Эколого-биохимические аспекты протекторной функции селена в растениях при окислительном стрессе

На правах рукописи

Скрыпник Любовь Николаевна ЭКОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОТЕКТОРНОЙ ФУНКЦИИ СЕЛЕНА В РАСТЕНИЯХ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ 03.00.16 – экология 03.00.12 – физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Калининград - 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный университет имени Иммануила Канта».

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Чупахина Галина Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Гинс Валентина Карловна доктор химических наук Племенков Виталий Владимирович

Ведущая организация: Государственное учреждение Научно исследовательский институт питания Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится «_»_ 2009 года в часов на заседании диссертационного совета Д 212.084.04 при ФГОУ ВПО «Российский государственный университет имени Иммануила Канта» по адресу: 236040, Калининград, ул. Университетская, 2, ауд.143.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 236040, г. Калининград, ул.

Университетская, 2, факультет биоэкологии, кафедра ботаники и экологии растений;

e-mail: [email protected].

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного университета имени Иммануила Канта по адресу г. Калининград, ул. Университетская, 2.

Автореферат разослан «_»_ 20 года

Ученый секретарь диссертационного совета И. Ю. Губарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Селен относится к эссенциальным микроэлементам, необходимым для нормальной жизнедеятельности организма человека и животных. При этом в последнее время все большее внимание привлекает регуляторная роль селена в организме и, прежде всего, его антиоксидантные свойства. Селен входит в структуру активного центра фермента глютатионпероксидазы, участвуя таким образом в поддержании в клетке перекисного гомеостаза [Flohe et al., 2000;

Arthur 2000;

Племенков, 2007].

Различные исследования последних лет показали, что во многих северо- и среднеевропейских странах (Германии, Австрии, Финляндии, Дании, Норвегии) содержание селена в кормовых растениях ниже определенного минимального порога, гарантирующего достаточное поступление селена в организм животных и человека [Hoesch, 1999].

Данных о селеновом статусе культурных и кормовых растений Калининградской области представлено не было, но, исходя из ее географического положения, можно предположить наличие селенодефицита, поэтому исследование особенностей накопления селена является особенно актуальным, в том числе и с целью изучения возможности применения селеносодержащих удобрений для повышения обеспеченности данным микроэлементом растений, животных и человека.

Изучение поступления селена в растения и влияющих на это факторов имеет большое значение для раскрытия функций селена в растительных организмах. До недавнего времени считалось, что селен не является необходимым для растений микроэлементом, его признавали лишь «условно эссенциальным». Присутствие селена в растениях и способность аккумулировать его из сред служили лишь косвенными доказательствами необходимости этого микроэлемента для растительных организмов. Но исследования последних лет показали, что селену принадлежит важная роль в усилении адаптивного потенциала растений. Так, описано положительное действие селена на растения в условиях окислительного стресса, вызванного УФ-излучением [Hartikainen, Xue, 1999;

Xue, Hartikainen, 2000;

Pennenen et al., 2002], гербицидами и гипотермией [Seppaenen et al., 2003;

Прудников, 2007], старением растений [Xue et al., 2001;

Djanaguiraman et al., 2004, 2005], солевым стрессом [Kong et al., 2005]. Выявлено повышение урожайности некоторых растений при добавлении низких концентраций селена [Graham et al., 2005].

Протекторный эффект селена в растениях в условиях окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности и дефицитом цинка еще не изучался. Кроме того, остается малоисследованным вопрос о механизме защитного действия селена в растениях. В связи с вышеизложенным актуальным является исследование влияния селена на антиоксидантную систему растений: как на функционирование антиоксидантных ферментов, так и на накопление низкомолекулярных антиоксидантов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение экологических аспектов поступления микроэлемента селена и его влияния на некоторые биохимические показатели растений в условиях окислительного стресса. Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оптимизировать методику пробоподготовки растительного материала для последующего определения в нем селена. Сравнить эффективности фотометрического, флуориметрического и атомно абсорбционного методов определения селена.

2. Изучить динамику накопления селена ячменем на различных стадиях онтогенеза в зависимости от концентрации внесенной селеновой добавки и кислотности почвы.

3. Исследовать влияние микроэлемента селена на развитие окислительного стресса в растениях китайской капуты и ячменя, вызванного светом повышенной интенсивности и дефицитом в питательной среде цинка.

4. Исследовать действие селена на ферментативную антиоксидантную систему растений (на активность супероксиддисмутазы, каталазы, глютатионпероксидазы, аскорбатпероксидазы, дегидроаскорбатредуктазы) в условиях окислительного стресса.

5. Изучить влияние селена на накопление ряда низкомолекулярных антиоксидантных соединений (каротиноидов, антоцианов, аскорбиновой кислоты, рутина, рибофлавина, глютатиона) в растениях ячменя, выращенных при окислительном стрессе.

