Участие 12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости растений картофеля к гипотермии
На правах рукописи
Демин Илья Николаевич Участие 12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости растений картофеля к гипотермии 03.01.05 – физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2010
Работа выполнена в лаборатории зимостойкости Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
доктор биологических наук, профессор Трунова Тамара Ильинична ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор биологических наук, профессор Шакирова Фарида Миннихановна доктор биологических наук Носов Александр Владимирович ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Российский государственный аграрный университет – МСХА им. К.А. Тимирязева
Защита состоится «27» апреля 2010 г. в 13.00 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу:
127276, г. Москва, ул. Ботаническая, 35.
Факс (495) 977-80-18, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН
Автореферат разослан «26» марта 2010 г.
Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук М.И. Азаркович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Б о льшая часть растений на Земле, обитающих на 64% территории суши, в течение года испытывают губительное действие низких тем ператур. Значимость этой проблемы возрастает также в связи с глобальным измене нием климата на планете, которое сопровождается усиливающейся нестабильностью, выражающейся, в частности, в резких перепадах температуры в относительно корот кие промежутки времени (Levitt, 1980;
Сандухадзе и др., 2003). Поэтому проблема ус тойчивости растений к низким температурам имеет большое фундаментальное и при кладное значение в современной науке.
В настоящее время выдвинуто несколько теорий, объясняющих механизмы по вреждения растений от действия низких температур, но наиболее изучен этот вопрос в отношении морозостойких растений (Туманов, 1979, Трунова, 2007). Среди причин повреждений теплолюбов от действия экстремальных низких температур наиболее часто называют повышенное образование активных форм кислорода (АФК) (Мерзляк, 1989, Лукаткин 2002, Попов и др., 2006), которые способны необратимо повреждать главным образом липидные компоненты мембран и, в первую очередь, полиненасы щенные жирные кислоты (Tepperman, Dunsmuir, 1990, Apel, Hirt, 2004, Suzuki, Mittler, 2006). Это приводит к повышению вязкости мембран, переходу липидов из жидкок ристаллической фазы в фазу геля, увеличению протонной проницаемости, снижению электрической проводимости мембран и инактивации мембранных ферментов (Лось, 1997, Лось 2005). При продолжительном воздействии стресс-факторов такие измене ния становятся необратимыми, что ведет к многочисленным нарушениям работы биологических систем и гибели растений. Вместе с тем, причины повреждений и ус тойчивости группы холодостойких растений к низким температурам, изучены в го раздо меньшей степени. В частности, остаются недостаточно исследованными меха низмы, предотвращающие развитие окислительного стресса при гипотермии.
Известно, что способность клеток растений к низкотемпературной адаптации связана с их возможностью изменять текучесть мембран посредством увеличения ко личества полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в мембранных липидах. По сравнению с неадаптировнными растениями, в мембранах закаленных растительных организмов наблюдается накопление линолевой (С18:2) и линоленовой (С18:3) жир ных кислот (ЖК) (Белоус, Бондаренко, 1982). В связи с этим, важное значение приоб ретают исследования роли десатураз – ферментов, отвечающих за образование двой ных (С=С) связей в цепях ЖК. Первая двойная связь, как правило, формируется после 9-го атома углерода (положение 9), вторая двойная связь – в положении 12, третья – в положениях 15 и 6. У цианобактерий, растений и практически всех живых ор ганизмов существуют специфические десатуразы, ответственные за образование двойных связей в определенных положениях ацильных цепей. В частности, 12-ацил липидная десатураза, функциональная роль которой изучается в данной работе, уча ствует в образовании второй двойной связи при переходе олеиновой (18:1) в линоле вую (18:2) кислоту. Однако выяснено, что не все типы десатураз вносят одинаковый вклад в формирование низкотемпературной устойчивости. Так, применительно к циа нобактериям, считается, что наличие в мембранных липидах линолевой (С18:2) ки слоты, а, следовательно, и активность 12-ацил-липидной десатуразы может служить одним из критериев устойчивости организма к воздействию низкотемпературного стресса (Wada et al., 1990, Tasaka et al., 1996).
У высших растений участие десатураз в формировании низкотемпературной ус тойчивости до сих пор изучено мало (Маали и др., 2007). Можно предположить, что экспрессия в холодостойких растениях картофеля гена desA 12-ацил-липидной деса туразы приведёт к увеличению полиненасыщенности жирных кислот мембранных липидов, изменению функционального состояния мембран и, в конечном итоге, по вышению устойчивости растений к окислительному стрессу и гипотермии, что может послужить экспериментальным доказательством участия этого фермента в формиро вании холодоустойчивости растений.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение роли 12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному действием гипотермии, на примере картофеля, трансформированного геном desA 12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии Synechocystis sp.
В соответствии с поставленной целью были выдвинуты следующие задачи:
1. Подтвердить наличие и экспрессию гетерологичного гена desA 12-ацил липидной десатуразы в тканях растений-трансформантов 2. Изучить влияние введённого гена desA на состав и содержание жирных кислот в мембранных липидах растений картофеля 3. Установить вызванные трансформацией изменения в ультраструктуре хлоропла стов, как основных поставщиков АФК в растительных клетках и в интенсивно сти СО2-газообмена листьев исследуемых генотипов растений в норме и при по ниженных температурах 4. Исследовать изменения интенсивности начальных процессов окислительного стресса и содержания конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также показатели активности основных ферментов антиоксидантной защиты под влиянием гипотермии у трансформированных и нетрансформиро ванных растений картофеля 5. Определить различия в устойчивости между контрольными и трансформирован ными растениями по степени повреждения листьев и выживаемости целых рас тений после действия гипотермии 6. Установить роль 12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении образования избыточных количеств АФК при окислительном стрессе, вызванном гипотерми ей, а также без участия низкой температуры путём обработки растений параква том.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение роли 12-ацил липидной десатуразы в формировании устойчивости холодостойких растений к окис лительному стрессу, индуцированному гипотермией, с использованием растений кар тофеля, трансформированных геном desA цианобактерии Synechocystis sp.
Установлено, что экспрессия гена desA 12-ацил-липидной десатуразы приво дила к увеличению содержания линолевой (18:2), а также линоленовой (18:3) жирных кислот в мембранных липидах листьев картофеля, что сопровождалось повышением общего количества ЖК, и их индекса ненасыщенности.
Увеличение содержания полиненасыщенных жирных кислот в тканях транс формированных растений способствовало формированию более устойчивой к гипо термии структуры хлоропластов, что выражалось в повышении количества гран и общего числа тилакоидов в хлоропластах, а также в поддержании более высокого от ношения интенсивности фотосинтеза к темновому дыханию при понижении темпера туры.
