Таксономия и филогения нематод инфраотряда rhigonematomorpha из кишечника тропических diplopoda
На правах рукописи
МАЛЫШЕВА Светлана Владимировна ТАКСОНОМИЯ И ФИЛОГЕНИЯ НЕМАТОД ИНФРАОТРЯДА RHIGONEMATOMORPHA ИЗ КИШЕЧНИКА ТРОПИЧЕСКИХ DIPLOPODA 03.02.04 – зоология 03.02.11 – паразитология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА 2013
Работа выполнена в лаборатории систематики и эволюции паразитов Центра паразитологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова РАН.
Научный консультант:
доктор биологических наук Спиридонов Сергей Эдуардович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Чесунов Алексей Валерьевич ФГБОУ ВПО Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, кафедра зоологии беспозвоночных кандидат биологических наук Воронов Дмитрий Анатольевич старший научный сотрудник, ФГБУН Институт проблем передачи информации имени А.А. Харкевича РАН
Ведущая организация:
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии имени К.И. Скрябина Российской академии сельскохозяйственных наук
Защита диссертации состоится «20» мая 2013 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.20 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119991, Россия, г. Москва, Ленинские горы, дом 1, строение 12, Биологический факультет, ауд. М-1.
Факс: 8(495)939-43-09;
Е-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова.
Автореферат разослан « » апреля 2013г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор И.Р. Бёме
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Нематоды (Nematoda) представляют собой один из наиболее многочисленных типов животного царства (Hodda, 2007). Одним из направлений эволюционного развития этой группы животных стало их проникновение внутрь других живых организмов, с формированием симбиотических отношений разной степени напряженности – от форезии до истинного паразитизма.
Объектом настоящего исследования были выбраны представители двух надсемейств инфраотряда Rhigonematomorpha: Rhigonematoidea (ригонематоидеи) и Ransomnematoidea (рансомнематоидеи), обитающие в половозрелом состоянии в кишечнике крупных тропических многоножек-диплопод. Диплоподы являются одними из наиболее древних обитателей суши, первые находки которых относятся к концу ордовикского периода (Головач, 1980). Некоторые из этих нематод (сем. Hethidae) питаются исключительно бактериями просвета кишки хозяина, чему способствуют сложные структуры их головного конца. Для некоторых представителей (род Zalophora) доказано хищничество – питание другими нематодами, обитающими в том же просвете кишки хозяина. Особенности биологии подавляющего большинства других нематод этих двух надсемейств все еще остаются неизвестными. Филетические связи этих двух таксонов нематод и их место в эволюционной истории всего типа представляют значительный интерес в плане изучения путей становления паразитизма в пределах типа Nematoda.
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования было проведение ревизии системы нематод надсемейств Rhigonematoidea и Ransomnematoidea и определение филетических связей этих двух таксонов нематод кишечника многоножек.
Определены следующие задачи:
1. Провести морфологическое изучение возможно большего числа родов нематод надсемейств Rhigonematoidea и Ransomnematoidea.
2. Получить нуклеотидные последовательности 2-х участков рибосомальной ДНК для нематод надсемейств Rhigonematoidea и Ransomnematoidea.
3. На основе полученных нуклеотидных последовательностей провести анализ филогенетических связей нематод надсемейств Rhigonematoidea и Ransomnematoidea и определить взаимоотношения между отдельными таксонами этих групп.
4. Подготовить и опубликовать описания новых для науки форм, выявленных в процессе проведения исследования.
Научная новизна. Впервые была исследована фауна нематод сем. Hethidae из многоножек Вьетнама и описаны четыре новых вида данного семейства, обнаружение которых явилось первым сообщением о нематодах этой группы из материковой Азии, также описан новый вид того же семейства из многоножек Австралии. Описан новый вид сем. Ichthyocephalidae, для которого приводятся морфологические и морфометрические данные по личиночным стадиям. Представлены дополнительные морфологические данные по уже описанному представителю надсемейства Rhigonematoidea – Xystrognathus phrissus. Описаны два новых вида и новый род нематод семейства Carnoyidae. Впервые описаны личинки первой стадии для одного представителя каждого из надсемейств. Для 16 видов нематод надсемейств Rhigonematoidea и Ransomnematoidea впервые с помощью сканирующего электронного микроскопа исследованы поверхностные структуры. Для представителей надсемейства Rhigonematoidea и 8 представителей надсемейства Ransomnematoidea получены нуклеотидные последовательности 18S и 28S рибосомальной ДНК. Впервые проведен филогенетический анализ этих двух надсемейств по совокупности морфологических и молекулярно-таксономических признаков.
Теоретическое и практическое значение работы состоит в разработке таксономии нематод, обитающих в задней кишке многоножек. Тропические многоножки являются одними из наиболее важных деструкторов целлюлозы в тропических экосистемах. Их связь с нематодами надсемейств Ransomnematoidea и Rhigonematoidea позволяет использовать данные по этим паразитам при изучении биологии и экологии их хозяев.
Изучение фауны нематод этих двух надсемейств дает дополнительный материал к познанию закономерностей формирования и расселения беспозвоночных в тропических экосистемах. Новые данные по строению ригонематоидей и рансомнематоидей дополняют существующие представления об организации нематод беспозвоночных и дают дополнительные признаки для систематики этого типа. Полученные нами нуклеотидные последовательности депонированы в ГенБанке (NCBI GenBank), что представляет собой часть работы по созданию всемирной базы данных, обеспечивающей надежное определение живых организмов.
Апробация работы. Материалы данного исследования были представлены и обсуждены на 5-м и 6-м Международных симпозиумах нематологов во Владивостоке в 2003 г. и в Москве в 2005 г., на Международной научной конференции паразитологов в Москве в 2006г., на 28-м Международном симпозиуме Европейского общества нематологов в 2006 г. в Благоевграде (Болгария), 4-м Всероссийском съезде Паразитологического общества при РАН в С.-Петербурге в 2008 г., 5-м Международном нематологическом конгрессе в Брисбене, Австралия в 2008 г., конференции «Молекулярная Филогенетика» в Москве в 2012 г. и Международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии» в Москве в 2012 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в международных рецензируемых журналах, включенных в базу данных Web of Science, а также публикаций в других изданиях (материалы научных совещаний и симпозиумов).
