Микроорганизмы цикла углерода в осадочных породах венда московской синеклизы
На правах рукописи
ПЕРВУШИНА Ксения Александровна МИКРООРГАНИЗМЫ ЦИКЛА УГЛЕРОДА В ОСАДОЧНЫХ ПОРОДАХ ВЕНДА МОСКОВСКОЙ СИНЕКЛИЗЫ Специальность 03.00.16 – экология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Ярославль – 2007 2
Работа выполнена на кафедре ботаники и микробиологии в Ярослав ском государственном университете им. П.Г. Демидова.
Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Шеховцова Нина Валентиновна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Ананьева Надежда Дмитриевна доктор биологических наук, профессор Ястребов Михаил Васильевич
Ведущая организация: Самарский государственный университет
Защита диссертации состоится _ 2007 г. в _на заседании диссертационного совета К 212.002.01 при Ярославском государственном университете им. П.Г. Демидова по адресу:
150057, г. Ярославль, проезд Матросова, д. 9.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ярославского государст венного университета им. П.Г. Демидова по адресу:
150000, г. Ярославль, ул. Полушкина роща, д. 1.
Автореферат разослан «_»_2007 года
Ученый секретарь диссертационного совета Швыркова Н.С.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время установлено (Оборин и др., 2004), что микроорганизмы могут функционировать в литосфере на глу бинах до 6820 м (Тюменская сверхглубокая скважина). Подземная биосфера участвует в регуляции потока вещества и энергии на нашей планете, под держивая ее гомеостаз (Pedersen, 2000), при этом цикл углерода является ве дущим в системе биогеохимических круговоротов и сопряжен с циклами других важнейших элементов – О, N, P и S (Заварзин, 2004). Максимальный возраст исследованных к настоящему времени осадочных отложений соста вил 400 млн лет и соответствовал девонским нефтеносным песчаникам, в ко торых обнаружили функционирующих анаэробных сульфатредукторов и ме таногенов (Ivanov, Belyaev, 1983). Особенности микроорганизмов в докем брийских осадочных отложениях глубоких горизонтов земной коры и воз можность их активности in situ в настоящее время, ранее не изучались.
Имеющиеся сведения о распространении микроорганизмов и их активности, в подпочвенных горизонтах в целом фрагментарны, что послужило основой для концептуального подхода к изучению так называемой «подземной био сферы». В настоящее время известны: концепция гидробиохимической зо нальности подземных вод Крамаренко (1973);
модель хемолитоавтотрофных экосистем – функционирующих в глубоких кристаллических породах за счет первичной продукции из СО2 и Н2 – Стивенса (1995) и Педерсена (1997);
концепция структурно-функциональных групп подземной биосферы Вер ховцевой и соавт. (1996), концепция трех «бактериальных фильтров» в лито сфере Земли Оборина (2004). Тем не менее, прогностическое значение этих концепций остается дискуссионным, поскольку они основаны на изучении изолятов и не сопровождались применением методов молекулярной эколо гии. Оценить метаболические возможности подпочвенных микроорганизмов можно с помощью метода меченых атомов. Однако все вышеуказанные ме тоды дороги, требуют специального оборудования и больших затрат време ни. Нами выбран более дешевый и экспрессный метод анализа жирнокис лотных биомаркеров в липидных профилях пород, который, благодаря при менению газовой хроматографии – масс-спектрометрии, позволяет опреде лять количество микробных клеток и соотносить их с известными таксона ми. Комплексный анализ биоценозов осадочных пород, залегающих на глу бинах более 1000 м, основанный на сочетании методов, без выделения и с выделением культивируемых микроорганизмов, ранее не проводился.
Цель исследования: изучение биоразнообразия, численности и актив ности микроорганизмов основных эколого-трофических групп цикла угле рода на примере осадочных пород венда Московской синеклизы с использо ванием маркерного анализа и микробиологических методов.
Задачи исследования:
1. Выделить доминантные эколого-трофические группы микроорганизмов цикла углерода в осадочных породах, вскрытых Высоковской поисковой скважиной №1, сочетая анализ биомаркеров в липидном профиле породы и выделение из нее микроорганизмов на лабораторных элективных средах.
2. Изучить качественные и количественные характеристики микроорганиз мов каждой эколого-трофической группы.
3. Изучить адаптивные свойства микроорганизмов, выделенных из кернов осадочных пород, вскрытых Высоковской поисковой скважиной №1, к усло виям подземной среды.
4. Оценить возможность биогеохимической активности микроорганизмов цикла углерода в осадочных породах, вскрытых Высоковской поисковой скважиной №1, в настоящее время.
Научная новизна работы. Впервые в осадочных породах венда Мос ковской синеклизы с помощью анализа липидных биомаркеров определена общая численность микроорганизмов. Методами посева показано, что толь ко часть пула микроорганизмов активна и высевается на питательные среды, ее массовая доля зависит от флюидопроницаемости пород. Результаты ис следования свидетельствуют, что в осадочных породах подземной биосферы есть условия для сосуществования, как аэробных, так и анаэробных микро организмов. Таким образом, впервые на основе комплексного анализа био ценозов осадочных пород, вскрытых в интервалах глубин 2350 – 2580 м, сконструирована схема цикла углерода, протекание которого возможно в ус ловиях изученных горизонтов.
Теоретическая и практическая значимость. Работа расширила су ществующие представления о подземной биосфере. Показана возможность функционирования цикла углерода в неисследованных ранее осадочных по родах с различной флюидопроницаемостью – песчанике и аргиллите, вскры тых Высоковской скважиной.
В работе показана прогностическая значимость метода липидного ана лиза, который позволяет вести целенаправленный поиск микроорганизмов в породах еще до получения геологической информации. Подтверждением тому является идентификация изолированных из кернов бактерий рр. Cory nebacterium и Propionibacterium, биомаркеры которых присутствовали в ли пидных профилях соответствующих пород. Выделенные микроорганизмы, могут быть потенциально перспективными объектами биотехнологии.