Впервые экспериментально выявлено, что повышение структурно функциональной стабильности мембран трансформированных растений картофеля, обусловленное активностью 12-ацил-липидной десатуразы, способствовало предот вращению избыточной генерации АФК. Это привело к снижению интенсивности процессов окислительного стресса и перекисного окисления липидов и, как следст вие, к повышению устойчивости трансформантов к гипотермии, что выражалось в меньшей степени повреждения их листовых пластин, а также в большем проценте выживаемости после воздействия низкими температурами.
Впервые для подтверждения важной роли 12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении накопления избыточных количеств АФК была использована мо дельная система с применением параквата для инициации свободнорадикального окисления у растений, без воздействия низкой температуры, которая показала, что трансформированные растения характеризуются меньшим, по сравнению с контро лем, содержанием начальных и конечных продуктов окислительного стресса и пере кисного окисления липидов.
Анализ поученных результатов позволил впервые сформулировать гипотетиче ский механизм влияния экспрессии гена desA 12-ацил-липидной десатуразы на под держание структуры и функций мембран растительных клеток в период охлаждения, что позволяет сохранить клеточный гомеостаз и, в конечном итоге, повысить выжи ваемость растений.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе экспери ментальные данные о роли 12-ацил-липидной десатуразы в повышении устойчиво сти растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному гипотермией, имеют существенное значение для понимания механизмов формирования низкотемператур ной резистентности у холодостойких растений. Теоретические обобщения и совокуп ность экспериментальных данных работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов естественнонаучных специальностей разных ВУЗов страны.
Апробация работы. Основные результаты научной работы были представлены на IX международной конференции «Биология клеток in vitro и биотехнология» (Зва нигород, 2008), на международной школе-конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях" (Звенигород 2008), на конференции молодых ученых в Институте физиологии расте ний им. К.А. Тимирязева РАН (Москва, 2009), а также на семинарах лаборатории зи мостойкости Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (Москва, 2007-2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из которых 2 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных ре зультатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, включая 5 таблиц, 30 рисунков;
библиография содержит название, из которых 163 на иностранном языке.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объекта исследования были использованы холодостойкие растения картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Десница), трансформированные конструкцией, несущей ген desA 12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии Synechocystis sp.
РСС 6803. Последовательность гена десатуразы была трансляционно слита с последо вательностью репортерного гена licBM3, кодирующего термостабильную лихеназу.
Конструкция гибридных генов находилась под контролем сильного конститутивного промотора 35S СаМV. Трансформанты также содержали маркерный ген устойчивости к канамицину nptII. Контролем служили нетрансформированные растения того же сорта. Растения были получены в результате совместной работы сотрудников ИФР РАН и ИОГен РАН, которым автор выражает глубокую благодарность за предостав ленный экспериментальный материал.
Растения размножали микрочеренкованием и выращивали в камере фитотрона ИФР РАН in vitro при 24оС и 16 ч освещении люминесцентными лампами белого све та (ЛБ-80, освещенность 100 моль квантов/м2·с) в течение 5 недель в пробирочной культуре на 10-13 мл агаризованной питательной среды, приготовленной по прописи Мурасиге и Скуга (Murashige, Skooge, 1962) с добавлением 2% сахарозы и витаминов.
Холодовую обработку проводили в климатической камере MIR-153 (“SANYO”, Япония). Растения в пробирках (без ватно-марлевых пробок) помещали в камеру, предварительно доведя температуру последней до 0С. В дальнейшем температуру внутри камеры постепенно (со скоростью 0,3С/мин) снижали до 9С и выдерживали растения при этой температуре в течение 20, 40 или 60 минут, в зависимости от задач опыта. Режим температурной обработки растений, т. е. сочетание температуры с про должительностью её действия был подобран в предварительных опытах, которые по казали, что температура –9С при воздействии от 20 до 60 минут не приводит к нук леации льда, как правило, губительной для холодостойких растений, но вызывает по вреждения, различные по степени в зависимости от устойчивости генотипа, которые отражаются на процессах окислительного стресса. Для исследований использовали листья без черешков, взятые из средней части растений.
Наличие и экспрессию введенных генов подтверждали с использованием моле кулярных методов ПЦР и ОТ-ПЦР.
Определение содержания и состава жирных кислот мембранных липидов опре деляли методом газожидкостной хроматографии (Пчелкин и др.,2001).
Ультраструктуру клеток и хлоропластов листьев контрольных и трансформиро ванных растений исследовали с помощью электронного микроскопа TEMSCAN CX2 («JEOL», Япония), предварительно получив ультратонкие срезы на ультрамик ротоме LKB-3 («LKB», Швеция). Морфометрические исследования проводили на приборе MOP-VIDEOPLAN («Reichert», Австрия) на основании просмотра не менее 100 клеток каждого варианта.
Определение интенсивности фотосинтеза и дыхания проводили с помощью ус тановки открытого типа с инфракрасным газоанализатором URAS 2T фирмы «Hartmann und Braun». Камера располагалась в рабочем объеме климатического шка фа «Gronland» (Германия). Изменения проводились при температуре 24С. Скорость газообмена измеряли сразу же после установления заданной температуры в камере. С целью снижения ошибки опыта, связанной с суточной динамикой фотосинтеза, изме рения проводили в одно и то же время – с 9:30 до 14:00.
Скорость образования супероксида определяли методом, в основе которого ле жит способность этого радикала восстанавливать адреналин в адренохром (Prayor, 1979). Количество супероксидного анион-радикала выражали в относительных еди ницах скорости (1 отн. ед. = 10-3 опт. ед./мин). Специфичность восстановления адре налина супероксидным анион-радикалом была подтверждена ингибированием реак ции при добавлении супероксиддисмутазы (100 ед.акт./мин).
Определение содержания перекиси водорода (Н2О2) проводили с помощью ме тода, основанного на образовании окрашенного соединения – комплекса пероксида титана (Kumar, Knowles, 1993). Концентрацию Н2О2 рассчитывали по стандартной ка либровочной кривой концентрации перекиси водорода и выражали в ммоль/г сырой массы.
Содержание диеновых конъюгатов (ДК) жирных кислот определяли по методу, основанному на свойствах сопряженных двойных и тройных связей, входящих в со став гидроперекисей липидов, интенсивно поглощать в УФ-области с характерными максимумами (232 нм). Количество ДК выражали в ммоль/г сырой массы (Biddlack, Tappel, 1973, Кейтс, 1975).
Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), основанному на образовании в кислой среде окра шенного триметинового комплекса, имеющего характерный спектр поглощения с максимумом = 532 нм (Стальная, Гаришвили, 1977). Количество МДА выражали в мкмоль/г сырой массы (Жиров и др., 1982).
Холодостойкость исследуемых генотипов картофеля оценивали по индексу по вреждения листовых пластин, который определяли путём измерения степени выхода электролитов из повреждённой холодом (–9С, 40 минут) ткани в водную фазу (Hepburn et al., 1986), а также прямым методом определения процента выживаемости контрольных и трансформированных растений картофеля после действия кратко срочного жесткого охлаждения (-9С, 60 минут).
Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли при помощи метода, осно ванного на способности СОД конкурировать с нитросиним тетразолием за суперок сидные радикалы, поступающие из реакции фотоокисления рибофлавина (Beauchamp, Fridovich, 1971). Активность СОД выражали в единицах активности на г сырой массы листьев.
Активность каталазы измеряли по скорости деградации H2O2 согласно методике (Kumar, Knowles, 1993). Фиксировали падение оптической плотности за 1 минуту по сле добавления в ферментный экстракт раствора 100 мкл 0,1М Н2О2 и выражали ак тивность фермента в ммоль разложившейся перекиси/г сырой массы в минуту.
Определение активности гваякол пероксидазы провдили по методу, основанно му на реакции окисления ароматического соединения (гваякола) до окрашенного со единения (тетрагваякола). Активность пероксидазы выражали в ммоль гваякола/г сы рой массы в минуту.
Для установления роли 12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении фор мирования избыточных количеств АФК применили модельную систему для индукции окислительного стресса, основанную на использовании параквата, гербицидные свой ства которого связаны с его способностью получать электрон от доноров электрон транспортных цепей (ЭТЦ) хлоропластов и передавать его на молекулу кислорода с образованием супероксидного аниона, что приводит к нарушениям фотосинтеза и усиленному образованию АФК (Bowler et al., 1992). У контрольных и трансформиро ванных растений определяли основные показатели окислительного стресса (скорость образования супероксидного радикала, накопление МДА и диеновых конъюгатов) и работу ферментативной составляющей антиоксидантной системы (активность СОД, каталазы, гваякол-пероксидазы). Для проведения данного эксперимента использовали методики, описанные выше.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием програм мы «Statistica for Windows 9.0» (применяли t-критерий Стьюдента для независимых выборок, Р=0,05) и графопостроителя «Microsoft Office Excel 2007». В экспериментах использовали 4-6-кратную биологическую и 8-12-кратную аналитическую повтор ность измерений. В таблицах представлены средние арифметические значения и их стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Молекулярно-биологический анализ растений-трансформантов.В начале исследовательской работы было необходимо провести выбор линий трансформированных растений с признаками активной экспрессии гена desA 12 ацил-липидной десатуразы цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Одним из способов доказательства экспрессии того или иного гена является анализ изменения субстрата соответствующего фермента. В работе Маали и др., 2007 были приведены данные по абсолютному содержанию жирных кислот в листьях различных линий растений картофеля, трансформированных геном desA. В соответствии с ними были выбраны 2 линии трансформантов, отличающиеся наибольшим содержанием ПНЖК в клетках, а следовательно, обладающие наибольшей активностью 12-ацил липидной десатуразы. При этом в одном случае последовательность гена десатуразы была трансляционно слита с последовательностью репортерного гена licBM3, кодирующего термостабильную лихеназу (desA-licBM3-растения), а в другом (desA растения) – растения несли нативный ген десатуразы desA. В ходе проведенной в дальнейшем экспериментальной работы было показано, что отличия в данных по большинству проводимых нами опытов между desA- и desA-licBM3-растениями были незначительными. Таким образом, можно подтвердить, что десатураза в составе гибридного белка сохраняет способность катализировать образование двойной связи в цепи ЖК и изменять состав ЖК в мембранных липидах (Маали и др., 2007), а лихеназа при этом не привносит побочных эффектов в действие целевого гена десатуразы. В соответствие с этими данными, было решено для изучения роли цианобактериальной 12-ацил-липидной десатуразы в повышении устойчивости трансформированных растений картофеля к гипотермии использовать desA-licBM3 растения, как наиболее удобный объект для периодических анализов экспрессии встроенного гена.
Для подтверждения наличия в тканях трансформированных растений введенных генов был использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
На рис. 1 видно, что в тканях трансформантов (в отличие от контрольных расте ний) присутствуют целевой ген desA, репортерный ген licBM3 и ген устойчивости к канамицину npt.
Но наличие гетерологичных генов в составе тотальной ДНК ещё не означает, что эти гены экспрессируются, а их белковые продукты выполняют свои функции. Уро вень экспрессии генов может быть определен по количеству образовавшихся мРНК и/или белкового продукта.
Мы оценили уровень экспрессии гибридного гена desA-licBM3 в клетках растений картофеля на основании метода ПЦР с обратной транкрипцией (ОТ-ПЦР), то есть по образованию мРНК. Резуль таты показали, что гетерологичные гены, содержа щиеся в тканях трансформантов, хорошо экспрес сируются, по крайней мере, на уровне транскрип ции (рис. 2).
Качественный и количественный состав Рис. 1. Электрофореграмма про дуктов ПЦР-реакции ДНК рас- ЖК мембранных липидов контрольных и тений картофеля:
трансформированных растений картофеля.
1) контрольные растения Ферментативная активность 12-ацил-липидной 2) desA-licBM3-растения 3) нуклеотидные маркеры десатуразы, осуществляющей образование второй двойной связи линолевой кислоты была, подтвер ждена анализом абсолютного содержания ЖК в ли стьях контрольных и трансформированных расте ний.
Данные показали существенные различия в содержании главных ЖК (таблица 1). Так, содер жание линолевой (9,12-18:2) кислоты – основного продукта активности 12-десатуразы – увеличи лось у трансформантов почти на 30% по отноше нию к нетрансформированному контролю.
При этом образование линолевой кислоты, Рис. 2. Электрофореграмма являющейся субстратом для последующего пре продуктов ОТ-ПЦР-реакции вращения в линоленовую (9,12,15-18:3) кислоту, мРНК растений картофеля:
привело к увеличению содержания последней бо 1) контрольные растения 2) desA-licBM3-растения лее чем на 25%, что мы связываем с работой расти 3) нуклеотидные маркеры тельных десатураз. Здесь следует отметить, что ак тивность десатураз зависит от количества соответствующего субстрата (Los, Murata, 1998, Лось 2005), то есть для образования 18:1 требуется ненасыщенная 18:0 кислота, для образования диеновой 18:2 в качестве субстрата необходима моноеновая 18: ЖК. Подобным образом можно объяснить то, что количество насыщенной пальмити новой (18:0) кислоты в тканях трансформантов было меньше, чем у контроля, при этом содержание моноеновой 18:1 ЖК было выше уже у desA-licBM3-растений. Вы страивая гипотетическую цепочку биохимических превращений, можно предполо жить, что активная экспрессия гена desA приводила к увеличению количества 18:2.
Это потребовало больше субстрата в виде 18:1, а следовательно, и увеличения актив ности собственных растительных ферментов, превращающих 18:0 в 18:1. В свою оче редь, сама линолевая (18:2) кислота тоже является субстратом для образования 18:3.
Особый интерес пред Таблица 1. Абсолютное содержание главных жирных кислот в листьях контрольных и трансформирован- ставляют данные по содержа ных геном desA 12-ацил-липидной десатуразы рас- нию в растениях тений картофеля*.
