Эпидемиологическое и молекулярно-генетическое исследование нейрофиброматоза i типа в республике башкортостан
На правах рукописи
МУСТАФИН РУСТАМ НАИЛЕВИЧ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОФИБРОМАТОЗА I ТИПА В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН 03.02.07 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2012 2
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Хуснутдинова Эльза Камилевна
Официальные оппоненты: Мустафина Ольга Евгеньевна доктор биологических наук, профессор Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН зав. лабораторией физиологической генетики Спицын Виктор Алексеевич доктор биологических наук, профессор ГУ Медико-генетический научный центр РАМН зав. лабораторией экологической генетики
Ведущая организация: ГБОУ ВПО национальный «Российский исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита диссертации состоится «_» апреля 2012 г. в «_» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: 450054, г. Уфа, просп. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН, по адресу: 4500г. Уфа, просп. Октября, 71, с авторефератом – на сайте: ibg.anrb.ru/dissov.html, e-mail: [email protected], [email protected]
Автореферат разослан «» марта 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Бикбулатова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Нейрофиброматоз I типа (НФ1) – аутосомно-доминантное заболевание с синдромом опухолевой предрасположенности тканей нейроэктодермального генеза, встречающееся с частотой 1:3500 населения в мире (Rasmussen et al., 2000;
Vandenbroucke, 2004;
Johannessen et al., 2005;
Ismat et al., 2006;
Jeong et al., 2006;
Hawes et al., 2007;
McDaniel et al., 2008;
Boyd et al., 2009;
Ponti et al., 2011). Примерно в 50% случаев болезнь развивается в результате мутаций de novo (D’Angelo et al., 2006;
Шнайдер, 2007;
Ponti et al., 2011). Основные клинические признаки НФ1: нейрофибромы, пигментные пятна на коже (CALM), гамартомы радужной оболочки глаза, глиомы зрительных нервов, когнитивные нарушения и костные дисплазии. Больные подвержены повышенному риску развития миелолейкоза и злокачественных опухолей из оболочек периферических нервов (MPNST) (Jeong et al., 2006;
Bottillo et al., 2007;
Gregorian et al., 2009;
Chen et al., 2010).
НФ1 возникает в результате мутаций в гене нейрофиброматоза I типа (NF1), локализованного на 17q11.2 (Upadhyaya et al., 1990;
Le et al., 2007).
Продукт гена NF1, белок нейрофибромин, функционирует в качестве онкосупрессора с негативной регуляцией активации прото-онкогена р21-ras. В базе данных генных мутаций человека (The Human Gene Mutation Database at the Institute of Medical Genetics in Cardiff, 2010) зарегистрировано более различных мутаций в гене NF1, расположенных практически во всех экзонах.
«Горячих точек» мутагенеза не выявлено (Rasmussen et al., 2000;
Горбунова и др., 2004). У 95% больных обнаруживаются внутригенные мутации, у 5% – делеции протяженного участка, включающего NF1 с соседними генами (Kluwe et al., 2004;
De Raedt et al., 2006;
Pasmant et al., 2009;
Sabbagh et al., 2009).
Описаны также случаи НФ1, обусловленные цитогенетическими перестройками, затрагивающими критический хромосомный сегмент 17q11. (Шнайдер, 2007). Несмотря на открытие огромного количества изменений в гене NF1, большинством исследователей не выявлено гено-фенотипических корреляций, за исключением случаев с делециями всего гена. Широкая вариабельность фенотипа, даже у больных с идентичной мутацией, говорит о вовлечении других факторов в детерминацию клинических проявлений, выявление которых имеет большое значение для разработки терапевтических моделей болезни (Rasmussen et al., 2000;
Kluwe et al., 2004;
Le et al, 2007;
Sabbagh et al., 2009).