Экспериментально показано присутствие в породах пула микроорга низмов, который обнаруживает потенциальную активность при проникнове нии человека в недра Земли.
Результаты работы включены в содержание курсов «Экология орга низмов» (раздел «Экология микроорганизмов») и «Микробиология и виру сология» (раздел «Экология и геохимическая деятельность микроорганиз мов») факультета биологии и экологии ЯрГУ им. П.Г. Демидова.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены, до ложены и обсуждены:
- на региональных конференциях: 11-ой и 12-ой "Структура, вещество, история литосферы Тимано-Североуральского сегмента" (Сыктывкар, 2002, 2003);
«Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, 2004);
«Биоразнообразие Верхневолжья: состояние и проблемы сохранения» (Ярославль, 2004);
- на всероссийских конференциях: посвященной 200-летию ЯрГУ им.
П.Г. Демидова (Ярославль, 2003);
"Экологические механизмы динамики и устойчивости биоты" (Екатеринбург, 2004);
«Актуальные проблемы совре менной биологии» (Астрахань, 2005);
«Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005);
аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование» (Ярославль, 2005);
«Эко логические проблемы уникальных природных и антропогенных ландшаф тов» (Ярославль, 2006);
«Наука. Образование. Молодежь» (Майкоп, 2007);
- на международных конференциях: «Микробное разнообразие: со стояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь, 2005);
«Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астра хань, 2005);
интернет-конференции «Современные направления теоретиче ских и прикладных исследований ‘2007» (Одесса, 2007);
IV международном семинаре «Минералогия и жизнь» (Сыктывкар, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том чис ле 1 статья в издании, рекомендованном ВАК.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Доминирующую эколого-трофическую группу осадочных пород венда Московской синеклизы составляют углеводородокисляющие микроор ганизмы.
2. Обнаружившие активность микроорганизмы могут осуществлять в изученных горизонтах цикл углерода.
3. Основным фактором, определяющим интенсивность цикла углерода в исследуемых горизонтах, является флюидопроницаемость пород.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на стра ницах машинописного текста, иллюстрирована 48 таблицами и 17 рисунка ми. Список литературы включает 228 наименований работ.
Автор выражает глубокую благодарность за помощь в работе и ценные рекомендации д.б.н. Г.А. Осипову (группа академика Ю.Ф. Исакова), д.б.н.
А.Л. Степанову (МГУ) и геологу И.С. Грибовой (ФГУП НПЦ «Недра»).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования служили керны осадочных пород венда Мос ковской синеклизы, вскрытых Высоковской поисковой скважиной №1 (ВПС 1) в интервале глубин 2358 – 2363 м (песчаник) и 2574 – 2580 м (аргиллит), а также изолированные из них культуры микроорганизмов. Значения парамет ров среды составили: температура – 37 и 39 C;
рН – 7,65 и 8,3;
открытая по ристость – 21,2 и 5,9%;
газопроницаемость – 49,6 и 5,62 миллидарси (мД);
содержание органического вещества (Сорг.) – 0,12 и 0,15% на породу, – в пес чанике и аргиллите соответственно. Рассеянное органическое вещество (РОВ) обеих пород было представлено частицами сапропелевого и водорос левого детрита. В составе РОВ пород присутствовали битумоиды, содер жавшие парафино-нафтеновые, ароматические углеводороды, легкие и тя желые смолы, асфальтены;
а также гуминовые кислоты и остаточное количе ство целлюлозы. В порах пород присутствовали N2, H2, CO2 и углеводород ные газы: метан, этан, пропан, следы бутилена. В песчанике обнаружен пен тан, а в аргиллите – гелий. Содержание сульфатов (SO42-) и сульфидов в кер не аргиллита составило 0,16 и 0,01 % соответственно, концентрация сульфа тов в песчанике – 0,01%, сульфиды не обнаружены.
В основу изучения подземной биосферы в осадочных породах, вскры тых ВПС-1, положили выявление в составе биоценозов песчаника и аргилли та доминантных эколого-трофических групп микроорганизмов цикла угле рода. Методика включала: 1) реконструкцию таксономического состава мик робоценозов кернов песчаника и аргиллита, вскрытых ВПС-1, на основе ана лиза жирнокислотных (ЖК) биомаркеров в липидных профилях пород;
2) выявление у представителей реконструированных биоценозов потенциаль ных свойств, связанных со способностью преобразовывать углеродсодержа щие соединения в экологических условиях исследуемых горизонтов и объе динение их в эколого-трофические группы;
3) выделение культивируемых микроорганизмов путем высева кернов пород в элективные питательные среды;
4) первичная идентификация полученных изолятов микроорганизмов и изучение их адаптивных свойств;
5) сопоставление данных по численно сти и биоразнообразию культивируемых микроорганизмов с результатами реконструкции микробоценозов;
6) конструирование схемы функционирова ния микробного сообщества, участвующего в цикле углерода в осадочных породах венда Московской синеклизы, вскрытых ВПС-1.
Керн при подготовке к исследованию дробили и растирали до порош кообразного состояния, предварительно удалив верхние 2,5 см, с соблюде нием правил стерильности. Породу в виде порошка использовали для выяв ления ЖК маркеров и микробиологического анализа. В последнем случае осуществляли десорбцию микроорганизмов с частиц породы растиранием порошка керна в 0,2 М растворе КОН (Кузнецов и др., 1963).
Реконструкцию биоценоза на основе анализа биомаркеров в липидном профиле породы осуществляли согласно ранее описанному алгоритму (Оси пов, Турова, 1997) с помощью различных баз данных о липидных профилях нескольких сотен чистых культур известных бактерий. Липидные профили снимали методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии на хромато масс-спектрометре AT-5971 (США).