Научная новизна. Оптимизирована методика автоклавной минерализации растительного материала под давлением с целью последующего определения в нем селена. Впервые исследовано содержание селена в некоторых кормовых растениях различных районов Калининградской области. Изучена динамика накопления селена ячменем в процессе вегетации в зависимости от кислотности почвы и вносимой селеновой добавки, а также установлены оптимальные концентрации селена для накопления биомассы ячменем. Впервые исследовано влияние селена на устойчивость растений китайской капуты и ячменя к окислительному стрессу, вызванному светом высокой интенсивности и дефицитом цинка. Установлено положительное действие селена на активность ряда ферментов (супероксиддисмутазы, глютатионпероксидазы, каталазы, аскорбатпероксидазы и дегидроаскорбатредуктазы) и увеличение пула некоторых низкомолекулярных антиоксидантов (каротиноидов, аскорбиновой кислоты, глютатиона). Выявлена компенсаторная функция селена в защите растений от окислительного стресса при недостатке цинка.

Защищаемые положения:

1. В процессе онтогенеза общее содержание селена в ячмене увеличивается, но интенсивность его накопления растениями снижается.

2. Ответная реакция антиоксидантной системы (антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных антиоксидантов) растений зависит от характера стрессового воздействия.

3. Селен уменьшает негативные последствия окислительного стресса, вызванного дефицитом цинка и светом высокой интенсивности, за счет повышения антиоксидантного статуса растений.

Практическая значимость. Исследование накопления селена растениями ячменя, а также изучение его влияния на устойчивость растений китайской капусты и ячменя к окислительному стрессу, вызванному светом высокой интенсивности и дефицитом цинка, позволяют более полно раскрыть функции данного микроэлемента в растениях, и, тем самым, создают основу для использования селенсодержащих удобрений не только для повышения обеспеченности селеном растений, животных и человека, но и с целью увеличения урожайности растениеводческой продукции, особенно в условиях действия неблагоприятных экологических факторов.

Оптимизированная методика пробоподготовки растительного материала позволяет повысить точность количественного определения селена и сократить время анализа.

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры ботаники и экологии растений и кафедры медицинской экологии Российского государственного университета им. И. Канта, в курсах лекций «Экология растений», «Физиология растений», «Биохимия растений», «Витаминология», «Рациональное питание» а также на занятиях Большого практикума.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлялись на: II Всероссийской научно-практической конференции «Химическое загрязнение среды обитания и проблемы экологической реабилитации нарушенных экосистем» (Пенза, 2004);

научной конференции Калининградского государственного университета (Калининград, 2004);

Международном научно-практического семинаре «Новые энергосберегающие технологии в зоотехнии и ветеринарии» (Калининград, 2005);

научном семинаре Института минерального питания растений и почвоведения Университета г. Киль «Успехи в минеральном питании растений» (Киль, 2006);

V Российско-Германских Днях Экологии (Калининград, 2006);

Всероссийской научно-практической конференция «Общие проблемы мониторинга природных экосистем» (Пенза 2007);

V Международном конгрессе валеологов (Санкт-Петербург, 2007);

VII Международной научной конференции «Состояние биосферы и здоровье людей» (Пенза, 2007), V Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (г. Минск, 2007);

IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (г.

Новосибирск, 2008);

Международной научно-практической конференции «Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур.

Традиции и перспективы» (п. ВНИИССОК, Московская обл., 2008);

Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и практика: проблемы и перспективы» (г. Калининград, 2008).

Основные результаты доложены и обсуждены на заседаниях кафедры медицинской экологии РГУ им. И. Канта (2004, 2005, 2007, 2008 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, библиографического списка. Библиография представлена 369 источниками, из них 296 на иностранных языках. Общий объем работы составляет 169 страниц. Иллюстративный материал представлен 21 таблицами и 43 рисунками.

Благодарность. Автор благодарит за ценные советы, помощь и содействие в работе научного руководителя доктора биологических наук, профессора Чупахину Галину Николаевну и кандидата химических наук, доцента Куркову Татьяну Николаевну. Особая благодарность директору ФГУ «ЦАС «Калининградский» доктору сельскохозяйственных наук, профессору Владимиру Ильичу Панасину за предоставление растительных образцов кормовых растений и возможность проведения флуориметрического анализа селена. Отдельная благодарность доктору Йошке Герендашу за внимательное руководство работой в Институте питания растений и почвоведения университета г. Киль и профессору Хайнриху Голдбаху за помощь в организации вегетационного опыта в Институте питания растений университета г. Бонн.

Автор выражает глубокую благодарность Немецкому экологическому фонду (Deutsche Bundesstiftung Umwelt) за содействие и финансовую поддержку, без которой осуществление данной исследовательской работы было бы невозможно.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение Приводятся общие сведения о работе (актуальность темы, цели и задачи исследования, научная новизна, теоретическое и практическое значение).