Благодаря применению молекулярно-генетических методов стало возможным описание случаев НФ1 со стертым течением без кожных и плексиформных нейрофибром (Upadhyaya et al., 2007) и атипичной клиникой, проявляющейся исключительно опухолями спинного мозга (Kaufmann et al., 2001), а также мозаичной формы без четких клинических проявлений (Kaplan et al., 2010).
Молекулярно-генетическое изучение нейрофиброматоза типа в I Республике Башкортостан не проводилось. Наши исследования, (РБ) направленные на выявление первичного генетического дефекта, являются необходимыми для проведения ДНК-диагностики НФ1 в отягощенных семьях.
Цель работы:
Изучение эпидемиологических и молекулярно-генетических особенностей нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан.
Задачи исследования:
1. Определить территориальные особенности распространения нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан.
2. Дать клиническую характеристику больных нейрофиброматозом I типа.
3. Создать банк ДНК больных нейрофиброматозом I типа и членов их семей.
4. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене NF у больных нейрофиброматозом I типа.
5. Провести анализ микросателлитных локусов маркеров 1int/STR(TCCA)n, и диаллельных IVS27AC28.4, D17S2237 (GXAlu), IVS38TG53. полиморфных вариантов rs1801052, rs2066736, rs9894862 в гене NF1 в семьях с нейрофиброматозом I типа.
6. Провести анализ корреляций обнаруженных мутаций в гене NF1 с клиническими проявлениями заболевания.
Научная новизна. Впервые дана эпидемиологическая характеристика нейрофиброматоза типа в Республике Башкортостан с учетом I административно-территориальной и этнической подразделенности населения региона. Впервые проведено исследование структурных изменений в гене NF у больных НФ1 из РБ, при этом выявлено 7 мутаций, ранее не описанных в литературе: с.1278GA с.1570GA (p.Trp426Х), (p.Glu541Lys), с.1973_1974delTC с.3526_3528delAGA (р.Leu658ProfsX10), (p.Arg1176del), с.3826delC с.4514+5GA, (р.Arg1276GlufsX8), c.5758_5761delTTGA (p.Leu1920AsnfsX7), а также 2 полиморфных варианта с.1674TC (p.Ile558Ile), с.7584AG (p.Ser2528Ser). Проведен подробный анализ гено-фенотипических корреляций у больных с идентифицированными мутациями.
Научно-практическая значимость. Полученные данные расширяют представление о молекулярно-генетических основах развития нейрофиброматоза I типа. В связи с трудностью выявления мутаций в гене NF1, пренатальная диагностика НФ1 в Республике Башкортостан до проведения настоящего исследования была невозможна. На основании полученных нами результатов создана пополняемая база данных мутаций больных НФ1 из РБ, которая позволяет проводить пренатальную диагностику данного заболевания в семьях с нейрофиброматозом I типа. Наша работа служит основой для дальнейшего усовершенствования ДНК-диагностики НФ1, оптимальной для РБ, и внедрения в практику медико-генетической консультации при ГУЗ «Республиканский перинатальный центр» РБ, медицинских диагностических центров и лечебных учреждений республики.
Полученные данные исследования могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Международной конференции европейского общества генетиков человека (Амстердам, 2011), II Всероссийской школе-семинаре «Биомика – наука XXI века» (Уфа, 2011), конференции «Актуальные вопросы онкогенетики» (Москва, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы (175 источников). Иллюстративный материал содержит рисунков и 8 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для проведения эпидемиологических исследований использована база данных по больным нейрофиброматозом I типа, состоящим на учете в медико генетической консультации при ГУЗ «Республиканский перинатальный центр» РБ и членов их семей за 40-летний период. Карта территориальной распространенности НФ1 в РБ построена с помощью пакета программы ArcViewGISv.3.0.
В качестве материала для молекулярно-генетических исследований были использованы образцы ДНК 69 больных с установленным клиническим диагнозом «нейрофиброматоз I типа» из 56 семей из Республики Башкортостан и 50 их родственников. В качестве контроля использовалась ДНК здоровых индивидов (n=50).
Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции 1984). Поиск изменений (Mathew, нуклеотидной последовательности в гене NF1 проводили методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP) с щелочной и температурной денатурацией Использованы (Orita et al., 1989).
олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие экзоны и прилегающие интронные области, подобранные с помощью программы Primer Select 5.05 из пакета DNASTAR (1993-2002). После денатурации образцы наносили на 8% полиакриламидный гель (ПААГ) с глицерином;
электрофорез проводили при температуре 4-25°C при напряжении 100 вольт в течение 40 часов. Гель окрашивали 0,09% раствором азотнокислого серебра. Анализ образцов осуществляли по критерию присутствия или отсутствия дополнительных полос по сравнению с контрольной ДНК (норма). Определение последовательности нуклеотидов у образцов с измененной подвижностью однонитевой ДНК проводили с помощью автоматического секвенатора ABI PRISM 3100 («Applied Biosystems») с использованием набора для флюорисцентного мечения DYEnamicTM ET, согласно протоколу фирмы-производителя («Amersham Pharmacia Biotech» DYEnamicTM ET Terminator Cycle Sequencing Kit). Для «прочтения» последовательности нуклеотидов использовали приложение BioEdit v.5.0.9. (1997-2001), для анализа полученных результатов – MegAlign из пакета программ DNAStar Inc (1993-2002).
С целью выявления протяженных делеций гена NF1 проведен анализ семи внутригенных полиморфных локусов. При анализе четырех микросателлитных маркеров: STR(TCCA)n в интроне 1, IVS27AC28.4 в интроне 27a, D17S2237 (GXAlu) в интроне 27b, IVS38TG53.0 в интроне 38, образцы наносили на 8% полиакриламидный гель (ПААГ) с последующей окраской 0,09% раствором AgNO3. Детекцию полиморфного варианта rs проводили методом ПДРФ-анализа/RsaI, образцы инкубировали при 37°C в течение 12 часов, с последующим их нанесением на 7% ПААГ, гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Генотипирование локусов rs2066736 и rs проводили методом SSCP.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Эпидемиология нейрофиброматоза I типа в Республике Башкортостан В Республике Башкортостан на учете в медико-генетической консультации состоит 238 больных НФ1 из 192 семей. Распространенность нейрофиброматоза I типа в РБ составила в среднем 4,7 на 100000 населения, тогда как среднемировая распространенность НФ1 – 28 на 100000 населения (Rasmussen et al., 2000;
Johannessen et al., 2005;
Ismat et al., 2006;
Bottillo et al., 2007;
Chen et al., 2010;
Ponti et al., 2011).
Заболевание зарегистрировано в 38 из 54 административных районов и в 18 из 21 города республики. Минимальные показатели распространенности (менее 3 на 100000 населения) выявлены в городе Ишимбай;
Абзелиловском и Баймакском районах;
наивысшие показатели (более 13 на 100000 населения) – в Мишкинском и Нуримановском районах (рис. 1). Соотношение между долей больных среди жителей городов к доле больных среди сельских жителей, а также между долей больных мужского и женского пола не достигает статистически значимой разницы.
Распределение больных НФ1 по этническому составу в РБ оказалось следующим: татары – 31,9%, русские – 20,7%, башкиры – 14,8%, марийцы – 6%, чуваши – 3%, немцы – 1,5%, мордва – 1,5%, белорусы – 0,7%, украинцы – 0,7%. 19,2% больных НФ1 составили метисы.
Выяснение семейного анамнеза с последующим уточнением клинических признаков и составлением родословных проводилось во всех 192 семьях. На основании этих данных для 45% больных НФ1 определены семейные случаи заболевания (наследование от матери – 25%, от отца – 20%), в 55% случаях диагноз установлен только у одного члена семьи.
Рис. 1. Распространенность НФ1 в Республике Башкортостан.
