Исследование мутаций в генах гемохроматоза и рецептора трансферрина 2 в популяциях центральной евразии и у больных многофакторными заболеваниями

На правах рукописи

ХУСНУТДИНОВА НАТАЛЬЯ НИКОЛАЕВНА ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ ГЕМОХРОМАТОЗА И РЕЦЕПТОРА ТРАНСФЕРРИНА 2 В ПОПУЛЯЦИЯХ ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЕВРАЗИИ И У БОЛЬНЫХ МНОГОФАКТОРНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа- 2012 2

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Хуснутдинова Эльза Камилевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Мустафина Ольга Евгеньевна доктор биологических наук, профессор Спицын Виктор Алексеевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится « » февраля 2012 г. в «_» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: www.ibg.anrb.ru/dissov.html, e-mail: [email protected].

Автореферат разослан «_» января 2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Наследственный гемохроматоз (НГХ) является одним из частых заболеваний обмена веществ, встречается с частотой 3-8 случаев на 1000 человек в европейских популяциях (Balan, 1994;

Baer, 1995;

Beutler, 2002;

Delatycki, 2005;

Bacon, 2011). Патогенетической характеристикой НГХ является увеличение абсорбции железа, приводящее к прогрессирующему накоплению его в различных органах и развитию цирроза печени, диабета, кардиомиопатий, артрозов и эндокринных нарушений (Pietrangelo, 2004;

Adams, 2007;

Olynyk, 2008;

Andrews, 2008). Для НГХ характерна высокая генетическая гетерогенность с различным уровнем пенетрантности (European Association For The Study Of The Liver, 2010). Существуют несколько форм НГХ, ассоциированных с различными генами и типами наследования. Самая распространенная форма НГХ (более 95% всех случаев) – тип 1, вызываемая дефектами в гене HFE (Simon, 1996). Продукт гена HFE - трансмембранный гликопротеин HFE, который является регулятором поглощения железа (Parkkila, 1997;

Feder, 1998;

Lebron, 1998). В настоящее время в гене HFE выявлено 11 мутаций, сцепленных с заболеванием. В 60-96% случаев НГХ больные европеоидного происхождения являются гомозиготами по мутации C282Y и 5% - компаунд-гетерозиготами по мутациям C282Y, H63D и S65C гена HFE (Beutler E, 1996;

Bacon BR. 1999;

Pietrangelo, 2010). Роль мутаций H63D и S65C гена HFE в развитии нарушений метаболизма железа недостаточно изучена, результаты многочисленных исследований противоречивы (Mura, 1999;

Gochee, 2002;

Samarasena, 2006). Индивиды, носители мутаций H63D и S65C гена HFE, имеют повышенную вероятность развития «мягкой» формы гемохроматоза, фенотипические проявления которой, судя по всему, зависят от влияния факторов внешней среды и каких-либо дополнительных генетических модифицирующих факторов (Waheed, 1997;

Bonkovsky, 2002). Вследствие гетерозиготных мутаций в гене гемохроматоза (HFE) небольшие количества железа могут аккумулироваться, способствуя увеличению тяжести или прогрессированию «негемохроматозных» заболеваний (Ellervik, 2007;

Sikorska, 2011;

Ishizu, 2011). Существуют выраженные этнические различия в распространенности мутаций C282Y, H63D и S65C гена HFE в популяциях мира, наиболее часто встречающихся в европейских популяциях, реже - у народов Юго-Восточной Азии и очень редко - в популяциях Африки, Центральной и Южной Америки (Beckman, 1999;

Chandok, 2011).

Известно существование нескольких форм НГХ, не связанных с мутациями в гене HFE, а развивающихся из-за повреждения других генов белков, участвующих в обмене железа, таких как ферропортин-1, трансферриновый рецептор 2 и гепсидин (Roetto, 1999;

Camaschella, 2000;

Mattman, 2000;

Donovan, 2000;

Kato, 2001).

Одновременно, поскольку железо играет важную роль в функционировании клетки, изменения в содержании железа могут играть патофизиологическую роль в развитии не только НГХ, но и ряда многофакторных заболеваний. (Kohgo, 2008).

Объяснение генетических основ НГХ вызвало новый интерес ко всем аспектам этого заболевания. Несмотря на значительный прогресс в понимании регуляции метаболизма железа и молекулярных основ различных форм НГХ, остается открытым ряд ключевых вопросов, касающихся распространенности и происхождения мутаций в генах, ответственных за развитие заболевания.

В настоящее время в Волго-Уральском регионе и Средней Азии гемохроматоз клинически не диагностируется, во многих популяциях Восточной Европы данные как по распространенности заболевания, так и по частоте гетерозиготного носительства мутаций в ответственных генах отсутствуют. В связи с этим является актуальным изучение распространенности наиболее частых мутаций в гене HFE, оценка их гетерозиготного носительства в различных популяциях Евразии, а также функциональной значимости мутаций в генах НГХ, в развитии широко распространенных социально значимых заболеваний человека.

Целью исследования является оценка распространенности мутаций в генах гемохроматоза (HFE) и рецептора трансферрина 2 (TfR2), ассоциированных с наследственным гемохроматозом, в различных популяциях Центральной Евразии и их вклада в развитие ряда многофакторных заболеваний.

Задачи исследования:

1. Оценить распространенность мутаций C282Y (с.845GA, rs1800562) и H63D (c.187CG, rs1799945) в гене HFE в популяциях Центральной Евразии.

2. Провести генотипирование полиморфных локусов с.340+4TC (rs2071303, IVS2(+4)TC), c.893-44TC (rs1800708, IVS4(-44)TC), c.1007-47GA (rs1572982, IVS(-47)AG) в гене HFE и анализ их гаплотипов у индивидов, гомозиготных по мутации H63D в гене HFE.

3. Провести анализ распространенности мутации S65C (c.193AT, rs1800730) в гене HFE в популяциях Волго-Уральского региона.