Для выделения из проб песчаника и аргиллита микроорганизмов раз ных эколого-трофических групп применяли питательные среды, в состав ко торых включали источники углерода и энергии, имеющие абиогенное и био генное происхождение в исследуемых горизонтах. Подбор элективных сред осуществляли, если не указано иначе, согласно рекомендациям (Кузнецов, Дубинина, 1989). Для выделения водородокисляющих бактерий (ВОБ) при меняли среду Шлегеля в атмосфере О2:СО2:Н2 (5:10:85);
автотрофных мета нобразующих бактерий (АМБ) – среду Беляева в атмосфере Н2:СО2 (80:20);
гетеротрофных (ацетокластических) метанобразующих бактерий (ГМБ) – среду Беляева с ацетатом натрия и Н2 в газовой фазе (Назина и др., 1998);
ав тотрофных ацетогенов – среду Пфеннига в атмосфере Н2:СО2 (80:20) (Дет кова, 2003);
автотрофных сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) – среду Сорокина в атмосфере воздуха (1/3) и Н2 (2/3);
гетеротрофных СРБ – среду Баарса с лактатом, либо ацетатом, натрия;
алканотрофов – среду Бушнелла Хааса, видоизмененный агар Чапека с РПА, разбавленным 1:10 (Методы …, 1991), и среду Мюнца, – в атмосфере пропана и бутана, а также среду Буш нелла-Хааса с 2%-м гексадеканом (Eriksson et al., 2000);
метанолокисляющих бактерий (МОБ) – среду Виттенбари;
аэробных целлюлозоразлагающих бак терий (ЦРБ) – минеральную среду с полосками фильтровальной бумаги либо микрокристаллической целлюлозой (Мельников и др., 2005);
анаэробных ЦРБ – среды для мезофильных и термофильных ЦРБ по Егорову (Практикум …, 1976);
бродильщиков – углеводо-пептонную среду;
олиготрофов – РПБ, разбавленный 1:10 (РПБр), среду М2 (Hottes et al., 2004) с глюкозой в кон центрации 0,2 г/л – М2(0,2) и 0,02 г/л – М2(0,02), среду R2A (Defives et al., 1999);
копиотрофов – РПБ, РПА, среду М2 с глюкозой в концентрации 2 г/л – М2(2). Концентрацию метана в газовой фазе флаконов определяли на газо вом хроматографе Chrom-41 с пламенно-ионизационным детектором. Ком понентный состав летучих ЖК в культурах автотрофных ацетогенов иден тифицировали на газовом хроматографе Hewlett Packard 5880 (США).
Численность бактерий большинства изученных групп определяли ме тодом предельных десятикратных разведений в 3-х-кратной повторности, определяя наиболее вероятное число по таблицам Мак-Креди. Численность МОБ определяли с помощью чашечного посева по Коху.
Посевы инкубировали при температуре горизонта – 37 °С, – для выде ления «аборигенных» микроорганизмов. Поскольку при 37 °С растут и ме зофилы и термофилы, для выявления различных температурных групп мик роорганизмов проводили инкубацию посевов при 28 и 60 °С.
Микробные изоляты в виде отдельных колоний получали по стандарт ным методикам на агаризованных питательных средах. Первичную иденти фикацию изолятов осуществляли на основе изучения фенотипических и хе мотаксономических свойств. Морфологию клеток определяли с применени ем микроскопа Биолам, увеличение 101,0100. Физиолого-биохимические свойства изучали согласно (Практикум …, 1976). Липидные профили чистых культур бактерий получали по методике (Stead et al., 1992) и анализировали на хроматографе Microbial Identification System (Sherlock), США.
В качестве адаптивных свойств выделенных микроорганизмов изучали способности к азотфиксации, к росту при температуре in situ (37 °С);
исполь зовать в качестве единственного источника углерода и энергии органические субстраты: 1) глюкозу – ключевое соединение многих метаболических путей микроорганизмов;
2) пропан, бутан и гексадекан – углеводороды флюидов в порах исследуемых пород;
3) микробные метаболиты: метанол и этанол – продукты процессов брожения и бактериального окисления некоторых угле водородов;
ацетат в виде соли натрия – продукт ацетогенов, в том числе, и бродильщиков;
4) растворитель «Нефрас» (ГОСТ 3134-78) и керосин освети тельный – техногенные смеси углеводородов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ биомаркеров в липидных профилях кернов осадочных пород, вскрытых ВПС- Анализ липидных профилей кернов песчаника и аргиллита показал, что их постоянными компонентами были биомаркеры бактерий, грибов и b ситостерол растений, а в аргиллите, кроме того, был найден пальмитиновый альдегид (16а) – специфический маркер простейших (рис. 1).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 lg N Песчаник, Аргиллит, Рис. 1. Структура микробных сооб ществ осадочных Глубина, м пород, вскрытых простейшие растения грибы бактерии ВПС- Анализ липидных профилей дает информацию о присутствии в образ це породы биомаркеров, как жизнеспособных культивируемых и некульти вируемых микроорганизмов, так и нежизнеспособных (мертвых). Можно по лагать, что эукариотные биомаркеры в липидных профилях пород являются компонентами мертвых клеток микроорганизмов, за исключением грибов, что согласуется с присутствием в породах водорослевого и сапропелевого детрита. Основным предметом нашего интереса являлись бактерии как наи более вероятные участники процессов цикла углерода в подземной среде.
Состав реконструированного бактериоценоза песчаника насчитывал 18 так сонов против двадцати трех аргиллита (табл. 1).
В бактериоценозах каждой из пород грамположительные бактерии (№п/п 13–30) доминировали над грамотрицательными (№п/п 1–12): в песча нике первые были представлены десятью таксонами, а их массовая доля (м.д.) составила 81,87%, в аргиллите – пятнадцатью таксонами и 92,78% со ответственно. Среди грамположительных преобладали неспорообразующие бактерии: их м.д. в обеих породах находилась на уровне 59% от всех членов сообщества. В этой группе в бактериоценозе песчаника доминировал р.