Клиническая характеристика больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан При анализе клинических проявлений нейрофиброматоза I типа в РБ с оценкой возраста манифестации, первых симптомов, характеристики проявлений болезни по основным и дополнительным признакам, выявлены определенные особенности (табл. 1).
Нейрофибромы определены только у 58% пациентов, это может быть обусловлено тем, что возраст последнего обследования у 64% пациентов составлял младше 20 лет, у 29% – младше 10 лет. Тогда как нейрофибромы диагностируются у 95% больных НФ1 после 30 лет.
Таблица Сравнительная клиническая характеристика больных НФ1 из Республики Башкортостан с данными мировых исследований Клинический признак Частота встречаемости у Частота встречаемости у больных НФ1 в РБ, % больных НФ1 в мире, % CALM 90 Нейрофибромы 58 Низкий рост 18 Скелетные аномалии 28 Сколиоз 19 12- Псевдоартроз 2 Когнитивные нарушения 20 30- (North, 2000;
Ebinger, 2005;
Stevenson et al., 2006;
Boyd et al., 2009) У больных, наследовавших НФ1 от матери нами прослежено утяжеление клинической картины заболевания по четким клиническим признакам (табл. 2).
Таблица Сравнительная клиническая характеристика больных НФ1 из Республики Башкортостан в зависимости от наследования Клинический Частота Частота Частота признак встречаемости у встречаемости у встречаемости у больных со больных с больных с спорадическим наследованием наследованием НФ случаем НФ1, % НФ1 от отца, % от матери, % Низкий рост 7 16 Сколиоз 16 22 Псевдоартроз 1 - Когнитивные 15 22 нарушения Развитие осложнений нейрофиброматоза I типа у больных из РБ значительно отличается от данных по миру (табл. 3).
Таблица Сравнительная оценка осложнений, выявленных у больных НФ1 из Республики Башкортостан, относительно мировых статистических данных Осложнения Частота встречаемости у Частота встречаемости у больных НФ1 в РБ, % больных в мире, % Опухоли ЦНС 4 Глиомы зрительных 2 7 – нервов Гидроцефалия 3 Плексиформные 2 нейрофибромы Кисты головного мозга 1,7 1 – MPNST - 5 – (Rasmussen et al., 2000;
Gregorian et al., 2009;
Melean et al., 2010;
Бочков, 2011) При оценке клинических проявлений НФ1 больных из РБ по степени тяжести, у 54% пациентов диагностировано тяжелое течение заболевания, у 46% – средней тяжести и легкое.
Поиск мутаций в гене NF1 у больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан Нами проведен поиск мутаций в 42 экзонах гена NF1 у 69 больных с установленным клиническим диагнозом «нейрофиброматоз I типа» из 56 семей, проживающих на территории Республики Башкортостан и их родственников. Как контроль использовалась ДНК здоровых индивидов (n=50).
В качестве основного метода поиска мутаций нами был использован метод SSCP (Orita et al., 1989). Обнаруженные при SSCP-анализе образцы с измененной, по сравнению с контролем, подвижностью одноцепочечной ДНК, в дальнейшем исследовались с помощью метода секвенирования.
В результате исследования выявлено 18 типов изменений подвижности однонитевых фрагментов ДНК в 18 экзонах и прилегающих к ним интронных областях. Секвенирование образцов с измененной подвижностью позволило идентифицировать 10 различных мутаций (табл. 4) и 8 однонуклеотидных полиморфных вариантов (SNP) (табл. 5).