Положения, выносимые на защиту.
- Монофилия Rhigonematomorpha не подтверждается ни морфологическими, ни молекулярными данными.
- Существует разрыв в уровне нуклеотидных различий по 28S рибосомальной ДНК между семействами и родами, входящими в состав Rhigonematoidea и Ransomnematoidea.
- В строении некоторых нематод надсемейства Ransomnematoidea сохраняется комплекс признаков строения, присущих возможным предковым формам.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 190 страницах текста и подразделена на введение, 5 глав, заключение и выводы. Диссертация иллюстрирована 62 графическими рисунками и схемами, а также фотографиями, полученными в сканирующем электронном микроскопе. В текст включено 22 таблиц.
Благодарности. Автор глубоко признателен своему научному руководителю Сергею Эдуардовичу Спиридонову за всестороннюю поддержку и ценные замечания при выполнении работы и подготовке рукописи. Особую благодарность за возможность работы по электронной микроскопии автор выражает Георгию Натановичу Давидовичу и Анатолию Георгиевичу Богданову, а также всем сотрудникам Межкафедральной лаборатории электронной микроскопии Биологического факультета МГУ имени М.В.
Ломоносова. Огромную благодарность за помощь в сборе материала автор выражает сотруднику музея природы Вьетнамской Академии Наук и Технологий д-ру Фам Ван Лыку, а также сотруднику Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Д.В.
Карелину.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ НЕМАТОД НАДСЕМЕЙСТВ RHIGONEMATOIDEA И RANSOMNEMATOIDEA В главе описывается развитие представлений о таксономии и классификации нематод надсемейств Rhigonematoidea и Ransomnematoidea. Особое внимание уделено положению этих нематод в системе типа Nematoda.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава включает в себя пять разделов, посвященных сбору материала, методике приготовления глицериновых препаратов, исследованию нематод в световом и сканирующем электронном микроскопе, молекулярным методам исследования (выделение ДНК, постановка ПЦР, очистка ПЦР-продукта и т.д.), методам филогенетического анализа полученных нуклеотидных данных.
Объектом исследований были выбраны 19 видов нематод надсемейств Rhigonematoidea и Ransomnematoidea. Собранный материал представлен как разными личиночными стадиями, так и половозрелыми особями самцов и самок. Хозяевами изученных ригонематоморф являются многоножки 11 родов (таблица 1).
Многоножки были собраны в разные годы во Вьетнаме: национальный парк Ба Ви, провинция Ха Тай;
Национальный Парк Би Дуп Нуй Ба, провинция Донг Най;
Национальный Парк Кат Тьен, провинция Лам Донг;
деревня Син Хо, провинция Лай Чау;
национальный парк Чу Янг Син, провинция Дак Лак;
подножие горы Ша Па, провинция Лао Чай. Также был собран материал по многоножкам в заповеднике Маунт Глориус, Квинсленд, Австралия. Небольшое количество материала было предоставлено кубинскими коллегами в виде фиксированных формалином особей.
Часть вьетнамского материала (c острова Фу Куок, провинции Кьен Зянг) предоставлена сотрудником музея природы Вьетнамской Академии Наук и Технологий д-ром Фам Ван Лыком. Многоножки, собранные на о-ве Сумба, Индонезия, а также в Танзании, были предоставлены сотрудником Биофака МГУ им.
М.В. Ломоносова д.б.н. Д.В. Карелиным. Электронно-микроскопические исследования проводились в Межкафедральной лаборатории электронной микроскопии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Таблица 1. Список изученных видов, стадий развития, методов исследования и хозяев ригонематоморф, использованных в данной работе.
Методы Хозяин Вид Стадия развития исследования (Diplopoda) Половозрелые особи (/) ММ, СМ, СЭМ Apeuthes sp.
Cattiena trachelomegali ММ, СМ, СЭМ Pseudospirobolellidae Cattiena fansipanis Половозрелые особи (/) gen. sp.
Личинки 2-й стадии (/) СМ, СЭМ Личинки 3-й стадии (/) СМ, СЭМ СМ, СЭМ Личинки 4-й стадии () ММ, СМ, СЭМ Apeuthes sp.
Insulanema Половозрелые особи (/) longispiculum СМ, СЭМ Личинки 4-й стадии () Carnoya sp. Половозрелые особи (/) ММ, СМ, СЭМ Salpidobolus sp.
Половозрелые особи (/) ММ, СМ, СЭМ Brumptaemilius justini Archispirostreptus gigas, Peters Половозрелые особи (/) ММ, СМ, СЭМ Harpagophoridae gen.
Heth taybaci sp.
Половозрелые особи (/) СМ, СЭМ Eucarlia sp.
Heth vietnamensis Половозрелые особи (/) СМ, СЭМ Platyrhacus sp.
Heth tonkinensis Половозрелые особи (/) СМ, СЭМ Apeuthes sp.
Heth taynguyeni Половозрелые особи (/) ММ, СМ, СЭМ Iulomorphidae gen. sp.
Heth baudini Heth sp. (Индонезия) Половозрелые особи (/) ММ, СМ, СЭМ Salpidobolus sp.
Половозрелые особи (/) СМ, СЭМ Rhinocricus sp.
Heth sp.(Куба) Ransomnema sp. Половозрелые особи (/) СМ, СЭМ Rhinocricus sp.
Половозрелые особи (/) ММ, СМ Thyropygus sp.
Rhigonema ingens Rhigonema sp. 1 Половозрелые особи (/) ММ, СМ, СЭМ Apeuthes sp.
Rhigonema sp. 2 Половозрелые особи (/) ММ, СМ, СЭМ Zephronia sp.
Половозрелые особи (/) ММ, СМ, СЭМ Salpidobolus sp.
Ichthyocephaloides sumbatus Личинки 2-й стадии () СМ СМ Личинки 3-й стадии () Ichthyocephalus sp. СЭМ Rhinocricus sp.
Половозрелые особи (/) Половозрелые особи (/) ММ, СМ, СЭМ Apeuthes sp.
Xystrognathus phrissus Личинки 3-й стадии () СМ Примечание. ММ – молекулярные методы;
СМ – световая микроскопия;
СЭМ – сканирующая электронная микроскопия.
Для филогенетического анализа были использованы последовательности ригонематоморф (таблица 2), а также 38 последовательностей из базы NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). В качестве внешней группы был выбран Plectus murrayi. Выравнивания получали с помощью программы ClustalX, с использованием программ GenDoc и FORCON их переводили в Nexus-формат и анализировали в программах PAUP* 4.0b10, MEGA5 и MrBayes (Swofford, 1998;
Tamura et al., 2011;
Huelsenbeck, Ronquist, 2001). Для построения кладограмм применяли методы максимальной экономии (Maximum Parsimony – MP), связывания ближайшего соседа (Neighbor Joining – NJ), максимального правдоподобия (Maximum Likelihood – ML) и Байесов анализ (Bayesian Inference – BI). Для повышения надежности выделения отдельных эволюционных линий помимо анализа 18S и D2-D3 последовательностей р-ДНК нами проводился анализ так называемых сомкнутых последовательностей – concatenated sequences. При этом последовательности D2-D3 и 18S рибосомальной ДНК, уже приведенные к единой длине у сравниваемых видов, объединялись для каждого вида между собой.
Таблица 2. Список депонированных последовательностей ригонематоморф.
Номер в NCBI Номер в NCBI Участок Участок Список видов GenBank GenBank рДНК рДНК (LSU) (SSU) D1-D3 JX999732 18S JX Brumptaemilius justini D1-D3 JX419378 18S JX Cattiena trachelomegali D1-D3 JX436470 18S JX Cattiena fansipanis D1-D3 JX436471 18S JX Insulanema longispiculum Carnoya sp. D1-D3 JX946703 18S JX D1-D3 JX946704 18S JX Heth taybaci D1-D3 JX443484 18S JX Heth baudini Heth sp. D1-D3 JX443483 18S JX Rhigonema sp.1 D2-D3 JX155275 18S JX Rhigonema sp.2 D2-D3 JX155276 18S JX D2-D3 JX131616 18S JX Rhigonema ingens D2-D3 JX155273 18S JX Ichthyocephaloides sumbatus D2-D3 JX155274 18S JX Xystrognathus phrissus ГЛАВА 3. ОПИСАНИЯ ВИДОВ НЕМАТОД ЗАДНЕЙ КИШКИ МНОГОНОЖЕК 3.1. Описания новых видов нематод семейства Hethidae Приводятся данные по 5 описанным автором работы видов рода Heth из Вьетнама и Австралии (Квинсленд). Для каждого из видов дано описание морфологии, графические рисунки, отражающие особенности морфологии взрослых особей, и результаты изучения каждого из видов в сканирующем электронном микроскопе.
3.2. Описания новых видов нематод семейства Carnoyidae Раздел включает описания вида Cattiena fansipanis Malysheva & Pham Van Luc, 2011 из провинции Лао Кай (северный Вьетнам) и нового вида и рода карнойид – Insulanema longispiculum Malysheva & Spiridonov, 2012 c острова Фукуок на южной оконечности Вьетнама. Первоописания этих таксонов были опубликованы в 2011 и 2012 гг. Для каждого из этих двух таксонов приводится описание морфологии, графические рисунки, отражающие особенности морфологии взрослых особей и личиночных стадий, а также результаты изучения каждого из видов в сканирующем электронном микроскопе.
В этом же разделе диссертации представлено описание нового вида рода Carnoya из диплопод рода Salpidobolus Silvestri, 1897 (Spirobolida: Rhinocricidae), собранных на острове Сумба в Индонезии. Поскольку диссертация и автореферат не могут быть местом опубликования нового вида данный новый вид представлен в работе как Carnoya sp.
3.3. Описания новых видов нематод семейства Ichthyocephalidae Приводятся сведения по виду Ichthyocephaloides sumbatus Malysheva, Pham Van Luc & Spiridonov 2013, первоописание которого прошло рецензирование и принято к печати в журнале “Nematology” и будет опубликовано в 2013 году. Этот вид был обнаружен в диплоподах Salpidobolus sp. (Spirobolida: Rhinocricidae), собранных на острове Сумба, Индонезия.
Также в этом разделе диссертации приведены новые сведения об уже известном виде ихтиоцефалид – Xystrognathus phrissus Hunt, Pham Van Luc & Spiridonov, 2002.
Приводятся новые данные по морфологии данного вида, в том числе описано строение личиночных стадий этих нематод.
3.4. Описания новых видов нематод семейства Rhigonematidae Приводятся морфологические описания (полностью подготовленные первоописания) двух видов рода Rhigonema. Поскольку текст диссертации не может рассматриваться как описание, виды обозначены как Rhigonema sp. 1., от диплопод Apeuthes sp. (Spirobolida: Trigoniulidae), собранных в Национальном парке Би Дуп–Нуй Ба, провинция Донг Най, Вьетнам, и вид Rhigonema sp. 2. от диплоподы Zephronia sp. (Sphaerotheriida: Zephroniidae), собранной в том же национальном парке.
ГЛАВА 4. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ТАКСОНОМИИ РИГОНЕМАТОМОРФ 4.1. Особенности морфологии ригонематоморф 4.1.1. Особенности организации Rhigonematoidea В разделе описывается организация представителей всех трех семейств (Carnoyidae, Hethidae и Ransomnematidae), относящихся к надсемейству Rhigonematoidea. Приводится сравнительно-морфологический анализ этих нематод.
Основное внимание уделено строению переднего конца тела, симметрии головного конца, форме ротового отверстия (Рис. 1). Описываются структуры поверхности кутикулы, строение фаринкса в разных семействах (Рис. 2), экскреторная система (Рис. 3), организация половой системы у самок и самцов. Раздел проиллюстрирован графическими рисунками, а также фотографиями, полученными при изучении представителей этих двух семейств в сканирующем электронном микроскопе.
Рис. 1. Форма ротового отверстия и головной капсулы представителей надсемейства Rhigonematoidea. А, Б, В: представители рода Rhigonema Cobb, 1898;
Г:
Ichthyocephalus sp.;
Д: Xystrognathus phrissus Hunt, Pham Van Luc & Spiridonov, 2002;
Е: Ichthyocephaloides sumbatus (in litt.).
Рис. 2. Схема, иллюстрирующая относительные пропорции отделов фаринкса в пределах надсемейства Rhigonematoidea. А: род Ichthyocephaloides Hunt & Sutherland, 1984;
Б: род Rhigonema Cobb, 1898;
В: род Zalophora Hunt, 1994 (по Hunt, 1994);
Г:
род Glomerinema van Waerebeke, 1985 (по van Waerebeke, 1985);
Д: род Trachyglossus Hunt, 2002 (по Hunt, 2002).
Рис. 3. Строение терминального участка экскреторной системы представителей надсемейства Rhigonematoidea. А: латерально;
Б: вентрально.
4.1.2. Особенности организации Ransomnematoidea В разделе описываются морфологические особенности и организация представителей трех семейств (Rhigonematidae, Ichthyocephalidae и Xustrostomatidae), входящих в состав надсемейства Ransomnematoidea. Даны примеры полового диморфизма в строении переднего конца тела и кутикулярном вооружении (Рис. 4) представителей семейств Carnoyidae и Hethidae. Описана морфология головного конца самок семейства Hethidae. Для представителей каждого семейства приводятся данные по симметрии головного конца, форме ротового отверстия и разнообразию кутикулярных структур, находящихся в ротовой полости. Описывается морфология фаринкса (Рис. 5) и экскреторной системы в пределах этой группы (Рис. 6).
Приводится строение половой системы самок и самцов. Раздел проиллюстрирован графическими рисунками, а также фотографиями, полученными при изучении представителей этих семейств в сканирующем электронном микроскопе.
Рис. 4. Разнообразие кутикулярных структур представителей надсемейства Ransomnematoidea. А, Б, В, Г: кутикулярное вооружение самок семейства Hethidae;
Д, Е, Ж, З: кутикулярное вооружение представителей семейства Carnoyidae.
Рис. 5. Схема, иллюстрирующая форму и соотношение отделов фаринкса у нематод надсемейства Ransomnematoidea. А, Б: самка и самец рода Cattiena Hunt & Spiridonov, 2001;
В: самка рода Heth Cobb, 1898;
Г: самка рода Ransomnema Artigas, 1926.
Рис. 6. Схема, иллюстрирующая строение экскреторной системы представителей каждого семейства Ransomnematoidea. А, Б: самка Carnoya sp. (Индонезия), вентрально и латерально, соответственно;
В: самец Heth taybaci Malysheva & Spiridonov, 2010;
Г: самка Ransomnema sp. (Куба).
4.2. Молекулярно-таксономические признаки в систематике ригонематоморф Приводятся результаты анализа нуклеотидных различий по 18S и D2-D3 участку 28S рибосомальной ДНК для представителей Rhigonematoidea и Ransomnematoidea и по D1-D участку 28S рибосомальной ДНК представителей Ransomnematoidea. Описывается уровень различий по данным фрагментам ДНК, и возможность использования фрагмента D1-D 28S рибосомальной ДНК в таксономии и систематике нематод данной группы. Данные представлены в виде таблиц нуклеотидных различий.
ГЛАВА 5. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РИГОНЕМАТОМОРФ И ИХ ПОЛОЖЕНИЕ В СИСТЕМЕ НЕМАТОД 5.1. Сравнительная морфология Rhigonematoidea и Ransomnematoidea и проблема единства ригонематоморф Обсуждается проблема единства Rhigonematoidea и Ransomnematoidea в свете полученных морфологических данных. Проводится сравнительный анализ структур, связанных с особенностями питания в просвете кишки хозяина: строения головного конца, структуры стомы и ее положения относительно тканей фарингеального корпуса, облик экскреторной системы и ее положение.
5.2. Сравнительный анализ онтогенетического развития представителей надсемейств Rhigonematoidea и Ransomnematoidea В данном разделе представлены данные по развитию яиц Rhigonema ingens (Rhigonematoidea) и Cattiena trachelomegali (Ransomnematoidea). Приводится описание личинок первой стадии для представителей семейств Rhigonematidae и Carnoyidae. Раздел проиллюстрирован фотографиями, сделанными со светового микроскопа, а также графическими рисунками.
5.3. Молекулярно-филогенетический анализ родственных отношений в пределах надсемейств Rhigonematoidea и Ransomnematoidea Масштабированное филогенетическое древо взаимоотношений между отдельными изученными в нашей работе нематодами и родственными формами из других групп представлено на Рис. 7. Здесь и далее приведены лишь результаты, полученные с Рис. 7. Филогенетические отношения между изученными нематодами ригонематоморфами и другими группами нематод (аскаридоморфы, оксиуридоморфы) по результатам Байесова анализа последовательностей 18S рДНК (общее число признаков – 1630;
модель эволюции GTR+G+I;
2000 000 генераций, ‘burn-in’= 300 000). Шкала – вероятность 0.1 нуклеотидной замены на сайт.
помощью Байесова анализа (топологии деревьев, полученных тремя другими методами анализа, существенно не отличались). В этой филограмме Rhigonematoidea, Ransomnematoidea и аскаридоморфы образуют три части единого кластера. Надежного объединения двух из этих групп вместе не обнаруживается. С высоким уровнем поддержки (100%) оксиуридоморфы оказываются вне этого единого кластера.
Рис. 8. Филогенетические отношения между изученными нематодами ригонематоморфами и другими группами нематод (аскаридоморфы, оксиуридоморфы) по результатам Байесова анализа последовательностей 28S рДНК (общее число признаков – 753;
модель эволюции GTR+G+I;
2000 000 генераций, ‘burn-in’ = 250 000). Шкала – вероятность 0.1 нуклеотидной замены на сайт.
В ГенБанке имеется лишь небольшое число последовательностей 28S рДНК для интересующих нас таксонов нематод. Результаты анализа по этому участку ДНК представлены на Рис. 8. Оксиуридоморфы на этом древе образуют независимую ветвь, к которой, хотя и при незначительном уровне поддержки, примыкает последовательность спируриды Anguillicola crassus. Нематоды надсемейства Rhigonematoidea объединяются с аскаридоморфами, но также с незначительной поддержкой. Таким образом, Rhigonematoidea, Ransomnematoidea и Ascaridomorpha образуют три независимые эволюционные линии.
Попыткой обойти недостаточную поддержку основных интересующих нас групп нематод стало проведение анализа т.н. сомкнутых последовательностей. Результаты такого анализа представлены на Рис. 9.
Рис. 9. Филогенетические отношения между изученными нематодами ригонематоморфами и другими группами нематод по результатам Байесова анализа «сомкнутых» последовательностей (18S+28S) рДНК (общее число признаков – 2297;
модель эволюции GTR+G+I;
2000 000 генераций, ‘burn-in’ = 300 000). Шкала – вероятность 0.1 нуклеотидной замены на сайт.
Использование «сомкнутых» последовательностей дает явное повышение поддержки основных ветвей, которая для ригонематоидей, рансомнематоидей и аскаридоморф составляет 99-100% (т.е. достоверна в Байесовом анализе). При этом взаимоотношения этих трех близких групп нематод не разрешены, т.е. мы не можем сказать, какие две из них оказываются более близкими друг к другу, нежели к третьей группе.
5.4. Филогенетические отношения ригонематоморф и других групп паразитических нематод В данном разделе приводится анализ взаимоотношений изучаемой группы нематод с представителями других таксонов паразитических нематод. «Молекулярный» анализ не имеет таксономического смысла вне связи с данными морфологических исследований. Поэтому, на филогенетическое древо, построенное методом Байесова анализа, были «нанесены» морфологические признаки. Целью был поиск морфологических синапоморфий, подтверждающих достоверность основных ветвей, выделенных по результатам молекулярно-филогенетического анализа. Выявление синапоморфий – появления новых признаков в эволюции – возможно лишь при определении гипотетических предковых признаков. Первый опыт выделения таких признаков был сделан М. Адамсоном и Д. Ван Веребеком (Adamson, van Waerebeke, 1985). В дополнение к признакам, предложенным данными авторами (шестиугольное ротовое отверстие с шестью губами, количество головных сенсилл 6+6+4), в качестве предковых мы рассматриваем также: копулятивный аппарат из двух спикул и рулька, наличие тонкой оболочки яиц, присутствие большого числа соматических сенсилл и «плектидный облик» экскреторной системы. На Рис. 10 на филогенетическое древо нами нанесены морфологические апоморфии для основных групп, выделенных по результатам молекулярно-филогенетического анализа. Морфологические апоморфии даны черными квадратами и отмечены порядковыми номерами. Узлы, характеризующиеся единственной или несколькими «молекулярными» синапоморфиями, отмечены знаком в виде волнообразной линии под соответствующим номером, а в Таблице 3 дан список этих синапоморфий и характер нуклеотидных замен.
Таким образом, на эволюционные линии «аскаридно-спируридно-оксиуридной» ветви нами нанесены синапоморфии и одна гомоплазия (белые квадраты). Каждая из синапоморфий характеризует лишь одну из исследованных групп и может использоваться как характеристика данного таксона. Выявленная гомоплазия (редукция соматических сенсилл) также отличает нематод «аскаридно спируридно-оксиуридной» ветви от предковых форм, но появляется, по-видимому, Рис. 10. Наложение морфологических признаков на кладограмму, полученную по результатам Байесова анализа «сомкнутых» последовательностей (18S+28S) рДНК – соответствует филограмме на Рис. 9. Синапоморфии в строении экскреторной системы: 1 - с центральным пузырем и 4-мя кутикуляризованными каналами;
2 – одинарный продольный канал в латеральном валике;
3 - трубчатый терминальный проток с общим поперечным каналом и очень тонкими каналами, отходящими в латеральные валики;
4 - терминальный проток с пузыревидными стенками и 4-мя протоками, отходящими из общего поперечного канала;
синапоморфии в строении оболочек яиц: 5 - с толстой оболочкой и 2-мя маточными слоями;
6 - с толстой оболочкой и 1-м маточным слоем из волокнистого гликопротеина;
7 - с толстой оболочкой без маточных слоев, с утолщенным хитиновым слоем;
гомоплазия: 8 утрата соматических сенсилл;
апоморфии: 9 - полное слияние спикул и редукция рулька;
10 - неполное слияние спикул (сохраняются две головки спикул).
независимо в нескольких рассматриваемых группах. Заметим также, что редукция соматических сенсилл и связанных с ними пор в кутикуле есть феномен, происходящий в самых разных эволюционных линиях «сецернентных» нематод (= Rhabditida De Ley, Blaxter, 2002). Ранее сам признак редукции соматических сенсилл рассматривался как свойство всех «сецернентов», однако обнаружение к настоящему времени многочисленных примеров сохранения соматических сенсилл или различных пор в кутикуле показывает, что этот признак не может быть синапоморфией для всех «сецернентов» (представителей отряда Rhabditida De Ley, Blaxter, 2002). Даже в пределах надсемейства Ransomnematoidea, у большей части которых сохраняются соматические сенсиллы, их редукция отмечена для рода Carnoya (гомоплазия 8). К апоморфным признакам, возникающим параллельно в нескольких эволюционных линиях исследованных нами нематод, следует отнести сокращение элементов копулятивного аппарата самцов – слияние или редукция спикул или рулька. Такие процессы характерны как для всех оксиуридоморф, так и для рансомнематоидей из сем. Hethidae. У некоторых Ichthyocephalidae наблюдается процесс уменьшения размеров одной спикулы при увеличении относительных размеров другой. У Rhigonematidae копулятивный аппарат самцов всегда состоит из двух равных или неравных спикул и рулька.
Больший интерес представляют синапоморфии, т.е. те новые признаки, что появились лишь в одной из эволюционных линий нематод «аскаридно-спируридно оксиуридной» ветви и характеризуют таксоны ранга надсемейства или семейства.
Анализ строения изученных нами нематод показывает, что такие признаки обнаруживаются как раз в тех органах нематод, что непосредственно обеспечивают их жизнедеятельность или способствуют завершению жизненного цикла. Так, у всех «сецернентных» нематод развивается более или менее разветвленная экскреторная система. При этом у оксиуридоморф – представителей надсемейств Oxyuroidea и Thelastomatoidea – экскреторная система всегда состоит из хорошо заметного пузыря, открывающегося на поверхность тела экскреторной порой, и 4-х каналов с кутикуляризованными стенками, отходящими в латеральные валики. Такое строение экскреторной системы является несомненной синапоморфией Oxyuridomorpha (1). До некоторой степени сходна с такой экскреторной системой ее организация у Rhigonematoidea, но у них стенки самого терминального канала образуют пузыревидную структуру, а 4 протока, отходящие из общего поперечного канала, не имеют заметной кутикуляризации (синапоморфия 4). Для большинства аскаридоморф описана экскреторная система с одним продольным цитоплазматическим тяжом, залегающим в толще одного из латеральных валиков (2), а для Ransomnematoidea характерны экскреторные системы с трубчатым терминальным протоком, ведущим в общий изогнутый канал, от которого в латеральные валики отходят очень тонкие каналы меньшего сечения (4).
Изучение строения оболочек яиц у нематод «аскаридно-спируридно-оксиуридной» ветви позволило обнаружить ряд синапоморфий, характеризующих отдельные таксоны. Для инфраотряда Oxyuridomorpha (синапоморфия 5) характерны толстые оболочки яиц с двумя маточными слоями;
для Ascaridomorpha (6) – толстые оболочки яиц c одним маточным слоем из волокнистого гликопротеина, а для Rhigonematoidea (7) – толстые оболочки яиц без маточных слоев, с утолщенным хитиновым слоем.
Таблица 3. Положение молекулярных синапоморфий в выравнивании и характер нуклеотидных замен. (1-6: место расположения синапоморфий на древе;
n: общее число синапоморфий для данного узла филогенетического древа;
формат столбца: цифра – положение синапоморфии в выравнивании, буквы – нуклеотидная замена;
общая длина выравнивания – 2297 п.н.;
с 1 по 1575 - 18S рДНК, с 1576-2297 - D2-D3 рДНК).
n 1 2 3 4 5 1 1265 CT 154 TA 1639 GA 509 CT 39 CG 124 GA 2 1560 GA 2007 GA 537 GA 552 CT 129 CT 3 2204 TA 542 TG 1648 CT 144 GA 4 1744 TC 1679 TG 148 CT 5 1806 CT 1952 GC 162 GA 6 386 CT 7 466 TC 8 508 AG 9 544 GA 10 713 AG 11 2172 CT Для некоторых изученных нами таксонов, а также для некоторых кластеров из родов, относящихся в соответствии с традиционной систематикой к разным семействам, находится неожиданно высокое количество «молекулярных» синапоморфий (Таблица 3). Максимальное число их характерно для узла, объединяющего Rhigonema sp.1, R. ingens и Xystrognathus phrissus (узел с пометкой на Рис. 10). При этом для Rhigonematoidea, как единого таксона, обнаруживается лишь одна синапоморфия (узел с пометкой 3).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Для каждого из 13 видов нематод надсемейств Rhigonematoidea и Ransomnematoidea получен «набор» данных, состоящий из результатов изучения морфологии в световом и сканирующем электронном микроскопах и последовательностей двух участков рибосомальной ДНК (18S и 28S). Эти два независимых массива данных (морфологические и молекулярные) были использованы для проведения филогенетического анализа. К основным результатам такого анализа можно в порядке убывания их таксономической важности отнести следующие: 1) «неподтвержденность» монофилии Rhigonematomorpha;
2) кластеризация между собой отдельных родов из надсемейств Rhigonematoidea и Ransomnematoidea вопреки существующей классификации и некоторым очевидным признакам морфологического сходства;
3) сохранение в пределах исследованных нами групп нематод форм с набором весьма «примитивных» признаков, непосредственно напоминающих гипотетические предковые признаки.
Проведенный молекулярно-филогенетический анализ не показывает монофилии ригонематоморф, как группы, объединяющей Rhigonematoidea и Ransomnematoidea.
Если в филограммах, построенных по отдельным методам, эти группы и объединялись, то поддержка такого единства была заведомо низкой. Конечно, анализ по двум участкам рибосомальной ДНК не может считаться окончательным.
Рибосомальные последовательности кодируют лишь РНК и не являются в полном смысле слова генами. Используемые в таксономии нематод морфологические признаки не связаны непосредственно с эволюцией рибосомальных последовательностей и, в этом смысле, морфология и молекулярные последовательности рДНК являются двумя независимыми источниками филогенетической информации. В таком случае совпадения между результатами анализа по этим двум типам данных повышают достоверность выявляемого родства между отдельными таксонами. Проведенный нами анализ морфологии Rhigonematoidea и Ransomnematoidea не выявил общих для них синапоморфных признаков, которые бы отличали этих нематод от других представителей «аскаридно спируридно-оксиуридной» группы паразитических нематод. Единственным общим признаком для этих двух надсемейств является «паразитирование в многоножках диплоподах». Этот признак не может считаться информативным, поскольку имеются и другие очевидные случаи колонизации задней кишки диплопод нематодами (например, некоторые представители Thelastomatoidea).
По результатам молекулярно-филогенетического анализа Rhigonematoidea и Ransomnematoidea были выявлены случаи хорошо поддержанной филетической связи между родами, относящимися к разным семействам. При этом роды одного семейства попадали в разные кластеры родов, очевидно противоречащие существующей систематике. Так часть видов рода Rhigonema (Rhigonema ingens и Rhigonema sp.1) образует кластер с родом Xystrognathus, а другой вид рода Rhigonema sp.2 – c родом Ichthyocephaloides. При этом по строению головного конца все эти три вида ригонем должны быть отнесены именно к этому роду: имеется полусферическая головная капсула, трирадиальное ротовое отверстие, передняя часть тела покрыта волосками.
В дереве, построенном на сомкнутых последовательностях, нематоды рода Carnoya из Индонезии образуют единый и хорошо поддержанный кластер с представителями семейства Hethidae. При некоторых других методах анализа, построенных по одному участку ДНК, эти нематоды не показывают объединения с Heth, но и не оказываются в родстве с другими представителями семейства Carnoyidae. Все остальные изученные карнойиды, включая формы, обнаруженные на разных континентах и показывающие существенные морфологические различия (например, и создают стабильный и хорошо Brumptaemilius Cattiena), поддерживаемый кластер. Проведенный морфологический анализ показывает, что Carnoya из Индонезии отличается от других изученных нами карнойид по такому существенному признаку, как отсутствие соматических сенсилл.
Двумя возможными причинами выявленного нами «разногласия» молекулярных филограмм и морфологических признаков являются неоднозначность молекулярно филогенетического анализа или несовершенство существующей систематики ригонематоморф. Не исключено, что каждый из наблюдаемых нами случаев несоответствия может объясняться одной из этих причин. Так, на данном этапе нам трудно объяснить обнаруженную кластеризацию отдельных видов рода Rhigonema с нематодами относящимися к другому (не Rhigonematidae!) семейству. В то же время, обособленное положение Carnoya из Индонезии на молекулярном древе хотя бы частично подтверждается их существенными морфологическими различиями от других карнойид. Поэтому мы не может исключить и полифилетической природы семейства Carnoyidae в нынешнем понимании. Быть может, признаки сходства между изученными нами представителями этого семейства – не более чем общие плезиоморфные признаки, не отражающие родства. Действительно, строение Carnoya и Cattiena сходно, потому что повторяет обычное для нематод строение, свойственное, в том числе, и предковым формам всего надсемейства. Вооружение головного конца, казалось бы сближающее эти роды – не более чем гомоплазия, объясняемая адаптивным характером кутикулярного вооружения, необходимого при продвижении в плотном субстрате задней кишки хозяина. С такой точки зрения и характерная для Rhigonema схема строения головного конца может быть предковой для всего надсемейства. Действительно, предложенные М. Адамсоном и Д. Ван Веребеком морфологические ряды билатеризации головного конца ригонематоидей «стартуют» с формы, соответствующей современным представителям рода Rhigonema. В этом случае предковое строение головного конца не может служить достоверной синапоморфией для этого рода. Требуются дополнительные морфологические исследования для выявления гетерогенности этого рода и выявления признаков, отличающих каждую из частей рода.
С точки зрения изучения эволюции нематод исследуемых групп существенный интерес представляют нематоды семейства Hethidae. Морфология самок типового рода этого семейства – Heth – существенно изменена по сравнению с типично нематодной. Головной конец превращается в особый подвижный орган, ответственный за избирательную фильтрацию бактерий просвета кишки хозяина. В то же время обнаружение Д. Хантом рода Tutunema дало промежуточное звено такой эволюции, показав существование формы с незавершенным процессом образования псевдолабий. Именно у таких существенно измененных нематод обнаруживается совокупность весьма примитивных для всей изучаемой группы признаков: тонкостенные яйца, развитие, завершающееся выходом личинки 1-й стадии из оболочек яйца и первой линькой в наружной среде, соматические сенсиллы и своеобразная, не имеющая аналогов среди других нематод «аскаридно спируридно-оксиуридной» группы, экскреторная система. Длина ветвей, ведущих к Heth в молекулярных филограммах, невелика, что может быть истолковано как признак низких темпов эволюции этой группы. В морфологии этих нематод сложные модификации, обеспечивающие новые механизмы питания, соседствуют с явно примитивными признаками. Можно сказать, что эта группа является интересным и ранее малоизученным примером эволюции нематод и колонизации ими новых экологических ниш, в данном случае задней кишки членистоногого-хозяина.
ВЫВОДЫ 1. Результаты филогенетического анализа исследованных представителей надсемейств Rhigonematoidea и Ransomnematoidea выявляют несоответствия между традиционной систематикой, построенной по морфологическим признакам, и филограммами, построенными по результатам сравнения нуклеотидных последовательностей 18S и 28S (D2-D3 сегмент) рибосомальной ДНК. Выявлена полифилия типового рода сем. Rhigonematidae и сем. Ichthyocephalidae.
Представители этих семейств образуют две группы, в каждую из которых попадают как виды рода Rhigonema, так и представители сем. Ichthyocephalidae. Также полифилетичным оказывается сем. Carnoyidae – его типовой род Carnoya объединяется с видами семейства Hethidae.
2. Выявлены существенные различия в морфологии личинок первой стадии представителей типового рода семейства Rhigonematidae (надсемейство Rhigonematoidea) и семейства Carnoyidae (надсемейство Ransomnematoidea). У личинок 1-й стадии Rhigonematidae проявляются черты строения взрослых ригонематоидей (форма тела с расширенным передним концом, передняя часть фаринкса охватывает стому). Личинки 1-й стадии карнойид сходны со свободноживущими личинками почвенных нематод (цилиндрическая стома, соотношение длины корпуса и базальной части фаринкса, продольные латеральные ребра кутикулы) и не имеют характерных особенностей взрослых рансомнематоидей.
3. В строении нематод рода (типового рода семейства Hethidae Heth Ransomnematoidea), а также представителей некоторых родов сем. Carnoyidae (Cattiena, Insulanema) того же надсемейства сохраняется комплекс признаков, присущих предковым формам всех «сецернентных» (= Rhabditida по De Ley, Blaxter, 2002) нематод:
присутствие множественных соматических сенсилл, экскреторная система с сильно извитыми экскреторными каналами, формирование тонкостенных оболочек яиц, развитие с самостоятельным выходом личинки первой стадии из оболочек яйца.
4. По результатам анализа морфологических и молекулярных признаков изученных нематод многоножек не подтверждена монофилия инфраотряда Rhigonematomorpha как совокупности двух надсемейств: Ransomnematoidea и Rhigonematoidea. Этот факт трактуется как свидетельство независимой колонизации задней кишки многоножек диплопод нематодами этих двух эволюционных линий.
5. Анализ сомкнутых (concatenated) последовательностей 18S рДНК и D2-D сегмента 28S рДНК позволяет разрешить филогенетические отношения в пределах «аскаридно-спируридно-оксиуридной» ветви нематод (clade III по Blaxter et al., 1998) и выявляет большее количество синапоморфий для каждого из выявленных таксонов (кластеров). Анализ каждого из этих участков по отдельности не дает достаточной поддержки основных ветвей в получаемых кладограммах.
6. Выявлен разрыв в уровне нуклеотидных различий по 28S рибосомальной ДНК между семействами и родами, входящими в состав Rhigonematoidea и Ransomnematoidea: представители разных семейств отличаются друг от друга не менее чем на 92 пары нуклеотидов, тогда как наблюдавшиеся межродовые различия не превышают 66 пар нуклеотидов.
7. Эволюционные линии, представленные надсемействами Ascaridoidea, Ransomnematoidea и Rhigonematoidea, показывают большее родство друг с другом, чем с другими таксонами паразитических нематод «аскаридно-спируридно-оксиуридной» ветви.
Для каждого из этих надсемейств выявлены морфологические и молекулярные синапоморфии, указывающие на их монофилетическое происхождение.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В изданиях, входящих в международную базу WoS (список ВАК):
1. Malysheva S. V., Spiridonov S. E. Four new species of Heth Cobb, 1898 (Rhigonematida:
Hethidae) from Vietnamese diplopods // Nematology. 2010. Vol. 12. № 4. P. 567-585.
2. Malysheva S. V., Pham Van Luc. Cattiena fansipanis n. sp. (Nematoda:
Rhigonematida: Carnoyidae) from a millipede (Myriapoda: Diplopoda: Spirobolida) in North Vietnam // Systematic Parasitology. 2012. Vol. 81. № 2. P. 135-146.
3. Malysheva S. V., Cribb T. A new species of Heth Cobb, 1898 (Nematoda:
Rhigonematida: Hethidae) from an Australian millipede (Myriapoda: Diplopoda:
Spirostreptida) // New Zealand Journal of Zoology. 2012. Vol. 39. № 4. P. 301-309.
4. Malysheva S. V., Pham Van Luc & Spiridonov S. E. Insulanema longispiculum gen.
n., sp. n. a new Carnoyidae (Nematoda: Rhigonematomorpha) from Phu Quoc Island, Vietnam // Russian Journal of Nematology. 2012. Vol. 20. № 2. P. 157-166.
В других изданиях:
Malysheva S. V., Spiridonov S. E. Nematode fauna from hind gut of diplopods from Guadeloupe, French West India // Russian Journal of Nematology. 2003. Vol. 11. № 2. P. 142.
Malysheva S. V. Comparative morphological study of anterior end of nematodes inhabiting hind gut of tropical diplopods // Russian Journal of Nematology. 2005. Vol. 13. № 2. P. 153-154.
Малышева С. В. Сравнительно-морфологическое изучение головного конца нематод из задней кишки тропических многоножек-диплопод // Материалы Шестого международного совещания Российского общества нематологов. Москва. 2005. с. 98.
Малышева С. В. Ультраструктурные особенности переднего конца тела нематод семейства Carnoyidae (Ransomnematoidea) // Материалы международной научной конференции «Фауна, биология, морфология и систематика паразитов». М.: Российская академия наук, 2006. C. 178-180.
Malysheva S. V., Spiridonov S. E. TEM and SEM study of anterior end morphology of Carnoyid nematodes (Carnoyidae, Ransomnematoidea, Rhigonematida) // Abstracts of the XXVIII ESN International Symposium. Blagoevgrad. Bulgaria. 2006. P. 159-160.
Малышева С. В. Тонкая морфология поверхности и ультраструктура нематод рода Travassosinema (Travassosinematidae: Thelostomatoidea) из кишечника тропических Diplopoda // Материалы IV Всероссийского Съезда Паразитологического общества при Российской академии наук. Санкт-Петербург. 2008. Т. 2, С 162.
Guzeeva E. A., Malysheva S. V., Pham Van Luc & Spiridonov S. E. Intestinal parasitic nematodes of vietnamese invertebrates: new findings // Abstracts of the 5th International Congress of Nematology. Brisbane. Australia. 2008. P. 229.
Malysheva S. V., Spiridonov S. E. The phylogeny of Rhigonematomorpha nematodes – intestinal parasites of diplopods // Contributions to the 3rd Moscow International Conference “Molecular Phylogenetics”. Moscow. Russia. 2012. P. 134.
Малышева С. В., Косевич И. А. и Спиридонов С. Э. Применение молекулярно – филогенетического анализа в таксономии и систематике нематод инфраотряда Rhigonematomorpha (Rhabditida: Nematoda) // Материалы Международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии». Москва. 2012. C. 201-205.