трансформантах 16:3-ЖК. Из вестно, что картофель относит Состав ЖК, нмоль/г сырой массы ся к 16:3-растениям, то есть его ЖК Контроль desA-licBM хлоропласты содержат 14:0 82 80 7,10,13-16:3 ЖК. Также из 16:0 2801 2924 вестно, что эта кислота, содер 9-16:1 373 552 жащаяся в sn-2 положении 9,12-16:2 65 79 фосфатидилдиацилглицеринов 7,10,13-16:3 379 626 хлоропластов, играет большую 18:0 296 252 роль в холодоустойчивости 9-18:1 271 346 16:3-растений, вероятно, спо 9,12-18:2 2054 2668 собствуя процессу фотосинтеза при пониженных температу 9,12,15-18:3 6710 рах. Как следует из результа 19:0 31 тов таблицы 1., содержание ос 20:0 131 татков 16:3-ЖК в липидах Сумма ЖК 13193 desA-licBM3-растений было на ИН 2,95 3, 65% выше, чем в контроле. По * Во всех случаях статистическая ошибка не превышала 4%.
скольку при биосинтезе 7,10,13-16:3 ЖК субстратом служат липиды, содержащие в sn-2 положении 7,10-16:2 кислоту, также представ ленную в растениях картофеля, можно предположить, что цианобактериальная 12 ацил-липидная десатураза в трансформантах картофеля может использовать в качест ве субстрата не только С18-ЖК, но и С16-ЖК. Возможно, что активность именно это го фермента приводила к значительному увеличению содержания 7,10,13-16:3 ЖК в липидах трансформантов линии desA-licBM3.
В конечном итоге трансформация растений привела к увеличению общей суммы ЖК в тканях трансформированных растений, а также индекса ненасыщенности ЖК, что является предпосылкой для увеличения холодостойкости трансформантов.
Исследование ультраструктурной организации хлоропластов контрольных и трансформированных растений картофеля Общее количество жирных кислот в большой степени влияет на мембранную структуру органелл клетки. Изменения в липидном составе мембран, большая часть которых у растений представлена мембранами хлоропластов, позволяет предполо жить существенные изменения в структуре этих органелл. Изучение ультраструктуры хлоропластов важно с той точки зрения, что способность к фотосинтезу при низкой температуре является необходимым условием формирования устойчивости растений к холоду (Климов, 1997).
Электронно-микроскопические наблюдения показали, что мембран ная система трансформированных растений, по сравнению с контролем, хлоропласты которых имеют рыхлую форму, более развита и упорядочена (рис. 3). На основании морфометри ческого анализа можно заключить, Рис. 3. Ультраструктурная организация хло- что при почти одинаковой площади ропластов листьев контрольных (слева) и хлоропластов у обоих генотипов, desA-licBM3 (справа) растений картофеля.
число гран в хлоропластах трансге нов увеличено почти на 50%, по сравнению с контролем.
У трансформантов также более, чем на четверть увеличилось количество тила коидов в гране. Общее же количество тилакоидов в хлоропластах desA-licBM3 растений было почти в 2 раза больше, чем у контрольных растений. Количество пла стоглобул в хлоропластах трансформантов почти на 20% превышало таковое у не трансформированных растений (таблица 2).
Таблица 2. Сравнительная характеристика структурных элементов хлоропластов листьев контрольных и desA-licBM3-растений картофеля.
Площадь Количество Площадь крах- пластогло Число ти- Общее Число хлоропла- мальн. бул лакоидов в число ти гран зерна гране лакоидов ста (мк ) (мк ) Дикий тип 9,10±0,3 1,23±0,1 14,48±0,5 5,75±0,2 83 4,04±0, 4,81±0, desA 9,46±0,3 0,84±0,1 21,48±0,8 7,27±0,2 licBM По-видимому, все эти изменения ультраструктуры хлоропластов трансформиро ванных растений картофеля, мембраны которых обогащены ненасыщенными жирны ми кислотами, направлены на поддержание структуры и функции органелл и клеток в целом, что, в конечном итоге, должно приводить к повышению устойчивости.
Определение интенсивности фотосинтеза и дыхания по скорости СО2 газообмена Изменения, вызванные введением гена десатуразы, отразились не только на структуре, но и на фотосинтетической функции хлоропластов. С точки зрения изуче ния фотосинтетических процессов, важным показателем холодоустойчивости являет ся более высокое соотношение интенсив ности фотосинтеза и дыхания (P/R) у рас тений, подвергнутых низкотемпературно му воздействию.
Результаты эксперимента показали, что после 5-дневного пребывания расте ний в условиях пониженной температуры (8С) соотношение фотосинтез/дыхание у трансформантов было выше, чем у кон трольных растений (рис. 4). Преобладание Рис 4. Соотношение интенсивности фо- фотосинтетических процессов свидетель тосинтез/дыхание (P/R) у контрольных и ствует о том, что пластическо desA-licBM3-растений картофеля в норме энергетический обмен растений и при гипотермии ( – 24С, – 8С). трансформантов является более активным.
Это, во-первых, служит предпосылкой для формирования холодоустойчивости расте ний и накопления в них веществ, защищающих от низкотемпературного стресса (ос молитов, криопротекторов и других), а, во-вторых, может свидетельствовать о том, что ЭТЦ хлоропластов трансформированных растений при гипотермии работают бо лее стабильно, чем у контрольных растений.
Влияние 12-ацил-липидной десатуразы на показатели индуцированного гипотермией окислительного стресса у растений картофеля Известно, что существует обратная корреляция между устойчивостью растений и индуцированной низкими температурами интенсивностью свободно-радикальных процессов в клетках. В связи с этим, представляется возможным оценить участие 12-ацил-липидной десатуразы в формировании низкотемпературной устойчивости по показателям окислительного стресса. Кроме того, детальное изучение процессов окислительного стресса, может раскрыть некоторые механизмы повышенной холодо стойкости того или иного генотипа.
Согласно современным представлениям, причиной повреждения растений при низких температурах считается нарушение структурно-функционального состояния мембран, возникающее при интенсификации свободно-радикальных процессов, ин дуцируемых АФК (Скулачев, 1996;
Мерзляк, 1999;
Лукаткин, 2002). Одним из первых соединений, появляющихся в результате свободно-радикальных процессов, является супероксид-анион. При действии холода в клетках растений происходит разобщение в работе цепей переноса электронов (Suzuki, Mittler, 2006). При этом в ЭТЦ митохон дрий и хлоропластов (Foyer et al., 2006), а также при участии различных НАДФH оксидаз (Apel, Hirt, 2004) лишний электрон "сбрасывается" на молекулярный кисло род, что ведет к образованию супероксида. Последний, в свою очередь, является своеобразной базой для генерации остальных АФК (Pastori et al., 2000). В связи с этим, важным показателем инициации окислительного стресса является скорость об разования радикальных форм кислорода (прежде всего, супероксидного аниона) в растительных клетках.