Глава 1. Обзор литературы В главе представлен обзор исследований, посвященных изучению физиологической роли селена в живых организмах, особенностей его поступления и метаболизма в растениях. Приводятся работы, характеризующие степень изученности протекторной функции селена в растениях при окислительном стрессе. Дается обзор современных методов определения селена в объектах окружающей среды.

Глава 2. Объекты и методы исследования В качестве объектов исследования использовались растения ячменя обыкновенного (Hordeum vulgare L.) сортов Ria и Кишенев, китайской капусты (Brassica rapa var. chinensis) Пак Чой, а также сборы многолетних злаковых (смесь трав – Arrhenatherum elatius L., Bromopsis inermis L., Dactylis glomerata L., Festuca pratensis L., Phleum pratense L., Poa pratensis L.) и бобовых трав (смесь трав - Lathyrus pratensis L., Medicago falcata L., Melilotus albus L., Trifolium pratense L., Trifolium hybridum L., Vicia sepium L.), выращенных в Гурьевском, Краснознаменском, Полесском, Гвардейском, Багратионовском, Зеленоградском, Гусевском, Черняховском районах Калининградской области.

Для исследования накопления селена ячменем на различных стадиях онтогенеза в зависимости от внесенной в почву селеновой добавки, выращивание ячменя проводили в вегетационных сосудах на несменяемой почве (9 кг) с рН 5,5 и рН 6,35. Селен вносили в почву в виде раствора селената натрия в концентрациях 0,01 мг, 0,05 мг, 0,1 мг, 0,5 мг на кг почвы. Влияние селена на растения сравнивали с контрольным вариантом (без селена). Растения анализировали на трех стадиях: кущения, выхода в трубку и созревания. На первых двух фазах развития растения анализировалась надземная часть проростка ячменя целиком, на последней стадии отдельно анализировали стебель и колос.

Для изучения влияния селена на физиолого-биохимические показатели растений при окислительном стрессе в качестве объектов исследования использовали китайскую капусту и ячмень обыкновенный, выращенные гидропонным методом на модифицированной питательной среде Хогланда. В опыте использовались 4 группы растений: 1) растения, выращенные на среде с добавлением селена;

2) растения, выращенные на среде с добавлением цинка;

3) растения, выращенные на среде с добавлением селена и цинка;

4) растения, выращенные на среде, не содержащей ни селена, ни цинка. Селен добавлялся в форме селената натрия в концентрации 1-2 мкмоль/л.

Растения китайской капусты выращивали в течение 4 недель на свету с интенсивностью 75 Вт/м2 и при фотопериоде 16/8 ч. Затем часть растений подвергали облучению светом более высокой интенсивности - 170 Вт/м2 в течение 12 часов.

Растения ячменя выращивали в течение 7 суток при интенсивности света 45 Вт/м2 и фотопериоде 16/8 ч. Затем их подвергали облучению светом более высокой интенсивности – 130 Вт/м2 в течение 12 часов.

Растительные образцы для проведения биохимических анализов отбирались до и непосредственно после световой экспозиции.

В растениях определяли содержание малонового диальдегида [Heath, Parker, 1968], общую активность супероксиддисмутазы (СОД) [Лукаткин, 2002], активность глютатионпероксидазы (ГПО) [Hartikainen et al., 2000], аскорбатпероксидазы (АПО) [Полесская и др., 2006], каталазы (КАТ) [Cakmak, Marschner, 1992], дегидроаскорбатредуктазы (ДГАР) [Nakano, Asada, 1981]. Содержание белка определяли спектрофотометрически [Bradford, 1976].

Содержание хлорофиллов a, b, каротиноидов, аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновых кислот, антоциановых пигментов, окисленного, восстановленного и суммарного рибофлавина, рутина определяли согласно [Методы…, 2004], глутатион - согласно [Деви, Прасад, 2005], свободный пролин – согласно [Холодова и др., 2005]. Для оценки содержания хлорофилла в листьях растений определяли SPAD значения (Minolta Chlorophyllmeter SPAD 502).

Определение содержания цинка проводили методом атомно абсорбционной спектроскопии, после сухого озоления растительных образцов [Боровик-Романова, 1973].

Селен в растениях определяли флуориметрически с 2,3 диаминонафталином и атомно-абсорбционным методом с проточно инжекционным генерированием гидридов [Скрыпник и др., 2005].

Для минерализации растительных образцов использовался модифицированный нами метод автоклавного разложения под давлением [Куркова и др., 2007].

Статистическую обработку данных проводили в программах «SAS» и «Excel». В таблицах представлены средние значения четырех биологических повторностей и их доверительные интервалы.

Достоверность различий оценивали по методу Фишера с использованием t критерия при уровне значимости 0,05. Обозначенные одинаковыми буквами средние значения, представленные в таблице и на рисунках, достоверно не различимы. Влияние отдельных факторов определяли методом многофакторного анализа [Дерффель, 1994].

