, что степень антибактериальной активности варьирует не только по отношению к различным видам, но и штаммам.

При изучении антагонизма P. chlororaphis в отношении микромицетов установлено, что среди исследованных десяти плесневых грибов Cladosporium cucumerinum наиболее чувствителен к воздействию культуры антагониста, при этом следует отметить, что представители рода Cladosporium являются фитопатогенами (табл. 2;

рис. 2).

При сравнении полученных результатов с литературными данными, выявлено, что максимальная антифунгальная активность исследуемого штамма псевдомонады по отношению к различным видам плесневых грибов была больше на 12-16 мм, чем антифунгальная активность P. chlororaphis SPB1217, выделенного из почв северо-западного региона России (Кравченко и др., 2002).

Таблица Антагонистическая активность Pseudomonas chlororaphis subsp. аureofaciens по отношению к плесневым грибам Зоны фунгицидной и фунгистатической активности от блока до мицелия, мм Среда №1 Среда № Тест-культуры на 3-е на 5-е на 3-е на 5-е сутки сутки сутки сутки 1. Aspergillus niger 0+8* 0 2+12* 2+5* 2. Aspergillus amylovorus 0+15* 0+2* 3+7* 1+5* 3. Aspergillus terreus 3+15* 0+6* 5 4. Penicillium sp. (1) 2 0 2+9* 4+2* 5. Penicillium sp. (2) 0 6* 3+8* 3+8* 6. Penicillium ochrochloron 2+2* 3 2+12* 7. Penicillium chrysogenum 0+5* 0+5* 4+12* 4+13* 8. Penicillium brevicompactum 3 2 2 9. Cladosporium cucumerinum 8 2+6* 11 10. Fusarium moniliforme 0+5* 0+5* 0+6* 2+6* «*» - зона фунгистатической активности По результатам эксперимента совместного культивирования P.

chlororaphis со спорами плесневых грибов методом «микрокультуры» установлено, что уже на первые сутки наблюдается заметное угнетение прорастания конидий по сравнению с контролем. Под воздействием метаболитов антагониста происходит ограничение развития ростковых трубок с формированием на кончиках растущих гиф сферопластов. Так, размеры ростковых трубок Fusarium sp. при выращивании антагониста на среде №1 и среде №2 в 1,9 и 2,5 раза меньше, по сравнению с контролем, а для Cladosporium cucumerinum это действие выражено сильнее – в 5,1 и 9, раза соответственно.

То есть данный штамм псевдомонады ингибировал прорастание спор плесневых грибов Fusarium sp. и Cladosporium cucumerinum, замедляя образование ростковых трубок и гиф, и вызывая структурные изменения мицелия, приводящие к нарушению нормального цикла развития фитопатогенов.

При совместном культивировании микроба-антагониста с культурой Fusarium sp. на предметном стекле на среде Чапека для фитопатогена и среде № 1 для псевдомонады установлено, что в непосредственной близости к биомассе бактерий в месте диффузии антимикробных веществ в агар наблюдалось отсутствие проросших конидий. Только на расстоянии 10 мм начинали появляться первые проросшие конидии с ростковыми трубками (рис. 3).

Рис. 2. Подавление роста фитопатогенного Рис. 3. Прорастание конидий Fusarium sp. на разном гриба Cladosporium cucumerinum расстоянии от культуры антагониста: а) 8 мм;

б) двухсуточной культурой штамма мм;

в) 15 мм;

г) 25 мм. Световая микроскопия.

Pseudomonas chlororaphis subsp. аureofaciens, Увеличение х 600.

выращенной на среде № 2.

Вне зоны ингибирующего действия метаболитов (25 мм) мицелий имеет типичный для данной культуры вид и хорошо развит.

Таким образом, с использованием различных методических подходов выявлено, что штамм P. chlororaphis проявил хорошо выраженную антагонистическую активность в отношении плесневых грибов и бактериальных культур на питательных средах №1 и №2.

Полученные результаты позволяют рекомендовать эти составы питательных сред для культивирования Pseudomonas chlororaphis subsp.

аureofaciens при создании биопрепаратов.

В результате проведенных исследований разработаны различные формы биопрепарата (жидкая и на носителях: торф, перлит и вермикулит) на основе исследуемого штамма псевдомонады.

3.2. Влияние температуры хранения на титр бактерий Pseudomonas chlororaphis subsp. аureofaciens в составе биопрепаратов. Биопрепараты в процессе транспортировки и хранения подвергаются воздействию различных температур, в связи с этим, определялась сохранность бактерий в препарате при двух основных режимах хранения 5-8°С и 22-25°С. Изучение динамики численности проводилось в течение 6 месяцев в четырех различных формах биопрепарата – жидкая, торфяная, вермикулитная и перлитная. Выявлено, что хранение биопрепарата при температуре 22-25оС позволяет сохранить потребительские качества биопрепарата в вариантах с использованием носителей (вермикулита и перлита) в течение двух месяцев, при температуре 5-8оС возможно продление срока хранения на вермикулите до полугода.

3.3. Состояние микробоценоза почвы после применения биопрепаратов на основе Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens. В ходе анализа полученных данных нами выявлено, что численность бактерий во всех опытных образцах достоверно превышала контрольное значение (рис. 4). В почве контрольного варианта был зафиксирован самый низкий показатель - 0,14±0,015105 КОЕ/г почвы. В варианте «Химический препарат» численность гетеротрофов превышала контроль в три раза.

Максимальный показатель численности бактерий зафиксирован в почве, отобранной после применения биопрепарата «Перлит 1», 4,39±0, КОЕ/г почвы, т.е. в 31,4 раза больше, чем в почве контрольного варианта, и в 8,8 раза превышал численность бактерий после применения химического препарата.

5 16,9* * *10 5 * *10 КОЕ/г4,5 * КОЕ/г КОЕ/г 3,5 3 10, * 9,97* * * 9,41* 2,5 * 1010 7,87* 7,75* * 2 * 6, 6, * * 5,15* * * 4,98* * * 1, * * 0, Рис. 4. Численность бактерий в почве после Рис. 5. Количество актиномицетов в почве уборки ярового ячменя после уборки ярового ячменя * - достоверные значения при p 0,05. * - достоверные значения при p 0,05.

Заметное увеличение численности микроорганизмов - положительное явление, так как с ростом активности почвенной микрофлоры возрастает и ее антагонистический потенциал по отношению к широко распространенным в почвах возбудителям корневой гнили зерновых культур (Евсеев, 2005).

Численность актиномицетов, в отличие от предыдущей группы, в трех вариантах опыта, таких как «Химический препарат», «Торф 2» и «Вермикулит 2», ниже, чем у контрольного варианта (рис. 5).

Актиномицеты, в отличие от сапротрофов, живут не за счет экзосмоса растений, а принимают активное участие в разложении отмирающих корней, поэтому их наибольшая численность отмечается в завершающие фазы развития растений (Масленникова, 2011). Вследствие этого численность актиномицетов превышает численность бактерий во всех вариантах в несколько раз.

На основании полученных данных установлено, что для актиномицетного сообщества, так же как и для бактерий, лучшей препаративной формой является «Перлит 1».

Исследование микромицетов в исследуемых образцах почвы показало, что минимальное количество плесневых грибов содержалось в варианте «Вермикулит 1» (0,67±0,06105 КОЕ /г почвы), почти в 2,5 раза меньше в сравнении с контролем (рис. 6). При использовании химического препарата численность микроскопических грибов была также ниже, чем в контрольном варианте. Во всех остальных вариантах численность данной группы была выше контроля.