Таблица Спектр мутаций в гене NF1 у больных НФ1 из Республики Башкортостан Образец Мутация Локали- Изменение Тип № зация аминокислотной наследования последовательности от отца 29. с.1278GA 10a экзон p.Trp426Х 29.2 от матери 39. с.1570GA 10с экзон p.Glu541Lys 39.1 с.1973_1974 12b экзон р.Leu658ProfsX10 спорадический 46. delTC от матери 48. с.2991-1GC мутация сайта 48.1 17 интрон сплайсинга спорадический 51. от матери 43. с.3526_ 21 экзон от отца 45.0 p.Arg1176del delAGA 45.2 с.3826delC 22 экзон р.Arg1276GlufsX8 спорадический 25. с.4514+5GA мутация сайта от отца 47.0 интрон сплайсинга с.4537СТ 27a экзон спорадический 16.0 p.Arg1513Х 31 экзон от отца 44.0 c.5758_5761 p.Leu1920AsnfsX delTTGA с.6792СA 37 экзон спорадический 35.0 p.Tyr2264X Таблица Полиморфные варианты в гене NF1 у больных НФ из Республики Башкортостан.
Полиморфный вариант Локализация Эффект изменения Частота, % с.1674TC 11 экзон p.Ile558Ile 1, с.2851-16TC, rs17880825 16 интрон однонуклеотидная 5, замена в интроне 20 интрон однонуклеотидная c.3496+33CА, rs2066736 замена в интроне с.3974+38 TG, rs9894862 23-1 интрон однонуклеотидная замена в интроне с.4368-46GC, rs17881285 25 интрон однонуклеотидная 2, замена в интроне с.5172GA, rs17887014 28 экзон p.Lys1724Lys 4, с.7584AG 43 экзон p.Ser2528Ser 1, с.8050+20GA, rs55747230 46 интрон однонуклеотидная 1, замена в интроне В экзоне 10а гена NF1 обнаружена нонсенс-мутация с.1278GA у двух больных из одной семьи татарской этнической (p.Trp426Х) принадлежности (рис. 2). У пробанда женского пола, №29.0, очаговые кожные нейрофибромы больших размеров, CALM, сколиоз II степени. У отца пробанда, № 29.2, множественные кожные и подкожные нейрофибромы, CALM.
с.1278GA (p.Trp426Х) Рис. 2. Идентификация мутации с.1278GA (p.Trp426Х) в гене NF1.
В экзоне гена выявлена миссенс-мутация с.1570GA 10с NF (p.Glu541Lys) у двух больных НФ1 из одной семьи русской этнической принадлежности (рис. 3). У пробанда мужского пола, № 39.0, множественные CALM, задержка физического и умственного развития тяжелой степени. У матери пробанда, № 39.1, очаговые кожные нейрофибромы, множественные CALM.
с.1570GA (p.Glu541Lys) Рис. 3. Идентификация мутации с.1570GA (p.Glu541Lys) в гене NF1.
В экзоне гена обнаружена делеция с.1973_1974delTC 12b NF (р.Leu658ProfsX10) у одного больного башкирской этнической принадлежности со спорадическим случаем заболевания (рис. 4). У пробанда № 46.0, мужского пола, множественные CALM, плексиформная нейрофиброма области шеи с прорастанием в кости черепа и позвоночник.
с.1973_1974delTС р.Leu658ProfsX Рис. 4. Идентификация мутации с.1973_1974delTC (р.Leu658ProfsX10) в NF1.
В интроне 17 гена NF1 обнаружена известная ранее мутация сайта сплайсинга с.2991-1GC у 3-х больных из 2-х неродственных семей (рис. 5). В одной семье у 2-х больных башкирской этнической принадлежности: у пробанда мужского пола, № 48.0, очаговые кожные нейрофибромы, CALM, острый лимфолейкоз с 3 лет;
у матери пробанда, № 48.1, множество кожных и подкожных нейрофибром, CALM. В другой семье татарской этнической принадлежности у пробанда мужского пола, № 51.0, со спорадическим случаем заболевания, единичные нерофибромы области шеи, CALM. Мутация с.2991 1GC выявлена ранее у 3-х больных в Германии (Fahsold et al., 2000).
с.2991-1GC Рис. 5. Идентификация мутации с.2991-1GC в гене NF1.