4. Определить частоту мутаций C282Y (с.845GA, rs1800562), H63D (c.187CG, rs1799945), S65C (c.193AT, rs1800730) в гене гемохроматоза (HFE) и Y250X (c.750CG) в гене рецептора трансферрина 2 (TfR2) у больных сахарным диабетом 2 типа, хронической сердечной недостаточностью и циррозом печени.

5. Оценить значимость мутаций в генах HFE и TfR2 в развитии изученных многофакторных заболеваний.

Научная новизна исследования. Впервые получены сведения о распространенности мутаций C282Y, H63D в гене HFE в популяциях Центральной Евразии и мутаций S65C в гене HFE и Y250X в гене TfR2 в Волго-Уральском регионе России. Выявлено три гаплотипа, сцепленных с мутацией H63D, на основе исследования полиморфных вариантов с.340+4TC (rs2071303), c.893-44TC (rs1800708), c.1007-47GA (rs1572982) гена HFE, что свидетельствует о неоднократном возникновении данной мутации на территории Центральной Евразии. Проведена оценка значимости мутаций C282Y, H63D, S65C в гене HFE и Y250X в гене TfR2 в развитии сахарного диабета 2 типа, цирроза печени и различных типов ремоделирования сердца при хронической сердечной недостаточности в РБ с учетом этнической принадлежности больных.

Научно-практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить имеющиеся знания о распространенности мутаций в гене HFE в популяциях Волго-Уральского региона, Центральной Азии и Восточной Европы, а также проливают свет на происхождение мутации H63D гена HFE в Центральной Евразии. Результаты исследования могут быть внедрены в практику медицинских учреждений и использованы для проведения медико-генетического консультирования. Материалы диссертации могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских учебных заведениях и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на съезде Российского общества медицинских генетиков V (Уфа, 2005), Международных конференциях европейского общества генетиков человека «European Human Genetics Conference» (Прага, Чехия, 2005;

Амстердам, Нидерланды, 2006;

Барселона, Испания, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы ( источников, в том числе 11 отечественных и 274 зарубежных). Иллюстративный материал содержит 11 рисунков и 23 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования. Анализ распространенности мутаций в гене HFE проведен с использованием образцов ДНК 2164 человек из 20 популяций России и бывших Республик СССР, полученных от практически здоровых неродственных индивидов, собранных во время экспедиционных выездов 2001-2004 годов, а также предоставленных Республиканским Центром охраны здоровья матери и ребенка Минздрава Республики Казахстан, Алматы (табл.1).

Таблица Объемы выборок и характеристика исследованных популяций Популяции Место забора материала Языковая N* N* N* принадлежность C282Y H63D S65C башкиры Бурзянский, Илишевский 79 79 районы, Башкортостан татары Альметьевский, Елабужский 110 110 районы, Татарстан чуваши Цивильский район, Чувашия 56 якуты дисперсная выборка из 84 Республики Саха (Якутия) казахи Жамбыльский, Жалагашский, 258 Абайский районы, Казахстан тюркская ветвь алтайской уйгуры Алматинская область, 116 языковой семьи Казахстан туркмены Чарджоуская область, 18 Узбекистан узбеки дисперсная выборка из 81 Узбекистана киргизы Ферганская область, 31 Узбекистан таджики Самаркандская область, 42 Узбекистан курды Алматинская область, иранская группа 49 Казахстан индоевропейско й языковой молдаване Тянгушевский район, 94 семьи Молдавия коми Коми-пермяцкий романская 51 автономный округ, Коми языковая семья удмурты Шарканский район, 61 Удмуртия мордва Старошайгинский район, 42 Мордовия финно-угорская ветвь уральской марийцы Звениговский район, Мари- 56 языковой семьи Эл карелы Кандопожский, 100 Прионежский районы, Карелия русские Архангельский район, 51 51 Башкортостан славянская ветвь индоевропейско белорусы дисперсная выборка из 96 й языковой Белоруссии семьи украинцы Полтавский район, Украина 94 Примечание: *число индивидов, генотипированных по мутациям гена HFE В работе также использована ДНК 406 больных, представляющих 3 группы высокого риска развития наследственного гемохроматоза и 519 индивидов без признаков хронических заболеваний в качестве контрольной выборки (табл.2).

Таблица Численность и характеристика больных с многофакторными заболеваниями Заболевание Количество Средний Пол Этиология заболеваний возраст цирроз печени 46 м 52 вирусной, 48 невирусной 100 45, 54 ж этиологии (ЦП) хроническая 60 лет 170 м 82 с эксцентрической гипертрофией сердечная 33 ж ЛЖ (ОТС менее 0.45, дилатация недостаточность ЛЖ), 107 с концентрической гипертрофией ЛЖ (ОТС более 0.45, (ХСН) ЛЖ более 1.5 см).

Сахарный 70 ж Сахарный диабет 2 типа 103 52, диабет (СД) 30 м Всего 420 человек Забор крови больных ЦП осуществляли на базе гастроэнтерологического отделения Республиканской клинической больницы им. Г.Г.Куватова (г.Уфа), больных ХСН - на базе кафедры госпитальной терапии БГМУ и городской клинической больницы №13 г. Уфы, больных сахарным диабетом - в эндокринологическом отделении городской клинической больницы № 22 г. Уфы.

Диагнозы были подтверждены клинически, лабораторно, инструментально и морфологически.

Методы исследования. Экстракция геномной ДНК проводилась из венозной крови методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984). Генотипирование мутаций C282Y (с.845GA, rs1800562), H63D (c.187CG, rs1799945), S65C (c.193AT, rs1800730) в гене гемохроматоза (HFE) и Y250X (c.750CG) в гене TfR2, полиморфных локусов с.340+4TC (rs2071303, IVS2(+4)TC), c.893-44TC (rs1800708, IVS4(-44)TC), c.1007-47GA (rs гена проводилось методами ПЦР-ПДРФ анализа с IVS(-47)AG) HFE использованием праймеров и ферментов рестрикции, описанных ранее (Beutler, 1996, 1997;

Mura, 1999;

De Gobbi, 2001).