*10 6 * * * КОЕ/г * * * Рис. 6. Количество микромицетов в почве Рис. 7. Численность олигонитрофилов в после уборки ярового ячменя почве после уборки ярового ячменя * - достоверные значения при p 0,05. * - достоверные значения при p 0,05.

В почве после уборки ярового ячменя была изучена численность олигонитрофильных микроорганизмов. Большинство олигонитрофилов по данным В.А. Чулкиной, Ю.И. Чулкина (1995) обладают выраженной антагонистической активностью по отношению к возбудителям корневой гнили злаков. Много представителей этой агрономически ценной группы микроорганизмов отмечено в вариантах «Торф 1», «Вермикулит 1» и «Вермикулит 2» (рис.7). В образцах «Перлит 2» и «Химический препарат» количество типичной аборигенной группировки почвенной микрофлоры олиготрофов наименьшее (4,60±0,92106 КОЕ/г почвы и 5, 34±0106 КОЕ /г почвы соответственно).

Реакция аэробных азотфиксаторов на внесение биопрепаратов аналогична группе гетеротрофных бактерий. Во всех опытных образцах почвы, после применения экспериментальных форм биопрепаратов, вне зависимости от формы и носителя, содержание Azotobacter sp. выше значения контрольного варианта и превышает 85%. Максимальный показатель был в почве после применения биопрепарата «Жидкая форма 1» (91,18±0,94%).

После применения химического препарата значение данного показателя ниже контроля на 10,23%.

Изучение влияния биопрепаратов на численность анаэробного азотфиксатора Clostridium pasteurianum показало, что наибольшее его количество было при использовании носителя торф, а так же в вариантах «Вермикулит 2» и «Перлит 1». Эти значения в 2 раза больше, чем в контроле.

Оценка санитарно-гигиенического состояния показала, что по количеству термофильных бактерий все почвенные образцы можно охарактеризовать как чистые почвы, а по титру БГКП чистыми являются только почвы двух вариантов: «Химический препарат» и «Жидкая форма 1».

Возможно, в остальных вариантах такие низкие значения титра связаны с тем, что при непосредственном высеве почвы на среду Эндо, вырастают так называемые «эндобактерии», к которым относится и большое количество непатогенных бактерий данной группы, типичных обитателей ризосферы, например, таких как, Klebsiella, Erwinia и т.д. (Антипчук, 1979).

Полученные результаты дают основание считать, что в целом экспериментальные биопрепараты положительно влияют на состояние микробоценоза, увеличивая микробиологическую активность почвы.

3.4. Сравнение эффективности применения жидкой, торфяной, вермикулитной и перлитной форм биопрепарата на рост и развитие ярового ячменя. В условиях полевого мелкоделяночного эксперимента установлено, что применение биопрепаратов изменило некоторые биометрические показатели ярового ячменя (табл. 3).

Ранее проведенными исследованиями было выявлено, что применение таких биопрепаратов как ризоагрин и флавобактерин на фоне N30P30K способствует увеличению длины стебля ячменя до 49,5 см (Завалин, 2005). В наших экспериментах внесение биопрепарата «Перлит 1» увеличило длину стебля до 56,8 см.

Таблица Элементы структуры урожая ярового ячменя сорта "Одесский 100" Длина стебля Количество Длина колоса, Варианты ячменя, см зерен в колосе, опыта шт см 1. Контроль 50,6±0,25 6,1±0,05 15,0±0, 2. Химический препарат 56,7±1,55* 6,0±0,05 14,3±0,10* 3. Жидкая форма 1 55,3±1,70* 6,1±0,05 14,8±1, 4. Жидкая форма 2 56,0±0,85* 6,7±0,10* 15,7±1,.

5. Торф 1 5,9±0,10 14,4±0,10* 53,8±0, 6. Торф 2 55,8±0,38* 6,1±0,08 14,6±0, 7. Вермикулит 1 60,1±4,35 6,4±0,20 15,8±0,.

8. Вермикулит 2 6,5±0,05* 15,5±5, 55,5±1, 9. Перлит 1 56,8±0,15* 6,2±0,15 14,7±0, 10. Перлит 2 54,2±1,40 6,2±0,35 15,4±1, * - достоверные значения при p 0,05 по сравнению с контролем;

.

- тенденция к достоверности при 0,05p0,1 по сравнению с контролем.

Самый высокий показатель длины колоса ячменя зафиксирован после применения препарата на основе жидкой формы 2, который превышает контрольное значение на 17%. Также стоит отметить показатель длины колоса с применением препарата «Вермикулит 2», уступающий максимальному значению на 0,3. В остальных вариантах показатели длины колоса находятся на уровне контроля.

Минимальное содержание зерен в колосе ячменя было зафиксировано в опыте после применения химического препарата.

Масса колоса ярового ячменя после применения исследуемых форм биопрепарата у вариантов на вермикулитной и перлитной основе оказалась выше, чем у остальных опытных и контрольных образцов (рис. 8).

Установлено, что использование биопрепарата на основе «Перлита 2» увеличивает массу колоса на 8,5% по сравнению с контрольным вариантом, и на 27,1% по сравнению с вариантом «Химический препарат». Масса колоса ярового ячменя в опыте с применением химпрепарата минимальная и составила 0,7 г.

Бактеризация семян ячменя перед посевом биопрепаратами Бинорам Ж, который содержит комплекс штаммов ризосферных бактерий Pseudomonas fluorescens, и Биосил, приводила к увеличению массы зерна колоса с 0,75 г в контрольном образце до 0,78 г (Титова, Внукова, 2012). В нашем случае обработка семян экспериментальным биопрепаратом способствовала увеличению массы колоса ячменя с 0,82 г в контрольном варианте до 0,89 г.

Таким образом, полученная прибавка в массе зерна колоса после применения исследуемого штамма псевдомонады свидетельствует о его высокой эффективности по сравнению с другими биопрепаратами на основе псевдомонад.

У всех опытных образцов масса 1000 зерен оказалась выше, чем у контрольного варианта (рис.9). Наибольшую эффективность показали препараты, полученные на основе жидких форм. В варианте «Жидкая форма 1» получены более полновесные семена, о чём свидетельствует самая высокая масса 1000 зерен – 53,28 г. Этот показатель выше на 17,4% контрольного варианта и на 13,6% выше показателя в варианте «Химический препарат».

* Масса 1000 зёрен, г * * * * Рис. 8. Масса колоса ярового ячменя Рис. 9. Масса 1000 зерен * - достоверные значения при p 0,05 по сравнению с ярового ячменя контролем;

* - достоверные значения при p 0, - тенденция к достоверности при 0,05p0,1 по сравнению с контролем.

по сравнению с контролем.

Препараты на основе вермикулита также показали хорошую эффективность. Полученная при их применении масса 1000 зерен на 8,8% и 8,2% выше контрольного варианта и варианта с химическим препаратом соответственно.

Более высокие показатели содержания зерен в колосе ячменя, а также массы 1000 зерен определяют наибольшую величину биологической урожайности. Так максимальное содержание зерен в колосе ячменя было в вариантах «Жидкая форма 2» и «Вермикулит 1», и масса 1000 зерен в этих же вариантах превосходит контроль и традиционную обработку химическим препаратом.

Максимальное достоверное значение урожайности выявлено в варианте «Вермикулит 1» (рис. 10).

Рис. 10. Урожайность ярового ячменя в различных вариантах полевого мелкоделяночного опыта * - достоверные значения при p 0,05 по сравнению с контролем.

Таким образом, оценивая полученные данные, можно констатировать, что использование изучаемых биопрепаратов для предпосевной обработки семян ячменя при выращивании его в открытом грунте, при больших перепадах температур и влажности, характерных для Ростовской области, оказалось эффективнее, чем обработка химическим препаратом. При этом из литературы известно, что окупаемость биопрепаратов таких как Агат-25К, Альбит, Планриз и Алирин Б на ячмене сорта «Абава», была выше протравителя «Дивиденд Стар» в 4,8-17,5 раза. Низкая окупаемость этого протравителя связана с его высокой стоимостью и несущественной прибавкой урожайности зерна (Помелов, Дудин, 2009).

Совокупность таких исследуемых показателей, как масса колоса и зерен ярового ячменя, урожайность, указывает на то, что применение вермикулита в качестве носителя обеспечивает наиболее высокую эффективность биопрепарата на основе бактерий Pseudomonas chlororaphis subsp. аureofaciens, в сравнении с жидкими, торфяными и перлитными формами.

ВЫВОДЫ Бактерия рода Pseudomonas, выделенная из почв г. Ростова-на-Дону, 1.

идентифицирована до вида Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens, потенциального продуцента вторичных метаболитов.

Подобраны две питательные среды для культивирования Pseudomonas 2.

chlororaphis subsp. aureofaciens, оптимальные для синтеза метаболитов, обладающих антибактериальной и антифунгальной активностями.

Установлена антагонистическая активность Pseudomonas chlororaphis 3.

subsp. aureofaciens в отношении плесневых грибов и бактериальных культур;

более чувствительными оказались микромицеты рода Cladosporium и бактерии рода Bacillus. Действие антагониста в отношении фитопатогенных грибов родов Fusarium и Cladosporium проявляется в ингибировании скорости прорастания спор.

Максимальная секреция вторичных метаболитов с антагонистической 4.

активностью регистрируется на 2-5 сутки культивирования.

Разработаны основные принципы получения различных форм 5.

эксперименатальных биопрепаратов на основе Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens в лабораторных условиях.

Выявлено, что хранение биопрепарата при температуре 22-25оС 6.

позволяет сохранить потребительские качества биопрепарата в вариантах с использованием носителей (вермикулита и перлита) в течение двух месяцев, при температуре 5-8оС возможно продление срока хранения на вермикулите до полугода.

Микробиологическая активность почв, обработанных биопрепаратами, 7.

в большинстве случаев выше, чем в почве с химическим препаратом после уборки ярового ячменя.

Применение вермикулита в качестве носителя обеспечивает наиболее 8.

высокую эффективность биопрепарата на основе бактерий Pseudomonas chlororaphis subsp. аureofaciens, в сравнении с жидкими, торфяными и перлитными формами, для роста и развития ярового ячменя в условиях полевого мелкоделяночного эксперимента.

СПИСОК РАБОТ Хархун Е.В. (Барановой Е.В.), опубликованных по теме диссертации Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Хархун Е.В., Полякова А.В., Внуков В.В., Ким Д.А. Состояние микробоценоза почвы после применения биопрепаратов на основе Pseudomonas chlororaphis subsp.

aureofaciens (Pseudomonas aureofaciens) // Фундаментальные исследования. 2012.

№ 11. С. 56-60.

2. Хархун Е.В., Полякова А.В., Русанов В.А., Внуков В.В. Антагонистическая активность вторичных метаболитов Pseudomonas aureofaciens // Изв. вузов. Сев Кавк. регион. Естеств. науки. 2012. № 6. С. 85-88.

3. Хархун Е.В., Полякова А.В., Внуков В.В., Ким Д.А. Эффективность разных форм биопрепарата на основе Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens // Проблемы агрохимии и экологии. 2012. № 4. С. 52-55.

Статьи и тезисы в других изданиях:

4. Баранова Е.В., Полякова А.В. Возможность коррекции санитарного состояния городских почв // Материалы III международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины».

Ростов-на-Дону. 2009. С. 67.

5. Баранова Е.В. Антагонистическая активность Pseudomonas aureofaciens // Сборник докладов 8-й Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь XXI века – будущее Российской науки». Ростов-на-Дону. 2010. С. 23.