Главы 3-4. Результаты исследования и их обсуждение Особенности пробоподготовки и оптических методов определения селена в растительном материале В результате исследования установлены оптимальные условия минерализации растительного материала при определении селена:

температура минерализации 180 0С, время – 2 часа, окислительная смесь – HNO3 (конц.) и Н2О2 (в соотношении 2,5:1), масса навески – не более 0,5 г, восстановитель – HCl (конц.) в присутствии 1,4 М раствора амидосульфокислоты с последующей выдержкой в водяной бане (t=700С, время – 1 час). Погрешность определения селена, связанная с пробоподготовкой, составила от 4 до 9%. Показана возможность использования данного метода пробоподготовки растительного материала для последующего флуориметрического и атомно-абсорбционного определения в нем селена.

Изучение эффективности оптических методов определения селена (фотометрического с 3,3/-диаминобензидином, флуориметрического с 2,3 диаминонафталином и атомно-абсорбционного) показало, что флуориметрическое определение селена является более чувствительным, предел обнаружения составляет 2·10-3 мкг/мл. Экстракционно фотометрическую реакцию с 3,3/-диаминобензидином можно применять при большем содержании селена в образцах. Атомно-абсорбционный метод является более экспрессным, позволяющим проводить определение селена без предварительной экстракции, что существенно снижает время анализа. В дальнейшем анализ растительных образцов на содержание селена проводили двумя методами: методом атомно-абсорбционной спектроскопии с генерированием гидридов в проточно-инжекционном варианте и экстракционно-флуориметрическим методом с 2,3 диаминонафталином.

Исследование кормовых растений Калининградской области на содержание в них селена Проведенные исследования показали, что среднее содержание селена в многолетних злаковых травах Калининградской области составляет 52, мкг/кг, при этом максимальная концентрация отмечена в растениях Краснознаменского р-на (68,2 мкг/кг), минимальная - в растениях Полесского р-на (39,8 мкг/кг). В бобовых растениях содержание селена было выше: средняя по области концентрация составила 96,0 мкг/кг, максимальная наблюдалась в растениях Зеленоградского р-на (109, мкг/кг), миниальная – в Гусевском р-не (86,8 мкг/кг). В кукурузном силосе было определено наибольшее содержание селена – 128,3 мкг/кг. Анализ полученных данных позволяет говорить о практически повсеместном дефиците селена в Калининградской области: кормовые растения во всех районах, за исключением Зеленоградского, содержали селена менее мкг/кг сухой массы, что является минимальной пороговой величиной, обеспечивающей достаточное поступление данного микроэлемента в организм животных и человека.

Экологические аспекты накопление селена растениями ячменя Изучение динамики накопление селена растениями ячменя в процессе онтогенеза показало, что общее содержание селена в ячмене увеличивается, однако интенсивность его накопления растениями снижается (рис. 1-2).

Интенсивное накопление селена растениями ячменя на стадии кущения свидетельствует о важной роли данного микроэлемента, особенно на ранних стадиях развития растений.

Одним из факторов, влияющим на накопление селена растениями, является кислотность почвы. Как показали наши исследования, характер накопления селена ячменем в процессе вегетации не зависел от кислотности почвы: как при рН почвы 6,35, так и при рН 5,5 наиболее интенсивно микроэлемент поступал в растения на начальном этапе развития – в фазе кущения, а общее содержание селена в растении в процессе онтогенеза увеличивалось. Однако была установлена количественная разница в накоплении селена растениями в зависимости от кислотности почвы, при обогащении ее селеном. Более высоким было содержание селена в ячмене, выращенном на менее кислой почве (рН 6,35). Вместе с тем на почве без добавления селена статистически достоверной разницы между содержанием селена в растениях, выращенных на почвах различной кислотности, установлено не было.

Повышение содержания селена в растениях, выращенных на менее кислой почве, объясняется с одной стороны тем, что при высокой кислотности почвы увеличивается анионная адсорбция, поэтому большая часть селена находится в адсорбированном состоянии, с другой стороны, при низких значениях рН почвы шестивалентный селен сильнее подвержен процессам восстановления, поэтому в кислых почвах он находится преимущественно в виде малодоступного для растений селенит-иона.

Рис.1. Содержание селена в Рис.2. Зависимость содержания растении ячменя (мкг селена в ячмене (мкг селена/г сухой селена/растение) в онтогенезе в массы) от концентрации внесенного зависимости от концентрации в почву селена в онтогенезе (рН внесенного в почву селена (рН почвы 6,35).