Статистическая обработка полученных результатов. В качестве инструмента вычислений использован пакет прикладных программ «SPSS v.13.0» (Bhl, 2006).

Для оценки неравновесия по сцеплению пары полиморфных локусов использовался показатель D', рассчитанный с помощью программы HaploView 4. (Barret, 2005). Построение карт осуществлялось с помощью пакета SURFER 9. (Golden Software, Inc., Golden, CO, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ мутаций в гене гемохроматоза (HFE) в популяциях Центральной Евразии С целью изучения распространенности гемохроматоза на территории России и бывших республик СССР проведено изучение мажорных мутаций C282Y и H63D в гене HFE в 4 популяциях Восточной Европы (карелы, молдаване, белорусы, украинцы), в 9 популяциях Волго-Уральского региона (коми, удмурты, мордва, марийцы, татары, чуваши, 2 этногеографические группы башкир и русские), в популяциях Средней Азии (узбеки, казахи, киргизы, таджики, курды уйгуры), а также у якутов. Проведен анализ частот аллелей и генотипов мутаций C282Y и H63D в гене HFE в зависимости от языковой принадлежности и территориальной локализации популяций Центральной Евразии. Учитывая низкую частоту мутации в гене в популяциях мира, мы провели исследование S56C HFE распространенности данной мутации только в трех наиболее многочисленных этнических группах Республики Башкортостан: русских (84 человека), татар ( человек) и башкир (406 человек).

Изучение распространенности мутации C282Y в гене HFE. Проведенное нами исследование показало неравномерность распространенности мутации C282Y в гене HFE в изученных нами популяциях Центральной Евразии. Мутация C282Y выявлена во всех исследуемых популяциях Восточной Европы с частотой от 0, у украинцев до 0,06 в популяции карелов. В среднем для исследуемого региона частота мутации C282Y оказалась равной 0,03, что сопоставимо с таковой в популяциях Центральной Европы (McLaren, 1995;

Burke, 1998;

Powell, 2000).

Частота C282Y мутации в популяциях Волго-Уральского региона варьировала от 0,009 у марийцев до 0,066 у удмуртов, составляя в среднем 0,03 и схожа с таковой в популяциях Восточной и Центральной Европы. Данная мутация не обнаружена у северо-западных башкир (Илишевского района Башкортостана), а также у якутов.

Частота мутации С282Y в популяциях Средней Азии составила 0,005, что на порядок ниже, чем в популяциях Волго-Уральского региона и Европы и выше, чем в популяциях Юго-Восточной Азии, где она представлена с частотой 0, (Cullen, 1998;

Pointon, 2003) и у народов Сибири – 0,002 (Михайлова, 2003).

Наибольшая частота мутации C282Y выявлена в популяциях финно-угорского происхождения (4%), сопоставимая с таковой в популяциях русских, чехов, австрийцев, французов, немцев, исландцев и нидерландцев, но ниже, чем в популяциях Северной Европы. Все выявленные мутации C282Y являются случаями гетерозиготного носительства, в гомозиготном состоянии эта мутация в популяциях Центральной Евразии не обнаружена. Частота мутации C282Y варьировала от 0,9% у марийцев до 6,6% у удмуртов, демонстрируя неоднородность финно-угорской группы народов. Это подтверждается и проведенными ранее исследованиями финно-угорских популяций Сибири (ханты, манси), у которых мутация C282Y не была выявлена (Михайлова, 2005). С меньшей частотой мутация C282Y встречалась в популяциях славянской и романской групп (2,5% и 2,1%, соответственно), что сопоставима с таковой в Южной Франции (Mercier, 1998), Гренландии (Merryweather-Clarke, 1999). В славянских популяциях Западной Европы наблюдается широкая вариация в частоте данной мутации - от 1,5% у сербов до 5% у чехов и не выявлена у болгар, что также свидетельствует о гетерогенности народов, принадлежащих к славянской языковой семье по исследуемой мутации.

Низкая частота мутации C282Y обнаружена у народов, принадлежащих к тюркской и иранской языковой группе (1,3% и 0,6%, соответственно). Такие низкие частоты C282Y мутации характерны для популяций Южной Европы и выше, чем в популяциях Юго-Восточной Азии и Сибири, соответствуя градиенту снижения частоты данной мутации с севера на юг и с запада на восток. Для определения распространенности мутации C282Y в популяциях мира, с учетом полученных нами результатов и доступных литературных данных, мы построили карту, демонстрирующую пространственное распределение частот гетерозиготного носительства мутации C282Y на территории Евразии (рис. 1).

Ареал распространения мутации C282Y демонстрирует наибольшую частоту в Северной Европе с постепенным снижением градиента частоты с севера на юг и с запада на восток. Характер распространенности мутации C282Y в изученных нами этнических группах соответствует их географическому расположению и вписывается в географический градиент снижения частоты с запада на восток, что дает основание предполагать, что она распространилась по миру в результате смешения с европейцами, мигрировавшими из Северной Европы.

Рисунок 1. Распространенность мутации C282Y в гене HFE в популяциях мира Наши результаты согласуются с литературными данными о возникновении мутации C282Y в гене HFE в Северной Европе (Cullen, 1998).

Изучение распространенности H63D мутации в гене HFE. Проведенное нами исследование показало неравномерность распространенности мутации H63D в гене HFE в исследованных нами 20 популяциях Центральной Евразии, варьируя от у таджиков до у мордвы, демонстрируя выраженную 2,4% 27% этноспецифичность исследуемого генетического маркера. В популяциях Восточной Европы мутация H63D обнаружена с более высокой частотой, варьируя от 9,6% у молдаван до 20,8% у белорусов. Мутация H63D встречается в гомозиготном состоянии в популяциях карелов (1%), украинцев (2,1%) и белорусов (8,3%) и не выявлена у молдаван. Частота гетерозиготного носительства мутации H63D – 19,2% для молдаван, 21% для карелов, 29,8% для украинцев и 41,6% для белорусов. В среднем для исследованных нами популяций Восточной Европы частота мутации H63D в гене HFE соответствует среднеевропейскому уровню. Частота H63D мутации в Волго-Уральском регионе колебалась от 0,08 0,089 в популяциях марийцев, коми и татар до 0,27 у мордвы. В популяциях удмуртов, мордвы, чувашей и башкир Илишевского района обнаружен гомозиготный генотип *63D/*63D с частотой 0,016;

0,098;

0,036 и 0,019, соответственно. По литературным данным, мутация H63D в гомозиготном состоянии встречается среди здоровых людей в европейских популяциях с частотой от 0,03 до 0,042 (Camaschella, 1997), у белых американцев частота этого генотипа – 0,016 – 0,02 (Marcela, 1999). Частота гетерозиготного носительства мутации для всех популяций Волго-Уральского региона в среднем, H63D составила 21,7%, что несколько ниже, чем в Европе (24,75%), но выше чем в Азии Выявлена неоднородность коренных народностей по (3,6–16,8%).

распространенности этих мутаций. Мутация Н63D обнаружена во всех изученных нами популяциях Средней Азии с частотой от 0,024 у таджиков до 0,139 у туркменов. В целом, в исследуемом регионе ее частота составила 0,074, что ниже, чем в Европе (0,25), где частота Н63D мутации колеблется от 0,12 до 0,29 (Burke, 1998) и в популяциях Волго-Уральского региона (0,22), с вариациями частоты от 0,08 до 0,27. При этом частота данной мутации в популяциях Средней Азии выше, чем в популяциях Юго-Восточной Азии (0,035) (Pointon, 2003), и соответствует таковой в популяциях Сибири (0,074) (Михайлова, 2003). В гомозиготном состоянии мутация H63D выявлена только у туркменов, где частота генотипа *63D/*63D составила 5,6%, что, видимо, связано с тем, что выборка состоит из туркменов, проживающих на территории Узбекистана, имеющих ограниченную численность, что не исключает возможность инбридинга.

Анализ распространенности мутации H63D в гене HFE в зависимости от лингвистической принадлежности популяций показал, что наибольшая ее частота выявлена для славянской группы, состоящей из популяций русских, белорусов и украинцев – 0,172, что сопоставимо с таковой в большинстве стран Центральной Европы. В популяциях, принадлежащих к финно-угорской группе народов, также наблюдается высокая частота данной мутации, составляя 0,127, обнаруживая сходство с популяциями Северной Европы (Cardoso, 1998;

Milman, 2005). В данной группе частота мутации варьирует от 0,08 у марийцев до 0,139 у удмуртов, за исключением популяции мордвы, где ее частота достигает 0,274, что может свидетельствовать о высокой распространенности заболеваний, связанных с перегрузкой железом у мордвы. У финно-угров Западной Сибири выявлена схожая картина распространенности мутации H63D, ее частота варьировала от 0,113 у хантов до 0,151 у манси и составила в среднем 0,13 (Михайлова С.В., 2003). У тюрко-язычных народов, представленных в нашем исследовании популяциями Волго-Уральского региона, Средней Азии, а также якутами, частота мутации H63D в гене HFE была ниже, чем у славянских и финно-угорских народов, составляя в среднем 0,098 и схожа с таковой у молдаван (0,096) - единственного представителя романской языковой семьи. Обнаружена широкая вариация в распространенности данной мутации в тюркоязычных популяциях Центральной Евразии, достигая двукратных различий – от 0,056 у узбеков до 0,119 у якутов. У тюрков Средней Азии наблюдается более низкая частота H63D мутации (0,077 в среднем) по сравнению с тюркскими популяциями Волго-Уральского региона (0,112 в среднем) и якутами (0,119). Интересен факт, что для тюркоязычных популяций Волго-Уральского региона характерна распространенность мутации H63D как для большинства европейских популяций, в то время как частота мутации C282Y в гене HFE значительно ниже, чем у европейцев. У тюрков Средней Азии частота мутации H63D схожа с таковой у алтайцев (0,085), тувинцев (0,05) и нивхов (0,047) и выше, чем у китайцев (0,028), японцев (0,01) и ряда других восточноазиатских популяций. В популяциях таджиков и курдов, принадлежащих к иранской языковой семье, частота мутации H63D оказалась несколько ниже, демонстрируя сходство с популяциями Юго-Восточной Азии.

Пространственное распределение частот гетерозиготного носительства мутации H63D в гене HFE на территории Евразии, построенное на основании полученных в этом исследовании результатов и доступных литературных данных, представлено на рис. 2.

Рисунок 2. Распространенность мутации H63D в гене HFE в популяциях мира.

Как видно из карты, нет четкого градиента снижения частоты мутации H63D с запада на восток, характерного для мутации C282Y. Наблюдается несколько очагов накопления мутации, исключающее ее распространение из одного источника. С целью подтверждения этой гипотезы мы провели анализ внутригенных полиморфных локусов в гене HFE для определения гаплотипов, сцепленных с мутацией, и выявления происхождения мутации H63D.

Анализ полиморфных вариантов IVS2(+4)TC, IVS4(-44)TC, IVS(-47)AG гена HFE и их гаплотипов у носителей мутации H63D гена HFE Мутация H63D – является более старой и распространенной, чем мутация С282Y, обнаружена почти во всех изученных популяциях мира и представлена большим разнообразием гаплотипов. Учитывая, что в изученных нами популяциях Центральной Евразии мутация H63D встречается с высокой частотой, мы провели анализ трех внутригенных интронных однонуклеотидных полиморфных локусов с.340+4TC (rs2071303, IVS2(+4)TC), c.893-44TC, rs1800708, IVS4(-44)TC), c.1007-47GA (rs1572982, IVS(-47)AG) гена HFE с целью определения происхождения мутации H63D и возможных путей ее распространения на данной территории. Для исследования были отобраны 26 индивидов, гомозиготных по мутации H63D, и 50 человек с отсутствием данной мутации, соответствующих по полу, этнической принадлежности и возрасту обследуемой группе. Распределение частот аллелей и генотипов изученных диаллельных полиморфных локусов гена HFE в контрольной выборке индивидов с отсутствием мутации H63D схожи с таковыми в европейских популяциях (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp) (табл.3).

Таблица Распределение частот генотипов локусов с.340+4TC (rs2071303, IVS2(+4)TC), c.893-44TC, rs1800708, IVS4(-44)TC), c.1007-47GA (rs1572982, IVS(-47)AG) Полиморфные локусы Генотип IVS2(+4)TC IVS4(-44)TC IVS(-47)AG Генотипы Частоты Генотипы Частоты Генотипы Частоты Гомозиготы по *T*T 0 *T*T 1 *A*A мутации H63D *T*C 0,731 *T*C 0 *A*G 0, *C*C 0,269 *C*C 0 *G*G 0, Без мутации H63D *T*T 0,40 *T*T 0,640 *A*A 0, *T*C 0,480 *T*C 0,280 *A*G 0, *C*C 0,120 *C*C 0,080 *G*G 0, Проведенный нами анализ гаплотипов на основе исследованных полиморфных вариантов гена HFE показал, что изученные локусы находятся в тесном неравновесии по сцеплению у индивидов, гомозиготных по мутации H63D, и образуют единый гаплоблок протяженностью 3 килобазы (D’=1) (рис. 3 А).

А Б Рисунок 3. Анализ неравновесия по сцеплению полиморфных локусов IVS2(+4)TC, IVS4(-44)TC, IVS(-47)AG гена HFE и их гаплотипов у гомозигот по мутации H63D (А) и в контрольной группе (Б).

Обнаружено 3 гаплотипа, самым частым оказался гаплотип *СТА – 0,611, гаплотипы *ТТА и *TTG встречались с частотой 0,222 и 0,167, соответственно. В контрольной группе индивидов без носительства мутации H63D локусы IVS2(+4)TC, IVS4(-44)TC, IVS(-47)AG образуют 7 гаплотипов, самым частым из них оказался гаплотип *TTG (0,348). Частота гаплотипа *CTA была статистически значимо выше у носителей мутации H63D по сравнению с группой сравнения, частота гаплотипа *TTG - достоверно выше у контроля (табл. 4).

Таблица Сравнительный анализ распределения частот гаплотипов на основе анализа локусов IVS2(+4)TC, IVS4(-44)TC, IVS(-47)AG гена HFE между носителями мутации H63D и контрольной группой Гаплотипы р H63D/H63D N/N CTA 0,611 0,216 21,665 3,2467E- TTG 0,167 0,348 5,702 0, TTA 0,222 0,186 0,439 0, TCG 0 0,106 6,692 0, CCG 0 0,068 3,748 0, CCA 0 0,048 2,154 0, CTG 0 0,029 0,881 0, В европейских популяциях мутация H63D сцеплена с гаплотипом *СТА, что свидетельствует о монофилетичности происхождения данной мутации в Европе (Beutler, 1997;

Rochette, 1999;

Aguilar-Martinez, 1999). Однако в Шри-Ланке мутация H63D оказалась ассоциирована с тремя другими гаплотипами (*TTG, *TTA, *CTG) (Rochette, 1999). У вьетнамцев мутация H63D была сцеплена как с европейским гаплотипом *СТА, так и c другими гаплотипами (Pointon, 2003).

Исследование жителей Южного Китая также выявило существование нескольких гаплотипов, ассоциированных с мутацией H63D, что свидетельствует о неоднократном мутационном событии (Cullen, 1998). Исследования жителей Новосибирска показали, что мутация H63D имеет общие корни с европейскими популяциями в данном регионе России (Михайлова, 2006).

В нашем исследовании у индивидов, гомозиготных по мутации H63D гена HFE, с высокой частотой выявлен европейский гаплотип *СТА, однако обнаружены и гаплотипы *TTG, *TTA, сцепленные с исследуемой мутацией в Шри-Ланке, что свидетельствует о неоднократных мутационных событиях в изученных нами популяциях Центральной Европы. Мутация видимо, частично H63D, распространилась из Западной Европы, а также возникала несколько раз в результате спонтанных мутаций на территории Центральной Евразии.

Учитывая обширность изучаемого нами региона, мы разделили выборку гомозигот по мутации H63D в зависимости от географического расположения популяций. Проведен анализ сцепления, частот и спектра гаплотипов у белорусов, украинцев и карелов, представляющих популяции Восточной Европы, а также отдельно рассмотрели представителей Волго-Уральского региона. У носителей мутации H63D из популяций Восточной Европы локусы IVS2(+4)TC, IVS4( 44)TC, IVS(-47)AG оказались в неравновесии по сцеплению (D’=1, LOD=1,91;

r2=0,542) и образовали гаплоблок с тремя гаплотипами. Частым оказался европейский гаплотип *СТА (0,591), однако с достаточно высокой частотой выявлены гаплотипы *TTG и *TTA. У представителей Волго-Уральского региона, гомозиготных по мутации H63D, также выявлено неравновесие по сцеплению локусов IVS2(+4)TC, IVS4(-44)TC, IVS(-47)AG гена HFE (D’=1, LOD=0,32;

r2=0,123) и три типа гаплотипов. Европейский гаплотип *СТА оказался самым частым (0,633), с достаточно высокой частотой выявлен гаплотип *TTA (0.300), частота гаплотипа *TTG оказалась низкой (0,067).

Среди представителей популяций Средней Азии выявлен всего один гомозиготный случай по мутации H63D у индивида туркменской этнической принадлежности. У него обнаружено сочетание генотипов *ТC/*TT/*GA локусов гена что предполагает IVS2(+4)TC, IVS4(-44)TC, IVS(-47)AG HFE, существование нескольких гаплотипов, сцепленных с мутацией H63D. С большой долей вероятности можно предположить, что у представителей Средней Азии с мутацией H63D ассоциированы такие же три гаплотипа *СТА, *TTG, *TTA, сцепленные с мутацией H63D в Волго-Уральском регионе и в Восточной Европе.

Таким образом, исследование полиморфных локусов с.340+4TC (rs2071303), c.893-44TC (rs1800708), c.1007-47GA (rs1572982) в гене HFE выявило сцепление мутации H63D с тремя гаплотипами *СТА, *TTG, *TTA, что свидетельствует о частичном распространении данный мутации в популяциях Центральной Евразии из Западной Европы, а также о возможном неоднократном возникновении мутации на исследуемой территории.

Изучение распространенности мутации S65C в гене HFE. Мутация S65C обнаружена в популяции русских с частотой 0,011, у башкир – 0,004, у татар – 0,012, что сопоставимо с таковой в европейских популяциях. По литературным данным частота мутации S65C в популяциях европейского происхождения составляет 1,5-2% и не встречается в популяциях Азии и Африки (Mura, 1999).

Анализ распространенности мутации S65C в популяциях мира позволяют сделать предположение о монофилетичном происхождении данной мутации в популяциях Центральной Европы и ее распространении по миру с уменьшением градиента частоты с севера на юг и с запада на восток в результате этнокультурных контактов и миграции населения (рис. 4).

Рисунок 4. Распространенность мутации S65C в гене HFE в популяциях мира.

АНАЛИЗ МУТАЦИЙ C282Y, H63D, S65C В ГЕНЕ HFE И Y250X В ГЕНЕ TfR2 С МНОГОФАКТОРНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ В настоящее время в Республике Башкортостан гемохроматоз клинически не диагностируется, и отсутствуют данные по частоте заболевания в популяциях Волго-Уральского региона. Нами сформирована выборка больных циррозами печени (ЦП), сахарным диабетом 2 типа (СД2) и хронической сердечной недостаточностью (ХСН), представляющих 3 группы высокого риска развития НГХ, и проведено исследование мутаций C282Y, H63D, S65C в гене HFE и Y250X в гене Tfr2 с целью выявления случаев НГХ и определения роли изученных мутаций в развитии трех многофакторных заболеваний.

Мутантные аллели гена HFE найдены у 24% больных циррозами печени (рис.

5). Мутация C282Y, являющаяся причиной 65-90% первичного гемохроматоза типа, обнаружена в гетерозиготном состоянии у 1 пациента 44 лет с циррозом печени смешанной этиологии С наибольшей (алиментарно-токсической+вирусной).

частотой выявлена мутация H63D, которая встречалась у 16% пациентов, из них у 14 больных ЦП в гетерозиготном варианте и у одной пациентки 50 лет с первичным билиарным циррозом в гомозиготном состоянии. Среди гетерозиготных носителей мутации H63D по три пациента оказались с ЦП неясного генеза, с первичным билиарным циррозом, ЦП смешанной этиологии, вирусной этиологии и по одному пациенту с ЦП алкогольно-токсического генеза и с болезнью Бадда-Киари.

TfR2*X250Y/X HFE*H63D/S65C TfR2*X250Y/N HFE*H63D/H63D 0Y 1% 5% 1% 3% HFE*C282Y/N 1% HFE*S65C/N 7% N/N, 68% HFE*H63D/N 14% Рисунок 5. Частоты генотипов исследованных локусов у больных ЦП из РБ.

В зависимости от этиологии ЦП частота мутации H63D варьировала от 5,8% у больных ЦП вирусного генеза до 10,4% у пациентов с ЦП невирусной природы, достигая 1,8 кратных различий. У мужчин с ЦП мутация H63D встречается реже, чем у женщин, однако различия не достигают статистической значимости. В нашем исследовании частота мутаций гена HFE оказалась ниже, чем в исследовании Кулагиной Е.А. (2009), составляя 23% у больных ЦП вирусной и 25% невирусной этиологии, что, видимо, связано с существованием выраженных этнических различий в их популяционных частотах. Частота мутации С282Y гена HFE у больных ЦП в целом оказалась ниже, чем в контрольной группе, мутация H63D у больных ЦП по своей частоте соответствовала среднепопуляционному уровню.

Мутация S65C выявлена у 7% пациентов ЦП различного генеза (вирусной С, неясного генеза, смешанной этиологии и как исход аутоиммунного гепатита). У женщин, больных ЦП, данная мутация встречалась чаще (4,6%) по сравнению с мужчинами (2,2%). У одной больной 32 лет с циррозом печени смешанной этиологии выявлены мутации H63D и S65C в компаунд-гетерозиготном состоянии. Частота мутации Y250X гена TfR2 у больных ЦП составила 5,5%, варьируя от 3,3% у мужчин до 7,4% у женщин. Данная мутация выявлена в гетерозиготном состоянии у 5% больных с поздним проявлением ЦП (средний возраст 59,4 года), при этом у женщин встречается чаще (7,4%), чем у мужчин (3,3%) вне зависимости от этиологии ЦП. У 3-х пациентов женского пола мутация Y250X обнаружена в гомозиготном состоянии. В контрольной группе здоровых индивидов данная мутация не выявлена.

Таким образом, проведенное нами изучение показало, что распространенные мутации C282Y (с.845GA) и H63D (c.187CG) в гене HFE не играют значимой роли, тогда как редкие мутации S65C (c.193AT) в гене HFE и Y250X (c.750CG) в гене TfR2, возможно, являются генетическими факторами, участвующими в развитии ЦП в РБ.

Предполагается, что мутации в гене HFE могут играть этиологическую роль в развитии сердечной недостаточности или влиять на прогноз течения заболевания, однако данные противоречивы, что может быть обусловлено различиями в распространенности ССЗ, региональными и этническими особенностями изученных популяций (Waalen, 2002;

Ellervik, 2007;

Kohgo, 2008).

У больных ХСН из РБ частота мутации С282Y составила 0,03, варьируя от 0, у мужчин до 0,061 у женщин. При разделении выборки больных в зависимости от типа ремоделирования сердца, наблюдается повышение частоты данной мутации до 0,047 в группе больных с эксцентрической ГЛЖ по сравнению с больными с концентрической формой ГЛЖ, у которых частота мутации С282Y составила лишь 0,017. При этом исследуемая мутация чаще встречается как у мужчин, так и у женщин с эксцентрической формой ГЛЖ, чем у мужчин и женщин с концентрической ГЛЖ. Причем, наиболее отчетливо данная тенденция отмечается для женщин с эксцентрической формой ГЛЖ, однако различия не достигают статистической значимости, вероятно, из-за малочисленности выборок. Все выявленные мутации C282Y являются случаями гетерозиготного носительства, в гомозиготном состоянии эта мутация в выборке больных ХСН не обнаружена. В группе больных ХСН частота мутации соответствовала C282Y среднепопуляционной. При разделении группы больных в зависимости от типа ремоделирования сердца наблюдается тенденция повышения частоты исследуемой мутации у больных с эксцентрической формой ГЛЖ (0,047) по сравнению с контрольной выборкой (0,029).

Мутация H63D в гене HFE выявлена в общей выборке больных ХСН с частотой 0,145, тогда как в контрольной выборке ее частота была ниже и составила 0,113, различия не достигают статистической значимости (2=2,104;

=0,073). Средний возраст носителей мутации H63D составил 47,73±5.58 лет. При разделении общей выборки больных на группы в зависимости от формы ГЛЖ отмечается повышение частоты исследуемой мутации у больных с эксцентрической ГЛЖ до 0,167 по сравнению с группой больных с концентрической ГЛЖ, у которых частота мутации H63D не превышает 0,129, однако, различия не достоверны. Среди больных, носителей мутации H63D, 26,42% оказались с ИБС с развитием застойной сердечной недостаточности и 29,70% больных с дилатационной кардиомиопатией. Среди пациентов с концентрическим типом ремоделирования 27,08% больных гипертонической болезнью и 21,05% больных гипертрофической кардиомиопатией являлись носителями данной мутации. У мужчин наблюдается более высокая частота исследуемой мутации вне зависимости от типа ремоделирования сердца. У 2% больных ХСН мутация H63D обнаружена в гомозиготном состоянии, тогда как в контрольной группе частота гомозигот по данной мутации составила всего 0,4%. Все случаи гомозигот по мутации H63D выявлены только у мужчин как с экцентрической ГЛЖ (1,2%), так и с концентрической формой ГЛЖ (2,7%). Мужчины относились к возрастной группе от 32 до 50 лет, страдали длительно (более 10 лет) гипертонической болезнью степени, у всех выявлена выраженная ГЛЖ. Один из этих пациентов в возрасте лет умер от геморрагического инсульта и по результатам патологоанатомического исследования страдал тяжелой формой поражения поджелудочной железы. Второй пациент, гомозиготный по мутации H63D, умер в возрасте 48 лет от развития острой коронарной недостаточности.

Мутация S65C гена HFE выявлена в общей выборке больных с частотой 0,005, что соответствует частоте данной мутации в контрольной выборке, варьируя от 0,003 у мужчин, больных ХСН, до 0,017 у женщин. По одному больному с концентрической и эксцентрической формами ГЛЖ оказались носителями мутации S65C.

Нами выявлены два случая компаунд-гетерозигот по мутациям C282Y и H63D.

Оба пациента мужского пола с концентрической и эксцентрической формами ремоделирования миокарда. Первый пациент страдал дилатационной кардиомиопатией, умер в возрасте 35 лет от явлений застойной сердечной недостаточности, причем имел наследственную отягощенность по дилатационной кардиомиопатии, мать умерла в возрасте 39 лет от ДКМП. Второй пациент более 15 лет страдал гипертонической болезнью, умер в возрасте 50 лет от острой коронарной недостаточности, при патологоанатомическом исследовании выявлена выраженная симметричная гипертрофия стенок ЛЖ (более 2.0 см).

S65C/N C282Y/N 1% 5.90% H63D/H63D 2% N/N H63D/N 67% 25% Рисунок 6. Частоты генотипов мутаций C282Y, H63D и S65C в гене HFE у больных ХСН из РБ.

Таким образом, мутации C282Y, H63D и S65C в гене HFE обнаружены у 33,9% больных ХСН из РБ (рис. 6), у 37,65% мужчин и у 24,24% женщин. При этом частота трех исследованных мутаций достигает у больных с 43,53% экцентрической формой ГЛЖ по сравнению с больными с концентрическим типом ГЛЖ, у 28,81% которых выявлены мутации гена HFE. Наблюдается повышение частоты мутаций как у женщин (50%), так и у мужчин с экцентрической ГЛЖ (43,59%). Достаточно высокая частота исследованных мутаций в гене HFE у пациентов с ХСН из РБ позволяет предположить, что HFE мутации могут быть вовлечены в процессы ремоделирования миокарда у больных ССЗ трудоспособного возраста.

Сахарный диабет является эндокринной патологией, очень часто связанной с гемохроматозом. Не у всех больных гемохроматозом развивается сахарный диабет, но высокая частота ассоциации побуждает изучить вопрос о роли мутаций в гене HFE в развитии сахарного диабета в различных популяциях. Сахарный диабет типа 2 развивается примерно у 20-50% пациентов с гемохроматозом.

(Niederau, 1985;

Fargion, 1992;

Moczulski, 2001). Однако исследования связи между C282Y и H63D мутациями в гене HFE и диабетом спорны и не являются окончательными. Мутация C282Y не обнаружена в исследованных нами выборках больных сахарным диабетом 2 типа из РБ. Частота мутации H63D оказалась 0,136, обнаружена у 24 больных СД2 в гетерозиготном состоянии и у двух пациентов выявлена в гомозиготном варианте (рис. 7). Наблюдается вариация частоты мутации от 13% у женщин до 15% у мужчин, больных СД2. При этом, оба случая гомозигот по мутации H63D оказались у женщин, гетерозиготное носительство составило от 0,206 у женщин до 0,300 у мужчин. В контрольной группе частота мутации H63D была незначительно ниже, чем у больных и составила 0,112.

H63D/N 23.30% S65C/N 2.90% N/N H63D/H63D 71.90% 1.90% Рисунок 7. Распределение частот генотипов мутаций C282Y, H63D и S65C в гене HFE у больных сахарным диабетом 2-го типа из РБ.