На рис. 5 можно видеть, что скорость образования супероксидного радикала, как в листьях растений дикого типа, так и у транс формантов, в нормальных условиях имела сходные значения. Однако после гипотерми ческого воздействия этот показатель значи тельно вырос (на 55%) у контрольных расте ний, тогда как у трансформантов достоверно не изменился. Мы связываем это со стабили зацией работы мембран трансформантов при Рис. 5. Скорость образования супер- гипотермии, вызванной повышенной актив оксидного аниона в листьях кон ностью 12-ацил-липидной десатуразы, трольных и desA-licBM3-растений обеспечивающей более высокую степень не картофеля в норме и после охлажде ния ( – 24С, – 20 мин, –9С). насыщенности ЖК мембранных липидов.
Другая форма активированного кисло рода, перекись водорода, являющаяся результатом ферментативной деградации су пероксида супероксиддисмутазой, способна повреждать белки, нуклеиновые кислоты и липиды. Она легко проникает через биологические мембраны и окисляет важные биополимеры не только в месте ее образования, но и в соседних компартментах и клетках, что может в разы увеличивать степень "окислительного" повреждения расти тельных тканей при стрессе.
В наших опытах содержание перекиси водорода при гипотермии а листьях кон трольных растений увеличилось более чем на 80% по сравнению с нормальными условия ми выращивания. У трансформированных растений это увеличение было не столь зна чительным (рис. 6). Полученные результаты согласуются с данными, представленными на рис 5., согласно которым скорость генерации супероксида при стрессе сильно увеличива Рис 6. Содержание перекиси водо лась у растений дикого типа, а у трансгенных рода в листьях контрольных и desA-licBM3-растений картофеля в оставалась примерно на том же уровне, что и норме и после охлаждения в нормальных условиях.
( – 24С, – 20 мин, –9С). Таким образом, изучение двух основных показателей окислительного стресса свидетельствует о более слабой его интенсивно сти при гипотермии у трансформированных растений, мембранные липиды которых обогащены ПНЖК.
Мы предположили, что снижение генерации избыточных количеств АФК при низкотемпературном стрессе, должно отразиться на процессах перекисного окисле ния мембранных липидов. В данной работе были изучены первичные и конечные продукты, образующиеся в результате реакций ПОЛ.
Показано, что содержание первичных продуктов ПОЛ – диеновых конъюгатов ЖК, возникающих при непосредственном образовании липогидроперекисей, практи чески не изменилось у трансформированных растений при действии низких температур, тогда как в листьях контрольных растений наблюдалось увеличение этого показателя почти на 50% (рис.7). Следует отметить, что определение содержания диеновых конъю Рис 7. Содержание диеновых конъюга- гатов (ДК) имеет важное значение для оцен тов ЖК в листьях контрольных и desA licBM3-растений картофеля в норме и ки ПОЛ, поскольку отражает раннюю ста – 20 дию окисления (Владимиров, 1989).
после охлаждения ( – 24С, мин, –9С). Данные по изучению диеновой конъю гации свидетельствуют о том, что активность 12-ацил-липидной десатуразы, по видимому, может оказывать заметное стабилизирующее воздействие на липиды мем бран и предотвращать их деградацию в ходе окислительного стресса, вызванного низкими температурами.
Конечным стабильным продуктом ПОЛ является малоновый диальдегид (МДА), содержание которого в клетках растений является одним из важнейших пока зателей их устойчивости к действию низких температур (Лукаткин, 2002). Увеличе ние количества МДА в клетках при стрессе свидетельствует о деструкции липидных компонентов биомембран в результате окис лительного стресса и о более слабой устой чивости растений к гипотермии.
Изменение содержания МДА при гипо термии имеет ту же тенденцию, что и показа тели диеновой конъюгации ЖК. Количество МДА у контрольных растений при действии низких температур увеличилось более чем на Рис 8. Содержание малонового ди альдегида в листьях контрольных 75% по сравнению с нормальными условия и desA-licBM3-растений картофеля ми выращивания. У трансформантов повы в норме и после охлаждения шение концентрации МДА в клетках было ( – 24С, – 20 мин, –9С).
незначительным (рис. 8).
Таким образом, изменения в структуре мембран, вызванные экспрессией гена 12-ацил-липидной десатуразы, способствовали предотвращению инициации окисли тельного стресса при гипотермии и следующего за ним перекисного окисления липи дов.
Изучение активности антиоксидантных ферментов у контрольных и транс формированных растений при гипотермии Содержание АФК при действии низких температур в значительной степени определя ется уровнем активности антиоксидантной сис темы растительных клеток. Поэтому было не обходимо провести анализ активности основ ных ферментов антиоксидантной защиты (су пероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы гваякола), участвующих в детоксикации АФК.
Основным антиоксидантным ферментом является супероксиддисмутаза, которая инак Рис 9. Активность супероксиддис тивирует супероксидный анион-радикал с обра мутазы в листьях контрольных и зованием перекиси водорода.
desA-licBM3-растений картофеля в норме и после охлаждения ( – В наших опытах повышение активности 24С, – 20 мин, -9С).
фермента в условиях гипотермии наблюдалось только у контрольных растений, тогда как в ли стьях растений, трансформированных геном 12-ацил-липидной десатуразы, возрас тание активности СОД было выражено в гораздо меньшей степени (рис. 9). Следует отметить, что транскрипция генов СОД чувствительна к окислительному стрессу и во многом зависит от интенсивности этого процесса (Scandalios, 1993). Учитывая тот факт, что содержание субстрата СОД – супероксидного радикала – на фоне действия повреждающих температур также было повышено только у контрольных растений, (рис. 5), наблюдаемые изменения в активности СОД при гипотермии можно объяс нить тем, что низкотемпературное воздействие не вызвало у трансформантов, в отли чие от растений дикого типа, сильного окислительного стресса.
Каталаза, как фермент антиоксидантной защиты, отвечает за утилизацию избы точных количеств перекиси водорода. Повышение активности каталазы после охлаж дения растений, отмеченное в литературе (Лукаткин, 2002), связывают с увеличением количества Н2О2 в результате развития окислительного стресса.
Результаты анализов показывают, что в условиях гипотермии уровень активно сти каталазы в листьях контрольных растений возрос приблизительно в 2 раза, тогда как у трансформантов активность этого фермента увеличилась незначительно (рис.
10).
Изменения активности ещё одного ан тиоксидантного фермента, участвующего в детоксикации перекиси водорода, мембран связанной пероксидазы гваякола, имеют сходную тенденцию с показателями актив ности каталазы (данные не представлены).