почвы 6,35). А - контроль (1);

0,01 мг селена/кг А - контроль (1);

0,01 мг селена/кг почвы (2), 0,05 мг селена/кг почвы (2), 0,05 мг селена/кг почвы(3);

почвы(3);

В - 0,1 мг селена/кг почвы (4), 0,5 мг В - 0,1 мг селена/кг почвы (4), 0,5 мг селена/кг почвы (5).

селена/кг почвы (5).

Изучение распределения селена в растении ячменя показало, что содержание селена в колосе было больше, чем в стебле растения (рис. 3).

Преимущественное накопление селена в колосе может свидетельствовать о необходимости данного микроэлемента. Полученный результат имеет также большое практическое значение и должен учитываться при обогащении селеном злаковых культур для повышения обеспеченности селеном животных и человека.

Рис.3. Содержание селена в колосе и стебле ячменя в зависимости от величины селеновой добавки Одной из особенностей микроэлемента селена является его двойственная природа, т.е. возможное проявление как антиоксидантных, так и прооксидантных свойств [Hartikainen et al., 2000;

Peng et al., 2002;

Xue et al., 2001]. Действие селена во многом определяется его концентрацией. Как показали наши исследования оптимальной для растений ячменя является добавка селена в концентрации 0,01-0,05 мг/кг почвы (рН почвы 6,35). В этих условиях на всех стадиях развития растения накапливали максимальную биомассу. Положительное влияние селена на ростовые процессы ячменя может быть связано с его антиоксидантными свойствами, т.е. способностью к ликвидации накапливающихся в избыточном количестве свободных радикалов.

Влияние селена на биохимические показатели растений при окислительном стрессе Выполненное исследование по изучению развития окислительного стресса у растений китайской капусты, подвергнутых действию света высокой интенсивности (I света = 170 Вт/м2) на фоне дефицита цинка, показало, что после 12-часовой световой экспозиции в листьях снижалось содержания хлорофиллов, уменьшалась биомасса растений, увеличивалось содержание малонового диальдегида - продукта перекисного окисления липидов, что свидетельствует об образовании в клетках избыточных количеств свободных радикалов. Одной из причин развития окислительного стресса в исследуемых растениях, как нами было установлено, явилось подавление под действием избыточных количеств активных форм кислорода ряда антиоксидантных ферментов. Так, было выявлено снижение активности каталазы, дегидроаскорбатредуктазы и глютатионпероксидазы (рис. 4).

Рис. 4. Влияние интенсивности света на активность глютатионпероксидазы (ГПО), дегидроаскорбатредуктазы (ДГАР) и каталазы (КАТ) в растениях китайской капусты.

На фоне окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности и дефицитом цинка, изучалась протекторная функция микроэлемента селена. Результаты исследования влияния селена на устойчивость растений китайской капусты к окислительному стрессу свидетельствуют о защитных функциях данного микроэлемента: в его присутствии увеличивалась устойчивость зеленых пигментов, уменьшалось содержание малонового диальдегида и как результат повышалось накопление биомассы растений китайской капусты.

Одним из возможных механизмов протекторного действия селена является его способность оказывать влияние на ферментативную антиоксидантную систему. Проведенное нами исследование показало, что наличие в питательной среде селена ведет к увеличению активности глютатионпероксидазы, дегидроаскорбатредуктазы и каталазы (рис.5).

Выполненное исследование по изучению роли селена в растениях ячменя в условиях окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности и недостатком цинка, показало, что селен оказывает протекторное действие в защите клетки от избыточных количеств активных форм кислорода.

Рис. 5. Влияние селена на активность глютатионпероксидазы (ГП), дегидроаскорбатредуктазы (ДГАР) и каталазы (КАТ) в растениях китайской капусты на фоне окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности (I = 170 Вт/м2) и дефицитом цинка.

Установлено снижение уровня малонового диальдегида (МДА) при добавлении в питательную среду селена (рис. 6). Положительное действие селена наблюдалось как при дефиците цинка, так и при экспозиции растений на свету высокой интенсивности и совместном влиянии обоих факторов.

нмоль/г мкмоль/г 90 4, 3, 3, 2, 45 2, 1, 1, 0, 0 0, -Se;

+Zn -Se;

-Zn +Se;

-Zn +Se;

+Zn -Se;

+Zn -Se;

-Zn +Se;

-Zn +Se;

+Zn Iсв.=45 Вт/м2 Iсв.=130 Вт/м2 Iсв.=45 Вт/м2 Iсв.=130 Вт/м Рис. 6. Влияние селена на Рис. 7. Влияние селена на содержание МДА в растениях накопление пролина растениями, ячменя, выращенных в условиях выращенными в условиях различного цинкового питания и различного цинкового питания и при при различной интенсивности света различной интенсивности света Кроме того, было установлено снижение накопления пролина в растениях, выращенных на питательной среде, содержащей селен (рис.7).

Увеличение пролина при воздействии на растение неблагоприятных факторов окружающей среды свидетельствует о нарушении клеточного гомеостаза и может являться показателем стрессового состояния организма [Кузнецов, Шевякова, 1999].