Rhodococcus (40,9%), в аргиллите – р. Corynebacterium (21,4%). Доля споро образующих анаэробных бактерий (р. Clostridium) равнялась 20,3 и 25,6%, а факультативно-анаэробных (р. Bacillus) 2,55 и 7,9%, в песчанике и аргилли те соответственно. Исходя из содержания биомаркеров, количество бактерий в обеих осадочных породах находилось на одном уровне – 107 усл.кл/г поро ды. Проанализировав потенциальные свойства у представителей бактерио ценозов песчаника и аргиллита, связанные с трансформацией СО2 и органи ческих соединений, в структуре сообществ пород мы выделили 7 эколого трофических групп микроорганизмов: ВОБ, гомоацетогены, СРБ, МОБ, уг леводородокисляющих бактерий (УОБ), ЦРБ, бродильщики.
В реконструированном бактериоценозе песчаника по массовой доле доминировали группы ВОБ, МОБ и УОБ: их м.д. находились в пределах 61, – 64,5% (рис. 2А). В аргиллите на первом месте были потенциальные бро дильщики (м.д. 78%), на втором – УОБ (м.д. 66%) (рис. 2Б). Однако, по ко личеству таксонов, доминировали УОБ: 66,7% от всех родов в песчанике, 60,9% – в аргиллите.
2. Численность культивируемых микроорганизмов Результаты высева кернов пород в элективные среды (табл. 2) под твердили активность шести эколого-трофических групп, выделенных на ос нове маркерного анализа.
Таблица 1.
Структура бактериоценозов (%), реконструированных на основе анализа биомаркеров в липидных профилях пород, вскрытых ВПС- № Группы бактерий 2358 м 2574 м Функциональные п/п способности 1. 4,6 2,0 МОБ р. Acetobacter 2. 0,1 УОБ;
ВОБ р. Acinetobacter – 3. 0,4 ЦРБ р. Agrobacterium – 4. 1,7 – УОБ;
ВОБ;
МОБ;
ЦРБ р. Pseudomonas 5. 0,1 – УОБ р. Sphingobacterium 6. 1,2 0,1 УОБ;
ЦРБ р. Sphingomonas 7. 0,5 – УОБ;
ВОБ;
бродильщики сем. Enterobacteriaceae 8. 0,8 – ЦРБ;
бродильщики р. Bacteroides 9. 4,7 0,5 ВОБ р. Wolinella 10. – 0,2 СРБ;
бродильщики р. Desulfovibrio 11. 4,4 0,1 ВОБ;
МОБ р. Nitrobacter 12. 3,8 УОБ;
МОБ;
ЦРБ р. Caulobacter – 13. 2,5 7,9 УОБ;
ВОБ;
МОБ;
ЦРБ;
р. Bacillus бродильщики 14. р. Clostridium 20,3 25,6 ЦРБ;
бродильщики;
го моацетогены 15. 2,2 УОБ;
ВОБ;
МОБ;
ЦРБ р. Micrococcus – 16. 1,8 УОБ;
ЦРБ;
бродильщики р. Staphylococcus – 17. 10,7 УОБ;
ЦРБ;
бродильщики р. Actinomyces – 18. 0,01 бродильщики р. Bifidobacterium – 19. 0,6 1,0 ЦРБ;
бродильщики р. Butyrivibrio 20. 2,5 УОБ;
ЦРБ;
бродильщики р. Cellulomonas – 21. 2,9 21,4 УОБ;
МОБ;
бродильщики р. Corynebacterium 22. 4,2 ЦРБ;
бродильщики;
го р. Eubacterium – моацетогены 23. 2,2 УОБ;
бродильщики р. Propionibacterium – 24. 4,5 0,9 УОБ;
ВОБ;
МОБ р. Mycobacterium 25. 3,2 УОБ;
ВОБ;
МОБ р. Nocardia – 26. 40,9 7,0 УОБ;
ВОБ;
МОБ р. Rhodococcus 27. 4,2 2,4 УОБ;
ЦРБ р. Pseudonocardia 28. 3,1 УОБ;
ЦРБ;
бродильщики р. Micromonospora – 29. 1,4 УОБ;
МОБ;
ЦРБ р. Streptomyces – 30. р. Actinomadura 1,3 УОБ;
ЦРБ – 7 Итого, усл. кл/г породы 2,410 2, Примечание: здесь и далее: 2358 м – песчаник;
2574 м – аргиллит;
сокращения названий эколого-трофических групп бактерий в тексте А Песчаник Количество таксонов микроорганизмов, % Массовая доля, % 80 60 40 ВОБ Ацет. СРБ МОБ УОБ ЦРБ Брод.
ВОБ Ацет. СРБ МОБ УОБ ЦРБ Брод.
Группы микроорганизмов Группы микроорганизмов Б Аргиллит Количество таксонов микроорганизмов, % Массовая доля, % 20 0 ВОБ Ацет. СРБ МОБ УОБ ЦРБ Брод. ВОБ Ацет. СРБ МОБ УОБ ЦРБ Брод.
Группы микроорганизмов Группы микроорганизмов микроорганизмы эколого-трофической группы прочие микроорганизмы Рис. 2. Эколого-трофические группы микроорганизмов в реконст руированных бактериоценозах песчаника (А) и аргиллита (Б) Культивируемых ацетогенов не обнаружили в пробах обеих пород.