Высокую степень сходства в характере изменений активности гваякол-пероксидазы и каталазы можно объяснить тем, что оба эти фермента, нейтрализующие перекись Рис 10. Активность каталазы в листьях контрольных и desA-licBM3-растений водорода, в равной степени, конкурируют за картофеля в норме и после охлаждения субстрат.
( – 24С, – 20 мин, -9С).
Влияние 12-ацил-липидной десату разы на устойчивость растений картофеля к гипотермии Повышенная устойчивость растений к окислительному стрессу, как правило, со четается с их более высокой устойчивостью к гипотермии. Одним из наиболее рас пространенных методов исследования устойчивости теплолюбивых и холодостойких растений к низким температурам является определение уровня повреждений расти тельных тканей по изменению проницаемости клеточных мембран, что отражается на последующем выходе электролитов из клеток.. Основываясь на том, что гипотерми ческое воздействие, приводящее к интенсификации ПОЛ, должно предшествовать повреждениям листовых пластинок и выходу электролитов из клеток, в данном опыте мы продлили температурную экспозицию при -9С до 40 мин (вместо 20 мин в пре дыдущих экспериментах).
Данные, представленные на рис. 11, показывают, что предложенное нами в этом эксперименте низкотемпературное воздей ствие вызвало значительные повреждения листовых пластин контрольных растений и практически не отразилось на состоянии трансформантов. Таким образом, можно сделать вывод, что трансформированные растения проявили большую устойчивость к гипотермии по сравнению с контрольным Рис 11. Индексы повреждений листо вариантом.
вых пластин контрольных и desA Это было подтверждено и прямым ме licBM3-растений картофеля в норме и после охлаждения ( – 24С, – 40 тодом определения выживаемости кон мин, -9С).
трольных и трансформированных растений после холодового воздействия -9С в Таблица 3. Процент выживаемости кон трольных и desA-licBM3-растений картофеля течение 60 минут. Анализ 80 растений после действия гипотермии каждого варианта показал, что выжи (–9С, 60 минут) ваемость контрольных растений не Выживаемость, % достигала и 20%, в то время как трансформантов выжило более 70% Контроль 17± (таблица 3).
77± desA-licBM Таким образом, экспрессия гете рологичного гена desA 12-ацил липидной десатуразы в тканях растений картофеля способствует стабилизации соста ва и функций мембран, тем самым защищая их от негативного воздействия активных кислородных радикалов при гипотермии, что повышает выживаемость растений по сле действия низких температур.
Роль десатуразы в предотвращении окислительного стресса, индуцирован ного паракватом Для подтверждения протекторной роли 12-ацил-липидной десатуразы в пре дотвращении генерации избыточных количеств АФК при низкотемпературном стрес се у растений картофеля, была применена модельная система, инициирующая окис лительный стресс без охлаждения растений. Такой системой явилась обработка рас тений паракватом, гербицидные свойства которого связаны с его способностью полу чать электрон от доноров ЭТЦ хлоропластов и передавать его на молекулу кислорода с образованием супероксидного аниона. В экспериментах использовалась концентра ция параквата 1 мМ, которая в предварительно проведённых опытах вызывала наибо лее существенные различия в реакциях исследуемых генотипов. Применение подоб ной системы может дать более чёткое представление о развитии процессов ПОЛ в растительных тканях и о роли цианобактериальной 12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении повреждений мембран при действии оксидативного стресса. У обоих генотипов растений определяли основные показатели окислительного стресса (ско рость образования супероксида, накопление МДА и диеновых конъюгатов) и работу ферментативной составляющей антиоксидантной системы (активность СОД, катала зы, гваякол-пероксидазы).
Согласно нашим данным, скорости образования супероксидного радикала до обработки паракватом у контрольных и трансформированных растений отличались незначительно (рис. 12). После обработки гербицидом этот показатель вырос у обоих генотипов растений, но если скорость образования О2.- в листьях трансформантов увеличилась на 25%, то у контрольных растений увеличение достигло 65%.
Количество диеновых конъюгатов, от ражающее раннюю стадию окисления ЖК мембранных липидов, увеличилось при дей ствии параквата в гораздо большей степени (на 67%) у нетрансформированных растений.
У трансформантов прирост этого показателя оказался не столь значительным (на 23%) (рис. 13).
В применённой нами модельной системе (как и при действии гипотермии) мембранные Рис. 12. Скорость образования супер- структуры desA-licBM3-растений оказались оксида в листьях контрольных и desA более устойчивыми к действию окислитель licBM3-растений картофеля до и после обработки паракватом ( – до обра- ного стресса уже на начальных этапах, что должно затормозить дальнейшую деградацию ботки, – 1 мМ паракват).
мембран в ходе процессов перекисного окис ления липидов.
Действительно, содержание МДА, от ражающее позднюю и уже необратимую ста дию окисления мембранных липидов, более чем в 2 раза увеличилось у контрольных рас тений после обработки паракватом, тогда у трансформантов этот показатель изменился в гораздо меньшей степени (рис. 14).
Рассматривая эти данные и сравнивая Рис. 13. Содержание диеновых их с предыдущими результатами по оценке конъюгатов ЖК в листьях контроль окислительного стресса, полученными при ных и desA-licBM3-растений карто действии низкой температуры, можно сде феля до и после обработки параква том ( – до обработки, – 1 мМ лать вывод, что трансформация растений паракват).
цианобактериальным геном desA 12-ацил липидной десатуразы влияет на стабилиза цию мембранных структур растительных клеток, за счёт чего при действии параквата, равно как и при гипотермии, предотвращается избыточная генерация АФК уже на на чальных стадиях, что не даёт оснований к дальнейшему развитию окислительного стресса и препятствует необратимым повреждениям тканей трансформированных растений картофеля.
Показатели активности основных ферментов антиоксидантной системы при об работке растений паракватом также имели сходную тенденцию с этими же данными при действии гипотермии.
Обработка паракватом, вызвавшая значительное усиление генерации АФК в клетках нетрансформированных растений (рис. 12), способствовала повышению ак тивности СОД у контрольного варианта поч ти на 80%. В листьях трансформантов изме нение этого показателя было менее заметным (рис. 15).
На рис. 16, отражающем изменение ак тивности каталазы при обработке параква том, мы также можем видеть значительное повышение активности фермента у кон трольного варианта, тогда как у трансформи Рис 14. Содержание малонового ди- рованных растений увеличение активности альдегида в листьях контрольных и каталазы было не столь значительным.
desA-licBM3-растений картофеля до и Изменение активности гваякол после обработки паракватом ( – до обработки, – 1 мМ паракват). пероксидазы в опытах с применением пара квата имеет сходный рисунок с активностью каталазы в этих условиях (данные не пред ставлены).
В общем, как и в опытах с гипотермией, при действии параквата активность основных ферментов антиоксидантной защиты была значительно повышена у нетрансформиро ванных растений. По нашему мнению, трансформанты не нуждались в столь силь ном увеличении активности антиоксидант ных ферментов, поскольку окислительный Рис. 15. Активность супероксид стресс у них был выражен в гораздо меньшей дисмутазы в листьях контрольных и desA-licBM3-растений картофеля до и степени по сравнению с контрольными рас после обработки паракватом ( – до тениями.
обработки, – 1 мМ паракват).
Подводя итоги проделанной работы, можно заключить, что гетерологичная 12 ацил-липидная десатураза способствует уве личению содержания ПНЖК в мембранных липидах, что приводит к более стабильному функционированию мембранных структур и в значительной степени предотвращает “сброс” электрона на кислород и повышен ное образование АФК в условиях стресса.
Рис. 16. Активность каталазы в ли стьях контрольных и desA-licBM3 растений картофеля до и после обра ботки паракватом ( – до обработки, – 1 мМ паракват).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Несмотря на большое количество работ, посвященных исследованию окисли тельного стресса, возникающего при охлаждении теплолюбивых растений, особенно сти этого процесса и механизмы защиты от него у холодостойких растений практиче ски мало изучены. При этом данные о роли десатураз в формировании терморези стентности холодостойких растений, а также механизмы проявления протекторного действия конкретных ферментов, осуществляющих десатурацию жирных кислот биомембран, нуждаются в существенном дополнении. В наибольшей степени, это от носится к ацил-липидным десатуразам, функциональная активность которых имеет решающее значение в поддержании текучести мембран в период действия низких температур (Lyons, 1976). В связи с этим, использующийся в данной работе типичный представитель группы холодостойких растений картофель (Solanum tuberosum L., сорт Десница), экспрессирующий ген desA 12-ацил-липидной десатуразы цианобак терии Synechocystis sp. PCC 6803, явился удачной моделью для изучения роли 12 ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости холодостойких растений к окислительному стрессу, индуцированному гипотермией.
В ходе исследований показано, что экспрессия в тканях растений картофеля ге терологичного гена desA 12-ацил-липидной десатуразы приводила к увеличению до ли полиненасыщенных жирных кислот в мембранных липидах (в особенности 18:2 и 18:3), а также индекса их ненасыщенности и общего количества жирных кислот.
Повышение уровня содержания ЖК привело к увеличению мембранных струк тур хлоропластов (в частности, гран и тилакоидов) трансформированных растений.
Структурно-функциональная стабильность мембран трансформированных растений картофеля, обусловленная активностью 12-ацил-липидной десатуразы, способство вала предотвращению избыточной генерации АФК, что привело к снижению интен сивности окислительного стресса и перекисного окисления липидов при гипотермии.
За счёт этого трансформанты приобрели повышенную устойчивость и выживаемость после действия низких температур.
Применение модельной системы (обработка разобщающим агентом – параква том) для инициации окислительного стресса без участия низкой температуры позво лило подтвердить важную роль цианобактериальной 12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении формирования избыточных количеств АФК при стрессе и защите важнейших биологических мембран от деструктивного действия процессов свобод норадикального окисления.
Каким же образом реализуется стресс-протекторное действие введённого в рас тения картофеля гена 12-ацил-липидной десатуразы? Анализ полученных в ходе экспериментальной работы данных позволил впервые сформулировать гипотетиче ский механизм влияния экспрессии гетерологичного гена desA 12-ацил-липидной Рис. 17. Гипотетическая схема влияния экспрессии гена desA 12-ацил-липидной десату разы на поддержание структуры и функций клеточных мембран растений картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Десница).
I. Транскрипция гена desA происходит в ядре, затем мРНК выходит из ядра через ядерные поры и попадает на рибосомы ЭПР II. На рибосомах происходит трансляция белка 12-ацил-липидной десатуразы, после чего ли пофильный белок попадает в мембранные структуры ЭПР, где катализирует образование вто рой двойной связи линолевой (18:2) кислоты. По-видимому, далее происходит образование линоленовой (18:3) кислоты за счёт активности собственных растительных десатураз III. Образовавшиеся ПНЖК в составе липосом транспортируются в аппарат Гольджи, где проис ходит их перераспределение IV. Далее липосомы переносят ПНЖК из аппарата Гольджи в мембранные структуры клеточных органелл (митохондрии, хлоропласты, цитоплазматическая мембрана). По-видимому, таким же образом в составе липосом способен переноситься и белок 12-ацил-липидной десатура зы.
десатуразы цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 на повышение устойчивости трансформированных растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному действием гипотермии (рис. 17).
Очевидно, что целевой ген desA при трансформации растений картофеля встроился в ядерный геном. Соответственно, процесс транскрипции происходит в яд ре растительной клетки. После завершения транскрипции мРНК выходит из ядра че рез ядерные поры и попадает на рибосомальный аппарат эндоплазматического рети кулума, где и происходит трансляция белка 12-ацил-липидной десатуразы. Следует отметить, что по структуре и функциям цианобактериальная 12-ацил-липидная де сатураза (ген desA) напоминает 12-ацил-липидную десатуразу растений (ген fad2) (Лось, 1997). По-видимому, после завершения трансляции она, подобно растительно му ферменту, попадает с рибосомального аппарата в ЭПР, где и осуществляет образо вание линолевой (18:2) кислоты из олеата (18:1). В дальнейшем, растительные деса туразы могут образовать из линолевой линоленовую (18:3) кислоту. Затем образо вавшиеся ПНЖК в составе всевозможных везикул и липосом транспортируются в ап парат Гольджи, откуда происходит дальнейшее их перемещение с последующим встраиванием в мембранные структуры клетки (плазмалемму, митохондрии, хлоро пласты). Таким же образом из ЭПР и аппарата Гольджи во внешние мембранные структуры может переноситься и сама десатураза.
Таким образом, показано, что постоянное поддержание текучести мембран по средством активной работы 12-ацил-липидной десатуразы имеет большое значение в формировании устойчивости растений картофеля к окислительному стрессу, разви вающемуся в ходе охлаждения. Это происходит благодаря увеличению жидкостных свойств мембран за счёт повышенной активности 12-ацил-липидной десатуразы, что, во-первых, способствует снижению интенсивности образования активных форм кислорода при низкотемпературном стрессе, а во-вторых, обеспечивает текучесть мембран при охлаждении, тем самым, сохраняя клеточный гомеостаз и поддерживая функциональную активность мембран-связанных белков в условиях гипотермии. Всё это в конечном итоге приводит к повышению устойчивости к действию низких тем ператур картофеля, как типичного представителя группы холодостойких растений.
ВЫВОДЫ 1. Подтверждено наличие и экспрессия гена desA 12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. в тканях трансформантов картофеля с помощью методов ПЦР, ОТ-ПЦР и анализа продуктов реакции десатурации.
2. Трансформированные растения отличались от контроля повышенным содержани ем в листьях полиненасыщенных ЖК, общего количества ЖК, а также индекса их ненасыщенности.
3. Повышение общего количества ЖК в листьях трансформантов отразилось на структуре хлоропластов: отмечено увеличение по сравнению с контролем коли чества пластоглобул, гран, числа тилакоидов в гране и общего количества тила коидов.
4. Изменения в структуре хлоропластов, вызванные введением гена десатуразы, от разились на фотосинтетической функции растений: трансформанты отличаются от контроля более высоким отношением интенсивности фотосинтеза к темновому дыханию при гипотермии, что служит показателем повышенной устойчивости мембран к действию низкой температуры.
5. Повышение структурно-функциональной стабильности мембран трансформиро ванных растений картофеля, вызванное действием 12-ацил-липидной десатура зы, способствовало предотвращению избыточной генерации АФК, что вырази лось в меньшей, по сравнению с контролем, интенсивности окислительного стресса и перекисного окисления липидов при гипотермии.
6. Трансформированные растения более устойчивы к гипотермии по сравнению с нетрансформированным контролем, что подтверждено рядом косвенных методов, а также путём прямого охлаждения растений.
7. Эксперименты по обработке растений паракватом, вызывающим окислительный стресс без воздействия низкой температуры, подтвердили протекторную роль 12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении генерации избыточных коли честв АФК, что выразилось в гораздо меньшей интенсивности образования су пероксидного аниона, а также начальных и конечных продуктов ПОЛ у транс формантов.
По материалам диссертации опубликованы следующие работы:
1. Дёмин И.Н., Антипина О.В., Маали А.Р., Юрьева Н.О., Дерябин А.Н., Синькевич М.С. (2007) Сравнительный анализ устойчивости к гипотермии разновозрастных ли стьев трансформантов картофеля с введенным геном 12-ацил-липидной десатуразы.
VII Международный Симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». Материалы симпозиума. М.: Изд-во Рос. ун-та Дружбы народов.
Т. 2. С. 121-125.
2. Demin I.N., Deryabin A.N., Sinkevich M.S.,. Antipina O.V, Trunova T.I. (2007) The en hancement of plant tolerance to hypothermic stress by the introducing of 12-acyl-lipid de saturase gene. 2-й Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности». Тезисы докладов. Москва.. С. 34.
3. Дёмин И.Н., Антипина О.В., Дерябин А.Н., Синькевич М.С., Трунова Т.И. (2007) Применение метода выхода электролитов для определения устойчивости холодо стойких растений к гипотермии. Международная Конференция «Современная фи зиология растений: от молекул до экосистем». Материалы докладов в трёх частях.
Сыктывкар. Ч. 2. С. 107-110.
4. Sinkevich M.S., Deryabin A.N., Demin I.N., Trunova T.I. (2007) Chilling tolerance differ ences of varied potato cultivars and its genotypes acquired through transformation. Abst.
2nd Intern. Symp. “Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Ap plying in Agriculture” 8-12 October, Kyiv, Ukraine. P. 89.
5. Sinkevich M.S., Deryabin A.N., Demin I.N., (2007) Trunova T.I. Effect of potato plant transformation by yeast invertase and delta-12-acyl-lipid desaturase genes at generation of reactive oxygen species during hypothermia. Abstr. 2nd Intern. Symp. “Plant Growth Sub stances: Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture” 8-12 October, Kyiv, Ukraine. P. 111.
6. Дёмин И.Н., Дерябин А.Н., Синькевич М.С., Трунова Т.И. (2008) Введение гена desA ацил-липидной десатуразы цианобактерии повышает устойчивость растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному гипотермией. Физиология расте ний. Т. 55. №5. С. 710-720.
7. Дёмин И.Н. (2008) Содержание диеновых конъюгатов в листьях растений картофе ля, трансформированных геном desA, при гипотермии. Материалы VIII Междуна родной конференции «Интродукция нетрадиционных и редких растений», г. Мичу ринск, 8-12 июня. T. 3. C. 32-36.
8. Демин И.Н. (2008) Дерябин А.Н., Синькевич М.С., Трунова Т.И.. Влияние гипотер мии на генерацию супероксидного радикала и активность супероксиддисмутазы в листьях растений картофеля, траснформированного геном 12-десатуразы. Мате риалы VIII Международной конференции «Интродукция нетрадиционных и редких растений». г. Мичуринск, 8-12 июня,. T. 3. C. 36-40.
9. Дёмин И.Н., Юрьева Н.О., Дерябин А.Н., Синькевич М.С., Трунова Т.И. (2008) Экс прессия гена дельта-12-десатуразы цианобактерии в трансформантах картофеля сни жает интенсивность совбоднорадикальных процессов. IX международная конферен ция "биология клеток in vitro и биотехнология". Звенигород. 8-12 ноября. Сборник тезисов. C. 108-109.
10. Дёмин И.Н., Дерябин А.Н., Синькевич М.С., Трунова Т.И. (2008) Влияние экспрес сии гена desA в листьях растений картофеля на интенсивность свободнорадикальных процессов при гипотермии. Годичное собрание ОФР "Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений". Тезисы докладов международ ной научной конференции. Екатеринбург. 6-10 0ктября. C. 157-158.
11. Маали Амири Р., Голденкова-Павлова И.В., Юрьева Н.О., Пчёлкин В.П., Цыдендам баев В.Д., Дерябин А.Н., Дёмин И.Н., Трунова Т.И., Лось Д.А., Носов А.М. (2008) Экспрессия гена ацил-липидной десатуразы Synechocystis sp. PCC 6803 повышает устойчивость растений картофеля к холодовому стрессу. Тезисы докладов междуна родной научной конференции "Физико-химические основы структурно функциональной организации растений". Екатеринбург. 6-10 0ктября. C. 255-256.
12. Юрьева Н.О., Дерябин А.Н., Мали Амири Реза, Голденкова-Павлова И.В., Соболько ва Г.И., Дёмин И.Н. (2008) Холодостойкость трансгенных растений картофеля, экс прессирующих модифицированный ген DES-A. IX международная конференция "биология клеток in vitro и биотехнология". Звенигород. 8-12 ноября. Сборник тези сов. C. 454-455.
13. Demin I. N. (2008) The content of dienoic and trienoic conjugates in leaves of potato plants transformed with a gene of 12-acil-lipid desaturase under hypothermia. Abst. Int.
Sc. Conf. «Actualities in Plant Physiology». Lithuanian Soc.Plant Physiol., Babtai, June 12 13. P.53.
14. Шимшилашвили Х.Р., Демин И.Н. (2008) Создание трансгенных растений картофеля устойчивых к стрессовым факторам. Международная школа-конференция молодых учёных: "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях". Звенигород. 7-12 декабря. Сборник тезисов. С. 79.
15. Sinkevich M.S., Deryabin A.N., Demin I.N., Trunova T.I. (2009) Dynamics of Superoxide Dismutase and Catalase Activities during Acclimation to Hypothermia of Wild-Type and Transformed Potato Plants. Vagos. V. 83 (36). P. 72-76.