Установлено также положительное влияние селена на стабильность зеленых пигментов растений ячменя.

Как было показано для китайской капусты, одним из возможных путей защитного действия селена является его влияние на активность ферментов антиоксидантной системы. Анализ полученных данных по изменению активности ферментов в растениях ячменя при оптимальном световом режиме в зависимости от минерального питания показал, что исключение из питательной среды цинка ведет к снижению активности СОД, АПО и ДГАР, в то время как активность КАТ и ГП возрастали (рис. 8-12).

7 0, отн.ед/(г белка*мин) 0, отн.ед/г белка 0, 2 0, 0 0, -Se;

+Zn -Se;

-Zn +Se;

-Zn +Se;

+Zn -Se;

+Zn -Se;

-Zn +Se;

-Zn +Se;

+Zn Iсв.=45 Вт/м2 Iсв.=130 Вт/м2 Iсв.=45 Вт/м2 Iсв.=130 Вт/м Рис. 8. Влияние селена на Рис. 9. Влияние селена на активность СОД в растениях активность КАТ в растениях ячменя, выращенных в условиях ячменя, выращенных в условиях различного цинкового питания и различного цинкового питания и при различной интенсивности света при различной интенсивности света Особенно сильным при дефиците цинка было снижение активности СОД (рис. 8) и повышение активности КАТ (рис. 9). Добавление микроэлемента селена оказывало положительное действие на активность всех ферментов, за исключением каталазы, хотя ее активность и была в растениях в присутствии селена выше, чем в варианте:

-Se;

+Zn. Действие селена на активность ферментов было более эффективным при дефиците цинка. Аналогичный результат был получен и для растений китайской капусты. Данная зависимость наблюдалась в ячмене как при физиологически оптимальном световом режиме, так и при выращивании растений на свету высокой интенсивности.

1, 0, отн.ед/(г белка*мин) отн.ед/(г белка*мин) 0, 0, 0, 0,0 -Se;

+Zn -Se;

-Zn +Se;

-Zn +Se;

+Zn -Se;

+Zn -Se;

-Zn +Se;

-Zn +Se;

+Zn Iсв.=45 Вт/м2 Iсв.=130 Вт/м2 Iсв.=45 Вт/м2 Iсв.=130 Вт/м Рис. 10. Влияние селена на Рис. 11. Влияние селена на активность АПО в растениях активность ДГАР в растениях ячменя, выращенных в условиях ячменя, выращенных в условиях различного цинкового питания и различного цинкового питания и при различной интенсивности света при различной интенсивности света отн.ед/(г белка*мин) -Se;

+Zn -Se;

-Zn +Se;

-Zn +Se;

+Zn Iсв.=45 Вт/м2 Iсв.=130 Вт/м Рис. 12. Влияние селена на активность ГПО в растениях ячменя, выращенных в условиях различного цинкового питания и при различной интенсивности света Действие света высокой интенсивности на ферментативный статус растений ячменя также было опосредавано наличием или отсутствием в питательной среде микроэлементов цинка и селена. Так, активность глютатионпероксидазы после 12-часовой световой экспозиции возрастала в растениях, выращенных на питательной среде, содержащей селен, и уменьшалась, если селен отсутствовал. Для аскорбатпероксидазы, напротив, данная зависимость была установлена для микроэлемента цинка.

Как видно из представленных данных, антиоксидантные свойства селена особенно эффективно проявлялись при дефиците цинка.

Статистический анализ показал наличие прямой корреляции между содержанием селена и активностью изученных ферментов, при этом наиболее сильная взаимосвязь наблюдалась между наличием в питательной среде селена и активностью глютатионпероксидазы.

Сопоставление коэффициентов корреляции для цинка и селена с активностями антиоксидантных ферментов, показало, что данные микроэлементы связаны с различными ферментативными системами (табл.1). Данный результат может объяснить тот факт, что состояние растений, выращенных на питательной среде, содержащей или селен, или цинк, было практически одинаковым (накопление биомассы, содержание воды, пролина, МДА, хлорофиллов).

Таблица 1.

Корреляционная зависимость между содержанием в питательной среде цинка или селена и активностями антиоксидантных ферментов ячменя.

Коэффициент корреляции Фермент Se Zn СОД 0,393 0, КАТ 0,298 -0, ГПО 0,949 0, АПО 0,221 0, ДГАР 0,761 0, Несмотря на значительную роль ферментов в детоксикации активных форм кислорода, их защита при окислительном стрессе оказывается менее эффективной в сравнении с протекторным действием низкомолекулярных антиоксидантов. Причина этого – быстрая инактивация конститутивного пула ферментов свободными радикалами и значительное время, необходимое для их синтеза. В этих условиях повышается значение низкомолекулярных соединений, чья избыточность и относительная свобода миграции в клеточной и тканевой среде выступают на передний план [Кения и др., 1993].