Случаев гомозиготного генотипа по мутации H63D у контроля не обнаружено.

Мутация S65C является более редкой, ее частота у больных СД2 составила 0,015, варьируя от 0,014 у женщин до 0,017 у мужчин. В контрольной группе мутация S65C выявлена с частотой 0,012, различия не достигают статистической значимости. Ассоциации мутаций C282Y, H63D и S65C в гене HFE с развитием сахарного диабета 2 типа в РБ не обнаружено.

Таким образом, мутация C282Y (с.845GA) в гене гемохроматоза (HFE) не является генетическим фактором риска развития хронической сердечной недостаточности, сахарного диабета 2 типа и циррозов печени в РБ. Обнаружена возможная роль мутации в гене в процессах H63D (c.187CG) HFE ремоделирования миокарда при развитии сердечной недостаточности у больных сердечно-сосудистой патологией и мутаций S65C (c.193AT) в гене HFE и Y250X в гене TfR2 в развитии циррозов печени у жителей РБ.

ВЫВОДЫ 1. Обнаружено, что мутация C282Y (с.845GA) гена HFE встречается в популяциях финно-угорского происхождения с частотой 4%, в популяциях славянской и романской групп в 2,5% и 2,1%, у тюркских и иранских народов в 1,3% и 0,6% случаев, соответственно. Выявлен градиент снижения частоты мутации с запада на восток и севера на юг, что дает основание предполагать о ее распространенности в популяциях Центральной Евразии из Западной Европы.

2. Обнаружена неравномерность распространенности мутации H63D (c.187CG) в гене HFE в исследованных 20 популяциях Центральной Евразии и несколько очагов ее накопления. Наибольшая частота мутации выявлена у славянских (17,4%) и финно-угорских народов (12,7%), ниже в тюрко- (9,8%) и ираноязычных популяциях.

3. Исследование полиморфных вариантов с.340+4TC (rs2071303), c.893 44TC (rs1800708), c.1007-47GA (rs1572982) в гене HFE выявило сцепление мутации H63D с тремя гаплотипами *СТА, *TTG, *TTA, что свидетельствует о частичном распространении мутации H63D из Западной Европы и о возможном ее неоднократном возникновении на территории Центральной Евразии.

4. Частота мутации S65C (c.193AT) в гене HFE составила 1,23% у татар, 1,07% у русских и 0,36% у башкир и сопоставима с таковой в европейских популяциях.

5. Мутации C282Y, H63D и S65C в гене HFE выявлены у 24% больных циррозами печени различной этиологии, 28,1% больных сахарным диабетом 2-го типа и у 33.9% больных хронической сердечной недостаточностью из РБ.

6. Мутация Y250X в гене TfR2 обнаружена у 5% больных циррозами печени в гетерозиготном и у 3% в гомозиготном состоянии, не выявлена у больных хронической сердечной недостаточностью и сахарным диабетом 2-го типа из РБ.

7. Обнаружена возможная роль H63D (c.187CG) мутации в гене HFE в процессах ремоделирования миокарда при развитии сердечной недостаточности у больных сердечно-сосудистой патологией и мутации S65C (c.193AT) в гене HFE, Y250X в гене TfR2 в развитии циррозов печени у жителей РБ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хуснутдинова Н.Н., Хусаинова Р.И., Хуснутдинова Э.К. Анализ CYS282TYR и HIS63ASP мутаций в гене HFE в популяциях казахов и уйгуров // Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков. Медицинская генетика.

2005. № 6. С. 285.

2. Khusnutdinova N., Khusainova R., Cvyatova G., Khusnutdinova E. Screening for Cys282Tyr and His63Asp mutations of HFE gene in Kazakhs and Uygurs populations of the Central Asia // Abstracts of the European Human Genetics Conference. Prague.

2005. P. 229.

3. Khusainova R. I., Khusnutdinova N. N., Khusnutdinova E. K. Analysis of C282Y and H63D mutations of HFE gene in populations of Central Asia // Abstracts of European Human Genetics Conference. Amsterdam. 2006. European Journal of Human Genetics. V. 14. P. 4. Хусаинова Р.И., Хуснутдинова Н.Н., Хуснутдинова Э.К. Анализ C282Y и H63D мутаций в гене гемохроматоза (HFE) в популяциях Средней Азии // Генетика.

2006. Т. 42. № 3. С. 333-338.

5. Khusnutdinova N. N., Khusainova R. I., Khusnutdinova E. K. Study of HFE gene mutations distribution in populations of Central Eurasia // Abstracts of European Human Genetics Conference. Barselona. 2008. European Journal of Human Genetics.

V. 16. P. 379.

6. Гусманова Г.Т., Хусаинова Р.И., Хуснутдинова Н.Н., Калимуллина Д.Х., Хуснутдинова Э.К. Поиск генетических факторов предрасположенности к развитию цирроза печени у больных из Республики Башкортостан // Медицинская генетика. 2011. Т.10. №8. С. 34-38.

7. Пушкарева А.Э., Хусаинова Р.И., Хуснутдинова Н.Н., Хуснутдинова Э.К.

Генотипы HFE у больных с хронической сердечной недостаточностью:

клинико-генетические аспекты и прогноз // Сердечная недостаточность. 2011.

№ 6. С. 356-362.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ДКМП – дилатационная кардиомиопатия ЖКТ – желудочно-кишечный тракт ГЛЖ – Гипертрофия левого желудочка сердца ГХ – гемохроматоз ЛЖ – левый желудочек сердца НГХ – наследственный гемохроматоз ПДРФ – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов РБ – Республика Башкортостан СД2 – сахарный диабет 2 типа ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания ОТС – относительная толщина стенок ХСН – хроническая сердечная недостаточность ЦП – цирроз печени ПЦР – полимеразная цепная реакция Подписано в печать 23.01.12 г. Формат 60х84 1/16.

Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 602.

Гарнитура «TimesNewRoman». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО.

Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-