6. Баранова Е.В., Полякова А.В. Антагонистическая активность Pseudomonas aureofaciens к плесневым грибам // Материалы Всероссийской научно практической конференции по медицинской микологии (XIII Кашкинские чтения).

Санкт-Петербург. 2010. С. 56.

7. Baranova E.V., Kim D.A., Polyakova A.V. The selection of optimal nutrient medium for the cultivation of Pseudomonas aureofaciens // Proceeding of the V International Young scientists conference «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution», dedicated to 160 anniversary from the birth of professor FrantsKamenskiy. Odesa. 2011. P.296.

8. Баранова Е.В., Полякова А.В. Изучение антибактериальной активности штамма Pseudomonas aureofaciens, выделенного из промышленной зоны городских почв // Сборник научных трудов «Экологические проблемы промышленных городов» под ред. проф. Е.И. Тихомировой. Саратов. 2011. С. 18-20.

9. Баранова Е.В., Полякова А.В. Изучение антагонистической активности штамма Pseudomonas aureofaciens по отношению к плесневым грибам // Сборник материалов всероссийской научной конференции «Модернизация науки и образования». Секция 1: «Биологические науки». Махачкала. 2011. С. 96-98.

10. Хархун Е.В., Русанов В.А., Ким Д.А., Полякова А.В. Влияние штамма Pseudomonas aureofaciens на прорастание спор плесневых грибов // Материалы I Международной научно-практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности.

Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области»:

электронное научн. издание. Пенза. 2011. С. 91-93.

11. Хархун Е.В., Полякова А.В., Русанов В.А., Ким Д.А. Антифунгальная активность штамма Pseudomonas aureofaciens // Сборник материалов 50-й юбилейной международной студенческой научной конференции «Студент и научно-технический прогресс». Биология. Новосибирск. 2012. С. 196.

12. Ким Д.А., Хархун Е.В., Полякова А.В. Изучение хранения биопрепарата в жидкой форме и на носителе-торфе // Сборник материалов научной конференции «Неделя науки 2012» студентов и аспирантов факультета биологических наук Южного федерального университета. Ростов-на-Дону. 2012. С. 59-62.

13. Kharkhun E.V., Polyakova A.V., Kim D.A. Comparing of influences of chemical fungicide and biological preparation on a microbiological activity of a soil // Proceeding of the conference “Adaptive Strategies of Living Systems”. Crimea. 2012. Р. 331-332.

14. Хархун Е.В., Полякова А.В., Ким Д.А. Влияние биопрепарата на основе Pseudomonas aureofaciens на урожайность ярового ячменя // Сборник материалов II Всероссийской с международным участием молодежной научной школе конференции: «Биология будущего: традиции и новации». Екатеринбург. 2012. С.

136-138.

15. Хархун Е.В., Полякова А.В., Русанов В.А. Фитопатологический анализ семян пшеницы, обработанных Pseudomonas aureofaciens // Сборник материалов третьего съезда микологов России. Москва. 2012. С. 340-341.

16. Хархун Е.В., Полякова А.В. Особенности взаимодействия Pseudomonas chlororaphis subsp. аureofaciens с Fusarium sp. // Материалы II Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука: модернизация и инновационное развитие страны»: электронное научн. издание. Пенза. 2012. С. 357 360.

17. Хархун Е.В., Полякова А.В., Ким Д.А. Влияние биопрепарата на основе Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens на микробиологическую активность почвы // Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». Саратов.

2012. С. 48.

18. Хархун Е.В., Полякова А.В., Ким Д.А. Определение оптимальных условий хранения экспериментального биопрепарата на основе Pseudomonas chlororaphis subsp. аureofaciens // Материалы молодежной конференции «Миссия молодежи в науке». Ростов-на-Дону. 2012. С. 286-289.