Как показали наши исследования защитное действие селена в растениях ячменя при окислительном стрессе также связано с увеличением накопления ряда низкомолекулярных антиоксидантов при добавлении в питательную среду селена. В условиях окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности, в растениях отмечено значительное увеличение пула аскорбиновой кислоты в присутствии селена (табл. 2);

при дефиците цинка – выявлено увеличение содержания каротиноидов, глютатиона, аскорбиновой кислоты в растениях, снабженных экзогенным селеном (табл. 3).

Таблица Влияние селена на накопление растениями ячменя низкомолекулярных антиоксидантов (НМА) при окислительном стрессе, вызванном светом высокой интенсивности (I св.=130 Вт/м2) Содержание НМА НМА Изменение, % - Se + Se Глютатион, мкмоль/г 1,99±0,06 1,91±0,04 - Рутин мкг/г 16,15±0,16 16,50±0,23 + Аскорбиновая кислота 195,8±3,0 262,2±3,6 + мкг/г Каротиноиды, мг/г 0,479±0,02 0,505±0,03 + Рибофлавин мг/г 9,70±0,54 9,19±0,32 - Антоцианы, мг/г 1,75±0,05 1,25±0,07 - Таблица Влияние селена на накопление растениями ячменя низкомолекулярных антиоксидантов (НМА) при окислительном стрессе, вызванном дефицитом цинка Содержание НМА НМА Изменение, % - Se + Se Глютатион, мкмоль/г 1,38±0,03 1,80±0,04 + Рутин мкг/г 12,21±0,15 13,30±0,22 + Аскорбиновая кислота 94,1±3,1 119,1±2,9 + мкг/г Каротиноиды, мг/г 0,274±0,02 0,393±0,02 + Рибофлавин мг/г 10,98±0,16 13,18±0,62 + Антоцианы, мг/г 1,66±0,05 1,47±0,05 - Таким образом, полученные данные доказывают протекторное действие селена в растениях ячменя и китайской капусты при окислительном стрессе, вызванном светом повышенной интенсивности и дефицитом цинка, что достигается за счет активации селеном антиоксидантных ферментов, прежде всего глютатионпероксидазы, а также за счет стимулирования накопления некоторых низкомолекулярных антиоксидантов (каротиноидов, аскорбиновой кислоты, глютатиона).

Выводы Проведенное исследование эколого-биохимических аспектов протекторной функции селена в растениях при окислительном стрессе позволяет сделать следующие основные выводы:

1. Исследованные кормовые пастбищные растения Калининградской области содержат менее 100 мкг селена на кг сухой массы, что может явиться причиной его дефицита в организме животных.

2. В процессе онтогенеза общее содержание селена в ячмене увеличивается, а интенсивность его накопления снижается. Выявлена тенденция к большему накоплению селена в колосе.

3. Показано преимущественное накопление селена в растениях ячменя, выращенных на почве с рН 6,35, по сравнению с растениями, произрастающими на более кислой почве (рН 5,5).

4. Положительное действие селена на накопление биомассы растениями ячменя отмечено при внесении в почву 0,01-0,05 миллиграмм селена на килограмм почвы.

5. В растениях ячменя, выращенных в условиях окислительного стресса (света высокой интенсивности I=130 Вт/м2 и дефицита цинка) селен оказывает протекторное действие, что выражается в снижении содержания малонового диальдегида, свободного пролина, увеличении устойчивости хлорофиллов и накопления биомассы.

6. Защитное действие селена в растениях ячменя связано с повышением активности ряда ферментов антиоксидантной системы (супероксиддисмутазы, глютатионпероксидазы, каталазы, аскорбатпероксидазы и дегидроаскорбатредуктазы) и увеличением пула некоторых низкомолекулярных антиоксидантов: каротиноидов, аскорбиновой кислоты, глютатиона.

7. В растениях китайской капусты, выращенных в условиях окислительного стресса (света высокой интенсивности I=170 Вт/м2 и дефицита цинка), под действием экзогенного селената натрия проиходит снижение концентрации малонового диальдегида, повышение устойчивости хлорофиллов и накопления биомассы, а также увеличение активности глютатионпероксидазы, дегидроаскорбатредуктазы и каталазы.

8. Ответная реакция антиоксидантной системы (антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных антиоксидантов) растений ячменя и китайской капусты зависит от характера стрессового воздействия.

Список опубликованных работ по теме диссертации Статьи в ведущих научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ 1. Скрыпник Л.Н., Чупахина Г.Н. Влияние селена и цинка на устойчивость растений китайской капусты к окислительному стрессу // Вестник РГУ им. И. Канта. Вып.7. Сер. Естественные науки. 2007. с. 73-79.

2. Романова Е.В., Гинс М.С., Чупахина Г.Н., Скрыпник Л.Н., Потапов С.А. Фенольные соединения – ценные качества китайской капусты // Картофель и овощи. 2008. № 5. С. 14.

Статьи и материалы научных конференций 3. Куркова Т.Н., Скрыпник Л.Н. Определение микрограммовых количеств селена в растениях методом атомно-абсорбционной спектроскопии с проточно-инжекционным генерированием гидридов // Сборник материалов II Всероссийской научно-практической конференции "Химическое загрязнение среды обитания и проблемы экологической реабилитации нарушенных экосистем". - Пенза, 2004. С.101-103.

4. Скрыпник Л. Н., Куркова Т. Н., Чупахина Г. Н. Сравнительная эффективность двух методов количественного определения селена в растительном материале // Методы анализа микроэлементов растений:

Практикум / Сост. Г.Н. Чупахина, Л.Н. Скрыпник. – Калининград: Изд-во РГУ им. Канта, 2005. – С. 21-24.

5. Куркова Т.Н., Скрыпник Л.Н. Особенности оптических методов определения селена и их применения к анализу растительного материала // Актуальные проблемы неорганической и аналитической химии:

межвузовский сборник научных трудов. – Калининград: Изд-во РГУ им.

Канта, 2005. – Вып. 1. – с. 93-99.

6. Скрыпник Л.Н., Чупахина Н.Ю. Исследование кормовых растений для оценки обеспеченности животных микроэлементом селеном // Материалы международного научно-практического семинара 10- ноября 2005 г «Новые энергосберегающие технологии в зоотехнии и ветеринарии» - Калининград: КГТУ, 2005. – С.151-154.

7. Чупахина Н.Ю., Скрыпник Л.Н., Лапа О.В. Содержание селена в кормах для норок ОАО «Зверохозяйство Гурьевское» Калининградской области // Вопросы зоотехнии и ветеринарной медицины: международный сборник научных трудов, 2006. С.122-125.

8. Скрыпник Л.Н. Химико-биологическое значение селена для различных экосистем и методы его определения в объектах окружающей среды // Общие проблемы мониторинга природных экосистем.

Всероссийская научно-практическая конференция: Сборник статей. Ч.2. – Пенза: РИО ПГСХА, 2007. – С. 134-136.

9. Чупахина Г.Н., Чупахина Н.Ю., Скрыпник Л.Н. Антиоксидантные свойства качественной пищи // Здоровье человека-5: Материалы Международного научного конгресса валеологов / Под ред. проф. В.В.

Колбанова. – СПб, 2007. – С.189-190.

10. Скрыпник Л.Н., Чупахина Г.Н. Микроэлемент селен и антиоксидантный статус растительной пищи // Состояние биосферы и здоровье людей: сборник статей VII Международной научно-практической конференции. – Пенза: РИО ПГСХА, 2007. – С 190-192.

11. Скрыпник Л.Н., Чупахина Г.Н. Микроэлемент селен и устойчивость растений ячменя к окислительному стрессу, вызванному светом повышенной интенсивности и дефицитом цинка // Регуляция роста, развития и продуктивности растений (Материалы V Международной научной конференции, г. Минск, 28-30 ноября 2007). – Мн.: ИООО «Право и экономика», 2007. - С. 186.

12. Куркова Т.Н., Скрыпник Л.Н., Чупахина Г.Н. Особенности пробоподготовки растительного материала при определении массового содержания селена // Актуальные проблемы неорганической и аналитической химии: межвузовский сборник научных трудов. – Калининград: Изд-во РГУ им. Канта, 2007. – Вып. 3. – с. 81-86.

13. Чупахина Г.Н., Куркова Т.Н., Скрыпник Л.Н. Влияние кислотности почвы на накопление и распределение селена в растении ячменя // Актуальные вопросы сельского хозяйства: межвузовский сборник научных трудов. – Калининград: ФГОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет», 2007. – С.158-163.

14. Скрыпник Л.Н., Чупахина Г.Н. Влияние селена на активность антиоксидантных ферментов в растениях китайский капусты // Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая 2008. Новосибирск: издательство «Арта», 2008. – С. 509.

15. Chupahina G.N., Skrypnik L.N. Influence of selenium on the accumulation of antioxidants in barley plants // Abstracts of the Society for Free Radical Research European Meeting, Berlin, July 5-9 2008. Berlin, 2008. – P.85.

Скрыпник Любовь Николаевна ЭКОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОТЕКТОРНОЙ ФУНКЦИИ СЕЛЕНА В РАСТЕНИЯХ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Формат 60х90 1/16.

Подписано в печать Бумага для множительных аппаратов. Ризограф. Усл. печ. л. 1,5.

Уч.-изд. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ.

Издательство Российского государственного университета им. И.Канта 236041, г. Калининград, ул. А. Невского,