В экзоне гена выявлена делеция с.3526_3528delAGA 21 NF (p.Arg1176del) у 3-х больных из 2-х неродственных семей (рис. 6). В одной семье у 2-х больных русской этнической принадлежности у пробанда мужского пола, № 45.0, множественные CALM, врожденная гидроцефалия, эпилепсия;
у отца пробанда, № 45.2, множественные подкожные нейрофибромы, CALM. В другой семье русской этнической принадлежности у пробанда мужского пола, № 43.0, с наследованием мутантного аллеля от матери, диагностированы задержка умственного развития, низкий рост, CALM, очаговые подкожные нейрофибромы, компенсированная гидроцефалия.
с.3526_3528delAGA (p.Arg1176del) Рис. 6. Идентификация мутации с.3526_3528delAGA (p.Arg1176del) в NF1.
В экзоне 22 гена NF1 обнаружена делеция с.3826delC (р.Arg1276GlufsX8) у одного больного, метиса (татарин/башкир), со спорадическим случаем заболевания (рис. 7). У пробанда мужского пола, № 25.0, диагностированы множественные подкожные нейрофибромы, в том числе больших размеров, множественные СALM. При проведении МРТ головного мозга у пациента выявлено объемное образование в области миндалины мозжечка.
с.3826delC р.Arg1276GlufsX Рис. 7. Идентификация мутации с.3826delC (р.Arg1276GlufsX8) в гене NF1.
В интроне 26 гена NF1 обнаружена мутация сайта сплайсинга с.4514+5GA (рис. 8) у одной больной русской этнической принадлежности с наследованием мутантного аллеля от отца. У пробанда № 47. диагностированы множественные СALM и характерные для НФ1 очаги Т2 взвешенной гиперинтенсивности при проведении МРТ головного мозга.
с.4514+5GA Рис. 8. Идентификация мутации с.4514+5GA в гене NF1.
В экзоне 27а гена NF1 обнаружена известная ранее нонсенс-мутация с.4537СТ у одной больной татарской этнической (p.Arg1513Х) принадлежности со спорадическим случаем заболевания (рис. 9). У пробанда № 16.0 множественные кожные и подкожные нейрофибромы небольших размеров, CALM. Мутация с.4537СT описана ранее у больных в Германии (Fahsold et al., 2000), Бельгии (Messiaen et al., 2000), Корее (Jeong et al., 2006) и Испании (Ars et al., 2000).
с.4537СТ (p.Arg1513Х) Рис. 9. Идентификация мутации с.4537СТ (p.Arg1513Х) в гене NF1.
В экзоне гена выявлена делеция 31 NF1 c.5758_5761delTTGA (p.Leu1920AsnfsX7) у одной больной, № 44.0, метиса (русская/татарка), с наследованием мутантного аллеля от отца (рис. 10). У пробанда очаговые кожные нейрофибромы в области грудной клетки, CALM, сколиоз II степени.
c.5758_5761delTTGA (p.Leu1920AsnfsX7) Рис. 10. Идентификация мутации c.5758_5761delTTGA (p.Leu1920AsnfsX7) в гене NF1.
В экзоне 37 гена NF1 обнаружена описанная ранее нонсенс-мутация с.6792СA у одной больной башкирской этнической (p.Tyr2264X) принадлежности со спорадическим случаем заболевания (рис. 11). У пробанда № 35.0 множественные CALM, ложный сустав голени, гидроцефалия. Мутация с.6792СA ранее выявлена у больных НФ1 в Испании (Ars et al., 2000), Германии (Fahsold et al., 2000), Бельгии (Messiaen et al., 2000) и Корее (Jeong et al., 2006).
с.6792СA (p.Tyr2264X) Рис. 11. Идентификация мутации с.6792СA (p.Tyr2264X) в гене NF1.