Культивируемые СРБ были выделены только из образца аргиллита на среде для автотрофов, и лишь при температуре in situ (37 °С). Этот факт подтвер дил результаты анализа липидных профилей пород (табл. 1): биомаркеры СРБ р. Desulfovibrio обнаружили только в керне аргиллита. Кроме того, ис ключительно в аргиллите присутствовали сульфиды – продукты жизнедея тельности СРБ, – тогда как сульфаты (акцепторы электронов для СРБ) были в обеих породах. Культивируемые ЦРБ были выделены исключительно из пробы песчаника, и лишь в среде для аэробов (табл. 2), что, как мы полагаем, обусловлено активностью аэробных бактерий р. Cellulomonas, биомаркеры которых присутствовали в липидном профиле указанной породы (табл. 1).
Таблица 2.
Численность микроорганизмов, выделенных из кернов осадочных по род, вскрытых ВПС-1, кл/г породы Группы микроорганизмов Источник выделения, глубина залегания, м Песчаник, 2358-2363 м Аргиллит, 2574-2580 м Температура, С 28 37 60 28 37 1 2 -1 0 Используют ВОБ 4,510 2,510 9,010 4,010 4,510 – углерод (следы) 3,0101 1,5102 2,0100 4,010 флюидов Автотрофные – – метаногены (сле ды) 1 2 9,010 4,010- 9,010 Ацетокластические 2,010 3,010 3, 1 1 метаногены (сле- (сле- (сле ды) ды) ды) Ацетогены н/о – н/о н/о – н/о Автотрофные СРБ – – – – 9,010 – Гетеротрофные – – – – – – СРБ 3,0100 9,5100 1,1101 1,5100 2, МОБ – Алканотрофы:
в атмосфере пропа- 4,0103 9,5102 6,0101 3,5101 1,5102 – на и бутана;
7,5103 7,5105 9,5101 4,5103 4,0104 6, на гексадекане 9,010 Используют ЦРБ – – – – – углерод (сле РОВ ды) 2,5104 8,0102 4,5101 3,0102 2,5102 9, Бродильщики Олиготрофы:
9,5103 2,5103 2,5102 3,0102 9,5101 5, РПБр 9,5101 9,5104 9,7102 2,5101 9,5103 1, М2(0,2) 2,5102 2,0103 2,5103 7,5100 7,5101 1, М2(0,02) 6,5101 7,5104 1,15103 9,5100 6,5103 1, R2A Копиотрофы:
5,0104 9,0102 1,2103 3,0103 9,5102 4, РПБ 2,5104 9,5104 3,0102 1,5103 1,5102 9, М2(2) Примечание: «–» – отсутствие видимых признаков роста;
н/о – не определяли;
сокраще ния названий питательных сред в тексте Путем высева кернов в питательные среды были выявлены три эколо го-трофические группы, которые невозможно выделить на основе маркерно го анализа пород. Во-первых, особенности хроматографа не позволили про вести учет биомаркеров метаногенов в липидных профилях пород. Однако в порах песчаника и аргиллита был метан – продукт их жизнедеятельности, – а также СО2 и Н2 – ростовые субстраты, и потому мы сочли метаногенов од ной из основных эколого-трофических групп в биоценозах исследуемых по род. Во-вторых, с учетом концепции подземной биосферы Верховцевой и соавт. (1996), мы выделили еще две группы микроорганизмов: окисляющих органический субстрат до СО2 и Н2О при его высоких концентрациях в среде – копиотрофов – и, очень низких, – олиготрофов.
При высеве образцов пород в питательные среды при 28, 37 и 60 °С были зафиксированы разные распределения численности микроорганизмов эколого-трофических групп. Характер зависимости численности (N) от тем пературы у большинства выделенных групп – с максимальным значением при 37 °C – соответствовал ожидаемому результату опытов по выделению микроорганизмов – «аборигенов» исследуемых пород. Указанную законо мерность наблюдали для ВОБ, АМБ, СРБ, ГОБ, ЦРБ, а также олиготрофов на М2(0,2) и R2A, песчаника и аргиллита. Кроме того, она была характерна для копиотрофов на М2(2) и ГМБ – только песчаника, а также ПБОБ, МОБ и олиготрофов на М2(0,02) – исключительно аргиллита. Численность копио трофов на РПБ, как и NБрод., были тем меньше, чем выше была температура, что может говорить об их наземном происхождении.
За исключением Nкоп. на РПБ при 37 °C, а также NБрод. при 60 °C, чис ленность микроорганизмов каждой группы, изолированной из песчаника, была выше, чем таковая – аргиллита. Полученное соотношение согласуется с флюидопроницаемостью пород: пористость (21,2%) и газопроницаемость (49,60 мД) песчаника были больше, чем аналогичные параметры аргиллита:
5,9% и 5,62 мД. Nкоп. обеих пород при 37 °C находилась на одном уровне:
9,0102 и 9,5102 кл/г соответственно, что, в свою очередь, согласуется с со держанием Сорг. в породе: в песчанике и аргиллите оно было близко – 0,12 и 0,15% на породу соответственно. NБрод. песчаника при 60 °С – 4,5101 кл/г – была незначительно ниже, чем NБрод. аргиллита при аналогичной температу ре – 9,5101 кл/г. Можно полагать, что бродильщики аргиллита более адапти рованы к высоким температурам, чем аналогичные бактерии песчаника.
Среди всех групп микроорганизмов, изолированных из кернов обеих пород, максимальная численность – 7,5105 кл/г породы – принадлежала ал канотрофам песчаника при температуре in situ. Наибольшая численность среди микроорганизмов аргиллита, также принадлежала алканотрофам при 37 °C и равнялась 4,0104 кл/г. Доминирующее положение алканотрофов подтверждает и тот факт, что доля культивируемых при 37 °C УОБ, как пес чаника (5%), так и аргиллита (0,3%), была максимальной, по сравнению с ос тальными группами микроорганизмов (рис. 3).
А Песчаник Б Аргиллит lg N lg N ВОБ Ацет. СРБ МОБ УОБ ЦРБ Брод. ВОБ Ацет. СРБ МОБ УОБ ЦРБ Брод.
Группы микроорганизмов Группы микроорганизмов рассчитаная на основе анализа биомаркеров в липидных профилях пород определенная методом высева керна в лабораторные среды при 37 °C Рис. 3. Численность микроорганизмов эколого-трофических групп песчаника (А) и аргиллита (Б) В порядке убывания численности, группы культивируемых при темпе ратуре in situ микроорганизмов, как песчаника, так и аргиллита, располага лись в ряд: алканотрофы олиготрофы копиотрофы бродильщики ВОБ МОБ метаногены. Численность СРБ, изолированных лишь из аргиллита, была близка NМОБ обеих пород – порядка 100 кл/г. ЦРБ в песчанике и мета ногены в аргиллите обнаружены в следовых количествах. В общем, ЦРБ яв ляются минорным компонентом исследуемых пород, что согласуется с гео химической обстановкой: целлюлоза – ростовой субстрат для ЦРБ – присут ствует в породах в остаточном количестве.
Значения интенсивности метаногенеза в образцах песчаника и аргил лита свидетельствуют об аборигенности выделенных метаногенов. Интен сивность гетеротрофного метаногенеза в песчанике при 28, 37 и 60 °С нахо дилась примерно в одном диапазоне величин: 0,02–0,092 нмоль СН4/см сут. Максимальное ее значение – 0,092 нмоль СН4/см330 сут – зафиксиро вали при температуре in situ. Активность АМБ аргиллита была выявлена только при 37 °С на уровне 0,070 нмоль СН4/см330 сут. Активность АМБ песчаника, а также ГМБ аргиллита, была тем больше, чем выше была темпе ратура выделения. Для АМБ она в целом варьировала в пределах от 0,030 до 0,160, для ГМБ – от 0,019 до 0,152 нмоль СН4/см3 30 сут. Таким образом, метаногены песчаника и аргиллита адаптированы, как к температуре гори зонта – 37 °С, – так и к более высоким температурам, вплоть до 60 °С.
3. Характеристика и оценка адаптивных свойств изолятов культивируемых микроорганизмов Из образца песчаника было выделено 70 изолятов микроорганизмов в виде колоний на агаризованных средах, из пробы аргиллита – 43 изолята.
Среди них, одна культура, изолированная из пробы аргиллита, содержала грамотрицательные палочки, 62 культуры песчаника и 35 – аргиллита – грамположительные спорообразующие палочки. Один изолят песчаника был представлен грамположительными кокками, 7 изолятов песчаника и 8 – ар гиллита – грамположительными неспорообразующими палочками.
По способности пересеваться на свежую питательную среду, все изо ляты, выделенные из обеих пород, поделили на 3 группы: 1) многократно пересеваемые – большая часть изолятов (96 культур), бактерии в которых являлись спорообразующими палочками, и два штамма неспорообразующих бактерий;
2) плохо пересеваемые – 4 изолята, представленные бесспоровыми палочками;
3) совсем непересеваемые – 11 изолятов неспорообразующих и один – спорообразующих – палочковидных бактерий. Этот факт свидетель ствует о неполноте наших знаний о специфических пищевых потребностях микроорганизмов в условиях подземной среды, а, в целом, это обстоятельст во часто сопровождает работу по выделению культивируемых микроорга низмов из природной среды (Андреева и др., 2001;
Cho, Giovannoni, 2004).
В реконструированных бактериоценозах песчаника и аргиллита доминиро вали грамположительные неспорообразующие бактерии. Поэтому мы прове ли идентификацию пересеваемых штаммов неспорообразующих бактерий, изолированных из кернов обеих пород. По липидным профилям и феноти пическим признакам культуры ГП1 и МП2, изолированные из песчаника, были предварительно отнесены к группе нокардиоформных актиномицетов и р. Corynebacterium соответственно, а шт. ГА6, выделенный из аргиллита, – к р. Propionibacterium. ЖК маркеры указанных таксонов присутствовали в липидных профилях соответствующих пород. Не удалось идентифицировать шт. ПК37.4, представленный кокками, и шт. ГА2, содержавший грамотрица тельные палочки. Этот факт свидетельствует о присутствии в подземной биосфере микроорганизмов, которые не имеют аналогов среди бактерий, изолированных ранее из почвы и наземных сред обитания.
Все изоляты, независимо от температуры выделения, были способны к росту при 37 °C, что свидетельствует об их адаптации температурным усло виям исследуемых горизонтов. За исключением шт. ПК60.1, все изоляты песчаника и аргиллита, могли фиксировать N2, что важно, поскольку отсут ствие связанного азота считают фактором, лимитирующим функционирова ние подземных экосистем (Оборин и др., 2004).
Все культуры микроорганизмов, изолированные из пород, могли по треблять глюкозу и пропаново-бутановую смесь в качестве единственного источника углерода и энергии. За исключением 33% олиготрофных и 9% ко пиотрофных изолятов песчаника, полученных при 28 °C, все культуры мик роорганизмов были способны использовать гексадекан. Среди мезофильных изолятов песчаника все предложенные субстраты: глюкозу, пропан и бутан, гексадекан, керосин, растворитель (далее – смесь углеводородов), метанол, этанол, а также ацетат натрия,– потребляли 100% гексадеканокисляющих культур, выделенных при 28 и 37 °C, и копиотрофных – при 37 °C. Анало гичными свойствами обладали 100% изолятов аргиллита: пропан бутанокисляющих – выделенных при 28 °C, олиготрофных и копиотрофных – при 37 °C. Способность использовать предложенные субстраты была наи более высокой у гексадеканокисляющих изолятов песчаника.
Четыре алканотрофных, 17 олиготрофных и 11 копиотрофных изоля тов, выделенных из обеих пород, одновременно со спорообразующими бак териями содержали дрожжи. Количество таких смешанных культур, как и содержание биомаркера грибов – линолевой кислоты (18:2) – было больше в песчанике (26 изолятов и 346 нг/г), по сравнению с аргиллитом (6 изолятов и 175 нг/г). Сопоставляя способность изолятов использовать 8 органических субстратов, было установлено, что у смешанных культур (СК) она была вы ше, чем у чистых (ЧК). Например, среди пропан-бутанокисляющих изолятов, выделенных из обеих пород при 37 °C, несмотря на то, что все культуры ис пользовали 6 субстратов, смесь УВ потребляли 40% ЧК и 100% СК, а керо син – 60 и 75% соответственно. Кроме того, все олиготрофные культуры, изолированные из песчаника и аргиллита при 37 °C, росли в атмосфере про пана и бутана, на смеси УВ, керосине и глюкозе. Гексадекан и этанол ис пользовали 100% СК и лишь 83 и 67% ЧК, соответственно;
метанол и этанол потребляли 90,9% СК и только 83% ЧК. Можно полагать, что дрожжи имеют большое значение для существования бактерий в исследуемых осадочных породах. Известно, что дрожжи способны утилизировать большой спектр органических субстратов, в том числе вещества, присутствующие в иссле дуемых породах in situ – спирты и н-алканы (Кузнецов, Дубинина, 1989;
Бабьева, Чернов, 2004;
Shmitz et al., 2000). Продукты их метаболизма – лету чие ЖК, высшие спирты и др., могут быть источниками питания для сопут ствующих микроорганизмов. Дрожжи также могут повышать азотфикси рующую способность бактерий (Бабьева, Чернов, 2004). Олиготрофные СК не удалось разделить на отдельные штаммы бактерий и дрожжей. Возможно, они являются синтрофными группировками.
Таким образом, в исследованных осадочных породах наиболее жизне способными являются грамположительные спорообразующие палочковид ные бактерии. Они не являются специалистами по отношению к источникам углерода и обладают рядом адаптивных свойств для выживания в подземной среде: способностью к азотфиксации, росту при температуре пласта, споро образованию. Они могут развиваться за счет использования веществ, при сутствующих в породах in situ: углеводородов, спиртов, ацетата. Некоторые из этих бактерий получают дополнительные питательные вещества – экзоме таболиты дрожжей, – с которыми они образуют ассоциации.
4. Схема цикла углерода в осадочных породах, вскрытых ВПС- Первичными продуцентами в экосистемах осадочных пород, вскрытых ВПС-1, и представленных песчаником и аргиллитом, могут быть автотроф ные метаногены и СРБ, способные получать энергию и наращивать свою биомассу за счет веществ, присутствующих в исследуемых горизонтах – СО2, Н2, SO42- (Pedersen, 1997) – а также ВОБ, использующие СО2, Н2 и О (Кузнецов, Дубинина, 1989).
В начале пищевой цепочки стоят и алканотрофы, которые образуют органическое вещество (ОВ) за счет углеводородов (Оборин и др., 2004). На личие акцептора электронов для аэробных микроорганизмов – О2 – в поро дах глубоких горизонтов можно объяснить поступлением его из оксидов (Gold, 1992), притоком из вышележащих горизонтов и радиолизом воды (Гу цало, 1974;
Onstott et al., 2003). Алканотрофы не только ассимилируют не доступный другим микроорганизмам субстрат, но и могут поставлять, в ка честве экзометаболитов СО2, аминокислоты, а при лизисе клеток все необ ходимые для роста гетеротрофов компоненты – аминокислоты, пептиды, ли пиды, углеводы (Оборин и др., 2004). При недостатке кислорода разложение алифатических углеводородов бактериями сопровождается накоплением промежуточных продуктов – жирных кислот, начиная с пропионовой (Ив шина и др., 1987). Экзометаболит УОБ метанол может служить ростовым субстратом для анаэробных гетеротрофных метаногенов (Заварзин, Колоти лова, 2001). Все продукты жизнедеятельности УОБ могут быть использова ны анаэробными бродильщиками (Кузнецов, Дубинина, 1989).
Субстратом для брожения может быть и некоторая часть автохтонного ОВ, в том числе продукты лизиса клеток микроорганизмов и продукты бак териального гидролиза целлюлозы, входящей в РОВ пород. Такие продукты брожения, как спирты, ацетат и другие ЖК, в присутствии О2 окисляются аэробными гетеротрофами (олиготрофами, копиотрофами, МОБ) до СО2 и Н2О. В аэробных же условиях микробные экзометаболиты СО2 и Н2, наряду с ювенильными, могут использоваться ВОБ.
В анаэробных условиях биогенные СО2 и Н2, также как и абиогенные, потребляются автотрофными метаногенами, выявленными в кернах обеих пород, а также СРБ аргиллита при использовании сульфатов. Н2 различного происхождения, вместе с ацетатом или метанолом, может быть ростовым субстратом для гетеротрофных метаногенов (Кузнецов, Дубинина, 1989).
Н2 присутствует в порах песчаника, но отсутствует в порах аргиллита.
Таким образом, в поровое пространство более проницаемого песчаника по ступает больше ювенильного и биогенного Н2, чем в поры плотного аргил лита, где Н2 полностью утилизируется гидрогенотрофными бактериями. Их численность в песчанике выше, чем в аргиллите. Можно полагать, что имен но поступление Н2 определяет развитие и, следовательно, конкуренцию, зна чительной части микроорганизмов, получающих энергию при использова нии флюидов в исследованных породах: водородных бактерий, метаногенов, сульфатредукторов и ацетогенов.
В каждом биоценозе (Заварзин, 2004) формируется трофическая сеть, представленная уравновешенными ветвями продуцентов и деструкторов.
Условием устойчивости сообщества является определенная степень замкну тости циклов биогенных элементов, что позволит ему существовать неопре деленно долго за счет поступающей извне энергии. Определяющий фактор автономности подземных экосистем (Morita, 2000;
Pedersen, 1997) – это воз можность микробиоты осуществлять первичную продукцию in situ, т. е. не зависимо от процессов фотосинтеза. В песчанике и аргиллите, вскрытых ВПС-1, есть, как продуценты, так и гетеротрофные микроорганизмы, спо собные использовать РОВ и микробные экзометаболиты. Таким образом, в осадочных породах венда Московской синеклизы, присутствуют микроорга низмы, обладающие адаптивными свойствами для существования в подзем ной среде. Их биогеохимическая активность способствует функционирова нию в настоящее время цикла углерода, который во многом определяется параметрами флюидопроницаемости пород.
Выводы:
1. По результатам анализа биомаркеров в липидных профилях осадоч ных пород венда Московской синеклизы обнаружены эколого-трофические группы микроорганизмов цикла углерода. Они могут развиваться за счет уг лерода флюидов (водородные бактерии, метаногены, сульфатредукторы, ме танолокисляющие бактерии, алканотрофы), либо за счет рассеянного орга нического вещества пород (целлюлозоразлагающие бактерии, бродильщики, олиготрофы, копиотрофы).
2. Доминирующую эколого-трофическую группу осадочных пород, вскрытых ВПС-1, по результатам посевов, составляют углеводородокис ляющие микроорганизмы. Культивируемые микроорганизмы в порядке убы вания численности при температуре in situ располагаются в ряд: алканотро фы олиготрофы копиотрофы бродильщики водородные бактерии метанолокисляющие бактерии метаногены.
3. Наиболее адаптированными к условиям изученных глубоких гори зонтов являются грамположительные спорообразующие палочковидные бак терии, способные к азотфиксации, росту при температуре пласта за счет ис пользования присутствующих в породах абиогенных углеводородов, био генных спиртов и ацетата. Некоторые из этих бактерий получают дополни тельные питательные вещества за счет ассоциации с дрожжами.
4. Обнаружившие активность микроорганизмы могут осуществлять в изученных горизонтах цикл углерода за счет продуцентов (автотрофных ме таногенов, сульфатредукторов, водородных бактерий и алканотрофов) и ре дуцентов (ацетокластических метаногенов, метанолокисляющих бактерий, целлюлозоразлагающих бактерий, бродильщиков, олиготрофов, копиотро фов).
5. Основным фактором, определяющим интенсивность цикла углерода в исследуемых горизонтах, является флюидопроницаемость пород.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК:
1. Шеховцова Н.В., Первушина К.А., Грибова И.С., Осипов Г.А. Мик роорганизмы в осадочных породах, вскрытых Высоковской скважиной // Не дра. Разведка и охрана недр. – 2007. – №4. – С. 49–51.
Другие научные работы:
2. Первушина К.А., Шеховцова Н.В. Об экологических особенностях микроорганизмов в породах глубоких горизонтов земной коры // Структура, вещество, история литосферы Тимано-Североуральского сегмента: Материа лы XI науч. конф. – Сыктывкар, 2002. – С. 148–150.
3. Шеховцова Н.В., Первушина К.А. Об исследовании углеводородо кисляющих микроорганизмов геологической среды Высоковской скважины // Биология, экология, химия, безопасность жизнедеятельности: Материалы всеросс. науч. конф. – Ярославль, 2003. – С. 46–49.
4. Первушина К.А., Шеховцова Н.В. Выделение углеводородокисляю щих микроорганизмов из осадочных пород глубоких горизонтов земной ко ры // Структура, вещество, история литосферы Тимано-Североуральского сегмента: Материалы XII науч. конф. – Сыктывкар, 2003. – С. 200–202.
5. Первушина К.А., Кувшинова М.А., Шеховцова Н.В. Изучение алка нотрофных микроорганизмов пород, вскрытых Высоковской скважиной // Биоразнообразие Верхневолжья: состояние и проблемы сохранения: Мате риалы науч.-практ. конф. – Ярославль, 2004. – С. 167–172.
6. Первушина К.А., Шеховцова Н.В., Кувшинова М.А. Подпочвенные экосистемы осадочных пород глубоких горизонтов земной коры // Эколого биологические проблемы бассейна Каспийского моря: Материалы VIII межд.
науч. конф. – Астрахань: Астраханский ун-т, 2005. – С. 134–135.
7. Первушина К.А. Микроорганизмы цикла углерода в осадочных по родах глубоких горизонтов земной коры // Рациональное природопользова ние: Материалы всеросс. конф. – Ярославль: ЯрГУ, 2005. – С. 152–156.
8. Первушина К.А., Кувшинова М.А., Шеховцова Н.В. Аэробные гете ротрофные микроорганизмы осадочных пород, вскрытых Высоковской скважиной // Современные проблемы биологии, экологии, химии: Сб. науч.
тр. – Ярославль: ЯрГУ, 2005. – С. 30–34.
9. Первушина К.А., Шеховцова Н.В., Осипов Г.А. Изучение микроор ганизмов, использующих газы в породах глубоких горизонтов стратисферы // Экологические проблемы уникальных природных и антропогенных ланд шафтов: Материалы всеросc. науч. конф. – Ярославль: ЯрГУ, 2006. – С.182– 188.
10. Первушина К.А., Шеховцова Н.В. Углеводородокисляющие мик роорганизмы в осадочных породах глубоких горизонтов земной коры // Нау ка. Образование. Молодежь: Материалы IV всеросc. науч. конф. – Майкоп:
АГУ, 2007. – Часть 2. – С. 140–143.
11. Первушина К.А., Шеховцова Н.В., Новожилов В.Е., Осипов Г.А.
Микроорганизмы цикла углерода в осадочных породах глубоких горизонтов земной коры в пределах Московской синеклизы // Современные направления теоретических и прикладных исследований ‘2007: Сб. науч. тр. по материа лам межд. науч.-практ. конф. – Одесса: Черноморье, 2007. – Т. 20. Биология.
Сельское хозяйство. – С. 14–22.