Таким образом, нами идентифицированы внутригенные мутации в гене NF1 у 23% исследованных больных НФ1 из РБ. При сопоставлении выявленных мутаций с клиническими проявлениями болезни гено фенотипических корреляций не обнаружено.
Идентификация протяженных делеций гена NF1 у больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан С целью выявления протяженных делеций гена NF1 проведен анализ микросателлитных локусов STR(TCCA)n в интроне 1, IVS27AC28.4 в интроне 27, D17S2237 (GXAlu) в интроне 27b, IVS38TG53.0 в интроне 38 и диаллельных полиморфных вариантов rs1801052 в экзоне 5, rs2066736 в интроне 20, rs9894862 в интроне 23-1 у 69 больных НФ1 из РБ, проживающих на территории Республики Башкортостан и 50 их родственников.
В результате проведенного исследования было выявлено два пробанда, гомозиготных по всем анализируемым маркерам. У пробанда № 3.0, женского пола, метиса (русская/татарка), со спорадическим случаем заболевания, врожденная гидроцефалия множественные (прооперирована), CALM, подкожные нейрофибромы, отставание в физическом и умственном развитии, сколиоз III степени. У пробанда № 52.0, женского пола, татарской этнической принадлежности, со спорадическим случаем заболевания, диагностированы плексиформная нейрофиброма, множественные подкожные CALM, нейрофибромы, дизморфизм лица, поперечные ладонные складки.
Таким образом, делеции протяженного участка гена NF1 обнаружены у 3% исследованных больных НФ1 из РБ. У данных больных определено тяжелое течение заболевание с развитием осложнений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Эпидемиологическое исследование нейрофиброматоза типа в I Республике Башкортостан выявило распространенность заболевания на уровень ниже, чем в среднем по миру. Распределение больных нейрофиброматозом I типа по этническому составу отражает демографическую ситуацию в республике.
При клиническом обследовании больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан выявлено более тяжелое течение заболевания при наследовании болезни от матери – у данных пациентов низкий рост, скелетные аномалии и задержка умственного развития диагностировались чаще. При анализе осложнений зафиксирована значительно более высокая частота развития опухолей головного мозга и низкая регистрация глиом зрительных нервов и плексиформных нейрофибром в сравнении с таковыми в мире.
Злокачественные опухоли из оболочек периферических нервов не диагностированы ни у одного больного. Более чем у 50% пациентов установлено тяжелое течение заболевания.
В результате анализа нуклеотидной последовательности 42 экзонов гена NF1 у 69 больных из 56 семей из Республики Башкортостан выявлено мутаций у 16 пациентов, что составило 23% в выборке больных. Мутации с.2991-1GC, с.4537СТ (p.Arg1513Х), с.6792СA (p.Tyr2264X) представлены в базе данных. Большинство идентифицированных мутаций приводят к укорочению белковой молекулы. При сопоставлении выявленных мутаций с клиническими проявлениями болезни гено-фенотипических корреляций не установлено, даже у членов одной и той же семьи. У больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан идентифицировано полиморфных вариантов, 2 из которых описаны впервые.
В результате проведенного анализа микросателлитных маркеров и D17S2237 (GXAlu), 1int/STR(TCCA)n, IVS27AC28.4, IVS38TG53. диаллельных полиморфных вариантов rs1801052, rs2066736, rs9894862 в семьях с нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан выявлены два неродственных пробанда, гомозиготных по всем маркерам, что является основанием для предположения о наличии у них протяженной делеции гена NF1. У данных больных отмечено тяжелое течение болезни с осложнениями.
ВЫВОДЫ Распространенность нейрофиброматоза типа в Республике 1. I Башкортостан составляет 4,7:100000 населения, что на порядок ниже среднемировой распространенности (28:100000 населения). Установлено неравномерное территориальное распределение заболевания по районам.
Выявлено 10 мутаций в гене NF1 у 16 пациентов, что составило 23% в 2.
выборке больных нейрофиброматозом I типа. Мутации с.1278GA с.1570GA с.1973_1974delTC (p.Trp426Х), (p.Glu541Lys), с.3526_3528delAGA с.3826delC (р.Leu658ProfsX10), (p.Arg1176del), с.4514+5GA, (р.Arg1276GlufsX8), c.5758_5761delTTGA (p.Leu1920AsnfsX7) описаны впервые.
Идентифицированы протяженные делеции гена NF1 у 3% обследованных 3.
больных нейрофиброматозом типа. У данных пациентов I диагностировано тяжелое течение заболевания.
Установлено, что у больных нейрофиброматозом типа 4. 45% I наследственная форма заболевания, у 55% – спорадические случаи. Из выявленных мутаций 8 являются уникальными для каждой семьи, из них 4 – спорадические случаи. Описанная ранее в литературе мутация с.2991 1GC обнаружена в двух неродственных семьях: со спорадическим случаем и с наследованием от матери. Мутация с.3526_3528delAGA (p.Arg1176del) выявлена в двух неродственных семьях: в одной семье – наследование от матери, в другой – от отца.
У больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан 5.
обнаружено 8 полиморфных вариантов в гене NF1, из которых с.1674TC (p.Ile558Ile) и с.7584AG (p.Ser2528Ser) описаны впервые.
Выявлено утяжеление течения нейрофиброматоза I типа по четким 6.
критериям у больных, наследовавших заболевание от матери.
Корреляции между типом мутации в гене NF1 и особенностями 7.
клинических проявлений у больных нейрофиброматозом I типа из Республики Башкортостан не выявлено.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Мустафин Р.Н., Бермишева М.А., Хуснутдинова Э.К. Клинико эпидемиологическое исследование нейрофиброматоза типа в Республике Башкортостан // Якутский медицинский журнал. 2009. № (26). С. 23–25.
2. Мустафин Р.Н., Бермишева М.А., Хуснутдинова Э.К. Комплексный подход в изучении особенностей нейрофиброматоза 1 типа // Креативная хирургия и онкология. 2012. № 1. С. 98–102.
3. Мустафин Р.Н., Бермишева М.А., Хуснутдинова Э.К. Особенности нейрофиброматоза 1 типа // Медицинская генетика. 2012. № 3. С. 3–16.
4. Мустафин Р.Н., Бермишева М.А., Хуснутдинова Э.К.
Эпидемиологическое и молекулярно-генетическое изучение нейрофиброматоза 1 типа в Республике Башкортостан // Медицинская генетика. Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков. 2010. Ростов-на-Дону. С. 122.
5. Mustafin R., Bermisheva M., Khusnutdinova E. Epidemiological and molecular genetic study of Neurofibromatosis type 1 in the Republic of Bashkortostan // European Human Genetics Conference. 2011. Amsterdam, Netherlands. P. 428.
6. Мустафин Р.Н., Бермишева М.А., Хуснутдинова Э.К. Клинико эпидемиологическое и молекулярно-генетическое изучение нейрофиброматоза 1 типа в Республике Башкортостан // Биомика.
Электронный журнал ИБГ УНЦ РАН. 2011. № 2. С. 86–88.
7. Мустафин Р.Н., Бермишева М.А., Хуснутдинова Э.К. Поиск мутаций в гене больных нейрофиброматозом типа в Республике NF1 Башкортостан // Медицинская генетика. Материалы конференции «Актуальные вопросы онкогенетики». 2011. С. 16–17.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ МРТ Магнитно-резонансная томография НФ1 Нейрофиброматоз I типа РБ Республика Башкортостан Пятна цвета кофе-с-молоком CALM Злокачественные опухоли из оболочек периферических MPNST нервов Ген нейрофиброматоза I типа NF SSCP Single strand conformation polymorphism (конформационный полиморфизм одноцепочечной ДНК) SNP Single-nucleotide polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм)